CN104862427A - 辣椒萎黄病病毒检测引物和探针 - Google Patents

辣椒萎黄病病毒检测引物和探针 Download PDF

Info

Publication number
CN104862427A
CN104862427A CN201510365563.5A CN201510365563A CN104862427A CN 104862427 A CN104862427 A CN 104862427A CN 201510365563 A CN201510365563 A CN 201510365563A CN 104862427 A CN104862427 A CN 104862427A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cacv
detection method
probe
research
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510365563.5A
Other languages
English (en)
Inventor
王利兵
彭梓
吴志鹏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201510365563.5A priority Critical patent/CN104862427A/zh
Publication of CN104862427A publication Critical patent/CN104862427A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于一种基于DNA体外扩增技术的植物病毒分子生物学研究和检测方法，涉及针对辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV）的检验检疫和分子生物学研究。本发明以CaCV非结构蛋白（Nonstructural Protein）基因的Ph segment S序列为靶序列，通过序列分析排除二级结构和非特异性序列区间，最终筛选出所需要的引物和探针。本发明的目的就是提供一种适用性广、特异性好、扩增效率高的引物和探针序列，以便对CaCV进行简易快速的田间检测或实验室检测。

Description

辣椒萎黄病病毒检测引物和探针
技术领域
本发明属于一种基于DNA体外扩增技术的植物病毒分子生物学检测方法，涉及针对布尼亚病毒科（Bunyaviridae）、番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus）的检验检疫和分子生物学研究领域。
背景技术
目前，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）技术（参见美国专利4,683,195、4,683,202、4,965,188）在分子生物学研究和检测技术领域的应用非常普遍，相关技术资料可以参考分子克隆-实验手册(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，New York) 等文献。
辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV）感染茄科植物，花生，蝴蝶兰（Phalaenopsis）等，是严重危害兰花养殖业的RNA植物病毒之一。CaCV最先由台湾学者发现感染蝴蝶兰，并很快被欧洲、澳大利亚等国列入兰花贸易待检病毒清单。CaCV最主要的病征是在受到侵害的植株叶面位置产生黄化轮斑，但它并不导致全株植物组织带毒。CaCV可以但不易通过机械接种、嫁接、组织切片等方式传播，这种病毒主要是通过蓟马以永续型方式传播。传播CaCV的蓟马种类尚未澄清。
CaCV属于番茄斑萎病毒属（Tospovirus）的第五血清群，或WSMoV血清组。病毒粒子为球状，直径80~110nm，粒体外层由一层脂质包裹。病毒基因组属于负单链RNA，由L RNA、M RNA、和S RNA三个片段RNA组成。L RNA 为大小约8.92kb的负链、含单个开放阅读框架（ORF），编码依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA Polymerase）。M RNA 和S RNA 均为双义RNA, 有2 个ORF，反向相连。M RNA 大小约4.82kb，编码非结构蛋白NSm（Nonstructural Protein NSm）和糖蛋白前体（Glycoprotein Precursor）。S RNA 大小约3.48kb，编码非结构蛋白NSs（Non-structural Protein NSs）和核衣壳蛋白N (Nucleocapsid Protein)。
国内目前对CaCV的检测主要以血清学方法和分子生物检测法为主。血清学方法包括免疫电镜法（Immuno-specific Electron Microscopy, ISEM）、免疫扩散法 (SDS-immunodiffusion Test)、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫斑点试验(Immunoblotting Test)、胶体金标记层析技术(Gold Immunochromatography Assay，GICA)等；分子生物检测法包括斑点杂交法（Dot Hybridization）、印痕杂交法（Southern Blot或Northern Blot）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等。上述方法中，基于对检测灵敏度和快速简单的要求，以RT-PCR最为适用并且在实际工作中应用最广。RT-PCR法具有极高的检测灵敏度，非常适合于样本的快速检测要求。目前常用于对名贵花卉品种的检查。
发明内容
发明目的：本发明的目的就是提供一种适用性广、特异性好、扩增效率高的引物和探针序列，以便对CaCV进行简易快速的田间检测或实验室检测。
本发明的原理如下：本发明以CaCV非结构蛋白（Nonstructural Protein）基因的Ph segment S序列（GenBank: KC953852.1）为靶序列，通过序列比对找出具有高度相似度的片段区间，通过序列分析排除二级结构和非特异性序列区间，最终筛选出的扩增片段位于靶序列第3041～3277碱基，产物大小为237bp。
本发明所涉及引物以及寡核苷酸探针的序列如下（自左至右按5’端到3’端方向排列）：
上游引物：GGT GCA AGG CCT TTA ATG CTG GA
下游引物：GAG GAT TGG ACT TTT AAG AGA A
寡核苷酸探针：A TGT GCT CTC AGG ATG A
上述寡核苷酸探针的5’端可以增加一个5～25mer的poly(dT)结构，以便更高效地将该寡核苷酸探针的5’端固定在载体表面并提高探针的杂交效率。
本发明所涉及的引物可根据需要在引物的5’端标记上生物素（Biotin）、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等标记物并通过杂交技术进行检测。
用本发明引物对CaCV进行检测时，病毒RNA样品制备方法可见有关文献。检测CaCVRT-PCR扩增产物的方法包括：（1）用琼脂糖凝胶电泳法分析扩增产物；（2）用与互补寡核苷酸探针杂交来进行检测，包括DNA微阵列、斑点印迹法和反向斑点印迹法。上述所用的具体实验方法均不属于本发明申请内容。
具体实施方式
具体实施例一
病毒RNA逆转录反应（10μL 的反应体系可用于逆转录1.0 ng～2.5 μg总RNA）：（1）将以下组分加入无核酸酶的微量离心管中：上下游引物各1 pmole，带CaCV样品总RNA 1μg， 10mM dNTP混合物（dATP，dGTP，dCTP和dTTP均为10mM，pH 7.0）0.5μl，加入灭菌蒸馏水至6μL；（2）混合物在65℃加热5分钟后，迅速置于冰上冷却，短暂离心后，加入以下组分： 5×第一链合成缓冲液2μL，0.1M DTT 1μL，40单位/μL RNasin 0.5μL，在离心管中轻轻将各种成分充分混合，并在37℃下孵育2分钟；（3）在室温下加入0.5μL（200单位/μL）逆转录酶，轻轻地吹打混匀，在37℃孵育50分钟。
具体实施例二
病毒RNA逆转产物的PCR扩增：
（1）在0.2mL PCR反应管中加入下列成分至终体积50μL：10μL cDNA，5μL 10×PCR缓冲液，1.5μL 50mM MgCl2，1μL 10mM dNTP混合物，上游引物（10μM）和下游引物（10μM）各1μL， Taq DNA聚合酶（5U/μL）0.5μl，加灭菌蒸馏水至总体积50μL；
（2）PCR反应条件：
94℃，2min
94℃，25s
60℃，25s                                                         30个循环
72℃，40s
72℃，5min。
具体实施例三
寡核苷酸探针在杂交膜上的固定：（1）将5’端带poly(dT)15结构的寡核苷酸探针溶于二甲基亚砜，探针终浓度为10～20μM；（2）把探针溶液点在杂交膜正表面；（3）把点有探针的杂交膜放入紫外交联设备中照射3～5min进行探针固定；（4）把杂交膜浸入蒸馏水洗涤，然后放入50℃烘箱干燥10min备用。
具体实施例四
杂交显色反应：（1）操作前先将杂交缓冲液（20mM Tris-HCl，50mM KCl， pH8.4）预热到室温，将杂交仪预热到42℃；（2）用PCR仪将PCR反应产物加热至99℃、7min然后快速冷却至4℃、3min，使DNA解链，然后置于冰上暂时存放；（3）取10μL经过解链处理的PCR反应产物与100μL经过预热的杂交缓冲液充分混合，将混合液加到固定了探针的杂交膜表面，用杂交盒密封后置于杂交仪于45℃杂交2hr，用去离子水充分洗涤；（4）将杂交膜浸入含1% BSA的磷酸缓冲液（pH 8.0），于37℃反应30分钟，用去离子水充分洗涤；（5）加入100μL链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物（终浓度=1μg/mL），于37℃反应30分钟，使链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物与结合在PCR产物5’端上的生物素相结合，用去离子水充分洗涤；（6）取100×NBT 100μL加入到10mL AP反应缓冲夜中，混匀后，再加入100×BCIP 100μl，混匀，即配成反应工作液，加入混合NBT/BCIP的显色反应液显色（一般约20～30min），完成显色后用去离子水洗涤后甩干。

Claims (3)

1.本发明涉及针对辣椒萎黄病病毒（Capsicum Chlorosis Virus，CaCV）的检验检疫和分子生物学研究或检测方法，该方法通过逆转录PCR扩增以及DNA杂交技术检测样品中CaCV基因，其特征在于：所进行的研究或检测方法涉及以下引物序列（自左至右按5’端到3’端方向排列）：
上游引物序列：GGT GCA AGG CCT TTA ATG CTG GA；
下游引物序列：GAG GAT TGG ACT TTT AAG AGA A。
2.根据权利要求1所述的研究或检测方法，其特征在于：该研究或检测方法涉及以下寡核苷酸探针序列（自左至右按5’端到3’端方向排列）：
寡核苷酸探针序列：A TGT GCT CTC AGG ATG A。
3.根据权利要求1、2所述的研究或检测方法，其特征在于：该研究或检测方法所涉及的寡核苷酸探针序列的5’端有一个5～25mer的poly(dT)结构。
CN201510365563.5A 2015-06-29 2015-06-29 辣椒萎黄病病毒检测引物和探针 Pending CN104862427A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510365563.5A CN104862427A (zh) 2015-06-29 2015-06-29 辣椒萎黄病病毒检测引物和探针

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510365563.5A CN104862427A (zh) 2015-06-29 2015-06-29 辣椒萎黄病病毒检测引物和探针

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104862427A true CN104862427A (zh) 2015-08-26

Family

ID=53908595

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510365563.5A Pending CN104862427A (zh) 2015-06-29 2015-06-29 辣椒萎黄病病毒检测引物和探针

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104862427A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088150A (zh) * 2011-10-28 2013-05-08 台湾糖业股份有限公司 同时检测四种病毒的引物、引物对、方法及试剂盒
TW201404884A (zh) * 2012-07-23 2014-02-01 Univ Nat Cheng Kung 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103088150A (zh) * 2011-10-28 2013-05-08 台湾糖业股份有限公司 同时检测四种病毒的引物、引物对、方法及试剂盒
TW201404884A (zh) * 2012-07-23 2014-02-01 Univ Nat Cheng Kung 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘黎卿 等: "蝴蝶兰病毒病研究进展及防治对策综述", 《安徽农学通报》 *
李瑶: "《基因芯片数据分析与处理》", 31 July 2006 *
杨英华 等: "番茄斑萎病毒属6种病毒的多重RT-PCR检测", 《植物检疫》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108192996B (zh) 一种用于甲型流感病毒检测及h1和h3分型的多重rt-rpa引物组合及其应用
CN110551853B (zh) 一种快速区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的三重pcr检测引物及试剂盒
CN101611155B (zh) 虾病原体诊断用序列
CN105018646B (zh) 一种检测牛流行热病毒的引物、探针及试剂盒
CN104513865B (zh) 反转录pcr检测基孔肯雅病毒的试剂盒及其检测方法
CN110669870B (zh) 一种帕利亚姆血清群病毒血清型的实时荧光定量rt-pcr检测引物、探针及检测试剂盒
CN110982935A (zh) 一种采用微流控芯片技术检测猪德尔塔冠状病毒的lamp引物组合物及其试剂盒
CN105349697B (zh) 同时鉴别8种感染人不同亚型禽流感病毒HA基因的GeXP快速检测引物组、试剂盒及其应用
CN107164566B (zh) 一种检测百合斑驳病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN113604612A (zh) 阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
CN106947834B (zh) 一种检测六种鸭易感病毒的多重pcr方法
CN104862421B (zh) 鉴定狂犬病、犬瘟热、传染性肝炎、细小病毒病、钩端螺旋体病和弓形体病病原的成套产品
CN108977578A (zh) 检测h7n9禽流感病毒的试剂盒及其方法
CN111518954A (zh) H5和n8亚型禽流感病毒双重纳米pcr检测的引物组、试剂盒及方法
CN117265186A (zh) 一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法
CN107287352A (zh) 鸭肠炎病毒和鸭肝炎病毒快速检测的探针引物组及其方法
CN110982937A (zh) 一种采用微流控芯片技术检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的lamp引物组合物及其试剂盒
CN107475462B (zh) 一种鉴别常见血清型鸡包涵体肝炎感染的试剂盒及其应用
CN107586886B (zh) 一种快速检测猪腺病毒的试剂以及方法
CN110184386A (zh) 用于检测anrsv的rt-lamp检测引物及其应用、检测试剂和检测方法
KR101236197B1 (ko) 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단
CN112941240B (zh) 检测鹅星状病毒和鹅嵌杯病毒的引物对、试剂盒及方法
Koekemoer et al. African horsesickness virus serotyping and identification of multiple co-infecting serotypes with a single genome segment 2 RT-PCR amplification and reverse line blot hybridization
CN104862427A (zh) 辣椒萎黄病病毒检测引物和探针
CN105063038B (zh) 一种检测葡萄卷叶伴随病毒3号的rpa引物及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150826

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication