CN104450879B - 检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明有关于检测艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)核糖分型027的序列、技术平台及其方法；此技术平台包括有与艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，可用以进行聚合酶链式反应(PCR)的引物对，以及多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料；其方法是先取得检体DNA，于活体外以引物组进行扩增检体DNA，再检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合此特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027；藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。
Description
技术领域
本发明有关于一种检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，尤其指针对检测艰难梭状杆菌核糖分型027特有的目标序列SEQ ID NO：1所设计出的#1与#2引物对，并发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台，通过聚合酶链式反应方式，即可检测检体是否具有目标序列的特征，藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。
背景技术
由Holdeman于1977年首度发表的艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)，属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)梭孢杆菌属(clostridium)，其属名来自希腊文，意指梭状物(spindle)，种名源自拉丁文difficile，是艰难的意思，表示其在分离和研究上都比较艰难；艰难梭状杆菌是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，在人体外环境或医疗环境中，会形成孢子体，常透过医疗照护行为而传播。艰难梭状杆菌尚有不同分型的菌株，其具有不同的毒性能力，其中有些亦为人体肠道中的正常菌群(normal flora)之一，由于其他肠道菌的竞争压抑才使其不易致病；但于医院里，有些病患会因为抗生素使用而抑制体内的正常菌群，导致艰难梭状杆菌伺机性感染，引起艰难梭状杆菌大量增生，由于艰难梭状芽孢杆菌主要的致病力来自于分泌的毒素A与毒素B，毒素会引发肠黏膜发炎及受损，因此会引起病人伪膜性结肠炎(pseudomembranous colitis)或严重腹泻等，并可能引起病人败血症，甚至死亡。另外，曾有研究针对医疗机构所爆发艰难梭状杆菌相关疾病的临床菌株进行分析，发现这些类似的菌株皆会分泌一种二元毒素CDT(binary toxin CDT)，并且于其致病基因tcdC上都有缺失(deletion)，如此的基因改变推测与毒素A与毒素B分泌增加相关。
近年来，艰难梭状杆菌感染症(Clostridium difficile infection，CDI)流行病学的改变与一株艰难梭状杆菌核糖分型(ribotype)027流行性菌株的出现有关，已知核糖分型027菌株具有高度毒性，并且由核糖分型027菌株引起的群体性突发事件中，常具有高致死率与高复发率的情形，因此分析艰难梭状杆菌分型将有助于了解其感染症的流行病学信息；现有艰难梭状杆菌首要的分型方法为聚合酶链式反应的核糖分型(PCRribotyping)，然全球却没有一套简易标准化的检测法可遵照。
目前艰难梭状杆菌诊断技术中无法直接以细菌基因分子诊断方式直接判读是否为核糖分型027，必须以传统聚合酶链式反应核糖分型方式，同时对比标准菌株的基因指纹图谱才能获得解答。请参阅图7，为现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图，以现有方法进行核糖分型分析时，其缺点为需要大量已知核糖分型的菌株作为分型的标准依据，并需要强大的计算机分析，才有办法作标准化分析，实验室的再现性低，具有标准菌株是否购足的限制且程序较为繁琐。
因此，如何发展出可专一性且快速检测艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的方式，找到一个特定的基因片段并发展成为单一步骤、快速且灵敏的诊断替代法，便成为此相关领域发明人关注的焦点。
发明内容
发明人即是鉴于上述现有的检测艰难梭状杆菌核糖分型的方法于实际实施使用时仍具有多处缺失，于是本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐，而加以改善，并据此研创出本发明。
本发明主要目的为提供一种可专一性检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，利用#1引物以及#2引物于活体外以聚合酶链式反应方式，检测检体是否具有目标序列特征，藉此达到快速确认检体中有无包含艰难梭状杆菌核糖分型027的目的。
为了达到上述实施目的，本发明人提出一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台及其方法，用以检测经过纯化和分离的目标序列；其中，目标序列可为脱氧核糖核酸(DNA)序列，其具有与SEQ ID NO：1至少85％的序列同一性，较佳是具有至少90％的序列同一性，更佳是具有至少95％的序列同一性，或可为SEQ ID NO：1序列。
一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其包括：(1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，用以进行聚合酶链式反应的引物对，其包含#1引物及#2引物，其中#1引物包含SEQ ID NO：2，而#2引物包含SEQ ID NO：3，此引物对是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的SEQ ID NO：1序列区域所设计；以及(2)多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
本发明的又一目的为提供一种活体外检测艰难梭状杆菌及其核糖分型027的方法，其包括下列步骤：先取得检体DNA；再于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027基因具专一性的引物组进行多重聚合酶链式反应扩增检体DNA，以检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027，其中，上述的特征是包括序列或序列的长度。
于本发明之一实施例中，检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌。
附图说明
图1：本发明较佳实施例的检测方法步骤流程图；
图2a：本发明其一具体实施例的其中三十一种标准菌株核糖分型检测分析图；
图2b：本发明其一具体实施例的其中二十种标准菌株核糖分型检测分析图；
图3a：本发明其一具体实施例的第1至41号临床菌株检测分析图；
图3b：本发明其一具体实施例的第42至73号临床菌株检测分析图；
图3c：本发明其一具体实施例的第74至119号临床菌株检测分析图；
图3d：本发明其一具体实施例的第120至149号临床菌株检测分析图；
图3e：本发明其一具体实施例的第150至210号临床菌株检测分析图；
图3f：本发明其一具体实施例的第211至273号临床菌株检测分析图；
图3g：本发明其一具体实施例的第274至334号临床菌株检测分析图；
图3h：本发明其一具体实施例的第335至380号临床菌株检测分析图；
图3i：本发明其一具体实施例的第381至414号临床菌株检测分析图；
图4：本发明其一具体实施例的核糖分型检测分析图；
图5：本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素检测分析图；
图6：本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素及核糖027分型检测分析图；
图7：现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图。
具体实施方式
本发明的目的及其结构功能上的优点，将依据以下附图所示的结构，配合具体实施例予以说明，使审查员能对本发明有更深入且具体的了解。
本发明提供一种经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列，其脱氧核糖核酸序列可例如为具有与SEQ ID NO：1(请参阅序列表所示)至少85％的序列同一性，较佳为具有至少90％的序列同一性，更佳为具有至少95％的序列同一性或可为SEQ ID NO：1核苷酸序列。
首先，本发明提出一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其主要包括有：
(1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，用以进行聚合酶链式反应(PCR)的引物对，其包含#1引物及#2引物，其中#1引物包含SEQ ID NO：2以及#2引物包含SEQ IDNO：3，且#1引物与#2引物是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列SEQ ID NO：1序列区域所设计；以及
(2)多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
请参阅图1所示，为本发明较佳实施例的检测方法步骤流程图，其检测方法主要包括有：
步骤一(S1)：取得检体DNA，其中此检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌，且为艰难梭状杆菌或其毒素或两者组合已被确认的检体；以及
步骤二(S2)：于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027具专一性的引物组进行多重聚合酶链式反应扩增(amplification)检体DNA，并以上述技术平台(可例如但不限定为一套件)检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，可例如为序列或序列的长度(2,981bp)与SEQ ID NO：1相符合者，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027。
此外，通过下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不以任何形式限制本发明的范围。
简言之，本发明有关于艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)核糖分型027菌株所特有的专一序列作为检测依据的技术平台；此技术平台包括：专一性检测艰难梭状杆菌核糖分型027的特异性序列的引物设计，及应用于进行多重聚合酶链式反应的引物组，以及此技术平台的检测流程。本发明人发展出一套多重聚合酶链式反应的检测法，其方法是先从临床粪便样本分离出DNA，于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，并同时筛选出临床上是否存在艰难梭状杆菌核糖分型027菌株。其中，毒素基因分型的引物设计是以毒基因型的艰难梭状杆菌致病基因座作为依据；另外还有一组引物利用核糖分型菌株所特有的序列作为检测依据，可用以专一性的结合在标的序列SEQ ID NO：1上。藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。因此，本发明人找到一个具有专一性的基因位点，并发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台用于临床检测艰难梭状杆菌核糖分型027菌株存在与否。
实验一：取得检体DNA
菌株来源是由美国加州大学洛杉矶分校(University of California,LosAngeles,UCLA)Prof.Goldstein实验室购得40株已知核糖分型的标准菌株，以及由瑞典CCUG种源库(Culture Collection,University ofSweden)购得11株标准菌株；另外，404株艰难梭状杆菌临床菌株取自署立台南医院病人的临床分离菌株；将上述菌株皆保存于-80℃。
于菌株培养时，直接自冻管取菌涂布于琼脂培养基(CDC anaerobe 5％sheepblood agar)，并置于培养箱中的厌氧缸内，以37℃培养48小时；再取其中单一菌落接种到50ml培养液(brain heart infusion(BHI)broth)内，密封后置于厌氧培养箱内，以37℃培养48小时，上述培养液包含有37g/L的脑心浸液(brain heart infusion)、5g/L的酵母提取物(yeast extraction)和1g/L的L-半胱氨酸(L-cysteine)。
接着，将培养于50mL离心管内的菌株以2,500g离心10分钟，并去除上清液留下沉淀物(pellet)，再以1mL PBS缓冲液回溶沉淀物后，取出200μL，利用套件(Genomic DNAMini Kit,Geneaid)所指示的步骤进行DNA萃取。
进一步地，本发明利用六组引物(如表一)所建立的多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR)来检测艰难梭状杆菌的16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC等六个基因，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型(toxin genotyping)的依据。基因扩增的反应条件为：(1)DNA变性步骤(denaturation)：94℃，5分钟；(2)接合步骤(annealing)：以94℃，1分钟，接着55℃，1分钟，再72℃，1分钟为一循环，共35个循环；以及(3)延展步骤(extension或elongation)：72℃，5分钟，并将产物保存在4℃环境。接着，利用2％琼脂凝胶(agarosegel)进行电泳反应(100伏特，40分钟)后，再以溴化乙菲啶(ethidium bromide,EtBr)染色以进行产物分析。
表一
实验二：利用与艰难梭状杆菌核糖分型027具特异性的引物对检测不同菌株
首先，本发明人将艰难梭状杆菌CD196(核糖分型027)，NC_013315.1菌株与艰难梭状杆菌630(核糖分型012)，NC_009089.1菌株的解序基因体做对比分析后，发现艰难梭状杆菌CD196中存在一组独特基因区域(目标序列，SEQ ID NO：1)为核糖分型027特有，此基因区域主要自3,490,544到3,493,524范围的两个基因(分别为CD196_2946：hypotheticalprotein与CD196_2947：CRISPR-associated helicase cas3)，故针对此目标序列设计专一性引物对，以期做为临床检测的专一性标志。而此引物对与艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，可用以进行聚合酶链式反应的引物对，分别为正股#1引物及反股#2引物，#1引物序列可为SEQ ID NO：2(24bp，Tm：57.1℃)，并且#2引物序列可为SEQ ID NO：3(19bp，Tm：51.1℃)，其放大的长度范围可为2,981bp。
将本发明设计的引物利用国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))数据库所提供目前已解序完成的17株(strains)艰难梭状杆菌，包含CD169、BI-1、R20291、2007855、CIP 107932、QCD-37x79、QCD-97b34、QCD-76w55、QCD-66c26、QCD-32q58、630、M68、M120、QCD23m63、ATCC 43255、BI-9，以及QCD-63q42的基因体作序列对比，而对比结果显示只有核糖分型027菌株才具有这段独特的目标序列存在。
萃取上述菌株的DNA，并使用Phusion Flash PCR Master Mix(ThermoScientific)与20pmol正股#1引物与反股#2引物混合进行聚合酶链式反应。基因扩增的反应条件为：(1)DNA变性步骤(denaturation)：98℃，10秒；(2)接合步骤(annealing)：以98℃，1秒，接着54℃，5秒，再72℃，70秒为一循环，共30个循环；以及(3)延展步骤(extension或elongation)：72℃，1分钟，并将产物保存在4℃环境。接着，利用1％琼脂凝胶进行电泳反应(100伏特，50分钟)后，再以溴化乙菲啶(ethidium bromide,EtBr)染色以进行产物分析。若所得产物具有与目标序列SEQ ID NO：1相同的序列或相同片段大小(2,981bp)，则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖糖分型027。
结果
结果一：本发明的引物对具有艰难梭状杆菌核糖糖分型027专一性
首先，请参阅图2a～图2b，为本发明其一具体实施例的标准菌株核糖分型检测分析图，利用本发明#1引物与#2引物，将不同菌株DNA进行聚合酶链式反应后，由图2a以及图2b的结果可得知，于11株标准菌株与40株已知核糖分型的菌株中，仅4株为核糖分型027(RT027)的菌株(R20291、BAA 1805、BI-1，以及BI-7)，才具有与目标序列大小片段相符的产物出现，其它皆没有产物，值得注意的是，其中已知与核糖分型027相似的菌株(RT019、RT075以及RT153)亦无出现此片段相符的产物。
另外，将收集到的404株临床菌株进行毒素基因分型(toxin genotyping)以作为临床检体的初步筛选与毒素分型分类，并针对不同毒素分型族群(尤其是具有高毒力基因型的菌株)再进行MLST分型做更进一步的次分类而得到特性相似的不同族群。其中值得注意的是，已知此临床检体中有出现核糖分型027相似(ribotype 027-like)、核糖分型078以及核糖分型078相似(ribotype 078-like)等的群体(数据未公开)；因此于获得以上信息后，进一步针对414株临床株菌进行核糖分型027专一性检测，并将已知为核糖分型027的两菌株(BAA1805与R20291)作为阳性对照组(positive control)；分析结果请参阅图3a～图3i，各临床菌株并未有与目标序列大小片段相符的产物出现(图3a～图3i)，表示临床菌株并未有核糖分型027菌株存在，此结果与先前已知结果吻合。
结果二：本发明的引物对可区分核糖分型027与核糖分型027相似的菌株
由于核糖分型027的菌株特征是具有tcdC负调控基因18个碱基缺失，但具有tcdC基因缺失者，并不一定为核糖分型027；因此，为避免假阳性结果，发明人已经在临床菌株中发现4株tcdC负调控基因18个碱基缺失的菌株(如图4的no.294、2、381以及286)，但在多位基因座序列分析(MLST)与核糖分型分析后排除为核糖分型027的可能(数据未公开)，使用本发明所设计的核糖分型027专一性引物可准确的区隔出正确的核糖分型027菌株(仅核糖分型027的菌株R20291、BAA 1805、BI-1以及BI-7，才有与目标序列大小片段相符的产物出现)，并无假阳性的结果。由此可知，此引物对与目标序列确实对于检测核糖分型027具有专一性，可以于临床上提供一个快速简单的诊断方法。
请参阅图5，为本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素检测分析图，本发明人亦已建立一套多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR)可快速筛检临床菌株其毒力基因型，其主要以16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB以及tcdC等六个基因，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型(toxin genotyping)的依据。
请参阅图6，结合以上发现，本发明人亦已建立一套多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR)技术平台，可快速筛检临床菌株其毒力基因型，其主要以tcdB、cdtB以及tcdC等三个基因，再加上核糖分型027具有专一性的基因，发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型及核糖分型027的依据。
由此可知，本发明针对目标序列所设计的#1引物及#2引物确实可专一地判别是否为艰难梭状杆菌核糖分型027菌株，若结合快速筛检临床菌株毒力基因型的方法，将可显著提升此菌株检测效率，藉此，可增加检测的时效性，达到临床快速检测是否为艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的目的。
由上述的实施说明可知，本发明与现有技术相较之下，本发明具有以下优点：
1.本发明针对核糖分型027特有的目标序列设计出一对专一性引物，相较于现有核糖分型的方法，本发明仅需一株阳性菌做参考并只要进行基因扩增流程，不需要特定标准菌株，亦不需计算机特殊分析，由电泳胶图结果即可直接判读结果，具有高专一性及流程简单的优点。
2.本发明取得检体DNA，于活体外检测是否为艰难梭状杆菌核糖分型027菌株，未来具有发展成商业化快筛套件、将其应用于临床检体快筛的潜力，亦可作为一种诊断替代法(diagnostic alternative)。
3.目前市面上尚无针对艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的直接诊断技术，本发明的技术平台及方法尤其可直接并快速检测是否为核糖分型027菌株，将可大幅减少临床病人等待检测结果的时间，而适时地得到妥当的治疗，故本发明对于临床病人亦是一大帮助。
综上所述，本发明的检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，的确能通过上述所揭露的实施例，达到所预期的使用功效，且本发明亦未曾公开于申请前，诚已完全符合专利法的规定与要求。
Claims (6)
1.一种检测目标序列的引物在用于制备检测艰难梭状杆菌核糖分型027的套件中的应用，其中所述目标序列的脱氧核糖核酸序列为SEQ ID NO：1。
2.一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的套件，其包括：
(1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性、用以进行聚合酶链式反应的引物对，其包含#1引物及#2引物；以及
(2)多重聚合酶链式反应检测艰难梭状杆菌的16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC六个基因所需的引物组及检测材料；
其中#1引物以及#2引物是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的SEQ ID NO：1序列区域所设计；
其中#1引物为SEQ ID NO：2以及#2引物为SEQ ID NO：3。
3.一种检测目标序列的引物在制备用于通过以下方法检测艰难梭状杆菌核糖分型027的套件中的应用，所述方法包括下列步骤：
步骤一：取得检体DNA；以及
步骤二：于以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027具专一性的16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC六个基因引物组进行多重聚合酶链式反应扩增检体DNA，并检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027；
其中所述套件包含针对所述目标序列所设计的#1引物以及#2引物以及多重聚合酶链式检测艰难梭状杆菌的16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC六个基因反应所需的引物组及检测材料；
其中#1引物为SEQ ID NO：2以及#2引物为SEQ ID NO：3。
4.根据权利要求3所述的应用，其中步骤一的检体为艰难梭状杆菌或其毒素或两者的组合已被确认的检体。
5.根据权利要求3所述的应用，其中检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌。
6.根据权利要求3所述的应用，其中目标序列SEQ ID NO：1的特征包括序列或序列的长度。
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