CN104450879A - 检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法 - Google Patents
检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104450879A CN104450879A CN201410494105.7A CN201410494105A CN104450879A CN 104450879 A CN104450879 A CN 104450879A CN 201410494105 A CN201410494105 A CN 201410494105A CN 104450879 A CN104450879 A CN 104450879A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ribotyping
- clostridium difficile
- sequence
- primer
- bacillus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 title claims abstract description 87
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 80
- 238000013098 chemical test method Methods 0.000 claims description 29
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 22
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 20
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 14
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 14
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 241001112741 Bacillaceae Species 0.000 description 3
- 206010009657 Clostridium difficile colitis Diseases 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 3
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 101150108363 cdtB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 101150089436 tcdB gene Proteins 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 2
- 208000003100 Pseudomembranous Enterocolitis Diseases 0.000 description 2
- 206010037128 Pseudomembranous colitis Diseases 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 description 2
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000031709 bromination Effects 0.000 description 2
- 238000005893 bromination reaction Methods 0.000 description 2
- 101150008941 cdtA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 2
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 2
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 101150032575 tcdA gene Proteins 0.000 description 2
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710142810 CRISPR-associated helicase Cas3 Proteins 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 208000037384 Clostridium Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010054236 Clostridium difficile infection Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000010558 Gene Alterations Effects 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 201000010927 Mucositis Diseases 0.000 description 1
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 231100000225 lethality Toxicity 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
Abstract
本发明有关于检测艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)核糖分型027的序列、技术平台及其方法；此技术平台包括有与艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，可用以进行聚合酶链式反应(PCR)的引物对，以及多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料；其方法是先取得检体DNA，于活体外以引物组进行扩增检体DNA，再检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合此特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027；藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。
Description
技术领域
本发明有关于一种检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，尤其指针对检测艰难梭状杆菌核糖分型027特有的目标序列SEQ ID NO：1所设计出的#1与#2引物对，并发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台，通过聚合酶链式反应方式，即可检测检体是否具有目标序列的特征，藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。
背景技术
由Holdeman于1977年首度发表的艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)，属于芽孢杆菌科(Bacillaceae)梭孢杆菌属(clostridium)，其属名来自希腊文，意指梭状物(spindle)，种名源自拉丁文difficile，是艰难的意思，表示其在分离和研究上都比较艰难；艰难梭状杆菌是一种厌氧性革兰氏阳性杆菌，在人体外环境或医疗环境中，会形成孢子体，常透过医疗照护行为而传播。艰难梭状杆菌尚有不同分型的菌株，其具有不同的毒性能力，其中有些亦为人体肠道中的正常菌群(normal flora)之一，由于其他肠道菌的竞争压抑才使其不易致病；但于医院里，有些病患会因为抗生素使用而抑制体内的正常菌群，导致艰难梭状杆菌伺机性感染，引起艰难梭状杆菌大量增生，由于艰难梭状芽孢杆菌主要的致病力来自于分泌的毒素A与毒素B，毒素会引发肠黏膜发炎及受损，因此会引起病人伪膜性结肠炎(pseudomembranous colitis)或严重腹泻等，并可能引起病人败血症，甚至死亡。另外，曾有研究针对医疗机构所爆发艰难梭状杆菌相关疾病的临床菌株进行分析，发现这些类似的菌株皆会分泌一种二元毒素CDT(binary toxin CDT)，并且于其致病基因tcdC上都有缺失(deletion)，如此的基因改变推测与毒素A与毒素B分泌增加相关。
近年来，艰难梭状杆菌感染症(Clostridium difficile infection，CDI)流行病学的改变与一株艰难梭状杆菌核糖分型(ribotype)027流行性菌株的出现有关，已知核糖分型027菌株具有高度毒性，并且由核糖分型027菌株引起的群体性突发事件中，常具有高致死率与高复发率的情形，因此分析艰难梭状杆菌分型将有助于了解其感染症的流行病学信息；现有艰难梭状杆菌首要的分型方法为聚合酶链式反应的核糖分型(PCR ribotyping)，然全球却没有一套简易标准化的检测法可遵照。
目前艰难梭状杆菌诊断技术中无法直接以细菌基因分子诊断方式直接判读是否为核糖分型027，必须以传统聚合酶链式反应核糖分型方式，同时对比标准菌株的基因指纹图谱才能获得解答。请参阅图7，为现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图，以现有方法进行核糖分型分析时，其缺点为需要大量已知核糖分型的菌株作为分型的标准依据，并需要强大的计算机分析，才有办法作标准化分析，实验室的再现性低，具有标准菌株是否购足的限制且程序较为繁琐。
因此，如何发展出可专一性且快速检测艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的方式，找到一个特定的基因片段并发展成为单一步骤、快速且灵敏的诊断替代法，便成为此相关领域发明人关注的焦点。
发明内容
发明人即是鉴于上述现有的检测艰难梭状杆菌核糖分型的方法于实际实施使用时仍具有多处缺失，于是本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐，而加以改善，并据此研创出本发明。
本发明主要目的为提供一种可专一性检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，利用#1引物以及#2引物于活体外以聚合酶链式反应方式，检测检体是否具有目标序列特征，藉此达到快速确认检体中有无包含艰难梭状杆菌核糖分型027的目的。
为了达到上述实施目的，本发明人提出一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台及其方法，用以检测经过纯化和分离的目标序列；其中，目标序列可为脱氧核糖核酸(DNA)序列，其具有与SEQ ID NO：1至少85％的序列同一性，较佳是具有至少90％的序列同一性，更佳是具有至少95％的序列同一性，或可为SEQ IDNO：1序列。
一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其包括：(1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，用以进行聚合酶链式反应的引物对，其包含#1引物及#2引物，其中#1引物包含SEQ ID NO：2，而#2引物包含SEQ ID NO：3，此引物对是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的SEQ ID NO：1序列区域所设计；以及(2)多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
本发明的又一目的为提供一种活体外检测艰难梭状杆菌及其核糖分型027的方法，其包括下列步骤：先取得检体DNA；再于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027基因具专一性的引物组进行多重聚合酶链式反应扩增检体DNA，以检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027，其中，上述的特征是包括序列或序列的长度。
于本发明之一实施例中，检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌。
附图说明
图1：本发明较佳实施例的检测方法步骤流程图；
图2a：本发明其一具体实施例的其中三十一种标准菌株核糖分型检测分析图；
图2b：本发明其一具体实施例的其中二十种标准菌株核糖分型检测分析图；
图3a：本发明其一具体实施例的第1至41号临床菌株检测分析图；
图3b：本发明其一具体实施例的第42至73号临床菌株检测分析图；
图3c：本发明其一具体实施例的第74至119号临床菌株检测分析图；
图3d：本发明其一具体实施例的第120至149号临床菌株检测分析图；
图3e：本发明其一具体实施例的第150至210号临床菌株检测分析图；
图3f：本发明其一具体实施例的第211至273号临床菌株检测分析图；
图3g：本发明其一具体实施例的第274至334号临床菌株检测分析图；
图3h：本发明其一具体实施例的第335至380号临床菌株检测分析图；
图3i：本发明其一具体实施例的第381至414号临床菌株检测分析图；
图4：本发明其一具体实施例的核糖分型检测分析图；
图5：本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素检测分析图；
图6：本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素及核糖027分型检测分析图；
图7：现有艰难梭状杆菌核糖分型检测分析图。
具体实施方式
本发明的目的及其结构功能上的优点，将依据以下附图所示的结构，配合具体实施例予以说明，使审查员能对本发明有更深入且具体的了解。
本发明提供一种经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列，其脱氧核糖核酸序列可例如为具有与SEQ ID NO：1(请参阅序列表所示)至少85％的序列同一性，较佳为具有至少90％的序列同一性，更佳为具有至少95％的序列同一性或可为SEQ ID NO：1核苷酸序列。
首先，本发明提出一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其主要包括有：
(1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，用以进行聚合酶链式反应(PCR)的引物对，其包含#1引物及#2引物，其中#1引物包含SEQ ID NO：2以及#2引物包含SEQ ID NO：3，且#1引物与#2引物是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列SEQ ID NO：1序列区域所设计；以及
(2)多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
请参阅图1所示，为本发明较佳实施例的检测方法步骤流程图，其检测方法主要包括有：
步骤一(S1)：取得检体DNA，其中此检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌，且为艰难梭状杆菌或其毒素或两者组合已被确认的检体；以及
步骤二(S2)：于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027具专一性的引物组进行多重聚合酶链式反应扩增(amplification)检体DNA，并以上述技术平台(可例如但不限定为一套件)检测检体是否含有符合目标序列SEQ ID NO：1的特征，可例如为序列或序列的长度(2,981bp)与SEQ ID NO：1相符合者，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027。
此外，通过下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不以任何形式限制本发明的范围。
简言之，本发明有关于艰难梭状杆菌(Clostridium difficile)核糖分型027菌株所特有的专一序列作为检测依据的技术平台；此技术平台包括：专一性检测艰难梭状杆菌核糖分型027的特异性序列的引物设计，及应用于进行多重聚合酶链式反应的引物组，以及此技术平台的检测流程。本发明人发展出一套多重聚合酶链式反应的检测法，其方法是先从临床粪便样本分离出DNA，于活体外进行艰难梭状杆菌的流行病学检测与基因分型，并同时筛选出临床上是否存在艰难梭状杆菌核糖分型027菌株。其中，毒素基因分型的引物设计是以毒基因型的艰难梭状杆菌致病基因座作为依据；另外还有一组引物利用核糖分型菌株所特有的序列作为检测依据，可用以专一性的结合在标的序列SEQ ID NO：1上。藉此达到快速确认检体中有无包含核糖分型027菌株的目的。因此，本发明人找到一个具有专一性的基因位点，并发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台用于临床检测艰难梭状杆菌核糖分型027菌株存在与否。
实验一：取得检体DNA
菌株来源是由美国加州大学洛杉矶分校(University of California,Los Angeles,UCLA)Prof.Goldstein实验室购得40株已知核糖分型的标准菌株，以及由瑞典CCUG种源库(Culture Collection,University ofSweden)购得11株标准菌株；另外，404株艰难梭状杆菌临床菌株取自署立台南医院病人的临床分离菌株；将上述菌株皆保存于-80℃。
于菌株培养时，直接自冻管取菌涂布于琼脂培养基(CDC anaerobe 5％sheep bloodagar)，并置于培养箱中的厌氧缸内，以37℃培养48小时；再取其中单一菌落接种到50ml培养液(brain heart infusion(BHI)broth)内，密封后置于厌氧培养箱内，以37℃培养48小时，上述培养液包含有37g/L的脑心浸液(brain heart infusion)、5g/L的酵母提取物(yeast extraction)和1g/L的L-半胱氨酸(L-cysteine)。
接着，将培养于50mL离心管内的菌株以2,500g离心10分钟，并去除上清液留下沉淀物(pellet)，再以1mL PBS缓冲液回溶沉淀物后，取出200μL，利用套件(GenomicDNA Mini Kit,Geneaid)所指示的步骤进行DNA萃取。
进一步地，本发明利用六组引物(如表一)所建立的多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR)来检测艰难梭状杆菌的16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，以及tcdC等六个基因，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型(toxin genotyping)的依据。基因扩增的反应条件为：(1)DNA变性步骤(denaturation)：94℃，5分钟；(2)接合步骤(annealing)：以94℃，1分钟，接着55℃，1分钟，再72℃，1分钟为一循环，共35个循环；以及(3)延展步骤(extension或elongation)：72℃，5分钟，并将产物保存在4℃环境。接着，利用2％琼脂凝胶(agarose gel)进行电泳反应(100伏特，40分钟)后，再以溴化乙菲啶(ethidium bromide,EtBr)染色以进行产物分析。
表一
实验二：利用与艰难梭状杆菌核糖分型027具特异性的引物对检测不同菌株
首先，本发明人将艰难梭状杆菌CD196(核糖分型027)，NC_013315.1菌株与艰难梭状杆菌630(核糖分型012)，NC_009089.1菌株的解序基因体做对比分析后，发现艰难梭状杆菌CD196中存在一组独特基因区域(目标序列，SEQ ID NO：1)为核糖分型027特有，此基因区域主要自3,490,544到3,493,524范围的两个基因(分别为CD196_2946：hypothetical protein与CD196_2947：CRISPR-associated helicase cas3)，故针对此目标序列设计专一性引物对，以期做为临床检测的专一性标志。而此引物对与艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性，可用以进行聚合酶链式反应的引物对，分别为正股#1引物及反股#2引物，#1引物序列可为SEQ ID NO：2(24bp，Tm：57.1℃)，并且#2引物序列可为SEQ ID NO：3(19bp，Tm：51.1℃)，其放大的长度范围可为2,981bp。
将本发明设计的引物利用国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))数据库所提供目前已解序完成的17株(strains)艰难梭状杆菌，包含CD169、BI-1、R20291、2007855、CIP 107932、QCD-37x79、QCD-97b34、QCD-76w55、QCD-66c26、QCD-32q58、630、M68、M120、QCD23m63、ATCC 43255、BI-9，以及QCD-63q42的基因体作序列对比，而对比结果显示只有核糖分型027菌株才具有这段独特的目标序列存在。
萃取上述菌株的DNA，并使用Phusion Flash PCR Master Mix(Thermo Scientific)与20pmol正股#1引物与反股#2引物混合进行聚合酶链式反应。基因扩增的反应条件为：(1)DNA变性步骤(denaturation)：98℃，10秒；(2)接合步骤(annealing)：以98℃，1秒，接着54℃，5秒，再72℃，70秒为一循环，共30个循环；以及(3)延展步骤(extension或elongation)：72℃，1分钟，并将产物保存在4℃环境。接着，利用1％琼脂凝胶进行电泳反应(100伏特，50分钟)后，再以溴化乙菲啶(ethidium bromide,EtBr)染色以进行产物分析。若所得产物具有与目标序列SEQ ID NO：1相同的序列或相同片段大小(2,981bp)，则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖糖分型027。
结果
结果一：本发明的引物对具有艰难梭状杆菌核糖糖分型027专一性
首先，请参阅图2a～图2b，为本发明其一具体实施例的标准菌株核糖分型检测分析图，利用本发明#1引物与#2引物，将不同菌株DNA进行聚合酶链式反应后，由图2a以及图2b的结果可得知，于11株标准菌株与40株已知核糖分型的菌株中，仅4株为核糖分型027(RT027)的菌株(R20291、BAA 1805、BI-1，以及BI-7)，才具有与目标序列大小片段相符的产物出现，其它皆没有产物，值得注意的是，其中已知与核糖分型027相似的菌株(RT019、RT075以及RT153)亦无出现此片段相符的产物。
另外，将收集到的404株临床菌株进行毒素基因分型(toxin genotyping)以作为临床检体的初步筛选与毒素分型分类，并针对不同毒素分型族群(尤其是具有高毒力基因型的菌株)再进行MLST分型做更进一步的次分类而得到特性相似的不同族群。其中值得注意的是，已知此临床检体中有出现核糖分型027相似(ribotype 027-like)、核糖分型078以及核糖分型078相似(ribotype 078-like)等的群体(数据未公开)；因此于获得以上信息后，进一步针对414株临床株菌进行核糖分型027专一性检测，并将已知为核糖分型027的两菌株(BAA1805与R20291)作为阳性对照组(positive control)；分析结果请参阅图3a～图3i，各临床菌株并未有与目标序列大小片段相符的产物出现(图3a～图3i)，表示临床菌株并未有核糖分型027菌株存在，此结果与先前已知结果吻合。
结果二：本发明的引物对可区分核糖分型027与核糖分型027相似的菌株
由于核糖分型027的菌株特征是具有tcdC负调控基因18个碱基缺失，但具有tcdC基因缺失者，并不一定为核糖分型027；因此，为避免假阳性结果，发明人已经在临床菌株中发现4株tcdC负调控基因18个碱基缺失的菌株(如图4的no.294、2、381以及286)，但在多位基因座序列分析(MLST)与核糖分型分析后排除为核糖分型027的可能(数据未公开)，使用本发明所设计的核糖分型027专一性引物可准确的区隔出正确的核糖分型027菌株(仅核糖分型027的菌株R20291、BAA 1805、BI-1以及BI-7，才有与目标序列大小片段相符的产物出现)，并无假阳性的结果。由此可知，此引物对与目标序列确实对于检测核糖分型027具有专一性，可以于临床上提供一个快速简单的诊断方法。
请参阅图5，为本发明具体实施例的艰难梭状杆菌毒素检测分析图，本发明人亦已建立一套多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR)可快速筛检临床菌株其毒力基因型，其主要以16s rDNA、tcdA、tcdB、cdtA、cdtB以及tcdC等六个基因，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型(toxin genotyping)的依据。
请参阅图6，结合以上发现，本发明人亦已建立一套多重聚合酶链式反应(multiplex-PCR)技术平台，可快速筛检临床菌株其毒力基因型，其主要以tcdB、cdtB以及tcdC等三个基因，再加上核糖分型027具有专一性的基因，发展出一个单一步骤、快速且灵敏的技术平台，作为艰难梭状杆菌菌株毒素分型及核糖分型027的依据。
由此可知，本发明针对目标序列所设计的#1引物及#2引物确实可专一地判别是否为艰难梭状杆菌核糖分型027菌株，若结合快速筛检临床菌株毒力基因型的方法，将可显著提升此菌株检测效率，藉此，可增加检测的时效性，达到临床快速检测是否为艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的目的。
由上述的实施说明可知，本发明与现有技术相较之下，本发明具有以下优点：
1.本发明针对核糖分型027特有的目标序列设计出一对专一性引物，相较于现有核糖分型的方法，本发明仅需一株阳性菌做参考并只要进行基因扩增流程，不需要特定标准菌株，亦不需计算机特殊分析，由电泳胶图结果即可直接判读结果，具有高专一性及流程简单的优点。
2.本发明取得检体DNA，于活体外检测是否为艰难梭状杆菌核糖分型027菌株，未来具有发展成商业化快筛套件、将其应用于临床检体快筛的潜力，亦可作为一种诊断替代法(diagnostic alternative)。
3.目前市面上尚无针对艰难梭状杆菌核糖分型027菌株的直接诊断技术，本发明的技术平台及方法尤其可直接并快速检测是否为核糖分型027菌株，将可大幅减少临床病人等待检测结果的时间，而适时地得到妥当的治疗，故本发明对于临床病人亦是一大帮助。
综上所述，本发明的检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法，的确能通过上述所揭露的实施例，达到所预期的使用功效，且本发明亦未曾公开于申请前，诚已完全符合专利法的规定与要求。
Claims (10)
1.一种经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列，其脱氧核糖核酸序列具有与SEQ ID NO：1至少85％的序列同一性。
2.根据权利要求1所述的经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列，其中脱氧核糖核酸序列具有与SEQ ID NO：1至少90％的序列同一性。
3.根据权利要求2所述的经过纯化和分离于活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的目标序列，其中脱氧核糖核酸序列具有与SEQ ID NO：1至少95％的序列同一性。
4.一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其包括：
(1)对于艰难梭状杆菌核糖分型027具有特异性、用以进行聚合酶链式反应的引物对，其包含#1引物及#2引物；以及
(2)多重聚合酶链式反应所需的引物组及检测材料。
5.根据权利要求4所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其中#1引物包含SEQ ID NO：2以及#2引物包含SEQ ID NO：3。
6.根据权利要求4所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的技术平台，其中#1引物以及#2引物是针对艰难梭状杆菌核糖分型027的SEQ ID NO：1序列区域所设计。
7.一种活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其包括下列步骤：
步骤一：取得检体DNA；以及
步骤二：于活体外以对艰难梭状杆菌毒素基因及核糖分型027具专一性的引物组进行多重聚合酶链式反应扩增检体DNA，并检测检体是否含有符合目标序列SEQ IDNO：1的特征，若符合特征则表示检体含有艰难梭状杆菌核糖分型027。
8.根据权利要求7所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其中步骤一的检体为艰难梭状杆菌或其毒素或两者的组合已被确认的检体。
9.根据权利要求7所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其中检体选自受感染的粪便或艰难梭状杆菌。
10.根据权利要求7所述的活体外检测艰难梭状杆菌核糖分型027的方法，其中目标序列SEQ ID NO：1的特征包括序列或序列的长度。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW102134634 | 2013-09-25 | ||
| TW102134634A TWI504751B (zh) | 2013-09-25 | 2013-09-25 | 檢測困難梭狀桿菌核醣分型027之序列、技術平台及其方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104450879A true CN104450879A (zh) | 2015-03-25 |
| CN104450879B CN104450879B (zh) | 2018-06-22 |
Family
ID=52691460
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410494105.7A Active CN104450879B (zh) | 2013-09-25 | 2014-09-24 | 检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20150087546A1 (zh) |
| CN (1) | CN104450879B (zh) |
| TW (1) | TWI504751B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110100012A (zh) * | 2016-12-22 | 2019-08-06 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 检测艰难梭菌的流行核糖体型的标志物的cobra探针 |
| CN111172301A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-05-19 | 深圳市儿童医院 | 一种艰难梭菌毒素b的pcr荧光检测试剂盒及其应用 |
| CN114507746A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-05-17 | 河北医科大学第二医院 | 用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针、引物组及方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2419527B1 (en) * | 2009-04-07 | 2013-06-26 | Koninklijke Philips Electronics N.V. | Method for the detection and characterization of a toxinogenic clostridium difficile strain |
-
2013
- 2013-09-25 TW TW102134634A patent/TWI504751B/zh active
-
2014
- 2014-09-24 CN CN201410494105.7A patent/CN104450879B/zh active Active
- 2014-09-24 US US14/494,902 patent/US20150087546A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-10-31 US US15/798,696 patent/US20180057861A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HE,M.等: "登录号：FN665654.1", 《NCBI数据库》, 24 March 2010 (2010-03-24) * |
| HE,M.等: "登录号：FN668941.1", 《NCBI数据库》, 21 April 2010 (2010-04-21) * |
| STABLER,R.A等: "登录号：FN545816.1", 《NCBI数据库》, 21 April 2010 (2010-04-21) * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110100012A (zh) * | 2016-12-22 | 2019-08-06 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 检测艰难梭菌的流行核糖体型的标志物的cobra探针 |
| CN110100012B (zh) * | 2016-12-22 | 2023-05-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 检测艰难梭菌的流行核糖体型的标志物的cobra探针 |
| CN111172301A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-05-19 | 深圳市儿童医院 | 一种艰难梭菌毒素b的pcr荧光检测试剂盒及其应用 |
| CN114507746A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-05-17 | 河北医科大学第二医院 | 用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针、引物组及方法 |
| CN114507746B (zh) * | 2022-03-25 | 2023-02-14 | 河北医科大学第二医院 | 用于高产毒艰难类梭菌快速鉴定和分型的探针、引物组及方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20150087546A1 (en) | 2015-03-26 |
| US20180057861A1 (en) | 2018-03-01 |
| CN104450879B (zh) | 2018-06-22 |
| TWI504751B (zh) | 2015-10-21 |
| TW201512406A (zh) | 2015-04-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ackerman et al. | The mycobiome of the human urinary tract: potential roles for fungi in urology | |
| Lau et al. | Capturing the diversity of the human gut microbiota through culture-enriched molecular profiling | |
| Fournier et al. | From culturomics to taxonomogenomics: a need to change the taxonomy of prokaryotes in clinical microbiology | |
| Sankar et al. | The human gut microbiome, a taxonomic conundrum | |
| Burton et al. | Improved understanding of the bacterial vaginal microbiota of women before and after probiotic instillation | |
| Warren et al. | Biochemical differentiation and comparison of Desulfovibrio species and other phenotypically similar genera | |
| Guo et al. | Different subtype strains of Akkermansia muciniphila abundantly colonize in southern China | |
| Podglajen et al. | Comparative molecular and microbiologic diagnosis of bacterial endocarditis | |
| CN102808031B (zh) | 检测及鉴别分枝杆菌的mPCR-DHPLC引物和方法 | |
| Ahangarkani et al. | Frequency of class 1 integron in Escherichia coli strains isolated from patients with urinary tract infections in North of Iran | |
| Ramadan et al. | Preliminary characterization of human skin microbiome in healthy Egyptian individuals | |
| Książczyk et al. | Application of routine diagnostic procedure, VITEK 2 compact, MALDI-TOF MS, and PCR assays in identification procedure of bacterial strain with ambiguous phenotype | |
| CN104450879A (zh) | 检测艰难梭状杆菌核糖分型027的序列、技术平台及其方法 | |
| Horvat et al. | Evaluating the effect of Clostridium difficile conditioned medium on fecal microbiota community structure | |
| Afouda et al. | Alcohol pretreatment of stools effect on culturomics | |
| Bafghi et al. | DNA extraction from nocardia species for special genes analysis using PCR | |
| Abuderman et al. | Molecular characterization of Clostridium difficile isolated from carriage and association of its pathogenicity to prevalent toxic genes | |
| Valadkhani et al. | Gene diversity of Trichomonas vaginalis isolates | |
| Rosa et al. | Comparison of PCR-RFLP, API® 20 Strep and MALDI-TOF MS for identification of Streptococcus spp. collected from sheep and goat milk samples | |
| Diop et al. | ‘Anaerococcus mediterraneensis’ sp. nov., a new species isolated from human female genital tract | |
| Hosny et al. | Description of Clostridium phoceensis sp. nov., a new species within the genus Clostridium | |
| CN104450941B (zh) | 一种检测干酪乳杆菌菌株的方法及其试剂盒和引物对 | |
| Sun et al. | Compositional and functional diversities of core microbial communities in wild and artificial Ophiocordyceps sinensis | |
| Durand et al. | “Intestinimonas massiliensis” sp. nov, a new bacterium isolated from human gut | |
| CN103014156A (zh) | 粪肠球菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |