CN108330165B

CN108330165B - 检测中药材肉苁蓉的lamp引物组合物、试剂盒、方法和用途

Info

Publication number: CN108330165B
Application number: CN201710795478.1A
Authority: CN
Inventors: 黄耀江; 刘宇; 蒋丹; 马敏敏
Original assignee: Minzu University of China
Current assignee: Minzu University of China
Priority date: 2017-09-06
Filing date: 2017-09-06
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2037-09-06
Also published as: CN108330165A

Abstract

本发明所述的一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途，所述LAMP引物组合物包括：正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；上述LAMP引物组合物以中药材肉苁蓉的ITS2基因为靶基因进行扩增，保证了所筛选的基因序列具有高度的特异性，可以实现中药材肉苁蓉的高特异性和高灵敏度检测，保证了其能在短时间内进行大量的中药材肉苁蓉检测，且鉴定结果准确可靠。

Description

检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途

技术领域

本发明属于中药材检测，具体涉及一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途。

背景技术

肉苁蓉为《中国药典》2015年版一部收载的一种常用药材，为列当科植物肉苁蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)或管花肉苁蓉(Cistanche tubulosa(Schenk)Wight)的干燥带鳞叶的肉质茎，具有补肾阳,益精血,润肠通便的功效，有“沙漠人参”之称，在治疗神经衰弱、老年尿频、妇女阴冷及便秘等方面有着独特的功效。

肉苁蓉及管花肉苁蓉均为沙漠多年生寄生植物,其独特的生物学特性及相对狭小的生活范围使得该资源自古就比较紧缺。随着中药事业的发展，肉苁蓉等药用植物的需求量逐渐增大，但是受利益驱动和资源紧缺的双重影响，次品、伪品冒充正品充斥着整个中药材市场，伪混品当道，而当药材使用不正确，极易对人身安全造成严重威胁，严重危害消费者的利益及正常的进出口贸易。因此，解决药材的真伪鉴别成为提高药材质量和保障进出口的重要课题。

中药材的传统鉴定方法包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定，虽然上述方法简便、直接，但是其主观性强，准确性常取决于鉴定者的经验，存在着效果不佳，准确性不够的劣势，特别是对于饮片或粉碎后的药材鉴定，传统鉴定方法存在相当大的困难。依赖经典形态分类以及传统鉴别方法已无法满足鉴别的需要。

近些年来，国内和国外已经开始运用生物化学和分子生物学等方法开始对中药材进行检测。如中国专利文献CN1896276A中公开的管花肉苁蓉鉴定引物序列及管花肉苁蓉的鉴别方法，其中设计了可以鉴别管花肉苁蓉的一对高特异性引物，该引物在给定的反应条件下，能够特异性鉴别管花肉苁蓉，对于其他伪品均不能扩增出相应的DNA片段，上述方案中应用了PCR技术鉴别管花肉苁蓉，可以快速方便的检测样品的真伪。但是由于PCR技术需要反复热变性，升降温过程比较复杂、耗时，所使用的PCR仪或测序仪以及凝胶电泳以及成像系统价格昂贵，进而使用PCR鉴别管花肉苁蓉成本比较高。近些年，在PCR基础上发展出了一种环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是由日本荣研株式会社的Notomi等人于2000年开发出来的一种新型核酸扩增方法。它依赖于4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可高效、快速、高特异地扩增靶序列。这种链置换型的DNA聚合酶，使模板两端的引物结合处循环出现环状单链结构，保证引物顺利的与模板结合，进行链置换扩增反应。该技术更克服了需要反复热变性的PCR反应的特点，有效避免了升降温的过程当中耗时的缺点，实现了恒温条件下的连续快速扩增，可以在15-60min之内扩增109-1010倍靶序列拷贝。扩增产物检测快速简单，方法多样，主要有肉眼观察沉淀法、荧光染料检测法、琼脂糖凝胶电泳法和浊度仪检测法。LAMP具有扩增效率高，灵敏度强，特异性好的优点，而且不需要昂贵的PCR仪和试剂，只需要一个恒温加热装置即可，成本低，适用于在基层使用，在普通的实验室具有很好的应用前景，适用于中药材肉苁蓉的检测。然而在现有技术中还没有提出一种利用环介导等温扩增法鉴别肉苁蓉的方法。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于提出一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途。

为此，本发明提供了一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物，所述LAMP引物组合物包括：正向内引物FIP，所述正向内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。

所述的检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物，所述LAMP引物组合物还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的环引物LF和/或核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的环引物LB。

本发明提供了一种检测中药材肉苁蓉的试剂盒，所述试剂盒包括所述LAMP引物组合物。

所述的检测中药材肉苁蓉的试剂盒，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水。

优选的，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mmol/L的pH8.8的Tris-HC1,20mmol/L的KCI,20mmol/L的(NH₄)SO₄,16mmol/L的MgSO₄,体积浓度为0.2％吐温20,1.6mol/L的甜菜碱以及2.8mmol/L的dNTPs。

所述的检测中药材肉苁蓉的试剂盒，所述试剂盒包括：

正向内引物FIP，40pmol/μL，100μL；

反向内引物BIP，40pmol/μL，100μL；

正向外引物F3，5pmol/μL，100μL；

反向外引物B3，5pmol/μL，100μL；

环引物LF，20pmol/μL，100μL；

环引物LB，20pmol/μL，100μL；

Bst DNA聚合酶，8U/μL，100μL；

含dNTPs的反应缓冲液，1.5mL；和/或

去离子水1mL。

本发明提供了一种检测中药材肉苁蓉的方法，包括如下步骤:

(1)提取待测中药材肉苁蓉的DNA；

(2)以步骤(1)提取到的DNA为模板，采用权利要求1或2所述的检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；

(3)检测步骤(2)中的扩增反应液中是否存在扩增产物，若存在扩增产物，则所述待测中药材肉苁蓉为真；若不存在扩增产物，则所述待测中药材肉苁蓉为假。

所述的检测中药材肉苁蓉的方法，所述LAMP扩增反应的体系为：

或

或

优选的，所述LAMP扩增反应的体系中，模板DNA的浓度为0.83×10^-2ng/μL

所述的检测中药材肉苁蓉的方法，所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为60℃-65℃，反应时间为20min-120min。

所述的检测中药材肉苁蓉的方法，所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为65℃，反应时间为90min。

本发明提供了所述的用于检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物或所述的用于检测中药材肉苁蓉的试剂盒在检测中药材肉苁蓉中的用途。

本发明技术方案，具有如下优点：

1.本发明所述的一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物，所述LAMP引物组合物包括：正向内引物FIP，所述正向内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示；上述LAMP引物组合物以中药材肉苁蓉的ITS2基因为靶基因进行扩增，筛选该序列采用了生物信息学的方法，使用最小遗传距离及相似性搜索法，保证了所筛选的基因序列具有高度的特异性，可以实现中药材肉苁蓉的特异性检测，针对靶基因的6个区域设计了4种特异性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，且与其它种属的植物不发生扩增反应，因而具有高特异性，同时具有高灵敏度，所需模板拷贝量少，检测下限约0.83×10^-5ng/μl。

2.本发明所述的检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物，所述LAMP引物组合物还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的环引物LF和/或核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的环引物LB；通过上述环引物，可以提高反应速率，在确保反应准确性的情况下，使本发明能够快速的进行肉苁蓉检测。

3.本发明所述的检测中药材肉苁蓉的试剂盒，所述试剂盒包括上述的LAMP引物组合物，在检测中药材肉苁蓉时更加快速和高效，核酸扩增在1h内即可完成，在20min开始发生扩增反应，对中药材肉苁蓉的检测具有重要意义。

4.本发明所述的检测中药材肉苁蓉的方法，包括(1)提取待测中药材肉苁蓉的DNA；(2)以步骤(1)提取到的DNA为模板，采用所述的检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应(3)检测步骤(2)中的扩增反应液中是否存在扩增产物，若存在扩增产物，则所述待测中药材肉苁蓉为真；若不存在扩增产物，则所述待测中药材肉苁蓉为假；上述方法使用本发明设计的LAMP引物组合物进行LAMP扩增，可以实现对中药材肉苁蓉的高特异性、高灵敏度、高准确度的检测，同时实现了恒温扩增，避免了使用PCR仪进行鉴别时进行的PCR反应需要反复升降温，过程复杂耗时，且避免使用PCR仪等昂贵设备，成本较高的缺陷，本发明的LAMP反应可操作性强，避免使用昂贵的热循环仪，只要求简单的恒温的反应仪器，必要时只准备恒温的水浴加热即可完成此操作；并且产物检测方便，通过肉眼观察浑浊度就能实现。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实验例1中中药材肉苁蓉LAMP反应的LAMP引物组合物筛选扩增曲线图，横坐标代表反应时间(min)，纵坐标代表浊度；

图2为本发明实验例2中所述LAMP引物组合物的LAMP反应特异性分析的实时浊度检测扩增曲线图，横坐标代表反应时间(min)，纵坐标代表浊度；

图3为本发明实验例3中所述LAMP引物组合物的LAMP反应灵敏度分析图；其中，

图3A为所述LAMP引物组合物的灵敏度的扩增柱状图；

图3B为所述LAMP引物组合物的灵敏度的扩增曲线图，CH1-CH7依次代表0.83×10¹—0.83×10^-6ng/μL的7个DNA模板浓度梯度；

图3C为所述LAMP引物组合物的LAMP反应的恒温水域可视化结果，1—7分别为0.83×10¹—0.83×10^-6ng/μL的DNA模板浓度，8为灭菌的蒸馏水。

具体实施方式

下述实施例中所涉及到的试剂均为市售产品，不同厂家和型号的并不会产生明显的区别。

中药材肉苁蓉购于吉林省北药药材加工有限公司。浊度仪生产厂家为北京蓝谱生物科技公司LA-500。

实施例1

以中药材肉苁蓉的2种基原物种PCR扩增产物纯化测序的结果，在NCBI上，通过相似性搜索法，根据搜索所得出的ITS序列，分析肉苁蓉的ITS序列特征，对实验样本的ITS序列进行鉴定和序列验证，列当科的植物出现在第三位，虽然相似度只有86％，但说明肉苁蓉与列当等中药材亲缘关系非常相近，单单依靠序列相似度很难将其完全区分。基于K2P模型计算遗传距离，肉苁蓉及其混伪品的种间K2P遗传距离为0.006-1.107；管花肉苁蓉及其混伪品的种间K2P遗传距离为0.768-1.129；物种的最大种内遗传距离均小于其与混伪品的最小种间遗传距离。肉苁蓉的的最大种内遗传距离略大于其与混伪品列当的最小种间遗传距离，但小于锁阳、黄花列当、地黄等混伪品，说明基于ITS2序列的遗传距离法仅无法区分肉苁蓉与列当，因此可以得出基于ITS2序列对于鉴定中药材肉苁蓉具有高度的稳定性和特异性，ITS2基因可作为特异性鉴定中药材肉苁蓉的特异性基因。

实施例2用于检测中药材肉苁蓉LAMP引物组合物的设计与合成

选取中药材肉苁蓉的特异性基因序列ITS2基因(NCBI登录号：GU434100)的序列，在所述ITS2基因上选取特异性序列区域设计如下LAMP引物组合物包括：正向内引物FIP，所述正向内引物FIP核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；和反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。在所述ITS2基因上选取6个特异性序列分别为：ITS2-F3：第157位到175位之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；ITS2-F2：第177位到197位之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；ITS2-F1：第218位到238位之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；ITS2-B1：第256位到285位之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；ITS2-B2：第315位到334位之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；ITS2-B3：第354位到371位之间的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

进一步的，所述LAMP引物组合物还包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的环引物LF和/或核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的环引物LB。

本实施例所述的LAMP引物组合物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例3用于检测中药材肉苁蓉的试剂盒

本实施例提供了一种检测中药材肉苁蓉的试剂盒，所述试剂盒包括实施例2设计的所述LAMP引物组合物。所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水；所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mmol/L的pH为8.8的Tris-HCl，20mmol/L的KCI，20mmol/L的(NH₄)SO₄，16mmol/L的MgSO₄，体积浓度为0.2％吐温20，1.6mol/L的甜菜碱以及2.8mmol/L的dNTPs。

进一步的，本实施例所述试剂盒，包括：

正向内引物FIP，40pmol/μL，100μL；

反向内引物BIP，40pmol/μL，100μL；

正向外引物F3，5pmol/μL，100μL；

反向外引物B3，5pmol/μL，100μL；

环引物LF，20pmol/μL，100μL；

环引物LB，20pmol/μL，100μL；

Bst DNA聚合酶，8U/μL，100μL；

含dNTPs的反应缓冲液，1.5mL；和/或

去离子水1mL。

实施例4中药材肉苁蓉基因组DNA模板的制备

本实施例提供了一种使用改良的CTAB法提取待测中药材肉苁蓉基因组DNA的方法，包括如下步骤：

1)取适量的待测中药材肉苁蓉，使用体积浓度为70％乙醇擦洗表面，无水乙醇浸泡5min后脱水，去除外源污染后，用刀片将药材切成小薄片放入研钵中，加入液氮迅速研磨至粉末状，备用；

2)取步骤1)中制备的0.1g粉末于预冷的离心管中，加入700-800μL、4℃预冷的缓冲液A(所述缓冲液A包含1mol/L的Tris-HCl(PH 8.0),0.5mol/L EDTA-Na₂,5mol/L的NaCl,2％(w/v)PVP(聚乙烯吡咯烷酮))，加入15μL巯基乙醇，冰浴15min，冰浴过程中颠倒2-3次，10000r/min，4℃，离心10min，弃上清，重复上述步骤直至上清液不粘稠；

3)向步骤2)中制备的上清液中加入700μL 65℃预热的缓冲液B(所述缓冲液B包含1mol/L的Tris-HCl(PH 8.0),0.5mol/L EDTA-Na₂,5mol/L的NaCl,3％(w/v)CTAB)，混匀后，65℃水浴90-120min，水浴过程中颠倒混匀数次，动作轻缓，12000r/min常温离心10min，吸取上清液于2mL管中，备用；

4)向步骤3)中的装有上清液的管中加入700μL氯仿-异戊醇溶液(氯仿：异戊醇体积比为24:1)颠倒混匀10min，12000r/min常温离心10min，吸取上清液于新的2mL离心管中，重复离心一次，直至两个液面之间没有沉淀；

5)向步骤4)获得的上清液中加入500μL预冷异丙醇摇匀，-20℃放置20min，12000r/min 4℃离心10min，弃上清，加入100μL的浓度为100mg/L的Rnase(核糖核酸酶)37℃放置30-60min；加入100μL去离子水，100μL的5mol/L的NaCl，800μL预冷的体积浓度为95％乙醇，轻轻摇匀，12000r/min在4℃离心10min，弃上清；用体积浓度为75％乙醇，清洗沉淀两次，所述沉淀室温自然干燥后，加入60μL的TE缓冲液或dH₂O定容，即得检测中药材肉苁蓉基因组DNA，-20℃贮存备用。

实施例5中药材肉苁蓉的检测

本实施例提供了一种检测中药材肉苁蓉的方法，包括如下步骤:

(1)取实施例4提取的待测中药材肉苁蓉基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取到的DNA为模板，采用实施例2所述的检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应，所述LAMP扩增反应的体系为：

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为60℃，反应时间为120min；

(3)检测步骤(2)中的扩增反应液中是否存在扩增产物，通过肉眼观察所述扩增反应液的浑浊度，若是产生浑浊，则说明存在扩增产物，所述待测中药材肉苁蓉为真；若是未产生浑浊，则说明不存在扩增产物，所述待测中药材肉苁蓉为假。

实施例6中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为65℃，反应时间为90min；

实施例7中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为63℃，反应时间为20min；

实施例8中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为60℃，反应时间为100min；

实施例9中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

实施例10中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为63℃，反应时间为50min；

实施例11中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为62℃，反应时间为95min；

实施例12中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

实施例13中药材肉苁蓉的检测

(1)取实施例4提取的检测中药材肉苁蓉基因组DNA；

所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为65℃，反应时间为20min；

实验例1筛选检测中药材肉苁蓉的最佳LAMP引物

本实施例通过比较本发明实施例6设计的LAMP引物组合物与对照组的LAMP引物组合物，将两组引物组合物加入提取的DNA模板进行LAMP特异性检验，按照实施例6的LAMP扩增反应体系进行扩增，采用浊度仪检测两组LAMP引物组合物扩增的扩增反应液的浊度以及扩增反应时间并绘制曲线，根据曲线是否出现以及曲线出现的时间筛选出最佳的LAMP引物组合物。其中对照组包括LAMP引物组合物1和LAMP引物组合物2：

LAMP引物组合物1包括：正向内引物FIP-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；反向内引物BIP-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；正向外引物F3-1，其核苷酸序列如SEQID NO:9所示；反向外引物B3-1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

LAMP引物组合物2，包括：正向内引物FIP-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；反向内引物BIP-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；正向外引物F3-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；反向外引物B3-2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

阴性对照为灭菌水。

将上述对照组的LAMP引物组合物以及阴性对照按照实施例6实施，检测结果如图1所示，由图中可知，本发明实施例6的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应时，是在反应80min时开始产生浊度，并逐渐递增，而对照组的LAMP引物组合物1(图1中引物组合1)在80min附近时产生极微量的浊度，并且随后浊度下降到起始浊度，而对照组的LAMP引物组合物2(图1中引物组合2)扩增后的反应液的浊度则相对起始时的反应液有所降低，综上说明本发明设计的LAMP引物组合物能够高效的扩增中药材肉苁蓉的特异性序列。

实验例2所述LAMP引物组合物检测中药材肉苁蓉的特异性分析

本实施例选取与中药材肉苁蓉功能和形态相近的中药材枸杞子、菟丝子、地黄、锁阳(上述药材购自于安国市药源中药材有限公司)等作为样本按照实施例9实施，对实施例9中所述LAMP引物组合物进行特异性检验，按照实施例9中LAMP扩增反应体系进行扩增，验证本发明所述的LAMP引物组合物的特异性。采用浊度仪检测不同中药材的扩增反应液的浊度以及扩增反应时间并绘制曲线，分析出峰时间及峰值。结果如图2所示，从图2可以看出，实施例9中所述LAMP引物组合物只与中药材肉苁蓉呈阳性反应，与其它物种均无扩增反应发生，证明实施例9中所述LAMP引物组合物有较好的特异性。

实验例3所述LAMP引物组合物检测中药材肉苁蓉的灵敏度分析

将实施例4中制备的DNA模板分别稀释为0.83×10¹ng/μL，0.83×10^-1ng/μL，0.83×10^-2ng/μL，0.83×10^-3ng/μL，0.83×10^-4ng/μL，0.83×10^-5ng/μL，0.83×10^-6ng/μL等7个浓度梯度，空白对照为灭菌的去离子水。按照实施例9的LAMP检测方法实施,进行灵敏度实验。结果如图3A所示的所述LAMP引物组合物灵敏度的扩增柱状图，横坐标1—7依次代表为0.83×10¹ng/μL—0.83×10^-6ng/μL的DNA模板浓度的反应液，8为空白对照，纵坐标为浊度值，随着DNA模板浓度的稀释，当DNA模板浓度在0.83×10¹ng/μL-0.83×10^-5ng/μL之间时，反应液有浊度值，当DNA模板浓度达到0.83×10^-6ng/μL时，无浊度值出现。如图3B所示的所述LAMP引物组合物灵敏度的扩增曲线图，图中CH1—CH7依次代表0.83×10¹ng/μL—0.83×10^-6ng/μL的DNA模板浓度的LAMP反应液，随着DNA模板浓度的稀释，扩增出现的时间逐渐延长，开始出现浊度值的反应时间为20min到35min不等，当DNA模板浓度达到0.83×10^-6ng/μL时，无扩增曲线出现。如图3C所示的所述LAMP引物组合物的LAMP反应的恒温水域可视化结果显示，图中管1—7依次为0.83×10¹ng/μL—0.83×10^-6ng/μL的DNA模板浓度的LAMP反应液，8为空白对照，当DNA模板浓度达到0.83×10^-6ng/μL时，反应体系颜色变为橙色。综上，LAMP检测显示，采用本LAMP方法能检测的最低稀释浓度为0.83×10^-5ng/μL，灵敏度非常高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 中央民族大学

<120> 检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物、试剂盒、方法和用途

<130> HA201600619

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(FIP)

<400> 1

gcgctatcgt caagctctcc catggtggag gagttcagga a 41

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(BIP)

<400> 2

gccagggata atgcggtggc ccataaccca atcgctgctg 40

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(F3)

<400> 3

cacctcgatg aggtgaagc 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(B3)

<400> 4

gtgacgccat agctgtcg 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(LF)

<400> 5

cgagggatgg cgttaaggc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(LB)

<400> 6

cggcgaggga tggcgttaa 19

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(FIP-1)

<400> 7

tcggtgaatt caggctttcc gtgccaacgt tctctgtttg ct 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(BIP-1)

<400> 8

cgcacaagtt gaaacaccac cccccgtcga ggatatgttc ca 42

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(F3-1)

<400> 9

gattggccgc gattgctc 18

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(B3-1)

<400> 10

cggcttttac gtacgagct 19

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(FIP-2)

<400> 11

aatccggagc cgacagctgt tcgaactcca accgaaggaa 40

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(BIP-2)

<400> 12

acgttctctg tttgctgtcc gatcggtgaa ttcaggcttt cc 42

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(F3-2)

<400> 13

atcgacgccg gaggattc 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(B3-2)

<400> 14

aacttgtgcg tcaggtgg 18

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> ITS2基因-F3(ITS2-F3)

<400> 15

gggagagctt gacgatagcg c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS2基因-F2(ITS2-F2)

<400> 16

atggtggagg agttcaggaa 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> ITS2基因-F1(ITS2-F1)

<400> 17

cacctcgatg aggtgaagc 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS2基因-B1(ITS2-B1)

<400> 18

gccaccgcat tatccctggc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> ITS2基因-B2(ITS2-B2)

<400> 19

ccataaccca atcgctgctg 20

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> ITS2基因-B3(ITS2-B3)

<400> 20

gtgacgccat agctgtcg 18

Claims

1.一种检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物，其特征在于，所述LAMP引物组合物包括：正向内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示；反向内引物BIP，其核苷酸序列如SEQID NO : 2所示；正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；和反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :4所示；以及环引物LB，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :6所示。

2.一种检测中药材肉苁蓉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述LAMP引物组合物。

3.根据权利要求2所述的检测中药材肉苁蓉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水。

4.根据权利要求2或3所述的检测中药材肉苁蓉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

正向内引物FIP，40 pmol/μL，100μL；

反向内引物BIP，40 pmol/μL，100μL；

正向外引物F3，5 pmol/μL，100μL；

反向外引物B3，5pmol/ μL，100μL；

环引物LB，20pmol/ μL，100μL；

Bst DNA聚合酶，8U/μL，100μL；

含dNTPs的反应缓冲液，1.5mL；

去离子水1mL。

5.一种检测中药材肉苁蓉的方法，其特征在于，包括如下步骤:

（1）提取待测中药材肉苁蓉的DNA；

（2）以步骤（1）提取到的DNA为模板，采用权利要求1所述的检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物进行LAMP扩增反应；

（3）检测步骤（2）中的扩增反应液中是否存在扩增产物，若存在扩增产物，则所述待测中药材肉苁蓉为真；若不存在扩增产物，则所述待测中药材肉苁蓉为假。

6.根据权利要求5所述的检测中药材肉苁蓉的方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应的体系为：

模板DNA，0.83×10¹ng/μL-0.83×10^-5ng/μL，2μL；

引物FIP，40pmol/μL，4μL；

引物BIP，40pmol/μL，4μL；

引物F3，5pmol/μL，0.5μL；

引物B3，5pmol/μL，0.5μL；

引物LB，20pmol/μL，2μL；

含dNTPs的反应缓冲液，11μL；

Bst DNA聚合酶，8U/μL，1μL。

7.根据权利要求5或6所述的检测中药材肉苁蓉的方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为60℃-65℃，反应时间为20min-120min。

8.根据权利要求7所述的检测中药材肉苁蓉的方法，其特征在于，所述LAMP扩增反应程序为：反应温度为65℃，反应时间为90min。

9.权利要求1所述的用于检测中药材肉苁蓉的LAMP引物组合物或权利要求2-4任一项所述的用于检测中药材肉苁蓉的试剂盒在检测中药材肉苁蓉中的用途。