CN101659995A - 一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的pcr方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，涉及一种人兽共患传染病病原体的基因检测技术，适用于布鲁氏菌定性检测。本发明由标准阳性模板、PCR反应液、布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物、阴性质控标准品组成。本发明检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可以替代传统的病原学检测方法。

Description

一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法

技术领域

本发明公开一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，用于检测牛奶中布鲁氏菌或者布鲁氏菌DNA，同时还提供了适应上述方法的试剂盒。属于生物检测技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为B类动物疫病，是国际贸易检疫中必检的一种传染病，我国将其列为二类动物疫病。布鲁氏菌包括6个种20个生物型，即羊种布鲁氏菌(B.melitensis)生物型1～3，牛种布鲁氏菌(B.abortus)生物型1～9、猪种布鲁氏菌(B.suis)生物型1～5、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)和犬种布鲁氏菌(B.canis)，其中羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌是引起人、家畜和野生动物流产的主要的病原菌，并且三者之间存在着宿主转移现象。人类通过食用未巴氏消毒的牛奶及奶制品或直接与感染动物或尸体接触而感染。临床上表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍症状、关节炎等非特异性症状。至今，布鲁氏菌病仍在我国部分地区流行，并时有疫情爆发的报道，直接危害人类的健康，严重困扰畜牧业的发展和动物及其产品的进出口贸易。

目前，布鲁氏菌病的诊断手段主要包括病原分离鉴定、虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)和补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、PCR等，用常规方法分离鉴定病原条件要求苛刻，且费力、费时、危险性高、成功率低。RBT和SAT特异性不高、敏感性低；CFT操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用极为不便。PCR方法是这些方法中特异性最强、敏感性最高。在欧美的一些发达国家已经把PCR作为布鲁氏菌病病原诊断的一种工具。国内对于布鲁氏菌病的检疫诊断还相对比较落后，国内很多实验室建设仍然还是空白，对该病的检测仍然采用RBT、SAT和CFT，远不能满足实际需要。因此，开发简便易行、快速、灵敏、特异的分子生物学技术已成为主要的发展趋势。

发明内容

本发明公开了一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR方法，适用于牛奶中布鲁氏菌定性检测。

本发明还进一步提供了适应上述方法的试剂盒及其制备方法，用于检测牛奶中的布鲁氏菌菌含量。

本发明的快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR试剂盒，由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品；

正向引物BF：5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′

反向引物BR：5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′

标准阳性模板含有布鲁氏菌高度保守基因的287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

PCR反应液：由正反向引物BF和BR，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成。

布鲁氏菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为：

5′-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgcggtt-3′

本发明所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA提取液：包括如下组分：10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA pH 8.8)，5％NP-40和0.5％Tween-20；

2)PCR反应液：由正反向引物BF和BR，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成；

3)标准阳性模板：含有布鲁氏菌高度保守基因BCSP31基因287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒；

4)布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物序列：

正向引物BF：5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′；

反向引物BR：5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′；

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

本发明的使用方法包括以下步骤：

取1mL牛奶样品于2mL离心管中，从牛奶样品中提取DNA；将DNA和阳性标准品加入到PCR反应液的反应体系中，进行PCR检测；取5μL PCR产物，以1％琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察287bp的扩增条带。

以下实验表明试剂盒可以快速检测布鲁氏菌：

(1)取1mL牛奶样品于2mL离心管中，加500μL 10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1MEDTA PH8.8)，加100μL 5％NP-40和0.5％Tween-20。98℃水浴30min，13，000r/m离心2min，取上清5μL，用于PCR扩增。

(2)分别取PCR反应液各45μL，取第(1)步所得布鲁氏菌DNA和布鲁氏菌阳性标准模板各5μL，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在PCR仪上平行做PCR检测。循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec、62℃退火30sec、72℃延伸30sec，扩增31个循环。

(3)取5μL PCR产物，以1％琼脂糖凝胶进行电泳检查，在凝胶图像分析仪上观察287bp的扩增条带。

反复重复试验3次，所得检测结果都相同，说明不同批次之间的检测结果具有可比性和良好的重复性。见图1。

从上述实例可以说明，PCR方法重复性好，而且PCR检测试剂盒对样品(DNA)的检测仅需3个小时就能完成。

本发明与现有技术相比其积极效果在于：该PCR检测方法实用性强，可直接检测牛奶样品中污染的布鲁氏菌，3小时内快速出结果、灵敏度高达0.16pg基因组，相当于11～16个细菌，装配成试剂盒使用安全，特异性好，使用步骤简单，可重复性好，可以对牛奶样品中的布鲁氏菌进行定性检测，可以替代传统的病原学和血清学方法。

附图说明

图1为布鲁氏菌标准阳性模板PCR扩增图；

图中，1是100bp Ladder DNA marker，2～5分别为牛种布鲁氏菌544A、牛种布鲁氏菌104M、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2pMD-18重组质粒的PCR扩增结果。

图2为PCR试剂盒的特异性鉴定图；

图中，1是DL2000DNA Marker；2是牛种布鲁氏菌544A PCR扩增结果、3是牛种布鲁氏菌104M PCR扩增结果、4是羊种布鲁氏菌16M PCR扩增结果、5是猪种布鲁氏菌S2PCR扩增结果；6是鼠伤寒沙门氏菌；7是金黄色葡萄球菌；8是铜绿假单胞菌；9是猪链球菌；10是大肠杆菌；11是肺炎克雷伯氏菌；12是变形杆菌；13是多杀性巴氏杆菌；14是小肠结肠炎耶尔森菌；15是蜡样芽胞杆菌；16是猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型；17是猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型；18是猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型；19是猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型；20是大肠杆菌O157:H7；21是纯水对照。

图3为PCR试剂盒的敏感性鉴定图；

图中，1是DL2000DNAMarker；2～10是倍比稀释牛种布鲁氏菌基因组PCR扩增图，2的浓度为1.6×10⁶pg；3是1.6×10⁵pg；4是1.6×10⁴pg；5是1.6×10³pg；6是1.6×10²pg；7是1.6×10¹pg；8是1.6pg；9是1.6×10^-1pg；10是阴性对照对照。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实验材料：牛种布鲁氏菌544A(B.abortus 544A)、牛种布鲁氏菌104M(B.abortus104M)、羊种布鲁氏菌16M(B.melitensis 16M)、猪种布鲁氏菌S2(B.suis S2)灭活菌液由中国地方病第一研究所提供，限制性内切酶、pMD18T克隆载体购自Takara公司，鼠伤寒沙门氏菌(CVCC541)、猪链球菌(CVCC606)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型(CVCC259)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型(CVCC260)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清3型(CVCC261)、猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型(CVCC263)均购自中国兽药监察所，金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠杆菌(ATCC35218)、蜡样芽胞杆菌(CMCC(B)63301)、变形杆菌(CMCC(B)45103)均购自由中国药品生物制品检定所，小肠结肠炎耶尔森菌(ATCC9610)由沈阳出入境检验检疫局赠送，大肠杆菌O157:H7(912981)由日本友人赠送，肺炎克雷伯氏菌(临床分离株，猪)、多杀性巴氏杆菌(临床分离株，猪)由本室保存。

实施例1：

试剂盒组成与配制

1)DNA提取液：包括如下组分：10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1M EDTA PH8.8)，5％NP-40和0.5％Tween-20。

2)PCR反应液：配制反应液，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)10μL、dNTPs(2.5mmol/L)5μL、正向引物和反向引物各2μL(10μmol/L)、Taq酶(5U/μL)0.5μL、无菌双蒸水25.5μL；

3)标准阳性模板：标准阳性模板为含有布鲁氏菌高度保守基因BCSP31基因287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒。

4)布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物序列：

正向引物BF：5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′；

反向引物BR：5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

实施例2：

试剂盒的特异性试验

用经过DNA有效性验证鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、猪链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌O157:H7等15种对照，阳性样品各5μL为模板进行PCR反应，同时设阴性对照。

PCR扩增条件为循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec、62℃退火30sec、72℃延伸30sec，扩增31个循环。

结果只有牛种布鲁氏菌544A、牛种布鲁氏菌104M、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2扩增出287bp特异性目的片段，而鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、猪链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清3型、猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型、大肠杆菌O157:H7和阴性对照无条带(见图2)。上述结果说明上述结果说明试剂盒具有较好的特异性。

实施例3

试剂盒的敏感性试验

取20μL牛布鲁氏菌544A基因组，稀释10倍，用UV-2802H型紫外可见分光光度汁测其浓度，然后倍比稀释，以倍比稀释的牛布鲁氏菌544A基因组为模板，取5μL进行PCR反应，同时设阴性对照。

PCR扩增条件为循环条件为：95℃预变性5min，94℃变性30sec、62℃退火30sec、72℃延伸30sec，扩增31个循环。

通过实验结果确定试剂盒的敏感性为0.16pg基因组(相当于11～16个细菌)(见图3)。

序列表

5′-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgcggtt-3′

Claims (4)

1、一种快速检测牛奶样品中布鲁氏菌的PCR试剂盒，其特征在于：

由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物对和阴性质控标准品；

正向引物BF：5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′

反向引物BR：5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′

标准阳性模板含有布鲁氏菌高度保守基因的287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组载体，该载体在大肠杆菌DH5α中增殖。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是：

PCR反应液：由正反向引物BF和BR，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是布鲁氏菌标准阳性模板所包含的BCSP31基因的核苷酸序列为：

5′-atccaggaaacccgactatgccattcgccgcctgatgcagggttttgggctgcgtttttaatcgtttcagtcggctctggcggcgcttgtcggcaagcgattgtattctttgggaaaatccagaataatggaatgcggtggttgacaatcggcctcaagcttcctatggttttcggcataatctatgcgggaagaggactggtattatgaaattcggaagcaaaatccgtcgcttggctgttgcggcggtggcgggcgcgattgcgttgggagcgagctttgcggtt-3′。

4.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

1)DNA提取液：包括如下组分：10×TE(0.1M Tris-HCl，0.1MEDTA pH 8.8)，5％NP-40和0.5％Tween-20；

2)PCR反应液：由正反向引物BF和BR，10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，dNTPs及无菌双蒸水组成；

3)标准阳性模板：含有布鲁氏菌高度保守基因BCSP31基因287个碱基的核苷酸片段构成的pMD-18重组质粒；

4)布鲁氏菌BCSP31基因特异性引物序列：

正向引物BF：5′-ATCCAGGAAACCCGACTATGCCA-3′；

反向引物BR：5′-AACCGCAAAGCTCGCTCCCAAC-3′；

5)阴性质控标准品：阴性质控标准品为无菌双蒸水。

Images