BR112019007450A2 - meganucleases modificadas específicas para sequências de reconhecimento no genoma do vírus da hepatite b - Google Patents

meganucleases modificadas específicas para sequências de reconhecimento no genoma do vírus da hepatite b Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a meganucleases modificadas que reconhecem e clivam uma sequência de reconhecimento dentro de uma estrutura de leitura aberta (ORF) do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B (VHB). A presente invenção também refere-se a métodos de uso de tais meganucleases modificadas em uma composição farmacêutica e em métodos para tratamento ou redução dos sintomas da infecção por VHB, ou tratamento de carcinoma hepatocelular (HCC). Além disso, a invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo proteínas de meganuclease modificadas, ácidos nucleicos codificando meganucleases modificadas, e o uso de tais composições para o tratamento de infecções por VHB ou HCC.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ME- GANUCLEASES MODIFICADAS ESPECÍFICAS PARA SEQUÊN- CIAS DE RECONHECIMENTO NO GENOMA DO VÍRUS DA HEPA- TITE B".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se aos campos de oncologia, biologia molecular e tecnologia de ácido nucleico recombinante. Em particular, a invenção refere-se às meganucleases modificadas possuindo espe- cificidade para uma sequência de reconhecimento dentro de pelo me- nos dois genótipos do genoma do vírus da Hepatite B. Tais meganu- cleases modificadas são úteis em métodos para o tratamento de infec- ções pelo vírus da hepatite B e carcinoma hepatocelular causado pelo vírus da hepatite B.
REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA SUBMETIDA COMO UM ARQUIVO DE TEXTO POR MEIO DE EFS-WEB
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi submetida em formato ASCII por meio de EFS-Web e é pelo pre- sente incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia de ASCII, criada em 13 de outubro de 2017, é nomeada P109070018WO00-SEQ-MJT.txt, e tem s 169.011 bytes em tamanho.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] O vírus da hepatite B (VHB) é um grande problema de saú- de em todo o mundo e mais de 350 milhões de pessoas são portado- ras crônicas. A infecção por VHB é uma doença infecciosa grave e comum do fígado. A infecção crônica está associada a um risco au- mentado de desenvolver doenças hepáticas graves, incluindo cirrose hepática e carcinoma hepatocelular (CHC), uma das formas mais co- muns de câncer humano. O risco estimado de CHC em portadores crônicos de VHB é aproximadamente 100 vezes maior do que em indi- víduos não infectados. Cerca de um terço da população mundial foi infectada em algum momento de suas vidas, incluindo entre 240 mi- lhões e 350 milhões que sofrem de infecções crônicas. Mais de
750.000 pessoas morrem de hepatite B por ano. Cerca de 300.000 destes são devidos ao câncer de fígado. Atualmente, os medicamen- tos anti-VHB disponíveis têm limitações. Por exemplo, a administração de interferon alfa está associada às reações adversas graves. Análo- gos nucleosídicos são virostáticos e requerem administração a longo prazo.
[004] O genoma do VHB exibe variabilidade genética com uma taxa estimada de 1,4-3,2x10-5 substituições de nucleotídeo por sítio por ano. Um grande número de variantes virais surgem durante a re- plicação como resultado da incorporação de nucleótideos na ausência de qualquer capacidade de leitura de prova pela polimerase viral. Essa variabilidade resultou em subtipos bem reconhecidos do vírus. O HVB foi classificado em genótipos bem definidos com base em uma diver- gência intergrupos de 8% ou mais na sequência genômica completa, cada um com uma distribuição geográfica distinta. Por exemplo, o ge- nótipo A é difundido na África Subsaariana, no norte da Europa e na África Ocidental; os genótipos B e C são comuns na Ásia; o genótipo C é observado principalmente no sudeste da Ásia; o genótipo D é domi- nante na África, Europa, países do Mediterrâneo e Índia; o genótipo G é relatado na França, na Alemanha e nos Estados Unidos; e o genóti- po H é comumente encontrado na América Central e na América do Sul. O genótipo I foi recentemente relatado no Vietnã e no Laos. O mais novo genótipo do VHB, o genótipo J, foi identificado nas ilhas Ryukyu, no Japão.
[005] VHB é um vírus de DNA envelopado que pertence à família Hepadnaviridae. Ele contém um genoma de DNA relaxado, de filamen- to duplo (DS), parcialmente circular que se replica por transcrição re- versa de um RNA intermediário, o RNA pré-genômico (pgRNA). O ge-
noma circular do DNA do VHB é incomum porque o DNA não é total- mente de filamento duplo. Uma das extremidades do filamento de ta- manho natural está ligada ao DNA polimerase viral. O genoma tem aproximadamente 3020 a 3320 nucleotídeos de comprimento (para o filamento de tamanho natural) e 1700 a 2800 nucleotídeos de compri- mento (para o filamento de tamanho curto). O sentido negativo (não codificante) é complementar ao mRNA viral.
[006] Existem quatro genes conhecidos codificados pelo genoma, referidos como C, X, P e S. A proteína do núcleo é codificada pelo ge- ne C (HBcAg), e seu códon de início é precedido por um códon de iní- cio AUG em estrutura a montante a partir do qual a proteína pré- núcleo é produzida. O HBeAg é produzido por processamento proteolí- tico da proteína pré-núcleo. O DNA polimerase é codificado pelos có- digos do gene P. Gene S para o antígeno de superfície (HBsAg). O gene HBsAg é uma estrutura longa de leitura aberta, porém contém três códons de "início" de estrutura (ATG) que dividem o gene em três seções: pré-S1, pré-S2, e S. Devido aos códons de início múltiplo, são produzidos polipeptídeos de três tamanhos diferentes chamados Grande (a ordem da superfície para a parte interna: pré-S1/pré-S2/S), Médios (pré-S2/S) e Pequenos (S). A função da proteína codificada pelo gene X não é totalmente compreendida, porém está associada ao desenvolvimento de câncer de fígado. Ela estimula genes que promo- vem o crescimento celular e inativa a molécula reguladora de cresci- mento.
[007] O DNA viral é encontrado no núcleo logo após a infecção da célula. O DNA de filamento parcialmente duplo é tornado filamento totalmente duplo por conclusão do filamento de sentido (+) e remoção de uma molécula de proteína do filamento de sentido (-) e uma curta sequência de RNA do filamento de sentido (+). Bases de não codifica- ção são removidas das extremidades do filamento de sentido (-) e as extremidades são reunidas.
[008] O ciclo de vida do VHB começa quando o vírus se liga à célula hospedeira e é internalizado. Estudos recentes demonstraram que o polipeptídeo cotransportador de taurocolato de sódio (NTCP) é um receptor funcional na infecção pelo VHB. O DNA circular viral rela- xado (rcDNA) é liberado para o núcleo, onde ele é reparado para for- mar um DNA circular covalentemente fechado (cccDNA). O cccDNA epissômico serve como modelo para a transcrição do RNA pré- genômico (pgRNA) e dos outros mRNAs virais pela RNA polimerase II do hospedeiro. As transcrições são em seguida exportadas para o ci- toplasma, onde ocorre a translação das proteínas virais. A transcrip- tase reversa (RT) se liga ao pgRNA e desencadeia a montagem das proteínas do núcleo em nucleocapsídeos imaturos contendo RNA. Os nucleocapsídeos imaturos passam então por um processo de matura- ção pelo qual o pgRNA é revertido transcrito por RT para formar o rcDNA maduro. Uma característica única da transcrição reversa do hepadnavírus é a iniciação da RT preparade da síntese de DNA de cadeia negativa, o que induz à ligação covalente da RT à extremidade 5 'do DNA de cadeia negativa.
[009] Os nucleocapsídeos maduros, contendo rcDNA são em se- guida envelopados pelas proteínas da superfície viral e secretados como vírions (via de secreção) ou, alternativamente, são reciclados de volta ao núcleo para amplificar ainda mais a mistura de cccDNA (via de reciclagem). A persistência de cccDNA nos hepatócitos desempe- nha um papel fundamental na persistência viral, na reativação da repli- cação viral após a interrupção da terapia antiviral e resistência à tera- pia.
[0010] As endonucleases de origem são um grupo de nucleases de ocorrência natural que reconhecem locais de clivagem de 15-40 pares de bases comumente encontrados nos genomas de plantas e fungos. Elas são frequentemente associadas a elementos parasíticos do DNA, como íntrons de autoligação do grupo 1 e inteínas. Elas natu- ralmente promovem a recombinação homóloga ou inserção de gene em localizações específicas no genoma hospedeiro produzindo uma ruptura de filamento duplo no cromossoma, que recruta a maquinaria de reparo de DNA celular (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49- 95). Endonucleases de origem são comumente agrupadas em quatro famílias: a família LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2), a família GIY-YIG, a família caixa His-Cys e a família HNH. Estas famílias são caracteriza- das por motifs estruturais, que afetam a atividade catalítica e sequên- cia de reconhecimento. Por exemplo, os membros da família LAGLI- DADG (SEQ ID NO: 2) são caracterizados por terem uma ou duas có- pias do motif LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) (veja, Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774). As endonucleases de origem LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) com uma única cópia do motif LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) formam homodímeros, enquanto os membros com duas cópias do motif LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) são encontrados como monômeros. Métodos para produção de endonu- cleases são conhecidos na técnica.
[0011] I-CreI (SEQ ID NO: 1) é um membro da família LAGLI- DADG (SEQ ID NO: 2) de endonucleases de origem que reconhece e corta uma sequência de reconhecimento de 22 pares de bases no cromossomo cloroplasto das algas Chlamydomonas reinhardtii. Técni- cas de seleção genética foram usadas para modificar a preferência do local de clivagem do tipo selvagem I-CreI (Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chames et al. (2005), Nucleic Acids Res. 33: e178; Seligman et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9, Arnould et al. (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58). Métodos para racionalmente designar as endonucleases de origem mono-LAGLIDADG (SEQ ID NO: 2) foram descritos que são capazes de redesenhar de forma abrangente o I-CreI e outras endonucleases de origem para alvejar sítios de DNA amplamente divergentes, incluindo sítios em genomas de mamíferos, leveduras, plantas, bactérias e virais (WO 2007/047859).
[0012] Como descrito pela primeira vez no documento WO 2009/059195, I-CreI e os seus derivados criados são normalmente di- méricos, porém podem ser fundidos em um polipepídeo simples utili- zando um polipeptídeo simples curto que une o terminal C de uma primeira subunidade com o terminal N de uma segunda subunidade (Li et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37: 1650-62; Grizot et al. (2009), Nu- cleic Acids Res. 37: 5405-19). Assim, uma meganuclease funcional de "cadeia simples" pode ser expressa a partir de uma única transcrição.
[0013] O uso de meganucleases modificadas para o tratamento de infecções por VHB foi sugerido. Por exemplo, o WO2010/136841 su- gere o uso de meganucleases modificadas para clivagem do genoma de vírus não genomicamente integrante. Tais meganucleases incluem variantes de I-CreI. O pedido ‘841 descreve diversas sequências de reconhecimento de meganuclease de 22 pares de base presentes no genoma de uma cepa de VHB. Entretanto, o pedido ‘841 não identifica quaisquer sequências de reconhecimento que estão presentes dentro de múltiplos genótipos do genoma de VHB.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0014] A presente invenção depende, em parte, do desenvolvi- mento de endonucleases de corte raro, específicas de sítio que são criadas para reconhecer as sequências de DNA dentro pelo menos one estrutura de leitura aberta (ORF) do genoma de VHB e dentro de pelo menos dois genótipos diferentes do genoma do VHB. Os invento- res identificaram sequências de reconhecimento específicas conser- vadas através de genótipos que podem ser alvejadas por meganu- cleases recombinantes a fim de inativar os múltiplos genótipos do ví-
rus.
[0015] A presente invenção melhora a técnica anterior em vários aspectos. Os inventores descobriram surpreendentemente que as se- quências de reconhecimento podem ser identificadas dentro de uma ORF de vários genótipos do genoma do VHB. Direcionando diversos genótipo do vírus, uma composição farmacêutica simples pode ser preparada que pode ser usada contra diferentes genótipos presentes em regiões localizadas do mundo. Desse modo, os métodos e compo- sições aqui descritos são úteis no tratamento ou redução da prolifera- ção de VHB em indivíduos infectados em todo o mundo. A supressão ou erradicação da replicação do VHB no fígado leva à melhora da pa- tologia hepática e diminui a progressão para cirrose hepática e carci- noma hepatocelular. Consequentemente, a presente invenção preen- che uma necessidade na técnica de métodos adicionais de terapia de gene para infecções por VHB. Além disso, a invenção fornece um mé- todo de tratamento para o carcinoma hepatocelular, fornecendo um meio de direcionar a inserção por recombinação homóloga de um "ge- ne suicida" em um genoma do VHB em uma célula HCC. O gene sui- cida pode codificar uma toxina ou proteína pró-apoptótica que mata diretamente a célula cancerosa, ou um antígeno de superfície celular ou um polipeptídeo antigênico do MHC Classe I que direciona o pró- prio sistema imunológico do indivíduo para matar a célula cancerosa.
[0016] A presente invenção fornece meganucleases modificadas úteis para o tratamento de infecção pelo vírus da Hepatite B (VHB). As meganucleases modificadas da invenção reconhecem e clivam uma sequência de reconhecimento dentro de uma estrutura de leitura aber- ta (ORF) do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepati- te B. A clivagem em tal sequência de reconhecimento por uma me- ganuclease modificada descrita aqui pode romper a expressão de uma ou mais proteínas virais devido à ligação de extremidade não homólo-
ga (NHEJ) no sítio de clivagem. NHEJ pode resultar em inserções, de- leções, ou resultar em uma mutação frameshift que pode interferir com a expressão de gene. Consequentemente, interrompendo a expressão de gene normal, a infecção e proliferação de VHB podem ser reduzi- das ou eliminadas de acordo com os métodos descritos aqui. A pre- sente invenção também fornece composições farmacêuticas e méto- dos para o tratamento de VHB que utilizam uma meganuclease modifi- cada tendo especificidade para uma sequência de reconhecimento po- sicionada dentro de uma ORF do genoma de pelo menos dois genóti- pos do vírus da Hepatite B. A presente invenção também fornece mé- todos de liberação das meganucleases modificadas descrita aqui a um indivíduo infectado com VHB a fim de reduzir o nível de VHB e/ou re- duzir os sintomas associados com uma infecção por VHB.
[0017] Desse modo, em um aspecto, a invenção fornece uma me- ganuclease modificada que reconhece e cliva uma sequência de reco- nhecimento dentro de uma estrutura de leitura aberta (ORF) do geno- ma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B. A meganu- clease modificada compreende uma primeira subunidade e uma se- gunda subunidade, em que a primeira subunidade se liga a um primei- ro meio sítio de reconhecimento da sequência de reconhecimento e compreende uma primeira região hipervariável (HVR1), e em que a segunda subunidade se liga a um segundo meio sítio de reconheci- mento da sequência de reconhecimento e compreende uma segunda região hipervariável (HVR2).
[0018] Em algumas modalidades, a sequência de reconhecimento é encontrada dentro de uma ORF de pelo menos 3, pelo menos 4, pe- lo menos 5, ou pelo menos 6 genótipos do vírus da Hepatite B. Em uma tal modalidade a sequência de reconhecimento está dentro de uma ORF de genótipo A (SEQ ID NO: 3) do vírus da Hepatite B. Tal modalidade inclui isolados de vírus da Hepatite B de genótipo A que diferem de SEQ ID NO: 3, porém compreendem uma ou mais sequên- cias de reconhecimento de meganuclease de VHB descritas aqui. Em outras tais modalidades, a sequência de reconhecimento está dentro de uma ORF de genótipo A e um ou mais dos genótipos B, C, D, E, F, e G (SEQ ID NOs: 4-9, respectivamente). Tais modalidades incluem isolados de vírus da Hepatite B de genótipo A, B, C, D, E, F, e G que diferem de SEQ ID NOs: 3-9, porém compreendem uma ou mais se- quências de reconhecimento de meganuclease de VHB descritas aqui.
[0019] Em algumas modalidades, a sequência de reconhecimento está dentro pelo menos uma ORF codificando uma proteína selecio- nada do grupo que consiste em: a proteína polimerase (P), a proteína de superfície grande (preS1/preS2/S), a proteína de superfície média (preS2/S), e a proteína de superfície pequena (S). Em algumas moda- lidades, a sequência de reconhecimento pode compreender SEQ ID NO: 10 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 1-2), SEQ ID NO: 12 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 5-6), SEQ ID NO: 14 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 7-8), ou SEQ ID NO: 16 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 11-12).
[0020] Em algumas modalidades, em que a sequência de reco- nhecimento compreende SEQ ID NO: 10, a região de HVR1 pode compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identida- de de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resíduos 24-79 de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou resíduos 215-270 de SEQ ID NO: 20 ou 21. Em tais modalidades, a região de HVR1 pode com- preender resíduos correspondendo aos resíduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de SEQ ID NO: 18 ou 19, ou resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de SEQ ID NO: 20 ou
21. Em modalidades particulares, a região de HVR1 pode compreen-
der resíduos 24-79 de SEQ ID NO: 18 ou 19, ou resíduos 215-270 de SEQ ID NO: 20 ou 21.
[0021] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 10, a região de HVR2 pode compre- ender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resí- duos 215-270 de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou resíduos 24-79 de SEQ ID NO: 20 ou 21. Em tais modalidades, a região de HVR2 pode compre- ender resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de SEQ ID NO: 18 ou 19, ou resíduos correspondendo aos resíduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de SEQ ID NO: 20 ou 21. Em modalidades particulares, a região de HVR2 pode compreender resí- duos 215-270 de SEQ ID NO: 18 ou 19, ou resíduos 24-79 de SEQ ID NO: 20 ou 21.
[0022] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 10, a primeira subunidade pode com- preender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resíduos 7-153 de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou resíduos 198-344 de SEQ ID NO: 20 ou 21, e a segunda subunidade pode compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identida- de de sequência aos resíduos 198-344 de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou resíduos 7-153 de SEQ ID NO: 20 ou 21. Em algumas modalidades, a primeira subunidade pode compreender resíduos 7-153 de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou resíduos 198-344 de SEQ ID NO: 20 ou 21. Igual- mente, em algumas modalidades, a segunda subunidade pode com- preender resíduos 198-344 de SEQ ID NO: 18 ou 19 ou resíduos 7-
153 de SEQ ID NO: 20 ou 21.
[0023] Em certas tais modalidades, em que a sequência de reco- nhecimento compreende SEQ ID NO: 10, a meganuclease modificada pode compreender um ligante, em que o ligante liga covalentemente a primeira subunidade e a segunda subunidade. Em modalidades parti- culares, a meganuclease modificada pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-21.
[0024] Em outras modalidades, em que a sequência de reconhe- cimento compreende SEQ ID NO: 12, a região de HVR1 pode com- preender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resíduos 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resí- duos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28. Em tais modali- dades, a região de HVR1 pode compreender resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24, ou re- síduos correspondendo aos resíduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28. Em modalidades particulares, a região de HVR1 pode compreender resí- duos 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28.
[0025] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 12, a região de HVR2 pode compre- ender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resí- duos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 215- 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28. Em tais modalidades, a região de HVR2 pode compreender resíduos correspondendo aos re-
síduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24, ou resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28. Em modalidades particulares, a região de HVR2 pode compreender resí- duos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 215- 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28.
[0026] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 12, a primeira subunidade pode com- preender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25- 28, e a segunda subunidade pode compreender sequência de aminoá- cido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resíduos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28. Em algumas modalidades, a primeira subunidade pode compreender resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28. Igualmente, em algumas modalidades, a segunda subunidade pode compreender resíduos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-24 ou resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25-28.
[0027] Em certas tais modalidades, em que a sequência de reco- nhecimento compreende SEQ ID NO: 12, a meganuclease modificada pode compreender um ligante, em que o ligante liga covalentemente a primeira subunidade e a segunda subunidade. Em modalidades parti- culares, a meganuclease modificada pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-28.
[0028] Em algumas modalidades, em que a sequência de reco- nhecimento compreende SEQ ID NO: 14, a região de HVR1 pode compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identida- de de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resíduos 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32. Em tais modalidades, a região de HVR1 pode compreender resíduos corres- pondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-
32. Em modalidades particulares, a região de HVR1 pode compreen- der resíduos 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32.
[0029] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 14, a região de HVR2 pode compre- ender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resí- duos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32. Em tais modali- dades, a região de HVR2 pode compreender resíduos correspondendo aos resíduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32. Em modalidades particula- res, a região de HVR2 pode compreender resíduos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32.
[0030] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 14, a primeira subunidade pode com- preender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32, e a segunda subunidade pode compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resí-
duos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32. Em algumas modalidades, a primeira subunidade pode compreender resíduos 198- 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32. Igualmente, em algu- mas modalidades, a segunda subunidade pode compreender resíduos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32.
[0031] Em certas tais modalidades, em que a sequência de reco- nhecimento compreende SEQ ID NO: 14, a meganuclease modificada pode compreender um ligante, em que o ligante liga covalentemente a primeira subunidade e a segunda subunidade. Em modalidades parti- culares, a meganuclease modificada pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32.
[0032] Em algumas modalidades, em que a sequência de reco- nhecimento compreende SEQ ID NO: 16, a região de HVR1 pode compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identida- de de sequência aos resíduos 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39. Em tais modalidades, a região de HVR1 pode compreen- der resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39. Em modalidades particulares, a região de HVR1 pode compreender resíduos 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39.
[0033] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 16, a região de HVR2 pode compre- ender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resíduos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-
39. Em tais modalidades, a região de HVR2 pode compreender resí- duos correspondendo aos resíduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39. Em modalidades particulares, a região de HVR2 pode compreender resí- duos 24-79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39.
[0034] Em tais modalidades, em que a sequência de reconheci- mento compreende SEQ ID NO: 16, a primeira subunidade pode com- preender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39, e a segunda subunidade pode compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identidade de sequência aos resí- duos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39. Em algumas modalidades, a primeira subunidade pode compreender resíduos 198- 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39. Igualmente, em algu- mas modalidades, a segunda subunidade pode compreender resíduos 7-153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39.
[0035] Em certas modalidades, a meganuclease modificada pode compreender um ligante, em que o ligante liga covalentemente a pri- meira subunidade e a segunda subunidade. Em modalidades particula- res, a meganuclease modificada pode compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39.
[0036] Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de ácido nucleico qualquer meganuclease modificada descrita aqui. Em uma modalidade particu- lar, o polinucleotídeo isolado pode ser um mRNA.
[0037] Em outras modalidades, o mRNA pode ser um mRNA poli- cistônico codificando uma ou mais meganucleases modificadas descri- tas aqui. Em certas modalidades, mRNA policistrônico da invenção pode ser, sem limitação, um mRNA bicistrônico codificando duas me- ganucleases modificadas descritas aqui, um mRNA tricistrônico codifi- cando três meganucleases modificadas descritas aqui, ou um mRNA quadcistrônico codificando quadro meganucleases modificadas descri- tas aqui. Em tais modalidades, em que duas ou mais meganucleases modificadas são codificadas por um mRNA policistrônico, cada me- ganuclease modificada codificada tem especificidade para uma dife- rente sequência de reconhecimento de VHB. Além disso, em tais mo- dalidades, um mRNA policistrônico da invenção pode codificar qual- quer combinação de meganucleases modificadas descritas aqui. Em uma modalidade particular, um mRNA policistrônico pode codificar uma meganuclease de VHB 1-2, uma meganuclease de VHB 5-6, uma meganuclease de VHB 7-8, e uma meganuclease de VHB 11-12. Em outra modalidade particular, um mRNA policistrônico pode ser um mRNA bicistrônico codificando uma meganuclease de VHB 5-6 e uma meganuclease de VHB 11-12.
[0038] Em outras modalidades, um mRNA policistrônico da inven- ção pode codificar uma ou mais meganucleases modificadas descritas aqui e uma ou mais proteínas adicionais que induzem um efeito tera- peuticamente benéfico em uma célula infectada por VHB e/ou indiví- duo infectado por VHB.
[0039] Em outro aspecto, a invenção fornece uma construção de DNA recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer meganuclease modificada da invenção. Em al- gumas modalidades, a construção de DNA recombinante compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui. Em outras modalidades, a construção de DNA recombinante compreende dois ou mais cassetes, em que cada cassete compreende um promo- tor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganuclease modificada tem especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui. Em modalidades particulares, a construção de
DNA recombinante pode compreender dois cassetes, três cassetes, quatro cassetes, ou mais.
[0040] Em outras modalidades, a construção de DNA recombinan- te compreende um cassete compreendendo um promotor e uma se- quência de ácido nucleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da sequência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrônico descrito aqui em uma célula alvo.
[0041] Em uma modalidade particular, a construção de DNA re- combinante codifica um vetor viral compreendendo uma sequência de ácido nucleico qualquer meganuclease modificada descrita aqui. Em tal modalidade, o vetor viral pode ser um vetor de retrovírus, um lenti- vírus, um adenovírus, ou um vírus adeno-associado (AAV). Em uma modalidade particular, o vetor viral pode ser um vetor de AVV recom- binante.
[0042] Em algumas modalidades, o vetor viral compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nu- cleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui. Em outras modalidades, o vetor viral compreende dois ou mais cassetes, em que cada cassete compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganuclease modificada tem especificidade pa- ra uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui.
[0043] Em outras modalidades, o vetor viral compreende one cas- sette compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da sequência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrônico descri- tas aqui em uma célula alvo.
[0044] Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor viral com- preendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica qualquer meganuclease modificada da invenção. Em algumas modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de retrovírus, um lentivírus, um adenoví- rus, ou um vírus adeno-associado (AAV). Em uma modalidade particu- lar, o vetor viral pode ser um vetor de AVV recombinante. Em algumas modalidades, o vetor viral compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma me- ganuclease modificada descrita aqui. Em outras modalidades, o vetor viral compreende dois ou mais cassetes, em que cada cassete com- preende um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganu- clease modificada tem especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui.
[0045] Em outras modalidades, o vetor viral compreende one cas- sette compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da sequência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrônico descri- tas aqui em uma célula alvo.
[0046] Em outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica para o tratamento de um indivíduo tendo vírus da hepati- te B (VHB) ou carcinoma hepatocelular causado por VHB, a composi- ção farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente acei- tável e: (a) um ácido nucleico codificando uma meganuclease modifi- cada descrita aqui; ou (b) uma proteína de meganuclease modificada descrita aqui; em que a meganuclease modificada tem especificidade para uma sequência de reconhecimento dentro de uma estrutura de leitura aberta (ORF) do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B. Em algumas modalidades, a sequência de reconheci- mento está dentro de uma ORF de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 genótipos do vírus da Hepatite B. Em uma tal modalidade a sequência de reconhecimento está dentro de uma ORF de genótipo de VHB A (SEQ ID NO: 3), ou isolados do mesmo que compreendem a sequência de reconhecimento, e pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 outros genótipos de VHB. Em várias modalidades, genótipos de VHB adicionais podem incluir genótipo B, C, D, E, F, e/ou G (SEQ ID NOs: 4-9, respectivamente), ou isolados do mesmo que compreen- dem uma ou mais sequências de reconhecimento de VHB descritas aqui.
[0047] Em algumas modalidades, a meganuclease modificada da composição farmacêutica, ou codificada por uma sequência de ácido nucleico da composição farmacêutica, tem especificidade para uma sequência de reconhecimento dentro de pelo menos uma ORF codifi- cando uma proteína selecionada do grupo que consiste: na proteína polimerase (P), na proteína de superfície grande (preS1/preS2/S), na proteína de superfície média (preS2/S), e na proteína de superfície pequena (S). Em algumas modalidades, a sequência de reconheci- mento pode compreender SEQ ID NO: 10, 12, 14, ou 16.
[0048] Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico da composição farmacêutica codificando uma meganuclease modificada descrita aqui pode ser um mRNA descrito aqui. Em tais modalidades, o mRNA pode ser um mRNA policistrônico descrito aqui, de modo que duas ou mais meganucleases modificadas descritas aqui sejam ex- pressas na célula alvo in vivo.
[0049] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compre- ende uma construção de DNA recombinante descrita aqui compreen- dendo a sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui. Em tais modalidades, a construção de DNA recombinante compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease mo- dificada da invenção. Em outras modalidades, a construção de DNA recombinante da composição farmacêutica compreende dois ou mais cassetes, em que cada cassete compreende um promotor e uma se- quência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganuclease modificada tem especifi- cidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB des- crita aqui. Em modalidades particulares, a construção de DNA recom- binante da composição farmacêutica pode compreender dois cassetes, três cassetes, quatro cassetes, ou mais.
[0050] Em outras modalidades, a construção de DNA recombinan- te da composição farmacêutica compreende um cassete compreen- dendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da sequência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrônico descritas aqui na célu- la alvo in vivo, de modo que duas ou mais meganucleases modificadas descritas aqui sejam expressas na célula alvo.
[0051] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compre- ende um vetor viral compreendendo a sequência de ácido nucleico co- dificando uma meganuclease modificada descrita aqui. Em uma tal modalidade, o vetor viral pode ser um vetor de retrovírus, um lentiví- rus, um adenovírus, ou um AAV. Em uma modalidade particular, o ve- tor viral pode ser um vetor de AVV recombinante.
[0052] Em tais modalidades, o vetor viral compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico codi- ficando uma meganuclease modificada descrita aqui. Em outras moda- lidades, o vetor viral compreende dois ou mais cassetes, em que cada cassete compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganuclease modificada tem especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui.
[0053] Em outras tais modalidades, o vetor viral compreende one cassette compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nu-
cleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da se- quência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrô- nico descritas aqui na célula alvo in vivo, de modo que duas ou mais meganucleases modificadas descritas aqui are expressas na célula alvo.
[0054] Em uma tal modalidade, a composição farmacêutica pode compreender uma meganuclease modificada descrita aqui (ou um áci- do nucleico codificando a mesma) que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 10. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada po- de compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-21.
[0055] Em outra modalidade, a composição farmacêutica pode compreender uma meganuclease modificada descrita aqui (ou um áci- do nucleico codificando a mesma) que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 12. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada po- de compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-28.
[0056] Em outra modalidade, a composição farmacêutica pode compreender uma meganuclease modificada descrita aqui (ou um áci- do nucleico codificando a mesma) que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 14. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada po- de compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32.
[0057] Em outra modalidade, a composição farmacêutica pode compreender uma meganuclease modificada descrita aqui (ou um áci- do nucleico codificando a mesma) que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 16. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada po- de compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39.
[0058] Em várias modalidades, a composição farmacêutica pode compreender duas ou mais proteínas de meganuclease modificadas descritas aqui, em que as meganucleases modificadas têm especifici- dade para diferentes sequências de reconhecimento de VHB descritas aqui. Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode com- preender dois ou mais ácidos nucleicos codificando as meganucleases modificadas descritas aqui, em que as meganucleases modificadas têm especificidade para diferentes sequências de reconhecimento de VHB descritas aqui. Em tais modalidades, os dois ou mais ácidos nu- cleicos podem ser compreendidos de mRNAs descritos aqui, constru- ções de DNA recombinante descritas aqui, e/ou viral vectors descritas aqui. Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode com- preender uma ou mais proteínas de meganuclease modificadas descri- tas aqui e um ou mais ácidos nucleicos codificando uma meganu- clease modificada descrita aqui (isto é, mRNA, construção de DNA re- combinante, ou vetor viral), em que as meganucleases modificadas e meganucleases modificadas codificadas têm especificidade para dife- rentes sequências de reconhecimento de VHB descritas aqui.
[0059] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode compreender uma combinação de proteínas de meganuclease modifi- cadas descritas aqui, uma combinação de ácidos nucleicos codifican- do meganucleases modificadas descritas aqui (isto é, mRNAs, cons- truções de DNA recombinante, vetores virais), ou uma combinação de proteínas de meganuclease modificadas e ácidos nucleicos codifican- do proteínas de meganuclease modificadas, em que a combinação de meganucleases modificadas e/ou meganucleases modificadas codifi- cadas na composição farmacêutica pode reconhecer e clivar uma se- quência de reconhecimento em cada um dos genótipos de VHB A, B, C, D, E, F, e G (SEQ ID NOs: 3-9), e isolados de cada genótipo que compreendem sequências de reconhecimento de VHB descritas aqui.
[0060] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica po-
de compreender uma ou mais mRNAs descritas aqui encapsuladas dentro de nanopartículas de lipídio. Em modalidades particulares, as nanopartículas de lipídio da composição farmacêutica podem compre- ender duas ou mais mRNAs descritas aqui, cada qual codificando uma meganuclease modificada da invenção tendo especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui. Nas modalidades específicas, as nanopartículas de lipídio podem compre- ender dois, três, ou quatro mRNAs descritos aqui, cada qual codifican- do uma meganuclease modificada da invenção tendo especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB. Em outras modalidades, as nanopartículas de lipídio da composição farmacêutica podem compreender uma ou mais mRNA policistrônicos descritos aqui, em que cada mRNA policistrônico codifica duas ou mais me- ganucleases modificadas da invenção tendo especificidade para as diferentes sequências de reconhecimento de VHB descritas aqui. Em modalidades particulares, as nanopartículas de lipídio podem compre- ender um mRNA policistônico codificando duas, três, ou quatro me- ganucleases modificadas descritas aqui. Em outras modalidades parti- culares, as nanopartículas de lipídio podem compreender duas ou mais mRNA policistrônicos descritas aqui, cada qual codificando duas ou mais meganucleases modificadas da invenção. Em algumas moda- lidades, as nanopartículas de lipídio têm uma composição que realça a liberação e captação no fígado, e especificamente dentro dos hepató- citos.
[0061] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o tratamento de um indivíduo tendo VHB. Igualmente, fornecido aqui é um método para redução do nível e/ou proliferação de VHB, ou redu- ção dos sintomas associados com VHB. Os métodos compreendem a liberação a um uma célula alvo no indivíduo: (a) um ácido nucleico co- dificando uma meganuclease modificada, em que a meganuclease modificada is expressas na célula alvo in vivo; ou (b) uma meganu- clease modificada protein; em que a meganuclease modificada tem especificidade para uma sequência de reconhecimento in an ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B, e em que a meganuclease modificada reconhece e cliva a sequência de re- conhecimento, desse modo clivando o genoma de VHB na célula alvo. O método pode reduzir ou eliminar a infecção e/ou proliferação de VHB no indivíduo.
[0062] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tra- tamento de um indivíduo tendo HCC causado por VHB. Os métodos compreendem a liberação a um uma célula alvo no indivíduo: (1) (a) um ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada, em que a meganuclease modificada is expressas na célula alvo in vivo; ou (b) uma proteína de meganuclease modificada; e (2) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de polinucleotídeo codificando um gene suicida e sequências homólogas às sequências que flanqueiam o sítio de clivagem de meganuclease; em que a meganuclease modifi- cada tem especificidade para uma sequência de reconhecimento em uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepa- tite B, em que a meganuclease modificada reconhece e cliva a se- quência de reconhecimento, desse modo clivando o genoma de VHB na célula alvo; em que o gene suicida é inserido no genoma de VHB clivado por recombinação homóloga; e em que a expressão do gene suicida mata a célula alvo.
[0063] Em algumas modalidades, o gene suicida é diretamente letal para a célula alvo. Em tais modalidades, o gene suicida direta- mente letal codifica um polipeptídeo tóxico ou uma proteína pró- apoptótica. Em algumas modalidades, o gene suicida é indiretamente letal para a célula alvo, e direciona o próprio sistema imunológico do indivíduo para matar a célula alvo. Em tais modalidades, o gene suici-
da indiretamente letal codifica uma proteína de superfície celular que é reconhecida como estranha pelo sistema imunológico e é alvejada por uma resposta imunológica humoral ou celular. Em outras tais modali- dades, o gene suicida indiretamente letal codifica um polipeptídeo que é apresentado por uma molécula de MHC de classe I, e é direcionado por uma resposta imunológica citotóxica.
[0064] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento para infecção por VHB ou HCC, a sequência de reconhecimento é encon- trada dentro de uma ORF de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 genótipos do vírus da Hepatite B. Em uma tal mo- dalidade a sequência de reconhecimento está dentro de uma ORF de genótipo A (SEQ ID NO: 3) do vírus da Hepatite B. Tal modalidade in- clui isolados de vírus da Hepatite B de genótipo A que diferem de SEQ ID NO: 3 porém compreendem uma ou mais sequências de reconhe- cimento de meganuclease de VHB descritas aqui. Em outras tais mo- dalidades, a sequência de reconhecimento está dentro de uma ORF de genótipo A e uma ou mais de genótipos B, C, D, E, F, e G (SEQ ID NOs: 4-9, respectivamente). Tais modalidades incluem isolados de ví- rus da Hepatite B de genótipo A, B, C, D, E, F, e G que diferem de SEQ ID NOs: 3-9 porém compreendem uma ou mais sequências de reconhecimento de meganuclease de VHB descritas aqui.
[0065] Em tais modalidades dos métodos de tratamento para in- fecção por VHB ou HCC, a sequência de reconhecimento pode estar dentro de pelo menos uma ORF codificando uma proteína selecionada do grupo que consiste: na proteína polimerase (P), na proteína de su- perfície grande (preS1/preS2/S), na proteína de superfície média (preS2/S), e na proteína de superfície pequena (S). Em algumas mo- dalidades, a sequência de reconhecimento pode compreender SEQ ID NO: 10 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 1-2), SEQ ID NO: 12 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 5-6), SEQ ID
NO: 14 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 7-8), ou SEQ ID NO: 16 (isto é, a sequência de reconhecimento do VHB 11-12).
[0066] Em modalidades particulares dos métodos de tratamento para infecção por VHB ou HCC, a proteína de meganuclease modifi- cada, ou a meganuclease modificada codificada, é uma meganuclease modificada descrita aqui.
[0067] Em outras modalidades, os métodos de tratamento para infecção por VHB ou HCC compreendem administrar ao indivíduo qualquer composição farmacêutica da invenção descrita aqui que compreende, pelo menos, um veículo farmaceuticamente aceitável e (a) um ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada des- crita aqui, em que a meganuclease modificada é expressa em uma célula alvo in vivo; ou (b) uma proteína de meganuclease modificada descrita aqui.
[0068] Em algumas modalidades dos métodos de tratamento para infecção por VHB ou HCC, a meganuclease modificada, ou o ácido nucleico codificando a meganuclease modificada, pode ser liberada para uma célula de hepatócito alvo. Em modalidades particulares, uma quantidade eficaz da meganuclease modificada, ou do ácido nucleico codificando a meganuclease modificada, pode ser liberada para uma célula de hepatócito alvo.
[0069] Em modalidades particulares, a liberação para uma célula de hepatócito ocorre ex vivo, em que uma quantidade eficaz das célu- las do hepatócito tendo sido liberada a meganuclease modificada, ou o ácido nucleico codificando a meganuclease modificada, é administrada a um indivíduo.
[0070] Em algumas modalidades, uma proteína hepatotóxica, ou um ácido nucleico ou AAV codificando uma proteína hepatotóxica, é administrada com as composições farmacêuticas descritas aqui.
[0071] Em modalidades particulares dos métodos, a primeira se-
quência de reconhecimento pode compreender SEQ ID NO: 10. Em tais modalidades, a meganuclease modificada pode ser qualquer me- ganuclease modificada da invenção que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 10. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada po- de compreender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-21.
[0072] Em outra modalidade dos métodos, a primeira sequência de reconhecimento pode compreender SEQ ID NO: 12. Em tais moda- lidades, a meganuclease modificada pode ser qualquer meganuclease modificada da invenção que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 12. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada pode compre- ender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22-28.
[0073] Em outras modalidades dos métodos, a primeira sequência de reconhecimento pode compreender SEQ ID NO: 14. Em tais moda- lidades, a meganuclease modificada pode ser qualquer meganuclease modificada da invenção que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 14. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada pode compre- ender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 29-32.
[0074] Em outras modalidades dos métodos, a primeira sequência de reconhecimento pode compreender SEQ ID NO: 16. Em tais moda- lidades, a meganuclease modificada pode ser qualquer meganuclease modificada da invenção que reconhece e cliva a SEQ ID NO: 16. Em modalidades particulares, a meganuclease modificada pode compre- ender a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33-39.
[0075] Em modalidades particulares dos métodos, the subject po- de ser um mamífero, tal como um humano.
[0076] Em outro aspecto, a invenção fornece uma meganuclease modificada descrita aqui para uso como um medicamento. A invenção também fornece o uso de uma meganuclease modificada, descrita aqui na fabricação de um medicamento para o tratamento de VHB, pa- ra redução do nível ou proliferação de VHB, redução dos sintomas as- sociados com VHB, ou tratamento de HCC.
[0077] Em outro aspecto, a invenção fornece um polinucleotídeo isolado para uso como um medicamento, em que o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui. A invenção também for- nece o uso de um polinucleotídeo isolado na fabricação de um medi- camento para o tratamento de VHB, para redução do nível ou prolife- ração de VHB, redução dos sintomas associados com VHB, ou trata- mento de HCC.
[0078] Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor de AVV re- combinante para uso como um medicamento, em que the recombinant AAV vector compreende um polinucleotídeo isolado, e em que o poli- nucleotídeo isolado compreende uma sequência de ácido nucleico co- dificando uma meganuclease modificada descrita aqui. A invenção também fornece o uso de um vetor de AVV recombinante na fabrica- ção de um medicamento para o tratamento de VHB, para redução do nível ou proliferação de VHB, redução dos sintomas associados com VHB, ou tratamento de HCC, em que o vetor de AAV recombinante compreende um polinucleotídeo isolado, e em que o polinucleotídeo isolado compreende uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui.
[0079] Os anteriores e outros aspectos e modalidades da presente invenção podem ser mais totalmente entendidos por referência a se- guinte descrição detalhada e reivindicações. Certos aspectos da in- venção, que são, para clareza, descritos no contexto de modalidades separadas, podem também ser fornecidos em combinação com uma única modalidade. Todas as combinações das modalidades são espe- cificamente abrangidas pela presente invenção e são descritas aqui como se cada combinação fosse individualmente e explicitamente descrita. Contrariamente, várias características da invenção, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única modalidade, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombina- ção adequada. Todas as subcombinações de funcionalidades listadas nas modalidades são também especificamente abrangidas pela pre- sente invenção e são descritas aqui como se cada uma dessas sub- combinações fosse individualmente e explicitamente descrita aqui. As modalidades de cada aspecto da presente invenção descrita aqui apli- cam-se a cada outro aspecto da invenção mutatis mutandis.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0080] Figura 1 mostra um mapa genômico do genoma do VHB e identifica todas as ORFs. As partículas de vírus têm um genoma de filamento parcialmente duplo (indicado por uma linha tracejada) com uma sobreposição coesiva que abrange as regiões 5 'de cada filamen- to e que é flanqueado por sequências de repetição direta (DR1 e DR2). O gene S codifica a principal proteína do antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) e seu parceiro glicosilado, que são proteínas de transmembrana do envelope do vírus. Sequências em estrutura a montante do gene S codificam os domínios pré-S, que são traduzidos com as sequências S para produzir os polipéptidos pré-S e S (proteí- nas médias e grandes) que contêm o receptor do vírus para infecção de hepatócitos. Gene C codifica o antígeno de núcleo de hepatite B (HBcAg) que forma o nucleocapsídeo do vírus. A região P codifica o vírus de transcriptase reserva que também tem Atividade de DNA po- limerase dependente de DNA e atividade de RNase H necessária para replicação de vírus. Embora o VHB seja um vírus de DNA, ele se repli- ca através de um intermediário de RNA pré-genômico. Finalmente, o gene X codifica a pequena proteína reguladora do vírus, o antígeno da hepatite B x (HBx). HBx é uma proteína transativadora que estimula a expressão de gene e a replicação do vírus, protege as células infecta- das por vírus contra a destruição imunomediada e contribui para o de- senvolvimento do carcinoma hepatocelular.
[0081] Figura 2. Sequências de reconhecimento de meganuclease modificada no genoma de VHB. A) cada sequência de reconhecimento alvejada por uma meganuclease modificada da invenção compreende dois meio sítios de reconhecimento. Cada meio sítio de reconhecimen- to compreende 9 pares de base, separados por uma sequência central de 4 pares de base. A sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10) compreende dois meio sítios de reconhecimento referidos como VHB1 e VHB2. A sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12) compreende dois meio sítios de reconhecimento re- feridos como VHB5 e VHB6. A sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14) compreende dois meio sítios de reconhecimento referidos como VHB7 e VHB8. A sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16) compreende dois meio sítios de reconhe- cimento referidos como VHB11 e VHB12.
[0082] Figura 3. Ilustração do genoma de VHB genótipo A e aposi- ção das sequências de reconhecimento de VHB 1-2, VHB 5-6, VHB 7- 8, e VHB 11-12 dentro do genoma. Tanto as sequências de reconhe- cimento de VHB 1-2 quanto VHB 5-6 estão posicionadas dentro de quatro ORFs do genoma do VHB: P, preS1/preS2/S, preS2/S, e S. As sequências de reconhecimento de VHB 7-8 e VHB 11-12 são cada qual posicionada dentro da ORF codificando a polimerase.
[0083] Figura 4. O alinhamento de sequências de reconhecimento de VHB nos genótipos de VHB A-G. As sequências de reconhecimento alvejadas pela invenção são conservadas através dos múltiplos genó- tipos de VHB. A sequência de reconhecimento do VHB 1-2 abrange os resíduos 185-206 de genótipo de VHB A estabelecido na SEQ ID NO: 3, e esta sequência de reconhecimento é totalmente conservada nos genótipos B, C, E, F, e G. O genótipo D compreende uma diferença de nucleotídeo simples de G a T na posição -4 do primeiro meio sítio. A sequência de reconhecimento do VHB 5-6 abrange os resíduos 742- 763 de genótipo de VHB A estabelecido na SEQ ID NO: 3, e esta se- quência de reconhecimento é totalmente conservada nos genótipos B, C, D, E, e G. Genótipo F compreende uma diferença de nucleotídeo simples de G a C na posição -3 do primeiro meio sítio. A sequência de reconhecimento do VHB 7-8 abrange os resíduos 1183-1204 de genó- tipo de VHB A estabelecido na SEQ ID NO: 3, e esta sequência de re- conhecimento é totalmente conservada nos genótipos B, C, D, F, e G. Genótipo E compreende uma diferença de nucleotídeo simples de G a C na posição -1 do primeiro meio sítio. A sequência de reconhecimen- to do VHB 11-12 abrange os resíduos 1259-1280 de genótipo de VHB A estabelecido na SEQ ID NO: 3, e esta sequência de reconhecimento é totalmente conservada nos genótipos B, C, D, E, F, e G.
[0084] Figura 5. As meganucleases modificadas da invenção com- preendem duas subunidades, em que a primeira subunidade compre- endendo a região de HVR1 se liga a um primeiro meio sítio de reco- nhecimento (por exemplo, VHB1, VHB5, VHB7, ou VHB11) e a segun- da subunidade compreendendo a região de HVR2 se liga a um segun- do meio sítio de reconhecimento (por exemplo, VHB2, VHB6, VHB8, ou VHB12). Nas modalidades onde a meganuclease modificada é uma meganuclease de cadeia simples, a primeira subunidade compreen- dendo a região de HVR1 pode ser posicionada como a subunidade de terminal N ou terminal C. Igualmente, a segunda subunidade compre- endendo a região de HVR2 pode ser posicionada como a subunidade de terminal N ou terminal C.
[0085] Figura 6. Esquemático de ensaio repórter em células CHO para avaliação de meganucleases modificadas direcionando uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B. Para as meganucleases modificadas descritas aqui, uma linhagem de célula CHO foi produzida em que um cassete repórter foi integrado estavel- mente no genoma da célula. O cassete repórter comprimido, na ordem 5' para 3': um Promotor Precoce do SV40; o 5 '2/3 do gene GFP; a se- quência de reconhecimento para uma meganuclease modificada da invenção (por exemplo, a sequência de reconhecimento do VHB 1-2); a sequência de reconhecimento para a meganuclease CHO-23/24 (WO/2012/167192); e a 3' 2/3 do gene GFP. Células estavelmente transfectadas com este cassete não expressam GFP na ausência de um agente de indução de rupture de DNA. As meganucleases foram introduzidas por transdução de DNA plasmidial ou mRNA codificando cada meganuclease. Quando uma quebra de DNA foi induzida em qualquer uma das sequências de reconhecimento de meganuclease, as regiões duplicadas do gene GFP recombinado com um outro para produzir um gene GFP funcional. A porcentagem de células expres- sando GFP poderia então ser determinada por citometria de fluxo co- mo uma medida indireta da frequência de clivagem de genoma pelas meganucleases.
[0086] Figura 7. Effciência de meganucleases modificadas para reconhecimento e clivagem de sequências de reconhecimento em uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B, gene em um ensaio repórter de célula CHO. Meganucleases modifica- das estabelecidas na SEQ ID NOs: 18-39 foram modificadas para al- vejar a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10), a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12), a se- quência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14), ou a se- quência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16), e foram analisadas quanto à eficácia no ensaio repórter de célula CHO. Os re-
sultados mostrados fornecem a porcentagem de células expressando GFP observadas em cada ensaio, que indica a eficácia de cada me- ganuclease para clivagem de uma sequência de reconhecimento alvo ou a sequência de reconhecimento de CHO-23/24. Um controle nega- tivo (bs) foi também incluído em cada ensaio. Figura 7A mostra me- ganucleases alvehandoa sequência de reconhecimento do VHB 1-2. Figura 7B mostra meganucleases alvejando a sequência de reconhe- cimento do VHB 5-6. Figura 7C mostra meganucleases direcionando a sequência de reconhecimento do VHB 7-8. Figura 7D mostra meganu- cleases direcionando a sequência de reconhecimento do VHB 11-12.
[0087] Figura 8. Eficiência de meganucleases modificadas para reconhecimento e clivagem de sequências de reconhecimento em uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B, gene em um ensaio repórter de célula CHO. Meganucleases modifica- das estabelecidas na SEQ ID NOs: 18-39 foram modificadas para al- vejar a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10), a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12), a se- quência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14), ou a se- quência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16), e foram analisadas quanto à eficácia no ensaio repórter de célula CHO em múltiplos pontos de tempo durante 12 dias após nucleofecção. Os re- sultados mostrados fornecem a porcentagem de células expressando GFP observadas em cada ensaio durante um período de 12 dias de análise, que indica a eficácia de cada meganuclease para clivagem de uma sequência de reconhecimento alvo ou a sequência de reconheci- mento de CHO-23/24 como uma função de tempo. A Figura 8A mostra meganucleases direcionando a sequência de reconhecimento do VHB 1-2. A Figura 8B mostra meganucleases direcionando a sequência de reconhecimento do VHB 5-6. A Figura 8C mostra meganucleases dire- cionando a sequência de reconhecimento do VHB 7-8. Figura 8D mos-
tra meganucleases direcionando a sequência de reconhecimento do VHB 11-12.
[0088] Figura 9. Avaliação de meganucleases de VHB quanto a sua capacidade de reconhecer e clivar sequências de reconhecimento dentro os plasmídeos de DNA epissômicos em um sistema repórter de E. coli. A Figura 9A mostra pARCUS de plasmídeo e pVHBa de plas- mídeo. Figura 9B mostra o número de colônicas presentes em cada placa seletiva, fornecendo evidência da capacidade de meganucleases de VHB de clivar o plasmídeo de pVHBa.
[0089] Figura 10. Avaliação de meganucleases de VHB em células AD38. Células AD38, que expressam um genoma de VHB e secretam HBsAg, foram transfectadas com DNA plasmidial codificando as me- ganucleases de VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26. DNA plasmidial codi- ficando uma proteína fluorescente vermelha foi usado no experimento como um controle. Nos dias 3 e 7 pós-transfecção, o sobrenadante celular foi colhido e ensaiado quanto à presença de HBsAg por ELISA.
[0090] Figura 11. Avaliação de meganucleases de VHB em células AD38. Células AD38, que expressam um genoma de VHB e secretam HBsAg, foram transduzidas com lentivírus codificando a meganuclease de VHB 5-6x.33 ou as meganucleases de VHB 11-12x.26, ou foram transduzidas com uma combinação das duas. Lentivírus codificando uma proteína fluorescente vermelha foi usado no experimento como um controle. MOIs de 1, 2, e 4 foram examinados. No dia 7 pós- transdução, o sobrenadante celular foi colhido e ensaiado quanto à presença de HBsAg por ELISA.
[0091] Figura 12. Avaliação de meganucleases de VHB em células AD38. Células AD38, que expressam um genoma de VHB e secretam HBsAg, foram transduzidas com lentivírus codificando a meganuclease de VHB 5-6x.33 (LV224), as meganucleases de VHB 11-12x.26 (LV225), ou uma proteína fluorescente vermelha (LV212). Um MOI de
4 foi examinado, e no dia 7 pós-transdução, o sobrenadante celular foi colhido e ensaiado quanto à presença de HBsAg e número de cópia de DNA de VHB extracelular. Adicionalmente, lisados de célula foram obtidos no dia 7 pós-transdução e analisados quanto ao número de cópia intracelular de cccDNA de VHB. A Figura 12A mostra as concen- trações de HBsAg em um meio de cultura celular. A Figura 12B mostra número de cópias de DNA de VHB extracelular em um meio de cultura celular. A Figura 12C mostra números de cópia de cccDNA de VHB intracelular em lisados celulares.
[0092] Figura 13. Avaliação de meganucleases de VHB em hepa- tócitos humanos primários infectados por VHB. Lentivírus foram gera- dos que expressam RFP, VHB 5-6x.33, ou VHB 11-12x.26, e hepatóci- tos humanos primários infectados por VHB foram transduzidos para determinar o impacto das meganucleases sobre a produção de HBsAg e HBeAg. Hepatócitos humanos primários foram semeados e 24 horas depois infectados com VHB. Um dia pós-infecção, as células foram lavadas e 24 horas depois (dia 2 pós-infecção) foram transduzidos com um lentivírus codificando RFP, VHB 5-6x.33, VHB 11-12x.26, ou uma mistura de 1:1 dos lentivírus codificando as meganucleases de VHB. Como um controle adicional, células infectadas foram tratadas com DMSO. Sobrenadantes celulares foram colhidos e o meio foi substituído nos dias 4, 8, 11, e 13 pós-transdução. Em cada ponto de tempo, HBsAg e HBeAg foram medidos nos sobrenadantes celulares por ELISA. O DNA extracelular no sobrenadante foi também medido no dia 13 pós-infecção. Para determinar se a transdução de lentivírus, em geral, secreção impactada de HBsAg ou HBeAg, sobrenadantes celulares de células transduzidas com um lentivírus codificando RFP foram comparados às células tratadas com DMSO. Figura 13A mostra que a transdução com um lentivírus codificando uma RFP teve pouco impacto sobre a expressão de HBsAg em um MOI ou 1,25, 2,5, ou 5.
Figura 13B mostra que a transdução com um lentivírus codificando uma RFP teve pouco impacto sobre a expressão de HBeAg em um MOI ou 1,25, 2,5, ou 5. Figura 13C mostra que a transdução com um lentivírus codificando uma RFP teve pouco impacto sobre expressão de DNA de VHB em um MOI ou 1,25, 2,5, ou 5.
[0093] Figura 14. Avaliação de meganucleases de VHB em hepa- tócitos humanos primários infectados por VHB. Lentivírus foram gera- dos que expressam RFP, VHB 5-6x.33, ou VHB 11-12x.26, e hepatóci- tos humanos primários infectados por VHB foram transduzidos para determinar o impacto das meganucleases sobre a produção de HBsAg e HBeAg. Hepatócitos humanos primários foram semeados e 24 horas depois infectados com VHB. 1 dia pós-infecção, as células foram lava- das e 24 horas depois (dia 2 pós-infecção) foram transduzidos com um lentivírus codificando RFP, VHB 5-6x.33, VHB 11-12x.26, ou uma mis- tura de 1:1 dos lentivírus codificando as meganucleases de VHB. Co- mo um controle adicional, células infectadas foram tratadas com DMSO. Sobrenadantes celulares foram colhidos e o meio foi substituí- do nos dias 4, 8, 11, e 13 pós-transdução. Em cada ponto de tempo, HBsAg e HBeAg foram medidos nos sobrenadantes celulares por ELI- SA. Figura 14A mostra HBsAg em um meio de cultura celular após transdução em um MOI de 2,5. A Figura 14B mostra HBsAg em um meio de cultura celular após transdução em um MOI de 1,25. A Figura 14C mostra HBeAg em um meio de cultura celular após transdução em um MOI de 2.5. Figura 14D mostra HBeAg em um meio de cultura celular após transdução em um MOI de 1,25.
[0094] Figura 15. Liberação de mRNA encapsulado por nanopartí- cula de lipídio para o fígado. Uma meganuclease modificada foi de- senvolvida que tem especificidade para uma sequência de reconheci- mento no gene CMP-NeuAc hidrolase (Cmah) de camundogo, que é expresso no fígado de camundongo. MRNA tamponado por ARCA co-
dificando a Cmah meganuclease foi encapsulado em três diferentes formulações de LNP comerciais. O mRNA encapsulado por LNP foi administrado aos camundongos CD-1 por injeção IV e os fígados fo- ram colhidos 6 dias depois. DNA genômico de fígado inteiro (gDNA) foi isolado e a frequência de mutações de inserção/deleção (indel) no ge- ne Cmah gene foi determinada usando um ensaio de T7 endonuclease I (T7E) e sequenciamento profundo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS
[0095] SEQ ID NO: 1 estabelece a sequência de aminoácido de I- CreI meganuclease do tipo selvagem de Chlamydomonas reinhardtii.
[0096] SEQ ID NO: 2 estabelece a sequência de aminoácido de LAGLIDADG.
[0097] SEQ ID NO: 3 estabelece a sequência de aminoácido de VHB genótipo A.
[0098] SEQ ID NO: 4 estabelece a sequência de aminoácido de VHB genótipo B.
[0099] SEQ ID NO: 5 estabelece a sequência de aminoácido de VHB genótipo C.
[00100] SEQ ID NO: 6 estabelece a sequência de aminoácido de genótipo de VHB D.
[00101] SEQ ID NO: 7 estabelece a sequência de aminoácido de genótipo de VHB E.
[00102] SEQ ID NO: 8 estabelece a sequência de aminoácido de genótipo de VHB F.
[00103] SEQ ID NO: 9 estabelece a sequência de aminoácido de genótipo de VHB G.
[00104] SEQ ID NO: 10 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (sentido).
[00105] SEQ ID NO: 11 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (antissentido).
[00106] SEQ ID NO: 12 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (sentido).
[00107] SEQ ID NO: 13 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (antissentido).
[00108] SEQ ID NO: 14 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (sentido).
[00109] SEQ ID NO: 15 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (antissentido).
[00110] SEQ ID NO: 16 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (sentido).
[00111] SEQ ID NO: 17 estabelece a sequência de aminoácido da sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (antissentido).
[00112] SEQ ID NO: 18 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 1-2x.2.
[00113] SEQ ID NO: 19 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 1-2x.14.
[00114] SEQ ID NO: 20 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 1-2x.68.
[00115] SEQ ID NO: 21 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 1-2x.93.
[00116] SEQ ID NO: 22 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.33.
[00117] SEQ ID NO: 23 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.84.
[00118] SEQ ID NO: 24 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.90.
[00119] SEQ ID NO: 25 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.4.
[00120] uSEQ ID NO: 26 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.5.
[00121] SEQ ID NO: 27 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.68.
[00122] SEQ ID NO: 28 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 5-6x.79.
[00123] SEQ ID NO: 29 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 7-8x.2.
[00124] SEQ ID NO: 30 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 7-8x.9.
[00125] SEQ ID NO: 31 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 7-8x.17.
[00126] SEQ ID NO: 32 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 7-8x.44.
[00127] SEQ ID NO: 33 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.26.
[00128] SEQ ID NO: 34 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.9.
[00129] SEQ ID NO: 35 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.13.
[00130] SEQ ID NO: 36 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.16 meganuclease.
[00131] SEQ ID NO: 37 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.27.
[00132] SEQ ID NO: 38 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.41.
[00133] SEQ ID NO: 39 estabelece a sequência de aminoácido da meganuclease de VHB 11-12x.48.
[00134] SEQ ID NO: 40 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB1 de meganuclease de VHB 1-2x.2.
[00135] SEQ ID NO: 41 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB1 de meganuclease de VHB 1-2x.14.
[00136] SEQ ID NO: 42 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB1 de meganuclease de VHB 1-2x.68.
[00137] SEQ ID NO: 43 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB1 de meganuclease de VHB 1-2x.93.
[00138] SEQ ID NO: 44 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB2 de meganuclease de VHB 1-2x.2.
[00139] SEQ ID NO: 45 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB2 de meganuclease de VHB 1-2x.14.
[00140] SEQ ID NO: 46 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB2 de meganuclease de VHB 1-2x.68.
[00141] SEQ ID NO: 47 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB2 de meganuclease de VHB 1-2x.93.
[00142] SEQ ID NO: 48 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de VHB 5-6x.33.
[00143] SEQ ID NO: 49 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de VHB 5-6x.84.
[00144] SEQ ID NO: 50 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de VHB 5-6x.90.
[00145] SEQ ID NO: 51 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de VHB 5-6x.4.
[00146] subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de SEQ ID NO: 52 estabelece a sequência de aminoácido da VHB 5-6x.5.
[00147] SEQ ID NO: 53 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de VHB 5-6x.68.
[00148] SEQ ID NO: 54 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB5 de meganuclease de VHB 5-6x.79.
[00149] SEQ ID NO: 55 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de VHB 5-6x.33.
[00150] SEQ ID NO: 56 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de VHB 5-6x.84.
[00151] SEQ ID NO: 57 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de VHB 5-6x.90.
[00152] SEQ ID NO: 58 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de VHB 5-6x.4.
[00153] SEQ ID NO: 59 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de VHB 5-6x.5.
[00154] SEQ ID NO: 60 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de VHB 5-6x.68.
[00155] SEQ ID NO: 61 estabelece a sequência de aminoácido da VHB 5-6x.79 subunidade de ligação ao VHB6 de meganuclease de.
[00156] SEQ ID NO: 62 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB7 de meganuclease de VHB 7-8x.2.
[00157] SEQ ID NO: 63 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB7 de meganuclease de VHB 7-8x.9.
[00158] SEQ ID NO: 64 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB7 de meganuclease de VHB 7-8x.17.
[00159] SEQ ID NO: 65 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB7 de meganuclease de VHB 7-8x.44.
[00160] SEQ ID NO: 66 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB8 de meganuclease de VHB 7-8x.2.
[00161] SEQ ID NO: 67 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB8 de meganuclease de VHB 7-8x.9.
[00162] SEQ ID NO: 68 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB8 de meganuclease de VHB 7-8x.17.
[00163] SEQ ID NO: 69 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB8 de meganuclease de VHB 7-8x.44.
[00164] SEQ ID NO: 70 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11- 12x.26.
[00165] SEQ ID NO: 71 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11-12x.9.
[00166] SEQ ID NO: 72 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11- 12x.13.
[00167] SEQ ID NO: 73 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11- 12x.16.
[00168] SEQ ID NO: 74 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11- 12x.27.
[00169] SEQ ID NO: 75 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11- 12x.41.
[00170] SEQ ID NO: 76 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB11 de meganuclease de VHB 11- 12x.48.
[00171] SEQ ID NO: 77 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de VHB 11- 12x.26.
[00172] SEQ ID NO: 78 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de VHB 11-12x.9.
[00173] SEQ ID NO: 79 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de VHB 11- 12x.13.
[00174] SEQ ID NO: 80 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de VHB 11- 12x.16.
[00175] SEQ ID NO: 81 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de.VHB 11-12x.27
[00176] SEQ ID NO: 82 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de VHB 11- 12x.41.
[00177] SEQ ID NO: 83 estabelece a sequência de aminoácido da subunidade de ligação ao VHB12 de meganuclease de VHB 11- 12x.48.
[00178] SEQ ID NO: 84 estabelece a sequência de ácido nucleico da sequência de reconhecimento presente no genótipo de VHB D que corresponde à sequência de reconhecimento do VHB 1-2 no genótipo de VHB A com uma substituição de G por C na posição -4 do primeiro meio sítio.
[00179] SEQ ID NO: 85 estabelece a sequência de ácido nucleico da sequência de reconhecimento presente no genótipo de VHB F que corresponde à sequência de reconhecimento do VHB 5-6 no genótipo de VHB A com uma substituição de G por C na posição -3 do primeiro meio sítio.
[00180] SEQ ID NO: 86 estabelece a sequência de ácido nucleico da sequência de reconhecimento presente no genótipo de VHB E que corresponde à sequência de reconhecimento do VHB 7-8 no genótipo de VHB A com uma substituição de C por T na posição -1 do primeiro meio sítio.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
1.1 Referências de Definições
[00181] A patente e literatura científica aqui referida estabelece o conhecimento que está disponível para aqueles versados na técnica. As patentes dos Estados Unidos da América emitidas, pedidos permi- tidos, pedidos estrangeiros publicados, e referências, incluindo as se- quências da base de dados do GenBank, aqui citados são incorpora- dos por referência na medida como se cada qual fosse especificamen- te indicado individualmente ser incorporado por referência.
[00182] A presente invenção pode ser incorporada em diferentes formas e não deve ser construída como limitante das modalidades mencionadas aqui. De preferência, estas modalidades são fornecidas para que esta invenção seja completa e meticulosa, e irá transmitir to- talmente o escopo da invenção por aqueles versados na técnica. Por exemplo, características ilustradas com repeito a uma modalidade po- de ser incorporada em outras modalidades, e características ilustradas com repeito a uma modalidade particular podem ser deletadas a partir daquela modalidade. Além disso, numerosas variações e adições às modalidades sugeridas aqui tornar-se-ão evidentes para aqueles ver- sados na técnica à luz da presente invenção, que não se afastam da presente invenção.
[00183] A menos que de outro modo definido, todos os termos téc- nicos e cientpificos usados aqui têm o mesmo significado como co- mumente entendido por alguém versado na tércnica à qual esta inven- ção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui é para o propósito de descrever as modalidades particulares apenas e não se destina a ser limitante da invenção.
[00184] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e ou- tras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência aqui em sua totalidade.
[00185] Como usado aqui, "um, uma (a)," "um, uma (an)," ou "o/a" pode significar um ou mais do que um. Por exemplo, "uma" célula po- de significar uma única célula ou uma multiplicidade de células.
[00186] Como usado aqui, a menos que especificamente indicado de outro modo, a palavra "ou" é usada no sentido inclusivo de "e/ou" e não no sentido exclusivo de "qualquer/ou."
[00187] Como usado aqui, os termos "nuclease" e "endonuclease" são usados alternadamente para referir-se às enzimas de ocorrência natural ou modificadas que clivam uma ligação de fosfodiéster dentro de uma cadeia de polinucleotídeo.
[00188] Como usado aqui, o termo "meganuclease" refere-se a uma endonuclease que liga DNA de filamento duplo em uma sequência de reconhecimento que é maior do que 12 pares de base. Preferivelmen- te, a sequência de reconhecimento para uma meganuclease da inven- ção é de 22 pares de base. A meganuclease pode ser um endonu- clease que é derivada de I-CreI, e pode referir-se a uma variante modi- ficada de I-CreI que foi modificada com relação ao I-CreI natural com respeito à, por exemplo, especificidade de ligação de DNA, atividade de clivagem de DNA, afinidade de ligação de DNA, ou propriedades de polimerização. Métodos para a produção de tais variantes modificadas de I-CreI são conhecidos na técnica (por exemplo, WO 2007/047859). A meganuclease como usada aqui se liga ao DNA de filamento duplo como um heterodímero. A meganuclease pode também ser uma "me- ganuclease de cadeia simples" em que um par de domínios de ligação de DNA é ligado em um polipeptídeo simples usando um ligante de peptídeo. O termo "endonuclease de origem" é sinônimo com o termo "meganuclease." Meganucleases da invenção são substancialmente não tóxicas quando expressam em células sem observar os efeitos nocivos sobre a viabilidade celular ou reduções significantes na ativi- dade de clivagem de meganuclease quando medidas usando os mé- todos descritas aqui.
[00189] Como usado aqui, o termo "meganuclease de cadeia sim- ples" refere-se a um polipeptídeo compreendendo um par de subuni- dades de nuclease ligado por um ligante. Uma meganuclease de ca- deia simples tem a organização: Subunidade de terminal N – Ligante – subunidade de terminal C. As duas subunidades de meganuclease ge- ralmente serão não idênticas na sequência de aminoácido e reconhe- cerão sequências de DNA não idênticas. Desse modo, meganuclea- sesde cadeia simples tipicamente clivam sequências de reconheci- mento palindrômicos ou não palindrômicos. A meganuclease de ca-
deia simples pode ser referida como um "heterodímero de cadeia sim- ples" ou "meganulcease heterodimérica de cadeia simples" embora não seja, de fato, dimérica. Para clareza, a menos que de outro modo especificado, o termo "meganuclease" pode referir-se a uma meganu- clease dimérica ou de cadeia simples.
[00190] Como usado aqui, o termo "ligante" refere-se a uma se- quência de peptídeo exógeno usada para ligar duas subunidades de meganuclease em um polipeptídeo simples. Um ligante pode ter uma sequência que é encontrada em proteínas naturais, ou pode ser uma sequência artificial que não é encontrada em qualquer proteína natu- ral. Um ligante pode ser flexível e carente de estrutura secundária ou pode ter propensão a formar uma estrutura tridimensional específica sob condições fisiológicas. Um ligante pode incluir, sem limitação, aqueles abrangidos pela Patente dos Estados Unidos nº 8.445.251 e Patente dos Estados Unidos nº 9.434.931. Em algumas modalidades, um ligante pode ter uma sequência de aminoácido compreendendo os resíduos 154-195 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-39.
[00191] Como usado aqui, com respeito a uma proteína, o termo "recombinante" ou "modificada" significa tendo uma sequência de ami- noácido alterada como um resultado da aplicação de técnicas de en- genharia genética aos ácidos nucleicos que codificam a proteína, e células ou organismos que expressam a proteína. Com respeito a um ácido nucleico, o termo "recombinante" ou "modificado" significa tendo uma sequência de ácido nucleico alterado como um resultado da apli- cação de técnicas de engenharia genética. Técnicas de engenharia genética incluem, porém não estão limitadas à, tecnologias de clona- gem de DNA e PCR; transfecção, transformação e outras tecnologias de transferência de genes; recombinação homóloga; mutagênese dire- cionada ao sítio; e fusão gênica. De acordo com esta definição, uma proteína tendo uma sequência de aminoácido idêntica a uma proteína de ocorrência natural, porém produzida por clonagem e expressão em um hospedeiro heterólogo, não é considerada recombinante.
[00192] Como usado aqui, o termo "tipo selvagem" refere-se ao ale- lo de ocorrência natural mais comum (isto é, sequência polinucleotídi- ca) na população de alelos do mesmo tipo de gene, em que um poli- peptídeo codificado pelo alelo de tipo selvagem tem suas funções ori- ginais. O termo "tipo selvagem" também se refere a um polipeptídeo codificado por um alelo de tipo selvagem. Alelos do tipo selvagem (isto é, polinucleotídeos) e polipeptídeos são distinguíveis dos alelos ou po- lipeptídeos mutantes ou variantes, que compreendem uma ou mais mutações e/ou substituições relativas à(s) sequência(s) do tipo selva- gem. Enquanto um alelo de tipo selvagem ou polipéptido pode conferir um fenótipo normal em um organismo, um alelo ou polipéptido mutante ou variante pode, em alguns casos, conferir um fenótipo alterado. As nucleases do tipo selvagem são distinguíveis das nucleases recombi- nantes ou não naturais. O termo "tipo selvagem" também pode se refe- rir a uma célula, um organismo, e/ou um indivíduo que possui um alelo de tipo selvagem de um gene particular, ou uma célula, um organismo, e/ou um indivíduo usado para propósitos comparativos.
[00193] Como usado aqui, o termo "geneticamente modificado" re- fere-se a uma célula ou organismo no qual, em um antepassado do qual, uma sequência de DNA genômico foi deliberadamente modifica- da por tecnologia recombinante. Como usado aqui, o termo "genetica- mente modificado" abrange o termo "transgênico".."
[00194] Como usado aqui com respeito às proteínas recombinan- tes, o termo "modificação" significa qualquer inserção, deleção ou substituição de um resíduo de aminoácido na sequência recombinante com relação a uma sequência de referência (por exemplo, uma se- quência do tipo selvagem ou nativa).
[00195] Como usado aqui, o termo "sequência de reconhecimento"
refere-se a uma sequência de DNA que é ligada e clivada por uma en- donuclease. No caso de uma meganuclease, uma sequência de reco- nhecimento compreende um par de "meio sítios" invertidos de 9 pares de base que são separados por quatro pares de base. No caso de uma meganuclease de cadeia simples, o domínio de terminal N da proteína contata um primeiro meio sítio e o ddomínio de terminal C da proteína contata um segundo meio sítio. A clivagem por uma meganu- clease produz quatro "protuberâncias" de par de base 3'. "Protuberân- cias", ou "extremidades densas" são segmentos de DNA de filamento simples, curto que podem ser produzidos por clivagem de endonu- clease de uma sequência de DNA de filamento duplo. No caso de me- ganucleases e meganucleases de cadeia simples derivadas de I-CreI, a protuberância compreende as bases 10-13 da sequência de reco- nhecimento de 22 pares de base.
[00196] Como usado aqui, o termo "sítio alvo" ou "sequência alvo" refere-se a uma região do DNA cromossômico de uma célula compre- endendo uma sequência de reconhecimento para uma nuclease.
[00197] Como usado aqui, o termo "afinidade de ligação ao DNA" ou "afinidade de ligação" significa a tendência de uma meganuclease associar-se não covalentemente a uma molécula de DNA de referên- cia (por exemplo, uma sequência de reconhecimento ou uma sequên- cia arbitrária). A afinidade de ligação é medida por uma constante de dissociação, Kd. Como usado aqui, um nuclease tem afinidade de liga- ção "alterada" se a Kd da nuclease para uma sequência de reconheci- mento de referência for aumentada ou diminuída por uma quantidade estatisticamente significante (p<0,05) com relação a uma nuclease de referência.
[00198] Como usado aqui, o termo "especificidade" significa a ca- pacidade de uma meganuclease para obter moléculas de DNA de fi- lamento duplo apenas em uma sequência particular de pares de bases referidos como a sequência de reconhecimento, ou apenas em um grupo particular de sequências de reconhecimento. O grupo de se- quências de reconhecimento compartilhar certas posições conserva- das ou motifs de sequência, porém pode ser degenerar em uma ou mais posições. Uma meganuclease altamente específica é capaz de clivar apenas uma ou algumas pequenas ou muito poucas sequências de reconhecimento. Especificidade pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Como usado aqui, a meganuclease tem especificidade "alterada" se ela se liga a e cliva uma sequência de re- conhecimento que não é ligada a e clivada por uma meganuclease de referência (por exemplo, um tipo selvagem) sob condições fisiológicas, ou se a taxa de clivagem de uma sequência de reconhecimento é au- mentada ou diminuída por uma quantidade biologicamente significante (por exemplo, pelo menos 2×, ou 2×-10×) com relação a uma meganu- clease de referência.
[00199] Como usado aqui, o termo "recombinação homóloga" ou "HR" refere-se ao processo celular natural em que uma ruptura de DNA de filamento duplo é reparada usando uma sequência de DNA homóloga como o modelo de reparo (veja, por exemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). A sequência de DNA homóloga pode ser uma sequência cromossômica endógena ou um ácido nucléi- co exógeno que foi liberado para a célula.
[00200] Como usado aqui, o termo "ligação de extermidade não homóloga" ou "NHEJ" refere-se a um processo celular natural no qual uma ruptura de DNA de filamento duplo é reparada pela ligação direta de dois segmentos de DNA não homólogos (veja, por exemplo, Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976). O reparo de DNA por liga- ção de extremidade não homóloga é propenso a erro e frequentemen- te resulta na adição ou deleção untemplated de sequências de DNA no sítio de reparo. Em alguns casos, a clivagem em uma sequência de reconhecimento alvo resulta em NHEJ em um sítio de reconhecimento alvo. A clivagem induzida por nuclease de um sítio alvo na sequência de codificação de um gene seguido po reparo de DNA por NHEJ pode introduzir mutações na sequência de codificação, tal como mutações frameshift, que rompem a função do gene. Desse modo, meganuclea- ses modificadas podem ser usadas eficazmente para reduzir um gene em uma população de células.
[00201] Como usado aqui com respeito tanto às sequências de aminoácidos quanto sequências de ácidos nucleicos, os termos "por- centagem de identidade", "identidade de sequência", "porcentagem de similaridade", "similaridade de sequência" e similares, referem-se a uma medida do grau de similaridade de duas sequências com base em um alinhamento das sequências que maximiza a similaridade entre os aminoácidos alinhados com os resíduos ou nucleótidos, e que é uma função do número de nucleótidos ou resíduos idênticos, o número total de nucleótidos ou de resíduos, e a presença e o comprimento dos intervalos no alinhamento das sequências. Uma variedade de algorit- mos e programas de computador estão disponíveis para determinar a similaridade de sequência usando parâmetros padrão. Como usado aqui, a similaridade de sequência é medida usando o programa BLASTp para sequências de aminoácidos e o programa BLASTn para sequências de ácido nucléico, ambas as quais estão disponíveis atra- vés do National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov/), e são descritas em, por exemplo, Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish e States (1993), Nature Genet. 3:266-272; Madden et al. (1996), Meth. Enzymol.266:131-141; Altschul et al. (1997), nucleic acids Res. 25:33 89-3402); Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(1-2):203-14. Como usado aqui, a porcenta- gem de similaridade de duas sequências de aminoácido é a pontuação com base nos seguintes parâmetros para o algoritmo BLASTp: tama-
nho da palavra=3; penalidade de abertura de intervalo=−11; penalida- de de extensão de intervalo=−1; e matriz de pontuação=BLOSUM62. Como usado aqui, a porcentagem de similaridade de duas sequências de ácido nucleico é a pontuação com base nos seguintes parâmetros para o algoritmo BLASTn: tamanho da palavra=11; penalidade de abertura de intervalo=−5; penalidade de extensão de intervalo=−2; re- compense de compatibilidade=1; e penalidade de incompatibilida- de=−3.
[00202] Como usado aqui com respeito às modificaçãos de duas proteínas ou sequências de aminoácido, o termo "correspondendo a" é usado para indicar que uma modificação especificada na primeira pro- teína é uma substituição do mesmo resíduo de aminoácido como na modificação na segunda proteína, e que a posição de aminoácido da modificação nas primeiras proteínas corresponde a ou se alinha com a posição de aminoácido da modificação na segunda proteína quando as duas proteínas são submetidas a alinhamentos de sequência pa- drão (por exemplo, usando o programa BLASTp). Desse modo, a mo- dificação de resíduo "X" em aminoácido "A" na primeira proteína cor- responderá à modificação de resíduo "Y" em aminoácido "A" na se- gunda proteína se os resíduos X e Y corresponderem uns aos outros em um alinhamento de sequência, e apesar do fato de que X e Y po- dem ser números diferentes.
[00203] Como usado aqui, o termo "meio sítio de reconhecimento," "meio sítio de sequência de reconhecimento," ou simplesmente "meio sítio" significa uma sequência de ácido nucleico em uma molécula de DNA de filamento duplo que é reconhecida por um monômero de uma meganuclease homodimérica ou heterodimérica, ou por uma subuni- dade da meganuclease de cadeia simples.
[00204] Como usado aqui, o termo "região hipervariável" refere-se a uma sequência localizada dentro de um monômero de meganuclease ou subunidade que compreende aminoácidos com variabilidade relati- vamente alta. Uma região hipervariável pode compreender cerca de 50-60 resíduos contíguos, cerca de 53-57 resíduos contíguos, ou pre- ferivelmente cerca de 56 resíduos. Em algumas modalidades, os resí- duos de uma região hipervariável podem corresponder às posições 24- 79 ou posições 215-270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-39. Uma região hipervariável pode compreender um ou mais resíduos que contatam as bases de DNA em uma sequência de reconhecimento e pode ser modificada para alterar a preferência de base do monômero ou subunidade. Uma região hipervariável pode também compreender um ou mais resíduos que se ligam à estrutura de DNA quando a me- ganuclease associa-se com uma sequência de reconhecimento de DNA de filamento duplo. Tais resíduos podem ser modificados para alterar a afinidade de ligação da meganuclease para a estrutura de DNA e a sequência de reconhecimento alvo. Em diferentes modalida- des da invenção, uma região hipervariável pode compreender entre 1 a 20 resíduos que exibem variabilidade e podem ser modificados para influenciar a preferência de base e/ou afinidade de ligação ao DNA. Em algumas modalidades, resíduos variáveis dentro de uma região hipervariável correspondem a uma ou mais das posições 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 49, 50, 54, 64, 68, 70, 75, e 77 de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 18-39. Em outras modalidades, resíduos variáveis dentro de uma região hipervariável correspondem a uma ou mais das posições 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 241, 245, 255, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 18-39.
[00205] Os termos "construção de DNA recombinante," "construção recombinante," "cassete de expressão," "construção de expressão," "construção quimérica," "construção," e "fragmento de DNA recombi- nante" são usados alternadamente aqui e são framentos de ácido nu-
cleico. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucleico, incluindo, sem limitação, se- quências regulatórias e codificação que não são encontradas junta- mente na natureza. Por exemplo, uma construção de DNA recombi- nante pode compreender sequências regulatórias e sequências de co- dificação que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências regu- latórias e sequências de codificação derivadas da mesma fonte e ar- ranjadas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construção pode ser usada por sis ó ou pode ser usada em con- junção com um vetor.
[00206] Como usado aqui, um "vetor" ou "vetor de DNA recombi- nante" pode ser uma construção que inclui um sistema de replicação e sequências que são capazes de trnascrição e translação de uma se- quência de codificação de polipeptídeoem uma determinada célula hospedeira. Se um vetor for usado, então a escolha do vetor será de- pendente do método que será usado para transformar as células hos- pedeiras como é bem conhecido por aqueles versados na técnica. Ve- tores podem incluir, sem limitação, vetores de plasmídeo e vetores de AAV recombinantes, ou qualquer outro vetor conhecido em tal técnica para liberação de um gene codificando a meganuclease da invenção para uma célula alvo. O técnico versado está bem ciente dos elemen- tos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transfor- mar, selecionar e propagar de forma bem sucedida as células hospe- deiras compreendendo qualquer das sequências de ácido nucleico ou nucleotídeos isolados da invenção.
[00207] Como usado aqui, um "vetor" pode também referir-se a um vetor viral. Vetores virais podem incluir, sem limitação, vetores retrovi- rais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, e vetores virais adeno- associados (AAV).
[00208] Como usado aqui, um mRNA "policistrônico" refere-se a um
RNA mensageiro simples que compreende duas ou mais sequências de codificação (isto é, cistrons) e codifica mais do que uma proteína. Um mRNA policistrônico pode compreender qualquer elemento conhe- cido na técnica para permitir a translação de dois ou mais genes da mesma molécula de mRNA incluindo, porém não limitado a, um ele- mento de IRES, um elemento de T2A, um elemento de P2A, um ele- mento de E2A, e um elemento de F2A.
[00209] Como usado aqui, um "controle" ou "célula de controle" re- fere-se a uma célula que fornece um ponto de referência para avaliar as mudanças em genótipo ou fenótipo de uma célula geneticamente modificada. Uma célula de controle pode compreender, por exemplo: (a) uma célula do tipo selvagem, isto é, do mesmo genótipo que o ma- terial de partida para a alteração genética que resultou na célula gene- ticamente modificada.; (b) uma célula do mesmo genótipo que a célula geneticamente modificada, porém que foi transformada com uma construção nula (isto é, com uma construção que não tem efeito co- nhecido sobre o traço de interesse); ou, (c) uma célula geneticamente idêntica à célula geneticamente modificada, porém que não está ex- posta a condições ou estímulos ou outras modificações genéticas que induziriam expressão de genótipo ou fenótipo alterado.
[00210] Como usado aqui com respeito às modificaçãos de duas proteínas ou sequências de aminoácido, o termo "correspondendo a" é usado para indicar que uma modificação especificada na primeira pro- teína é uma substituição do mesmo resíduo de aminoácido como na modificação na segunda proteína, e que a posição de aminoácido da modificação nas primeiras proteínas corresponde a ou se alinha com a posição de aminoácido da modificação na segunda proteína quando as duas proteínas são submetidas aos alinhamentos de sequência pa- drão (por exemplo, usando o programa BLASTp). Desse modo, a mo- dificação de resíduo "X" em aminoácido "A" na primeira proteína cor-
responderá à modificação de resíduo "Y" em aminoácido "A" na se- gunda proteína se os resíduos X e Y corresponderem uns aos outros em um alinhamento de sequência, e apesar do fato de que X e Y po- dem ser números diferentes.
[00211] Como usado aqui, os termos "tratamento" ou "tratando um indivíduo" refere-se à administração de uma meganuclease modificada da invenção, ou um ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada da invenção, a um indivíduo infectado com VHB com a fi- nalidade de diminuir ou interromper a taxa de proliferação de VHB do vírus, clivando o genoma de pelo menos uma partícula VHB. Tal tra- tamento reduz ou impede a transfecção e replicação de VHB no indiví- duo, e ou alívio parcial ou completo de um ou mais sintomas de VHB no indivíduo. Métodos para avaliar o alívio de sintomas de infecção por VHB podem incluir medição das funções hepáticas, determinando os níveis da enzima alanina aminotransferase (ALT) ou medição da con- versão serológica, a saber, desaparecimento da HbeAg. Além disso, alívio ou redução dos sintomas de VHB pode ser determinado exami- nando biópsias hepáticas e medindo o nível de fibrose tecidual por mé- todos bem conhecidos na técnica. O número de partículas virais circu- lantes pode ser determinado, por exemplo, medindo os níveis de DNA do VHB utilizando PCR ou detectando os níveis de HBsAg no sangue. Os termos "tratamento" ou "tratando um indivíduo" podem também re- ferir-se à administração de uma célula (por exemplo, células de hepa- tócitos) compreendendo um ácido nucleico codificando uma meganu- clease modificada, em que a célula é liberada para um tecido alvo (por exemplo, fígado) e produz uma meganuclease modificada em uma quantidade suficiente para tratar uma infecção por VHB no indivíduo, desse modo resultando em alívio parcial ou completo de um ou mais sintomas de VHB. Em alguns aspectos, uma meganuclease modifica- da da invenção, um ácido nucleico codificando a mesma, ou uma célu-
la geneticamente modificada da invenção administrada durante o tra- tamento sob na forma de uma composição farmacêutica da invenção.
[00212] O termo "infecção pelo Vírus da Hepatite B" refere-se a qualquer condição relacionada à ou resultante de infecção por um ví- rus da hepatite B, como doenças/distúrbios crônicos do fígado, infla- mações, condições fibróticas e distúrbios proliferativos, como cânceres hepáticos. A infecção por VHB crônica persistente pode causar fadiga, lesão hepática, cirrose hepática e carcinoma hepatocelular, um câncer hepático primário.
[00213] Os termos "proliferante" e "proliferação" como usados aqui referem-se às células de VHB que ativamente se dividem e infectam células humanas. Desse modo, redução na proliferação refere-se a qualquer diminuição na proliferação de VHB incluindo redução de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 100% quando comparada a um contro- le apropriado não tendo sido administrada a meganuclease modifica- da, ou ácido nucléico codificando a meganuclease modificada, aqui. Por todo este pedido, o termo "distúrbio proliferativo" refere-se a qual- quer doença/distúrbio marcado pela proliferação indesejada ou aber- rante de tecido. Como usado aqui, o termo "distúrbio proliferativo" também refere-se às condições em que o crescimento desregulado e/ou anormal de células pode induzir ao desenvolvimento de uma do- ença indesejada, que pode ser cancerosa ou não cancerosa.
[00214] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeutica- mente eficaz" refere-se a uma quantidade suficiente para conseguir efeitos benéficos ou biológicos e/ou resultados clínicos desejáveis. A quantidade terapeuticamente eficaz variará dependendo da formula- ção ou composição da meganuclease, da doença e da sua gravidade e da idade, peso, condição física e capacidade de resposta do indiví- duo a ser tratado. Nas modalidades específicas, uma quantidade efi-
caz da meganuclease modificada ou composições farmacêuticas des- critas aqui reduz o nível ou proliferação de VHB ou reduz pelo menos um sintoma de VHB em um indivíduo com uma infecção por VHB.
[00215] O termo "nanopartícula de lipídio" refere-se a uma compo- sição de lipídio tendo uma estrutura tipicamente esférica com um diâ- metro médio entre 10 e 1000 nanometrômetros. Em algumas formula- ções, as nanopartículas de lipídio podem compreender pelo menos um lipídio catiônico, pelo menos um lipídio não catiônico, e pelo menos um lipídio conjugado. Nanopartículas de lipídio conhecidas na técnica são adequadas para encapsulação de ácidos nucleicos, tal como mRNA, são contempladas para uso na invenção.
[00216] Como usado aqui, a recitação de uma faixa numérica para uma variável pretende transmitir que a invenção pode ser praticada com a variável igual a qualquer dos valores dentro dessa faixa. Desse modo, para uma variável que é inerentemente discreta, a variável pode ser igual a qualquer valor inteiro dentro da faixa numérica, incluindo os pontos finais da faixa. Similarmente, para uma variável que é ineren- temente contínua, a variável pode ser igual a qualquer valor real den- tro da faixa numérica, incluindo os pontos finais da faixa. Como exem- plo, e sem limitação, uma variável que é descrita como tendo valores entre 0 e 2 pode assumir os valores 0, 1 ou 2 se a variável for ineren- temente discreta, e pode assumir os valores 0.0, 0.1, 0.01, 0.001, ou qualquer outro valor real ≧ 0 e ≦ 2 se a variável for inerentemente contínua.
2.1 Princípio da invenção
[00217] A presente invenção é baseada, em parte na hipótese de que as meganucleases modificadas podem ser usadas para reduzir o nível de VHB ou diminuir a proliferação do VHB pela clivagem de uma ORF dentro do genoma do VHB. Mais especificamente, as meganu- cleases podem ser modificadas para reconhecer e clivar uma sequên-
cia de reconhecimento presente dentro do genoma de múltiplos genó- tipos de VHB. Desse modo, uma meganuclease modificada simples pode ser usado para reduzir o nível de proliferação do VHB, ou reduzir os sintomas de uma infecção por VHB, de múltiplos genótipos do vírus da Hepatite B.
[00218] Desse modo, a presente invenção abrange meganucleases modificadas que reconhecem e clivam uma sequência de reconheci- mento dentro de uma ORF de pelo menos 2 genótipos do genoma do VHB. A presente invenção também abrange métodos de uso de tais meganucleases modificadas em uma composição farmacêutica e em métodos para o tratamento de infecção por VHB. Além disso, a inven- ção abrange composições farmacêuticas compreendendo proteínas de meganuclease modificadas, ou ácidos nucleicos codificando meganu- cleases modificadas, e o uso de tais composições para o tratamento de infecção por VHB.
2.2 Meganucleases para reconhecimento e clivagem de Sequência de reconhecimentos dentro do Genome de VHB
[00219] É conhecido na técnica que é possível usar uma nuclease específica de sítio para fazer uma quebra de DNA no genoma de um vírus, e que tal quebra de DNA pode resultar em uma mutação perma- nente do genoma por meio de NHEJ, de modo que o vírion de VHB não possa mais dividir-se ou infectar células humanas. Desse modo, em uma modalidade, a invenção pode ser praticada usando meganu- cleases recombinantes modificadas.
[00220] Em modalidades preferidas, as nucleases usadas para pra- ticar a invenção são meganucleases de cadeia simples. Uma meganu- clease de cadeia simples compreende uma subunidade de terminal N e uma subunidade de terminal ligadas por um peptídeo ligante. Cada um dos dois domínios reconhece metade da sequência de reconheci- mento (isto é, um meio sítio de reconhecimento) e o sítio de clivagem de DNA está no meio da sequência de reconhecimento próximo à in- terface das duas duas subunidades. As quebras de rupture de DNA são compensadas por quatro pares de base de modo que a clivagem de DNA por uma meganuclease gere um par de quatro pares de base, protuberâncias de filamento simples 3'.
[00221] Em alguns exemplos, meganucleases modificadas da in- venção foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10). A sequência de reco- nhecimento do VHB 1-2 é posicionada dentro das ORFs de proteína P, S, preS2/S, e preS1/preS2 de múltiplos genótipos de VHB. A sequên- cia de reconhecimento do VHB 1-2 pode pelo menos ser encontrada no genoma de múltiplos genótipos de VHB incluindo genótipo A, B, C, E, F, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-5 e 7-9, respectivamente). Tais meganucleases modificadas são coletivamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 1-2." Meganucleases de VHB 1-2 exemplares são fornecidas nas SEQ ID NOs: 18-21.
[00222] Em exemplos adicionais, meganucleases modificadas da invenção foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12). A sequência de reco- nhecimento do VHB 5-6 é posicionada dentro das ORFs de proteína P, S, preS2/S e preS1/preS2 de múltiplos genótipos de VHB. A sequência de reconhecimento do VHB 5-6 pode pelo menos ser encontrada no genoma de múltiplos genótipos de VHB incluindo genótipo A, B, C, D, E, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-7 e 9, respectivamente). Tais meganucleases modificadas são coletivamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 5-6." Meganucleases de VHB 5-6 exemplares são fornecidas nas SEQ ID NOs: 22-28.
[00223] Em exemplos adicionais, meganucleases modificadas da invenção foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14). A sequência de reco-
nhecimento do VHB 7-8 é posicionada dentro da ORF de proteína P de múltiplos genótipos de VHB. A sequência de reconhecimento do VHB 7-8 pode pelo menos ser encontrada no genoma de múltiplos ge- nótipos de VHB incluindo genótipo A, B, C, D, F, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-6, 8, e 9, respectivamente). Tais meganucleases modi- ficadas são coletivamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 7-8." Meganucleases VHB 7-8 exemplares são fornecidas nas SEQ ID NOs: 29-32.
[00224] Em exemplos adicionais, meganucleases modificadas da invenção foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16). A sequência de re- conhecimento do VHB 11-12 é posicionada dentro da ORF de proteína P de múltiplos genótipos de VHB. A sequência de reconhecimento do VHB 11-12 pode pelo menos ser encontrada no genoma de múltiplos genótipos de VHB incluindo genótipo A, B, C, D, E, F, e G (por exem- plo, SEQ ID NOs: 3-9, respectivamente). Tais meganucleases modifi- cadas são coletivamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 11-12." Meganucleases de VHB 11-12 exemplares são fornecidas nas SEQ ID NOs: 34-40.
[00225] Meganucleases modificadas da invenção compreendem uma primeira subunidade, compreendendo uma primeira região hiper- variável (HVR1), e uma segunda subunidade, compreendendo uma segunda região hipervariável (HVR2). Além disso, a primeira subuni- dade se liga a um primeiro meio sítio de reconhecimento na sequência de reconhecimento (por exemplo, o meio sítio de VHB1, VHB5, VHB7, ou VHB11), e a segunda subunidade se liga a um segundo meio sítio de reconhecimento na sequência de reconhecimento (por exemplo, o meio sítio de VHB2, VHB6, VHB8, ou VHB12). Nas modalidades onde a meganuclease modificada é uma meganuclease de cadeia simples, a primeira e segunda subunidades podem ser orientadas de modo que a primeira subunidade, que compreende a região de HVR1 e liga o primeiro meio sítio, seja posicionada como a subunidade de terminal N, e a segunda subunidade, que compreende a região de HVR2 e liga o segundo meio sítio, seja posicionada como a subunidade de terminal C.
Em modalidades alternativas, a primeira e segunda subunidades podem ser orientadas de modo que a primeira subunidade, que com- preende a região de HVR1 e liga o primeiro meio sítio, seja posiciona- da como a subunidade de terminal C, e a segunda subunidade, que compreende a região de HVR2 e liga o segundo meio sítio, seja posi- cionada como a subunidade de terminal N.
Meganucleases de VHB 1- 2 exemplares da invenção são fornecidas nas Tabela 1. Meganuclea- ses de VHB 5-6 exemplares da invenção são fornecidas na Tabela 2. Meganucleases de VHB 7-8 exemplares da invenção são fornecidas na Tabela 3. Meganucleases de VHB 11-12 exemplares da invenção são fornecidas na Tabela 4. Tabela 1. Meganucleases modificadas exemplares criadas para reco- nhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10) Meganucle- AA Resíduos Subuni- *Subuni Resíduos Subuni- *% de ase SEQ de subuni- dade de dade de de subu- dade de subuni- ID dade de VHB1 VHB1 % nidade de VHB2 dade de VHB1 SEQ ID VHB2 SEQ ID VHB2 VHB 1-2x.2 18 7-153 40 100 198-344 44 100 VHB 1-2x.14 19 7-153 41 93,2 198-344 45 91,16 VHB 1-2x.68 20 198-344 42 93,2 7-153 46 91,16 VHB 1-2x.93 21 198-344 43 100 7-153 47 95,92 *"% de Subunidade de VHB1" e "% de subunidade de VHB2" repre- sentam a identidade de sequência de aminoácido entre as regiões de subunidade de ligação ao VHB1 e ligação de VHB2 de cada meganu- clease e as regiões de subunidade de ligação ao VHB1 e ligação de VHB2, respectivamente, da meganuclease de VHB 1-2x.2.
Tabela 2. Meganucleases modificadas exemplares criadas para reco- nhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12) Meganucle- AA SEQ Resíduo Subuni- *% de Resíduo Subuni- *% de ase ID de Su- dade de subuni- de Su- dade de Subuni- bunidade VHB5 dade de bunidade VHB6 dade de de VHB5 SEQ ID VHB5 de VHB6 SEQ ID VHB6 VHB 5-6x.33 22 198-344 48 100 7-153 55 100 VHB 5-6x.84 23 198-344 49 93,2 7-153 56 92,52 VHB 5-6x.90 24 198-344 50 91,84 7-153 57 93,2 VHB 5-6x.4 25 7-153 51 92,52 198-344 58 95,92 VHB 5-6x.5 26 7-153 52 92,52 198-344 59 93,88 VHB 5-6x.68 27 7-153 53 91,16 198-344 60 93,88 VHB 5-6x.79 28 7-153 54 93,2 198-344 61 93,88
[00226] *"% de subunidade de VHB5" e "de subunidade de VHB6 %" representam a identidade de sequência de aminoácido entre as regiões de subunidade de ligação ao VHB5 e ligação de VHB6 de ca- da meganuclease e as regiões de subunidade de ligação ao VHB5 e ligação de VHB6, respectivamente, da meganuclease de VHB 5-6x.33. Tabela 3. Meganucleases modificadas exemplares criadas para reco- nhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14) Meganucle- AA SEQ Resíduos Subuni- *% de Resíduos Subuni- *% de ase ID de subu- dade de Subuni- de subu- dade de subuni- nidade de VHB7 dade de nidade VHB8 dade de VHB7 SEQ ID VHB7 de VHB8 SEQID VHB8 VHB 7-8x.2 29 198-344 62 100 7-153 66 100 VHB 7-8x.9 30 198-344 63 98,64 7-153 67 99,32 VHB 7-8x.17 31 198-344 64 98,64 7-153 68 99,32 VHB 7-8x.44 32 198-344 65 96,6 7-153 69 99,32 *"% de Subunidade de VHB7" e "% de Subunidade de VHB8" repre- sentam a identidade de sequência de aminoácido entre as regiões de subunidade de ligação ao VHB7 e ligação de VHB8 de cada meganu- clease e as regiões de subunidade de ligação ao VHB7 e ligação de VHB8, respectivamente, da meganuclease de VHB 7-8x.2.
Tabela 4. Meganucleases modificadas exemplares criadas para reco- nhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16) Meganuclease AA Resí- Subuni- *% de Resí- Subuni- *% de SEQ duos de dade de subuni- duos de dade de subuni- ID subuni- VHB11 dade de subuni- VHB12 dade de dade de SEQ ID VHB11 dade de SEQ ID VHB12 VHB11 VHB12 VHB 11-12x.26 33 198-344 70 100 7-153 77 100 VHB 11-12x.9 34 198-344 71 93,2 7-153 78 93,88 VHB 11-12x.13 35 198-344 72 93,88 7-153 79 93,88 VHB 11-12x.16 36 198-344 73 95,92 7-153 80 95,92 VHB 11-12x.27 37 198-344 74 100 7-153 81 93,2 VHB 11-12x.41 38 198-344 75 95,92 7-153 82 93,2 VHB 11-12x.48 39 198-344 76 93,88 7-153 83 93,2 *"% de subunidade de VHB11" e "% de subunidade de VHB12" repre- sentam a identidade de sequência de aminoácido entre as regiões de subunidade de ligação ao VHB11 e ligação de VHB12 de cada me- ganuclease e as regiões de subunidade de ligação ao VHB11 e liga- ção de VHB12, respectivamente, das meganucleases de VHB 11- 12x.26.
2.3 Métodos para Liberação e Expressão de Endonucleases
[00227] São descritos aqui métodos para o tratamento de infecção por VHB ou HCC em um indivíduo. Igualmente, são fornecidos méto- dos para a redução dos sintomas de uma infecção por VHB e redução da quantidade de VHB, redução da taxa de proliferação de VHB ou tratamento de HCC em um indivíduo compreendendo administrar uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceutica- mente aceitável e uma meganuclease modificada descrita aqui (ou um ácido nucleico codificando a meganuclease modificada). Nos métodos da invenção, uma meganuclease modificada descrita aqui pode ser liberada para e/ou expressa de DNA/RNA em células alvo que pode fornecer uma meganuclease modificada para o genoma de VHB.
[00228] Meganucleases modificadas descritas aqui podem ser libe- radas em uma célula na forma de proteína ou, preferivelmente, como um ácido nucleico codificando a meganuclease modificada. Tal ácido nucleico pode ser DNA (por exemplo, de plasmídeo circular ou lineari- zado ou produtos de PCR) ou RNA (por exemplo, mRNA). Para moda- lidades em que a sequência de codificação de meganuclease modifi- cada é liberada na forma de DNA, deve estar operativamente ligada a um promotor para facilitar a transcrição do gene da nuclease. Promo- tores de mamíferos adequados para a invenção incluem promotores constitutivos, como o promotor precoce do citomegalovírus (CMV) (Thomsen et al. (1984), Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):659-63) ou o promotor precoce de SV40 (Benoist and Chambon (1981), Nature. 290(5804):304-10) bem como promotores induzíveis tal como o pro- motor induzível por tetraciclina (Dingermann et al. (1992), Mol Cell Bi- ol. 12(9):4038-45). Uma meganuclease modificada da invenção pode também ser operavelmente ligada a um promotor sintético. Promotores sintéticos podem incluir, sem limitação, o promotor de JeT (WO 2002/012514). Nas modalidades específicas, uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada como descrito aqui pode ser operavelmente ligada a um promotor específico de fíga- do. Exemplos de promotores específicos de fígado, sem limitação, promotor de antitripsina alfa-1 humana e promotor de apolipoproteína A-II.
[00229] Nas modalidades específicas, uma sequência de ácido nu- cleico codificando pelo menos uma meganuclease modificada é libera- da em uma construção de DNA recombinante ou cassete de expres- são. Por exemplo, a construção de DNA recombinante pode compre- ender um cassete de expressão (isto é, "cassete") compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma me- ganuclease modificada descrita aqui. Em outras modalidades, a cons-
trução de DNA recombinante compreende dois ou mais cassetes, em que cada cassete compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganuclease modificada tem especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui. Em mo- dalidades particulares, a construção de DNA recombinante pode com- preender dois cassetes, três cassetes, quatro cassetes, ou mais. Por exemplo, um cassete ou combinação de cassetes pode codificar qual- quer número ou combinação de uma meganuclease de VHB 1-2, uma meganuclease de VHB 5-6, uma meganuclease de VHB 7-8, e uma meganuclease de VHB 11-12. Em algumas modalidades, um cassete simples pode codificar uma meganuclease de VHB 1-2, uma meganu- clease de VHB 5-6, uma meganuclease de VHB 7-8, e uma meganu- clease de VHB 11-12. Em outra modalidade particular, um cassete ou combinação de cassetes pode codificar uma meganuclease de VHB 5- 6 e uma meganuclease de VHB 11-12.
[00230] Em outras modalidades, a construção de DNA recombinan- te compreende um cassete compreendendo um promotor e uma se- quência de ácido nucleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da sequência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrônico descrito aqui em uma célula alvo.
[00231] Em algumas modalidades, mRNA codificando uma me- ganuclease modificada é liberada para uma célula porque isto reduz a probabilidade de que o gene codificando a meganuclease modificada se integrará no genoma da célula. Tal mRNA codificando uma me- ganuclease modificada pode ser produzido usando métodos conheci- dos na técnica tal como transcrição in vitro. Em algumas modalidades, o mRNA é tamponado usando 7-metil-guanosina. Em algumas modali- dades, o mRNA pode ser poliadenilado.
[00232] Em modalidades particulares, um mRNA codificando uma nuclease modificada da invenção pode ser um mRNA policistônico co- dificando duas ou mais nucleases que são simultaneamente expressas em uma célula. Em algumas modalidades, um mRNA policistrônico pode codificar duas ou mais meganucleases descritas aqui que alve- jam diferentes sequências de reconhecimento no genoma de VHB, de modo que o genoma de VHB seja clivado em múltiplos sítios. Em al- gumas modalidades, um mRNA policistrônico pode codificar duas ou mais meganucleases descritas aqui e pelo menos uma proteína adici- onal que induz um efeito terapeuticamente benéfico na célula. Um mRNA policistrônico da invenção pode compreender qualquer elemen- to conhecido na técnica para permitir a translação de dois ou mais ge- nes da mesma molécula de mRNA incluindo, porém não limitado a, um elemento de IRES, um elemento de T2A, um elemento de P2A, um elemento de E2A, e um elemento de F2A. Em modalidades particula- res, o mRNA policistrônico é um mRNA bicistrônico codificando duas meganucleases descritas aqui, um mRNA tricistrônico codificando três meganucleases descritas aqui, ou um mRNA quadcistrônico codifican- do quatro meganucleases descritas aqui, em que as nucleases codifi- cadas por cada mRNA têm especificidade para diferentes sequências de reconhecimento no genoma de VHB. Por exemplo, um mRNA poli- cistrônico pode codificar qualquer número ou combinação de uma me- ganuclease de VHB 1-2, uma meganuclease de VHB 5-6, uma me- ganuclease de VHB 7-8, e uma meganuclease de VHB 11-12. Em al- gumas modalidades, um mRNA policistrônico pode codificar uma me- ganuclease de VHB 1-2, uma meganuclease de VHB 5-6, uma me- ganuclease de VHB 7-8, e uma meganuclease de VHB 11-12. Em ou- tra modalidade particular, um mRNA policistrônico pode ser um mRNA bicistrônico codificando uma meganuclease de VHB 5-6 e uma me- ganuclease de VHB 11-12.
[00233] Em outra modalidade particular, um ácido nucleico codifi-
cando um endonuclease da invenção pode ser introduzido ma célula usando um modelo de DNA de filamento simples. O DNA de filamento simples pode também compreender uma repetição terminal invertida (ITR) de AVV 5' e/ou 3' a montante e/ou a jusante da sequência codifi- cando a meganuclease modificada. Em outras modalidades, o DNA de filamento duplo pode também compreender uma ramificação de hho- mologia 5' e/ou 3' a montante e/ou a jusante da sequência codificando a meganuclease modificada.
[00234] Em outra modalidade particular, genes codificando uma en- donuclease da invenção podem ser introduzidos em uma célula usan- do um modelo de DNA linearizado. Em alguns exemplos, um DNA plasmidial codificando uma endonuclease pode ser digerida por uma ou mais enzimas de restrição de modo que o DNA plasmidial circular seja linearizado antes de ser introduzido em uma célula.
[00235] As proteínas nuclease purificadas podem ser liberadas em células para clivar o DNA genômico por uma variedade de mecanis- mos diferentes conhecidos na técnica, incluindo aqueles detalhados aqui abaixo.
[00236] O tecido(s) alvo para liberação de meganucleases modifi- cadas da invenção inclui, sem limitação, células do fígado, tais como uma célula de hepatócito ou preferivelmente um hepatócito primário, mais preferivelmente um hepatócito humano ou um hepatócito primário humano, uma célula HepG2.2.15 ou HepG2-hNTCP. Como descrito, meganucleases da invenção podem ser liberadas como protepina puri- ficada ou como RNA ou DNA codificando a meganuclease. Em uma modalidade, proteínas meganuclease, ou mRNA, ou vetores de DNA codificando endonucleases, são fornecidos para alvejar as células (por exemplo, células no fígado) por meio de injeção diretamente no tecido alvo. Alternativamente, a proteína de endonuclease, mRNA, ou DNA pode ser liberada sistemicamente por meio do sistema circulatório.
[00237] Em algumas modalidades, proteínas endonuclease, ou DNA/mRNA codificando endonucleases, são formulados para adminis- tração sistêmica, ou administração para alvejar os tecidos, em um veí- culo farmaceuticamente aceitável de acordo com técnicas conhecidas. Veja, por exemplo, Remington, The Science and Practice of Pharma- cy (21a edição, 2005). Na fabricação de uma formulação farmacêutica de acordo com a invenção, proteínas/RNA/mRNA são tipicamente mis- turadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo deve, certamente, ser aceitável no sentido de ser compatível com quaisquer outros ingredientes na formulação e não deve ser nocivo para o paci- ente. O veículo pode ser um sólido ou um líquido, ou ambos, e pode ser formulado com o composto como uma formulação de dose unitária.
[00238] Em algumas modalidades, proteínas endonuclease, ou DNA/mRNA codificando a endonuclease, são acoplados a uma célula que penetra o peptídeo ou alveja o ligante para facilicitar a captação celular. Exemplos de peptídeos penetrantes conhecidos na técnica in- cluem poli-arginina (Jearawiriyapaisarn, et al. (2008) Mol Ther. 16:1624-9), peptídeo de TAT do vírus HIV (Hudecz et al. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736), MPG (Simeoni, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2717–2724), Pep-1 (Deshayes et al. (2004) Biochemistry 43: 7698–7706, e HSV-1 VP-22 (Deshayes et al. (2005) Cell Mol Life Sci. 62:1839-49. Em uma modalidade alternativa, proteínas, ou DNA/mRNA endonuclease codificando endonucleases, são acoplados covalentemente ou não covalentemente a um anticorpo que reconhece um receptor de superfície celular específico expresso em células alvo de modo que a proteína de endonuclease/DNA/mRNA se ligue a e se- ja onternalizado pelas células alvo. Alternativamente, proteína de en- donuclease/DNA/mRNA pode ser acoplado covalentemente ou não covalentemente ao ligante natural (ou uma porção do ligante natural) para tal receptor de superfície celular. (McCall, et al. (2014) Tissue
Barriers. 2(4):e944449; Dinda, et al. (2013) Curr Pharm Biotechnol. 14:1264-74; Kang, et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol. 15(3):220-30; Qian et al. (2014) Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10(11):1491-508).
[00239] Em algumas modalidades, proteínas, ou DNA/mRNA endo- nuclease codificando endonucleases, são encapsulados dentro de hi- drogéis biodegradáveis para injecção ou implantação dentro da região desejada do fígado (por exemplo, na proximidade de células endoteli- ais hepáticas sinusoidais ou células endoteliais hematopoiéticas, ou células progenitoras que se diferenciam na mesma). Os hidrogéis po- dem fornecer liberação prolongada e sintonizável da carga útil terapêu- tica para a região desejada do tecido alvo, sem a necessidade de inje- ções frequentes, e materiais sensíveis a estímulos (por exemplo, hi- drogéis sensíveis à temperatura e ao pH) podem ser projetados para liberar a carga útil em resposta a estímulos ambientais ou externamen- te aplicados (Kang Derwent et al. (2008) Trans Am Ophthalmol Soc. 106:206-214).
[00240] Em algumas modalidades, proteínas, ou DNA/mRNA endo- nuclease codificando endonucleases, são acoplados covalentemente ou, preferivelmente, não covalentemente a uma nanopartícula ou en- capsulados dentro de tal nanopartícula usando os métodos conhecidos na técnica (Sharma, et al. (2014) Biomed Res Int. 2014). Uma nano- partícula é um sistema de liberação em nanoescala, cuja escala de comprimento é <1 µm, preferivelmente <100 nm. Tais nanopartículas podem ser planejadas usando um núcleo composto de metal, lipídio, polímero, ou macromolecula biológica, e múltiplas cópias das proteí- nas de endonuclease, mRNA, ou DNA podem ser ligadas a ou encap- suladas com o núcleo de nanopartícula. Isto aumenta o número de có- pia da proteína/mRNA/DNA que é liberado para cada célula e, assim, aumenta a expressão intracelular de cada endonuclease para maximi- zar a probabilidade de que as sequências de reconhecimento alvo se-
jam cortadas. A superfície de tais nanopartículas pode ser também modificada com polímeros ou lipídios (por exemplo, quitosana, políme- ros catiônicos, lipídios ou catiônicos) para formar uma nanopartícula de núcleo-casca cuja superfície confere funcionalidades adicionais pa- ra melhorar a liberação celular e a captação da carga útil. (Jian et al. (2012) Biomaterials. 33(30): 7621-30). Nanopartículas podem adicio- nalmente ser vantajosamente acopladas para alvejar as moléculas pa- ra direcionar a nanopartícula para o tipo de célula apropriado e/ou au- mentar a probabilidade de captação celular. Exemplos de tais molécu- las alvo incluem anticorpos específicos para receptores de superfície celular e os ligantes naturais (ou porções dos ligantes naturais) para receptores de superfície celular.
[00241] Em algumas modalidades, as proteínas de endonuclease ou DNA/mRNA codificando as endonucleases são encapsulados den- tro de lipossomas ou complexados usando lipídios catiônicos (veja, por exemplo, reagente de transfecção LIPOFECTAMINE, Life Technologi- es Corp., Carlsbad, CA; Zuris et al. (2015) Nat Biotechnol. 33: 73-80; Mishra et al. (2011) J Drug Deliv. 2011:863734). As formulações de lipossomas e lipoplexos podem proteger a carga útil da degradação, realçar o acúmulo e retenção no sítio alvo, e facilitar a captação celular e a eficiência de liberação através da fusão com e/ou ruptura das membranas celulares das células alvo.
[00242] Em algumas modalidades, proteínas, ou DNA/mRNA endo- nuclease codificando endonucleases, são encapsulados dentro de an- daimes poliméricos (por exemplo, PLGA) ou complexados usando po- límeros catiônicos (por exemplo, PEI, PLL) (Tamboli et al. (2011) Ther Deliv. 2(4): 523-536). Veículos poliméricos podem ser planejados para fornecer taxas de libertação de fármaco sintonizáveis através do con- trolo da erosão de polimerização e difusão de fármaco, e eficiências de encapsulação de fármaco elevado podem oferecer proteção da carga útil terapêutica até à liberação intracelular à população de células alvo desejada.
[00243] Em algumas modalidades, proteínas, ou DNA/mRNA endo- nuclease codificando meganucleases modificadas, são combinados com moléculas anfifílicas que se montam em micelas (Tong et al. (2007) J Gene Med. 9(11): 956-66). As micelas poliméricas podem in- cluir uma casca micelar formada com um polímero hidrofílico (por exemplo, polietilenoglicol) que pode impedir a agregação, mascarar as interações de carga e reduzir as interações não específicas.
[00244] Em algumas modalidades, proteínas, ou DNA/mRNA endo- nuclease codificando endonucleases, são formulados em uma emul- são ou uma nanoemulsão (isto é, tendo um diâmetro médio de partícu- la <1nm) para administração e/ou liberação para a célula-alvo. O termo "emulsão" refere-se a, sem limitação, quaisquer dispersões ou gotícu- las óleo-em-água, água-em-óloe, água-em-óleo-em-água ou óleo-em- água-emóleo, incluindo estruturas lipídicas que podem se formar como resultado de forças hidrofóbicas que impulsionam resíduos apolares (por exemplo, longas cadeias de hidrocarbonetos) longe da água e grupos cabeças polares em direção à água, quando uma fase imiscível em água é misturada com uma fase aquosa. Estas outras estruturas lipídicas incluem, porém não estão limitadas a, vesículas lipídicas uni- lamelares, paucilamelares e multilamelares, micelas e fases lamelares. Emulsões são compostas de uma fase aquosa e uma fase lipofílica (tipicamente contendo um óleo e um solvente orgânico). Emulsões também frequentemente contêm um ou mais tensoativos. As formula- ções de nanoemulsões são bem conhecidas, por exemplo, como des- crito nos Pedidos de Patente dos Estados Unidos nºs. 2002/0045667 e 2004/0043041, e Patentes dos Estados Unidos nºs 6.015.832,
6.506.803, 6.635.676, e 6.559.189, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[00245] Em algumas modalidades, proteínas, ou DNA/mRNA endo- nuclease codificando endonucleases, são covalentemente ligados a, ou não covalentemente associados com conjugados poliméricos multi- funcionais, dendrímeros de DNA e dendrímeros poliméricos (Mastora- kos et al. (2015) Nanoscale. 7(9): 3845-56; Cheng et al. (2008) J Pharm Sci. 97(1): 123-43). A geração de dendrímeros pode controlar a capacidade e tamanho de carga útil, e pode fornecer uma alta capaci- dade de carga útil de fármaco. Além disso, a exibição de múltiplos grupos de superfície pode ser aproveitada para melhorar a estabilida- de, reduzir interações não específicas, e realçar o direcionamento de células específicas e liberação de fármaco.
[00246] Em algumas modalidades, genes codificando uma endonu- clease são liberada usando um vetor viral. Tais vetores são conheci- dos na técnica e incluem vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, e vetores de vírus adeno-associados (AAV) (revisado em Vannucci, et al. (2013 New Microbiol. 36:1-22). Em algumas modalida- des, os vetores virais são injetados diretamente em tecidos alvo (por exemplo, tecido hepático). Em modalidades alternativas, os vetores virais são liberados sistemicamente por meio do sistema circulatório. É conhecido na técnica que diferentes vetores de AAV tendem a locali- zar-se em diferentes tecidos. Nos tecidos alvo do fígado, transdução eficaz dos hepatócitos foi demonstrada, por exemplo, com os serotipos AAV 2, 8, e 9 (Sands (2011) Methods Mol. Biol. 807:141-157). Os veto- res AAV também podem ser auto-complementares de modo que não requeiram a síntese de DNA de segundo filamento na célula hospedei- ra (McCarty, et al. (2001) Gene Ther. 8:1248-54).
[00247] Em uma modalidade, um vetor viral usado para liberação do gene da endonuclease é um vetor viral autolimitante. Um vetor viral autolimitante pode ter tempo de persistência limitado em uma célula ou organismo devido à presença de uma sequência de reconhecimento para uma meganuclease modificada dentro do vetor. Desse modo, um vetor viral autolimitante pode ser modificado para fornecer codificação para um promotor, um endonuclease descrita aqui, e um sítio de reco- nhecimento de endonuclease dentro das ITRs. O vetor viral autolimi- tante libera o gene da endonuclease para uma célula, tecido ou orga- nismo, de modo que a endonuclease seja expressa e capaz de cortar o genoma da célula em uma sequência de reconhecimento endógena dentro do genoma. A endonuclease liberada também encontrará seu sítio dentro do próprio vetor viral autolimitante, e cortará o vetor neste sítio alvo. Uma vez cortadas, as extremidades 5' e 3' do genoma viral serão expostas e degradadas por exonucleases, desse modo matando o vírus e cessando a produção da endonuclease.
[00248] Se os genes da endonuclease são liberados na forma de DNA (por exemplo, plasmídio) e/ou por meio de um vetor viral (por exemplo, AAV) eles devem ser operavelmente ligados a um promotor. Em algumas modalidades, este pode ser a promotor viral tal como promotores endógenos do vetor viral (por exemplo, a LTR de um vetor lentiviral) ou os promotores precoces de citomegalovírus ou vírus SV40 bem conhecidos. Em uma modalidade preferida, os genes da meganuclease são operavelmente ligados a um promotor que regula a expressão de gene preferenciallmente nas células alvo. Exemplos de promotores específicos de fígado incluem, sem limitação, promotor de antitripsina alfa-1 humana e promotor de apolipoproteína A-II.
[00249] Em modalidades particulares, o vetor viral compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nu- cleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui. O ve- tor viral também pode compreender dois ou mais cassetes, em que cada cassete compreende um promotor e uma sequência de ácido nu- cleico codificando uma meganuclease modificada descrita aqui, e em que cada meganuclease modificada tem especificidade para uma dife-
rente sequência de reconhecimento de VHB descrita aqui. Em algu- mas modalidades, o vetor viral compreende um cassete compreen- dendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico policistrônico, em que o promotor regula a expressão da sequência de ácido nucleico polistrônico para gerar um mRNA policistrônico, such as mRNA policis- trônico codificando uma meganuclease modificada, descritas aqui em uma célula alvo.
[00250] Métodos e composições são fornecidos para liberação de uma meganuclease descrita aqui ao fígado de um indivíduo infectado com VHB. Em uma modalidade, hepatócitos nativos que foram remo- vidos do mamífero podem ser transduzidos com um vetor que codifica a meganuclease modificada. Alternativamente, hepatócitos nativos do indivíduo infectado pelo VHB podem ser transduzidos ex vivo com an adenovetor viral que codifica a meganuclease modificada e/ou uma molécula que estimula a regeneração do fígado, como uma hepatoto- xina. Preferivelmente, a hepatotoxina é uPA, e foi modificada para ini- bir sua secreção do hepatócito, uma vez expressa pelo vetor viral. Em outra modalidade, o vetor codifica tPA, que pode estimular a regenera- ção de hepatócitos de novo. Os hepatócitos transduzidos que foram removidos do mamífero podem então ser retornados para o mamífero, onde condições sao fornecidas que são conducentes à expressão da meganuclease modificada. Tipicamente, os hepatócitos transduzidos podem ser devolvidos ao paciente por infusão através da vasculatura do baço ou portal, e a administração pode ser única ou múltipla duran- te um período de 1 a 5 ou mais dias.
[00251] Em um aspecto in vivo dos métodos da invenção, um vetor retroviral, pseudotipo ou adenoviral associado é construído que codifi- ca a meganuclease modificada e é administrada ao indivíduo. A admi- nistração de um vetor codificando a meganuclease modificada pode ocorrer com a administração de um vetor adenoviral que codifica uma hepatotoxina deficiente em secreção, ou codifica tPA, que estimula a regeneração de hepatócitos sem agir como hepatotoxina.
[00252] Doses apropriadas dependerão, entre outros fatores, dos específicos de qualquer vetor de AVV escolhido (por exemplo, soroti- po, etc.), da rotina de administração, do indivíduo que está sendo tra- tado (isto é, idade, peso, sexo, e condição geral do indivíduo), e do modo de administração. Desse modo, a dosagem apropriada pode va- riar de paciente para paciente. Uma quantidade eficaz apropriada pode ser facilmente determinada por alguém versado na técnica. O trata- mento posológico pode ser um esquema de dose única ou um esque- ma de múltiplas doses. Além disso, o indivíduo pode ser administrado com tantas doses quanto apropriado. Alguém versado na técnica pode facilmente determinar um número apropriado de doses. A dosagem pode precisar ser ajustada para leva rem consideração uma rotina al- ternativa de administração, ou equilibrar o benefício terapêutico contra quaisquer efeitos colaterais.
2.4 Composições farmacêuticas
[00253] Em algumas modalidades, a invenção fornece uma compo- sição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e uma meganuclease modificada da invenção, ou um veículo farmaceuticamente aceitável e um polinucleotídeo isolado compreen- dendo um ácido nucleico codificando uma meganuclease modificada da invenção. Em outras modalidades, a invenção fornece uma compo- sição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e uma célula da invenção que pode ser liberada para um te- cido alvo onde a célula expressa a meganuclease modificada como descrita aqui. Composições farmacêuticas da invenção podem ser úteis para o tratamento de um indivíduo tendo VHB, redução do nível ou proliferação de VHB, redução de pelo menos um sintoma de VHB, ou tratamento de HCC.
[00254] Composições farmacêuticas podem ser planejadas ou sele- cionadas de acordo com o genótipo da cepa de VHB alvo. Como des- crito em detalhes aqui, as meganucleases da invenção foram modifi- cadas para reconhecer e clivar sequências de reconhecimento em ge- nótipos específicos de VHB. Por exemplo, meganucleases de VHB 1-2 (por exemplo, SEQ ID NOs: 18-21), reconhecem e clivam a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 que é pelo menos encontrada no ge- noma de genótipos de VHB A, B, C, E, F, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-5 e 7-9, respectivamente). Além disso, sequência de reconhe- cimentos das meganucleases modificadas descritas aqui pode ser en- contrada em isolados de genótipos de VHB A, B, C, D, E, F, e G que não compartilham 100% de identidade de sequência aos respectivos exemplos de genótipo fornecidos nas SEQ ID NOs: 3-9. Como usado aqui, "isolados" de VHB podem compartilhar pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pe- lo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou mais identidade de sequência com o exemplo de genótipo correspondente fornecido em quaisquer SEQ ID NOs: 3-9. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas descritas aqui podem ser administradas a um indivíduo tendo qualquer genótipo de VHB compreendendo uma sequência de reconhecimento estabele- cida na SEQ ID NO: 10, 12, 14, ou 16.
[00255] Tais composições farmacêuticas podem ser preparadas de acordo com técnicas conhecidas. Veja, por exemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21a ed. 2005). Na fabricação de uma formulação farmacêutica de acordo com a invenção, polipeptí- deos de endonuclease (ou DNA/RNA codificando os mesmos) são tipi- camente misturados com um veículo farmaceuticamente aceitável e a composição resultante é administrada a um indivíduo. O veículo deve, certamente, ser aceitável no sentido de ser compatível com quaisquer outros ingredientes na formulação e não deve ser nocivo para o indiví- duo. Em algumas modalidades, composições farmacêuticas da inven- ção podem também compreender um ou mais agentes adicionais ou moléculas biológicas úteis no tratamento de uma doença no indivíduo. Igualmente, o agente(s) adicional e/ou molécula(s) biológica pode ser coadministrado como uma composição separada.
[00256] Em modalidades particulares, composições farmacêuticas da invenção podem incluir combinações das meganucleases modifica- das descritas aqui (ur ácidos nucleicos codificando meganucleases modificadas), em que cada meganuclease modificada tem especifici- dade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB, de modo que uma única composição farmacêutica seja amplamente útil para o tratamento de uma ampla gama de isolados de genótipos e/ou genótipos de VHB em um indivíduo. Igualmente, em outras modalida- des, composições farmacêuticas da invenção podem incluir mRNA po- licistrônicos (ou construções de DNA recombinante ou vetores virais tendo cassetes que, quando expressos, produzem mRNA policistrôni- co) que codificam múltiplas meganucleases modificadas descritas aqui tendo especificidade para a sequência de reconhecimento de diferen- tes VHBs. Tais composições farmacêuticas são também amplamente usadas para o tratamento de uma ampla gama de genótipos de VHB e/ou isolados de genótipo em um indivíduo. Em qualquer caso, tais composições farmacêuticas podem ser úteis como um tratamento sim- ples quando o genótipo ou isolado de VHB específico é conhecido ou desconhecido no indivíduo.
[00257] Por exemplo, composições farmacêuticas compreendendo múltiplas meganucleases recombinantes diferentes descritas aqui ou compreendendo moléculas nucleicas codificando múltiplas meganu- cleases recombinantes diferentes descritas aqui, podem ser adminis- tradas a um paciente infectado com múltiplos genótipos de VHB, ou infectados com genótipos desconhecidos de VHB. Consequentemente, provêr as composições farmacêuticas com múltiplas meganucleases recombinantes diferentes ou compreendendo moléculas nucleicas co- dificando múltiplas meganucleases recombinantes diferentes fornece uma opção flexível para o tratamenti e controle de infecção por VHB onde os recursos não permitem uma genotipagem precisa de VHB e onde as soluções de tratamento rápido e amplo são desejadas.
[00258] Em modalidades particulares da invenção, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais mRNAs descritos aqui encapsuladao dentro de nanopartículas de lipídio, que são descritas em outro lugar aqui. Em modalidades particulares, nanopartículas de lipídio podem compreender dois ou mais mRNAs descritos aqui, cada qual codificando uma meganuclease modificada da invenção tendo especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB descritos aqui. Nas modalidades específicas, nanopartículas de lipídio podem compreender dois, três, ou quatro mRNAs descritos aqui, cada qual codificando uma meganuclease modificada da inven- ção tendo especificidade para uma diferente sequência de reconheci- mento de VHB. Em outras modalidades, nanopartículas de lipídio pode compreender uma ou mais mRNA policistrônicos descritas aqui, em que cada mRNA policistrônico codifica duas ou mais meganucleases modificadas da invenção tendo especificidade para a sequência de reconhecimento de diferentes VHBs descritos aqui. Em modalidades particulares, nanopartícula de lipídios pode compreender um mRNA policistônico codificando dois, três, ou quatro meganucleases modifi- cadas descritas aqui. Em outras modalidades particulares, nanopartí- culas de lipídio podem compreender dois ou mais mRNAs policistrôni- cos descritos aqui, cada qual codificando duas ou mais meganuclea- ses modificadas da invenção.
[00259] Algumas nanopartículas de lipídio contempladas para uso nainvenção compreendem pelo menos um lipídio catiônico, pelo me- nos um lipídio não catiônico, e pelo menos um lipídio conjugado. Em exemplos mais particulares, nanopartículas de lipídio podem compre- ender cerca de 50 % em mol a cerca de 85 % em mol de um lipídio catiônico, de cerca de 13 % em mol a cerca de 49,5 % em mol de um lipídio não catiônico, e de cerca de 0,5 % em mol a cerca de 10 % em mol de um conjugado de lipídio, e são produzidss de tal maneira para ter uma morfologia não lamelar (isto é, não bicamada). Em outros exemplos particulares, nanopartículas de lipídio podem compreender de cerca de 40 % em mol a cerca de 85 % em mol de um lipídio catiô- nico, de cerca de 13 % em mol a cerca de 49,5 % em mol de um lipídio não catiônico, e de cerca de 0,5 % em mol a cerca de 10 % em mol de um conjugado de lipídio, e são produzidas de tal maneira cpara ter uma morfologia não lamelar (isto é, não bicamada).
[00260] Lipídios catiônicos podem incluir, por exemplo, um ou mais dos seguintes: palmitoil-oleoil-nor-arginina (PONA), MPDACA, GUA- DACA, ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-il 4- (dimetilamino)butanoato) (MC3), LenMC3, CP-LenMC3, γ-LenMC3, CP-γ-LenMC3, MC3MC, MC2MC, MC3 Éter, MC4 Éter, MC3 Amida, Pan-MC3, Pan-MC4 e Pan MC5, 1,2-dilinoleilóxi-N,N- dimetilaminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinolenilóxi-N,N- dimetilaminopropano (DLenDMA), 2,2-dilinoleyl-4-(2-dimetilaminoetil)- [1,3]-dioxolano (DLin-K-C2-DMA; "XTC2"), 2,2-dilinoleil-4-(3- dimetilaminopropil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C3-DMA), 2,2-dilinoleil-4- (4-dimetilaminobutil)-[1,3]-dioxolano (DLin-K-C4-DMA), 2,2-dilinoleil-5- dimetilaminometil-[1,3]-dioxano (DLin-K6-DMA), 2,2-dilinoleil-4-N- metilpepiazino-[1,3]-dioxolano (DLin-K-MPZ), 2,2-dilinoleil-4- dimetilaminometil-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA), 1,2- dilinoleilcarbamoilóxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2- dilinoleióxi-3-(dimetilamino)acetoxipropano (DLin-DAC), 1,2-
dilinoleióxi-3-morfolinopropano (DLin-MA), 1,2-dilinoleoil-3- dimetilaminopropano (DLinDAP), 1,2-dilinoleiltio-3- dimetilaminopropano (DLin-S-DMA), 1-linoleoil-2-linoleilóxi-3- dimetilaminopropano (DLin-2-DMAP), sal de cloreto de1,2-dilinoleilóxi- 3-trimetilaminopropano (DLin-TMA.Cl), sal de cloreto de 1,2-dilinoleoil- 3-trimetilaminopropano (DLin-TAP.Cl), 1,2-dilinoleilóxi-3-(N- metilpiperazino)propano (DLin-MPZ), 3-(N,N-dilinoleilamino)-1,2- propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-dioleilamino)-1,2-propanodio (DOAP), 1,2-dilinoleiloxo-3-(2-N,N-dimetilamino)etoxipropano (DLin-EG-DMA), cloreto de N,N-dioleil-N,N-dimetilamônio (DODAC), 1,2-dioleilóxi-N,N- dimetilaminopropano (DODMA), 1,2-distearilóxi-N,N- dimetilaminopropano (DSDMA), cloreto de N-(1-(2,3-dioleilóxi)propil)- N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), brometo de N,N-distearil-N,N- dimetilamônio (DDAB), cloreto de N-(1-(2,3-dioleoilóxi)propil)-N,N,N- trimetilamônio (DOTAP), 3-(N-(N′,N′-dimetilaminoetano)- carbamoil)colesterol (DC-Chol), brometo de N-(1,2-dimiristiloxiprop-3- il)-N,N-dimetil-N-hidroxietil amônio (DMRIE), 2,3-dioleilóxi-N- [2(spermine-carboxamido)etil]-N,N-dimetil-1- propanaminiumtrifluoroacetato (DOSPA), dioctadecilamidoglicil esper- mina (DOGS), 3-dimetilamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxibutan-4-óxi)-1- (cis,cis-9,12-octadecadienóxi)propano (CLinDMA), 2-[5′-(colest-5-en-3- beta-óxi)-3′-oxapentóxi)-3-dimeti-1-(cis,cis-9′,1-2′- octadecadienóxi)propano (CpLinDMA), N,N-dimetil-3,4- dioleiloxibenzilamina (DMOBA), 1,2-N,N′-dioleilcarbamil-3- dimetilaminopropano (DOcarbDAP), 1,2-N,N′-dilinoleilcarbamil-3- dimetilaminopropano (DLincarbDAP), ou misturas dos mesmos.
O lipí- dio catiônico pode também ser DLinDMA, DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), MC3, LenMC3, CP-LenMC3, γ-LenMC3, CP-γ-LenMC3, MC3MC, MC2MC, MC3 Éter, MC4 Éter, MC3 Amida, Pan-MC3, Pan-MC4, Pan MC5, ou misturas dos mesmos.
[00261] Em várias modalidades, o lipídio catiônico pode compreen- der de cerca de 50 % em mol a cerca de 90 % em mol, de cerca de 50 % em mol a cerca de 85 % em mol, de cerca de 50 % em mol a cerca de 80 % em mol, de cerca de 50 % em mol a cerca de 75 % em mol, de cerca de 50 % em mol a cerca de 70 % em mol, de cerca de 50 % em mol a cerca de 65 % em mol, ou de cerca de 50 % em mol a cerca de 60 % em mol do lipídio total presente na partícula.
[00262] Em outras modalidades, o lipídio catiônico pode compreen- der de cerca de 40 % em mol a cerca de 90 % em mol, de cerca de 40 % em mol a cerca de 85 % em mol, de cerca de 40 % em mol a cerca de 80 % em mol, de cerca de 40 % em mol a cerca de 75 % em mol, de cerca de 40 % em mol a cerca de 70 % em mol, de cerca de 40 % em mol a cerca de 65 % em mol, ou de cerca de 40 % em mol a cerca de 60 % em mol do lipídio total presente na partícula.
[00263] O lipídio não catiônico pode compreender, por exemplo, um ou mais lipídios aniônicos e/ou lipídios neutros. Em modalidades prefe- ridas, o lipídio não catiônico compreende um dos seguintes componen- tes de lipídio neutro: (1) colesterol ou um derivado do mesmo; (2) um fosfolipído; ou (3) uma mistura de um fosfolipído e colesterol ou um derivado do mesmo. Exemplos de derivados de colesterol incluem, po- rém não estão limitados a, colestanol, colestanona, colestenona, co- prostanol, colesteril-2′-hidroxietil éter, colesteril-4′-hidroxibutil éter, e misturas dos mesmos. O fosfolipídio pode ser um lipídio neutro inclu- indo, porém não limitado a, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distea- roilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), palmi- toiloleoil-fosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), palmitoiloleyol-fosfatidilglicerol (POPG), dipalmitoil- fosfatidiletanolamina (DPPE), dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), monometil- fosfatidiletanolamina, dimetil-fosfatidiletanolamina, dielaidoil-
fosfatidiletanolamina (DEPE), estearoiloleoil-fosfatidiletanolamina (SOPE), fosfatidilcolina de ovo (EPC), e misturas dos mesmos. Em certas modalidades preferidas, o fosfolipídio é DPPC, DSPC, ou mistu- ras dos mesmos.
[00264] Em algumas modalidades, o lipídio não catiônico (por exemplo, um ou mais fosfolipídios e/ou colesterol) pode compreender de cerca de 10 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 15 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 20 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 25 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 30 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 10 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 15 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 20 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cer- ca de 25 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 30 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 13 % em mol a cerca de 50 % em mol, de cerca de 15 % em mol a cerca de 50 % em mol ou de cer- ca de 20 % em mol a cerca de 50 % em mol do lipídio total presente na partícula. Quando o lipídio não catiônico é uma mistura de um fos- folipído e colesterol ou um derivado de colesterol, a mistura pode compreender até cerca de 40, 50, ou 60 % em mol do lipídio total pre- sente na partícula.
[00265] O lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas po- de compreender, por exemplo, um ou mais dos seguintes: um conju- gado de polietilenoglicol (PEG)-lipídio, um conjugado de poliamida (ATTA)-lipídio, conjugados catiônico-polimérico-lipídico (CPLs), ou mis- turas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, as partículas de ácido nucleico-lipídio compreendem um conjugado de PEG-lipídio ou um conjugado de ATTA-lipídio. Em certas modalidades, o conjugado de PEG-lipído ou conjugado de ATTA-lipídio é usado juntamente com um CPL. O lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas pode compreender um PEG-lipídio incluindo, por exemplo, um PEG-
diacilglicerol (DAG), um PEG dialquiloxipropil (DAA), um PEG- fosfolipídio, uma PEG-ceramida (Cer), ou misturas dos mesmos. O conjugado de PEG-DAA pode ser PEG-di lauriloxipropil (C12), um PEG-dimiristiloxipropila (C14), um PEG-dipalmitiloxipropila (C16), um PEG-disteariloxipropila (C18), ou misturas dos mesmos.
[00266] Conjugados de PEG-lipídio adicionais adequados para uso na invenção incluem, porém não estão limitados a, mPEG2000-1,2-di- O-alquil-sn3-carbomoilglicerídeo (PEG-C-DOMG). A síntese de PEG- C-DOMG é descrita no Pedido de PCT No. PCT/US08/88676. Ainda, conjugados de PEG-lipídio adicionais adequados para uso na in a in- venção incluem, sem limitação, 1-[8′-(1,2-dimiristoil-3-propanóxi)- carboxamido-3′,6′-dioxaoctanil]carbamoil-ω-metil-poli(etileno glicol) (2KPEG-DMG). A síntese de 2KPEG-DMG é descrita na Patente dos Estados Unidos nº 7.404.969.
[00267] Em alguns casos, o lipídio conjugado que inibe a agregação de partículas (por exemplo, conjugado de PEG-lipídio) pode compre- ender cerca de 0,1 % em mol a cerca de 2 % em mol, de cerca de 0,5 % em mol a cerca de 2 % em mol, de cerca de 1 % em mol a cerca de 2 % em mol, de cerca de 0,6 % em mol a cerca de 1,9 % em mol, de cerca de 0,7 % em mol a cerca de 1,8 % em mol, de cerca de 0,8 % em mol a cerca de 1,7 % em mol, de cerca de 1 % em mol a cerca de 1,8 % em mol, de cerca de 1,2 % em mol a cerca de 1,8 % em mol, de cerca de 1,2 % em mol a cerca de 1,7 % em mol, de cerca de 1,3 % em mol a cerca de 1,6 % em mol, de cerca de 1,4 % em mol a cerca de 1,5 % em mol, ou cerca de 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou 2 % em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou faixa destes) do lipídio total presente na partícula. Tipicamente, em tais casos, a porção PEG tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 Daltons. Em outros casos, o lipídio conjugado que inibe a agregação de partícu- las (por exemplo, conjugado de PEG-lipídio) pode compreender de cerca de 5,0 % em mol a cerca de 10 % em mol, de cerca de 5 % em mol a cerca de 9 % em mol, de cerca de 5 % em mol a cerca de 8 % em mol, de cerca de 6 % em mol a cerca de 9 % em mol, de cerca de 6 % em mol a cerca de 8 % em mol, ou cerca de 5 % em mol, 6 % em mol, 7 % em mol, 8 % em mol, 9 % em mol, ou 10 % em mol (ou qual- quer fração dos mesmos ou faixa destes) do lipídio total presente na partícula. Tipicamente, em tais casos, a porção PEG tem um peso mo- lecular médio de cerca de 750 Daltons.
[00268] Em outras modalidades, a composição pode compreender lipossomas anfotéricos, que contêm pelo menos um veículo de carga positiva e pelo menos um de carga negativa, que difere da positiva, estando o ponto isoelétrico dos lipossomas entre 4 e 8. Este objetivo é alcançado pelo fato de que os lipossomas são preparados com carga variável, dependente de pH.
[00269] Estruturas lipossômicas com as propriedades desejadas são formadas, por exemplo, quando a quantidade de portadores de carga catiônica formadora de membrana ou com base em membrana excede aquela dos portadores de carga aniônica em um baixo pH e a relação é revertida em um pH elevado. Este é sempre o caso quando os componentes ionizáveis têm um valor de pKa entre 4 e 9. Visto que o pH do meio cai, todos os portadores de carga catiônica são mais car- regados e todos os portadores de carga aniônica perdem sua carga.
[00270] Compostos catiônicos úteis para lipossomas anfotéricos incluem aqueles compostos catiônicos anteriormente descritos aqui acima. Sem limitação, compostos fortemente catiônicos podem incluir, por exemplo: DC-Chol 3-β-[N-(N′,N′-dimetilmetano) carbamoil] coleste- rol, TC-Chol 3-β-[N-(N′, N′, N′-trimetilaminoetano) carbamoil colesterol, BGSC bisguanidínio-espermidina-colesterol, BGTC bis-guadínio-tren- colesterol, DOTAP cloreto de (1,2-dioleoiloxipropil)-N,N,N- trimetilamônio, DOSPER (1,3-dioleoilóxi-2-(6-carbóxi-espermil)-
propilarnida, DOTMA (cloreto de 1,2-dioleoiloxipropil)-N,N,N- trimetilamônio) (Lipofectin®), DORIE brometo de 1,2-dioleoiloxipropil)- 3-dimetil-hidroxietilamônio, DOSC (1,2-dioleoil-3-succinil-sn-gliceril co- lina éster), DOGSDSO (omitina de dissulfeto de 1,2-dioleoil-sn-glicero- 3-succinil-2-hidroxietila), DDAB brometo de dimetildioctadecilamônio, DOGS ((C18)2GlySper3+) N,N-dioctadecilamido-glicol-espermina (Transfectam®) (C18)2Gly+ N,N-dioctadecilamido-glicina, CTAB bro- meto de cetiltrimetilarnmônio, CpyC cloreto de cetilpiridínio, DOEPC 1,2-dioleoli-sn-glycero-3-etilfosfocolina ou outras O-alquil- fosfatidilcolina ou etanolaminas, amidas de lisina, arginina ou omitina e fosfatidil etanolarnina.
[00271] Exemplos de compostos fracamente catiônicos incluem, sem limitação: His-Chol (histaminil-colesterol hemissuccinato), Mo- Chol (morfolina-N-etilamino-colesterol hemissuccinato), ou histidinil- PE.
[00272] Exemplos de compostos neutros incluem, sem limitação: colesterol, ceramidas, fosfatidil colinas, fosfatidil etanolaminas, lipídios de tetraéter, ou diacil gliceróis.
[00273] Compostos aniônicos úteis para os lipossomas anfotéricos incluem aqueles compostos não catiônicos anteriormente descritos aqui. Sem limitação, exemplos de compostos fracamente aniônicos podem incluir: CHEMS (hemisuccinato de colesterol), ácidos alquil carboxílicos com 8 a 25 átomos de carbono, ou hemissuccinato de di- acil glicerol. Compostos fracamente aniônicos adicionais podem incluir as amidas de ácido aspártico ou ácido glutâmico e PE bem como PS e suas amidas com glicina, alanina, glutamina, asparagina, serina, ciste- ína, treonina, tirosina, ácido glutâmico, ácido aspártico ou outros ami- noácidos ou ácidos aminodicarboxílicos. De acordo com o mesmo princípio, os ésteres de ácido hidroxicarboxílico ou ácidos hidroxidicar- boxílicos e PS são também compostos farcamente aniônicos.
[00274] Em algumas modalidades, lipossomas anfotéricos podem conter um lipídio conjugado, tais como aqueles descritos aqui acima. Exemplos particulares de lipídios conjugados úteis incluem, sem limi- tação, fosfatidiletanolamina modificada por PEG e ácido fosfatídico, conjugados de PEG-ceramida (por exemplo, PEG-CerC14 ou PEG- CerC20), dialquilaminas modificadas por PEG e 1,2-diaciloxipropan-3- aminas modificadas por PEG. Diacilgliceróis e dialquilgliceróis modifi- cados por PEG são particularmente preferidos.
[00275] Em algumas modalidades, os lipídios neutros podem com- preender de cerca de 10 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 15 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 20 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 25 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 30 % em mol a cerca de 60 % em mol, de cerca de 10 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 15 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 20 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 25 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 30 % em mol a cerca de 55 % em mol, de cerca de 13 % em mol a cerca de 50 % em mol, de cerca de 15 % em mol a cerca de 50 % em mol ou de cerca de 20 % em mol a cerca de 50 % em mol do lipídio total presente na partícula.
[00276] Em algunas casos, o lipídio conjugado que inibe a agrega- ção de partículas (por exemplo, conjugado de PEG-lipídio) pode com- preender de cerca de 0,1 % em mol a cerca de 2 % em mol, de cerca de 0,5 % em mol a cerca de 2 % em mol, de cerca de 1 % em mol a cerca de 2 % em mol, de cerca de 0,6 % em mol a cerca de 1,9 % em mol, de cerca de 0,7 % em mol a cerca de 1,8 % em mol, de cerca de 0,8 % em mol a cerca de 1,7 % em mol, de cerca de 1 % em mol a cerca de 1,8 % em mol, de cerca de 1,2 % em mol a cerca de 1,8 % em mol, de cerca de 1,2 % em mol a cerca de 1,7 % em mol, de cerca de 1,3 % em mol a cerca de 1,6 % em mol, de cerca de 1,4 % em mol a cerca de 1,5 % em mol, ou cerca de 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, ou 2 % em mol (ou qualquer fração dos mesmos ou faixa des- tes) do lipídio total presente na partícula. Tipicamente, em tais casos, a porção PEG tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 Daltons. Em outros casos, o lipídio conjugado que inibe a agregação de partícu- las (por exemplo, conjugado de PEG-lipídio) pode compreender de cerca de 5,0 % em mol a cerca de 10 % em mol, de cerca de 5 % em mol a cerca de 9 % em mol, de cerca de 5 % em mol a cerca de 8 % em mol, de cerca de 6 % em mol a cerca de 9 % em mol, de cerca de 6 % em mol a cerca de 8 % em mol, ou cerca de 5 % em mol, 6 % em mol, 7 % em mol, 8 % em mol, 9 % em mol, ou 10 % em mol (ou qual- quer fração dos mesmos ou faixa destes) do lipídio total presente na partícula. Tipicamente, em tais casos, a porção PEG tem um peso mo- lecular médio de cerca de 750 Daltons.
[00277] Considerando a quantidade total de lipídios neutros e con- jugados, o equilíbrio restante do lipossoma anfotérico pode compreen- der uma mistura de compostos catiônicos e compostos aniônicos for- mulada em várias relações. A relação de lipídio catiônico para aniônico pode ser selecionada a fim de obter as propriedades desejadas de en- capsulação de ácido nucleico, zeta potencial, pKa, ou outra proprieda- de fisicoquímica que é pelo menos em parte dependnete da presença de componentes de lipídio carregado.
[00278] Em algumas modalidades, as nanopartículas de lipídio têm uma composição que especificamente realça a liberação e captação no fígado, especificamente dentro dos hepatócitos.
2.5 Métodos para a Produção de Vetores de AAV Recombinantes
[00279] Em algumas modalidades, a invenção fornece vetores de AAV recombinantes para uso nos métodos da invenção. Vetores de AAV recombinantes são tipicamente produzidos em linhagens celula- res de mamíferos, tais como HEK-293. Porque os genes virais cap e rep são removidos do vetor para impedir sua autorreplicação para dar espaço ao gene(s) terapêutico a ser liberado (por exemplo, o gene en- donuclease), é necessário fornecer estes in trans no empacotamento de linhagem celular. Além disso, é necessário fornecer os componen- tes "auxiliadores" (por exemplo, adenovirais) necessário para suportar a replicação (Cots D, Bosch A, Chillon M (2013) Curr. Gene Ther. 13(5): 370-81). Frequentemente, vetores de AAV recombinantes são produzidos usando uma tripla-transfecção em que uma linhagem celu- lar é transfectada com um primeiro plasmídeo codificando os compo- nentes "auxiliadores", um segundo plasmídeo compreendendo os ge- nes cap e rep, e um terceiro plasmídeo compreendendo as ITRs virais contendo a sequência de DNA de intervenção a ser embalada no ví- rus. As partículas virais compreendendo um genoma (ITRs e gene(s) de intervenção de interesse) envolto em um capsídeo são então pro- venientes de células por ciclos de congelamento-descongelamento, sonicação, detergente, ou outros significados conhecidos na técnica. As partículas são então purificadas usando centrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio ou cromatografia de afinidade e sub- sequentemente liberada ao (s) gene (s) de interesse para células, teci- dos ou um organismo tal como um paciente humano.
[00280] Porque as partículas de AAV recombinantes são produzi- das (fabricadas) nas células, precauções devem ser tomadas na práti- ca da presente invenção para garantir que a endonuclease específica do sítio não seja expressa em células de empacotamento. Porque os genomas virais da invenção compreendem uma sequência de reco- nhecimento para a endonuclease, qualquer endonuclease expressa no empacotamento de linhagem celular será capaz de clivar o genoma viral antes de poder ser embalado em partículas virais. Isto resultará na eficiência de empacotamento e/ou o empacotamento de genomas fragmentados. Diversos métodos podem ser usados para impedir a expressão de endonuclease em células de empacotamento, incluindo:
[00281] A endonuclease pode ser colocado sob o controle de um promotor específico de tecido que não é ativo em células de empaco- tamento. Por exemplo, se um vetor viral é desenvolvido para liberação de (um) gene(s) de endonuclease para o tecido muscular, um promo- tor específico de músculo pode ser usado. Exemplos de promotores específicos de músculo incluem C5-12 (Liu, et al. (2004) Hum Gene Ther. 15:783-92), promotor de creatinina cinase específico de músculo (MCK) (Yuasa, et al. (2002) Gene Ther. 9:1576-88), ou o promotor do músculo liso 22 (SM22) (Haase, et al. (2013) BMC Biotechnol. 13:49- 54). Exemplos de promotores específicos de SNC (neurônio) incluem os promotores de NSE, Sinapsina, e MeCP2 (Lentz, et al. (2012) Neu- robiol Dis. 48:179-88). Exemplos de promotores específicos de fígado incluem promotores de albumina (tal como Palb), α1-antitripsina hu- mana (tal como Pa1AT), e hemopexina (tal como Phpx) (Kramer, MG et al., (2003) Mol. Therapy 7:375-85). Exemplos de promotores especí- ficos de olho incluem opsina, e promotores de K12 específicos do epi- télio da córnea (Martin KRG, Klein RL, e Quigley HA (2002) Methods (28): 267-75) (Tong Y, et al., (2007) J Gene Med, 9:956-66). Estes promotores, ou outros promotores específicos de tecido conhecidos na técnica, não são altamente ativos em células HEK-293 e, desse modo, não deverá produzir níveis significativos de expressão de gene de en- donuclease em células de empacotamento quando incorporados em vetores virais da presente invenção. Similarmente, os vetores virais da presente invenção contemplam o uso de outras linhagens celulares com o uso de promotores específicos de tecido incompatíveis (isto é, a conhecida linhagem de célula HeLa (célula epitelial humana) e usando o promotor da hemopexina específico do fígado). Outros exemplos de promotores específicos de tecidos incluem: sarcomas sinoviais PDZD4 (cerebelo), C6 (fígado), ASB5 (músculo), PPP1R12B (coração),
SLC5A12 (rim), regulação do colesterol APOM (fígado), ADPRHL1 (coração), e síndromes de malformação monogênica TP73L (múscu- lo). (Jacox E, et al., (2010) PLoS One v.5(8):e12274).
[00282] Alternativamente, o vetor pode ser empacotado em células de uma espécie diferente em que a endonuclease não é susceptível ser expressa. Por exemplo, Partículas virais podem ser produzidas em células microbianas, de insetos ou vegetais usando promotores de mamíferos, tal como os be, conhecidos promotores precoces do vírus citomegalovírus-SV40, que não são ativos nas células de empacota- mento não mamíferas. Em modalidades preferidas, partículas virais são produzidas em células de inseto usando o sistema de baculovírus como descrito por Gao, et al. (Gao, H., et al. (2007) J. Biotechnol. 131(2):138-43). Uma endonuclease sob o controle de um promotor um mamíferoian é improvável que seja expressa nestas células (Airenne, KJ, et al. (2013) Mol. Ther. 21(4):739-49). Além disso, células de inse- to utilizam diferentes motifs de ligação de mRNA do que células de mamíferos. Desse modo, é possível incorporar um íntron de mamífero, tal como o íntron do hormônio do crescimento humano (HGH) ou o ín- tron de antígeno T de SV40 grande, na sequência de codificação de uma endonuclease. Porque estes íntrons não são eficientemente liga- dos a partir de transcrições de pré-mRNA em células de inseto, células de inseto não expressarão uma endonuclease funcional e empacota- rão o genoma de tamanho natural. Ao contrário, células mamíferas aos quais as partículas de AVV recombinante são liberadas adequadamen- te ligarão o pré-mRNA e expressarão a proteína endonuclease funcio- nal. Haifeng Chen reportou o uso dos íntrons de antígeno T grande de HGH e SV40 para atenuar a expressão das proteínas tóxicas barnase e fragmento A de toxina da difteria em uma célula de empacotamento de inseto, permitindo a produção de vetores de AAV recombinantes transportando estes genes de toxina (Chen, H (2012) Mol Ther Nucleic
Acids. 1(11): e57).
[00283] O gene endonuclease pode ser operavelmente ligado a um promotor induzível de modo que um pequeno indutor de molécula pe- quena seja requerida para expressão de endonuclease. Exemplos de promotores induzíveis incluem o sistema Tet-On (Clontech; Chen H., et al., (2015) BMC Biotechnol. 15(1):4)) e o sistema RheoSwitch (Intre- xon; Sowa G., et al., (2011) Spine, 36(10): E623-8). Ambos os siste- mas, bem como sistemas similares conhecidos na técnica, contam com os fatores de transcrição induzível por ligante (variantes do recep- tor Tet Repressor e Ecdisona, respectivamente) que ativa a transcrição em resposta a um ativador de molécula pequena (Doxiciclina ou Ecdi- sona, respectivamente). A prática da presente invenção usando tais ativadores de transcrição induzível por ligante inclui: 1) colocar o gene endonuclease sob o controle de um promotor que responde aos fator de transcrição correspondente, o gene endonuclease tendo (a) sítio(s) de ligação para o fator de transcrição; e 2) incluindo o gene codifican- do o fator de transcrição no genoma viral empacotado. A última etapa é necessária porque a endonuclease não será expressa nas células ou tecidos alvo após liberação de AAV recombinante se o ativador de transcrição não for também fornecido para as mesmas células. O ati- vador de transcrição então induz a expressão de gene endonuclease apenas em células ou tecidos que são tratados com o ativador de mo- lécula pequena cognata. Este método é vantajoso porque ele permite que a expressão de gene endonuclease seja regulada de uma maneira espaço-temporal selecionando quando e para quais tecidos o induto de molécula pequeno é liberado. Entretanto, o requisito para incluir o indutor no genoma viral, que tem capacidade de transporte significan- temente limitada, cria uma desvantagem para este método.
[00284] Em outra modalidade preferida, partículas de AVV recombi- nante são produzidas em uma linhagem de célula mamífera que ex-
pressa um regressor de transcrição que impede a expressão da endo- nuclease. Os repressores de transcrição são conhecidos na técnica e o Repressor Tet, o Repressor Lac, o repressor Cro, e o repressor Lambda. Muitos receptores de hormônio nuclear tal como o receptor de ecdisona também age como repressores de transcrição na ausên- cia de seu ligante de hormônio cognato. Para praticar a presente in- venção, células de empacotamento são transfectadas/transduzidas com um vector codificando um repressor de transcripção e o gene en- donuclease no genoma viral (vetor de empacotamento) é operavel- mente ligado a um promotor que é modificado para compreender os sítios de ligação para o repressor de modo que o repressor silencie o promotor. O gene codificando o repressor de transcrição pode ser co- locado em uma variedade de posições. Ele pode ser codificado em um vetor separado; ele pode ser incorporado no vetor de empacotamento for a da sequência de ITR; ele pode ser incorporado no vetor de cap/rep ou no vetor auxiliar adenoviral; ou, mais preferivelmente, ele pode ser estavelmente integrado no genoma da célula de empacota- mento, de modo que ele seja expresso constitutivamente. Métodos pa- ra modificar promotores mamíferos comuns para incorporar os sítios de repressor de transcrição são conhecidos na técnica. Por exemplo, Chang e Roninson modificaram os promotores de CMV e RSV fortes, constitutivos para compreender os operados para o repressor Lac e mostraram que a expressão de gene dos promotores modificados foi grandemente atenuada em células expressando o repressor (Chang BD, e Roninson IB (1996) Gene 183:137-42). O uso de um repressor de transcrição não humano garante que a transcrição do gene endo- nuclease será reprimida apenas nas células de empacotamento ex- pressando o repressor e não em células ou tecidos alvo transduzidos com o vetor de AVV recombinante resultante.
2.6 Variantes de Meganuclease Modificada
[00285] Modalidades da invenção abrangem as meganucleases modificadas descritas aqui, e variantes das mesmas. Outras modali- dades da invenção abrangem os polinucleotídeos isolados compreen- dendo uma sequência de ácido nucleico codificando as endonucleases descritas aqui, e variantes de tais polinucleotídeos.
[00286] Como usado aqui, "variantes" destina-se a significar se- quências substancialmente similares. Um polipeptídeo "variante" desti- na-se a significar um polipeptídeo derivado da polipeptídeo "nativo" por deleção ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoáci- dos em um ou mais sítios no polipeptídeo nativo. Como usado aqui, um polinucleotídeo ou polipeptídeo "nativo" compreende uma sequên- cia parenteral da qual as variantes são derivadas. Polipeptídeos vari- antes abrangidos pelas modalidades são biologicamente ativos. Isto é, eles continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa; isto é, a capacidade de reconhecer e clivar uma sequência de reconhecimento dentro de uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B, por exemplo, a sequência de reco- nhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10), a sequência de reconheci- mento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12), a sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14), ou a sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16). Tais variantes podem resultar, por exemplo, de manipulação humana. Variantes biologicamente ativas de um polipeptídeo nativo das modalidades (por exemplo, SEQ ID NOs: 18-39), ou variantes biologicamente ativas das subunidades de ligação de meio sítio de reconhecimento descritas aqui, terão pelo menos cer- ca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cer- ca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cer-
ca de 98%, ou cerca de 99%, de identidade de sequência à sequência de aminoácido do polipeptídeo nativo ou subunidade nativa, como de- terminado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos em outro lugar aqui. Uma variante biologica ativa de um poli- peptídeo ou subunidade das modalidades pode diferir daquele polipep- tídeo ou subunidade por tão pouco quanto cerca de 1-40 resíduos de aminoácido, tão pouco quanto cerca de 1-20, tão pouco quanto cerca de 1-10, tão pouco quanto cerca de 5, tão pouco quanto 4, 3, 2, ou ainda 1 resíduo de aminoácido.
[00287] Os polipeptídeos das modalidades podem ser alterados em de vários modos incluindo substituições, deleções, truncações e inser- ções de aminoácido. Métodos para manipulações são geralmente co- nhecidos na técnica. Por exemplo, variantes de sequência de aminoá- cido podem ser preparade por mutações no DNA. Métodos para muta- gênese e alterações de polinucleotídeo são bem conhecidos na técni- ca. Veja, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367- 382; Patente dos Estados Unidos nº 4.873.192; Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Com- pany, Nova Iorque) e as referências citadas a este assunto. Orientação quanto às substituições de aminoácidos adequadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse pode ser encontrada no modelo de Diahoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence e Structu- re (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporado aqui por referência. Substituições conservativas, tal como permuta de um aminoácido por outro com propriedades similares, podem ser ideais.
[00288] Em algumas modalidades, meganucleases modificadas da invenção podem compreender variantes das regiões de HVR1 e HVR2 descritas aqui. Regiões de HVR parentais podem compreender, por exemplo, resíduos 24-79 ou resíduos 215-270 das meganucleases modificadas exemplificadas. Desse modo, HVRs variantes podem compreender sequência de aminoácido tendo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou mais, de identida- de de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resíduos 24-79 ou resíduos 215-270 of as meganucleases modificadas exemplificadas aqui, de modo que as regiões de HVR variante mante- nham a atividade bbiológica da meganuclease modificada (isto é, li- gando para clivar a sequência de reconhecimento). Além disso, em algumas modalidades da invenção, uma região de HVR1 variante ou região de HVR2 variante pode compreender resíduos correspondendo aos resíduos de aminoácido encontrados em posições específicas dentro da HVR parental. Neste contexto, "correspondendo a" significa que um resíduo de aminoácido na HVR variante é o resíduo de amino- ácido (isto é, um resíduo idêntico separado) presente na sequência de HVR parental na mesma posição relativa (isto é, com relação aos ami- noácidos restantes na sequência origem). Por meio de exemplo, se uma sequência de HVR parental compreender um resíduo de serina na posição 26, uma HVR variante que "compreende um resíduo cor- respondendo ao" resíduo 26 também compreenderá uma serina em uma posição que é relativa à posição parental 26.
[00289] Um número substancial de modificações de aminoácido pa- ra o domínio de reconhecimento de DNA da meganuclease I-Crel do tipo selvagem foi anteriormente identificado (por exemplo, Estados Unidos 8.021.867) que, isoladamente ou em combinação, resultam em meganucleases modificadas com especificidades alteradas em bases individuais dentro do meio sítio de sequência de reconhecimento de DNA, de modo que as meganucleases racionalmente designadas re- sultantes tenham especificidades de meio sítio diferentes da enzima do tipo selvagem. A tabela 5 fornece substituições potenciais que po- dem ser feitas em um monômero ou subunidade de meganuclease modificada para realçar a especificidade baseada na base presente em cada posição de meio sítio (-1 a -9) de um meio sítio de reconhe- cimento.
Tabela 5. Base de filamento de sentido favorecido Posn.
A C G T A/T A/C A/G C/T G/T A/G/T A/C/G/T -1 Y75 R70* K70 Q70* T46* G70 L75* H75* E70* C70 A70 C75* R75* E75* L70 S70 Y139* H46* E46* Y75* G46* C46* K46* D46* Q75* A46* R46* H75* H139 Q46* H46* -2 Q70 E70 H70 Q44* C44* T44* D70 D44* A44* K44* E44* V44* R44* I44* L44* N44* -3 Q68 E68 R68 M68 H68 Y68 K68 C24* F68 C68 I24* K24* L68 R24* F68 -4 A26* E77 R77 S77 S26* Q77 K26* E26* Q26* -5 E42 R42 K28* C28* M66 Q42 K66 -6 Q40 E40 R40 C40 A40 S40 C28* R28* I40 A79 S28* V40 A28* C79 H28* I79 V79 Q28*
Base de filamento de sentido favorecido Posn. A C G T A/T A/C A/G C/T G/T A/G/T A/C/G/T -7 N30* E38 K38 I38 C38 H38 Q38 K30* R38 L38 N38 R30* E30* Q30* -8 F33 E33 F33 L33 R32* R33 Y33 D33 H33 V33 I33 F33 C33 -9 E32 R32 L32 D32 S32 K32 V32 I32 N32 A32 H32 C32 Q32 T32
[00290] Entratadas em negrito são resíduos de contado do tipo sel- vagem e não constituem "modificações" como usado aqui. Um asteris- co indica que o resíduo contata a base no filamento antissentido.
[00291] Para polinucleotídeos, uma "variante" compreende uma de- leção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios dentro do polinucleotídeo nativo. Um versado na técnica reconhecerá que as variantes dos ácidos nucleicos das modalidades serão constru- ídas, de modo que a estrutura de leitura aberta seja mantida. Para po- linucleotídeos, variantes conservativas incluem aquelas sequências que, por causa da degeneração do código genético, codifica a se- quência de aminoácido de um dos polipeptídeos das modalidades. Po- linucleotídeos variantes incluem polinucleotídeos sinteticamente deri- vados, tais como aqueles gerados, por exemplo, usando mutagênese direcionada ao sítio, porém que ainda codificam uma meganuclease modificada das modalidades. Geralmente, variantes de um polinucleo- tídeo em particular das modalidades terão pelo menos cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de 60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cer-
ca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cer- ca de 99% ou mais de identidade de sequência àquele polinucleotíde em particular como determinado por programas de alinhamento de se- quência e parâmetros descritos em outro lugar aqui. Variantes de um polinucleotídeo em particular das modalidades (isto é, o polinucleotí- deo de referência) podem também ser avaliadas em comparação com a porcentagem de identidade de sequência entre o polipeptídeo codifi- cado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência.
[00292] As deleções, inserções e substituições das sequências de proteínas aqui abrangidas não são esperadas produzir mudanças radi- cais nas características do polipeptídeo. Entretanto, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, deleção ou inserção antes de fa- zê-lo, alguém versado na técnica apreciará que o efeito será avaliado através da análise do polipeptídeo pela sua capacidade de, preferen- cialmente, reconhecer e clivar uma sequência de reconhecimento den- tro de uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B.
EXEMPLOS
[00293] Esta invenção é também ilustrada pelos seguintes exem- plos, que não devem ser interpretados como limitantes. Aqueles ver- sados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar, usando não mais que experimentação de rotina, numerosos equivalen- tes para as substâncias específicas e procedimentos descritos aqui. Tais equivalentes são destinados a serem abrangidos no escopo das reivindicações que seguem os exemplos abaixo. EXEMPLO 1 Caracterização de Meganucleases que Reconhecem e Clivam Se- quências de Reconhecimentos de VHB
Meganucleases que reconhecem e clivam a sequência de reconheci- mento do VHB 1-2
[00294] Meganucleases modificadas (SEQ ID NOs: 18-21), coleti- vamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 1-2," foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10), que é posicionada dentro das ORFs de proteína P, S, preS2/S e preS1/preS2 de múltiplos genótipos de VHB incluindo genótipo A, B, C, E, F, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-5 e 7-9, respectivamente). Cada meganuclease modificada de VHB 1-2 compreende um sinal de localização de nuclease de terminal N deri- vado de SV40, uma primeira subunidade de meganuclease, uma se- quência de ligante, e uma segunda subunidade de meganuclease. Uma primeira subunidade em cada meganuclease de VHB 1-2 se liga ao meio sítio de reconhecimento de VHB1 de SEQ ID NO: 10, enquan- to uma segunda subunidade se liga ao meio sítio de reconhecimento de VHB2 (veja, Figura 2).
[00295] As subunidades de ligação ao VHB1 e subunidades de li- gação ao VHB2 cada qual compreendem uma região hipervariável de 56 pares de base, referidas como HVR1 e HVR2, respectivamente. As subunidades de ligação ao VHB1 são altamente conservadas fora da região de HVR1. Similarmente, subunidades de ligação ao VHB2 são também altamente conservadas fora da região de HVR2. As regiões de ligação ao VHB1 de SEQ ID NOs: 18-21 são fornecidas como SEQ ID NOs: 40-43, respectivamente. Cada uma das SEQ ID NOs: 40-43 compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 40, que é a região de ligação ao VHB1 da meganuclease VHB 1- 2x.2 (SEQ ID NO: 18). Regiões de ligação ao VHB2 de SEQ ID NOs: 18-21 são fornecidas como SEQ ID NOs: 44-47, respectivamente. Ca- da uma das SEQ ID NOs: 44-47 compartilha pelo menos 90% de iden- tidade de sequência à SEQ ID NO: 44, que é a região de ligação ao
VHB2 da meganuclease VHB 1-2x.2 (SEQ ID NO: 18). Meganucleases que reconhecem e clivam a sequência de reconheci- mento do VHB 5-6
[00296] Meganucleases modificadas (SEQ ID NOs: 22-28), coleti- vamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 5-6," foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12), que é posicionada dentro das ORFs de proteína P, S, preS2/S e preS1/preS2 de múltiplos genótipos de VHB, incluindo genótipo A, B, C, D, E, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-7 e 9, respectivamente). Cada meganuclease modificada de VHB 5-6 compreende um sinal de localização de nuclease de terminal N deri- vado de SV40, uma primeira subunidade de meganuclease, uma se- quência de ligante, e uma segunda subunidade de meganuclease. Uma primeira subunidade in cada VHB 5-6 meganuclease se liga ao meio sítio de reconhecimento de de VHB5 SEQ ID NO: 12, enquanto uma segunda subunidade se liga ao meio sítio de reconhecimento de VHB6 (veja, Figura 2).
[00297] As subunidades de ligação ao VHB5 e subunidades de li- gação ao VHB6, cada qual, compreendem uma região hipervariável de 56 pares de base, referidas como HVR1 e HVR2, respectivamente. As subunidades de ligação ao VHB5 são altamente conservadas fora da região de HVR1. Similarmente, subunidades de ligação ao VHB6 são também altamente conservadas fora da região de HVR2. As regiões de ligação ao VHB5 de SEQ ID NOs: 22-28 são fornecidas como SEQ ID NOs: 48-54, respectivamente. Cada uma das SEQ ID NOs: 48-54 compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 49, que é a região de ligação ao VHB5 da meganuclease VHB 5- 6x.33 (SEQ ID NO: 22). Regiões de ligação ao VHB6 de SEQ ID NOs: 22-28 são fornecidas como SEQ ID NOs: 55-61, respectivamente. Ca- da uma das SEQ ID NOs: 55-61 compartilha pelo menos 90% de iden-
tidade de sequência à SEQ ID NO: 55, que é a região de ligação ao VHB5 da meganuclease VHB 5-6x.33 (SEQ ID NO: 22). Meganucleases que reconhecem e clivam a sequência de reconheci- mento do VHB 7-8
[00298] Meganucleases modificadas (SEQ ID NOs: 29-32), coleti- vamente referidas aqui como "meganucleases VHB 7-8," foram modifi- cadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 14), que é posicionada dentro da ORF de prote- ína P de múltiplos genótipos de VHB, incluindo genótipo A, B, C, D, F, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-6, 8, e 9, respectivamente). cada meganuclease VHB 7-8 modificada compreende um sinal de localiza- ção de nuclease de terminal N derivado de SV40, uma primeira subu- nidade de meganuclease, uma sequência de ligante, e uma segunda subunidade de meganuclease. Uma primeira subunidade in cada VHB 7-8 meganuclease se liga ao meio sítio de reconhecimento de VHB7 de SEQ ID NO: 14, enquanto uma segunda subunidade se liga ao meio sítio de reconhecimento de VHB8 (veja, Figura 2).
[00299] As subunidades de ligação ao VHB7 e subunidades de li- gação ao VHB8, cada qual, compreendem uma região hipervariável de 56 pares de base, referidas como HVR1 e HVR2, respectivamente. As subunidades de ligação ao VHB7 são altamente conservadas fora da região de HVR1. Similarmente, as subunidades de ligação ao VHB8 são também altamente conservadas fora da região de HVR2. As regi- ões de ligação ao VHB7 de SEQ ID NOs: 29-32 são fornecidas como SEQ ID NOs: 62-65, respectivamente. Cada uma das SEQ ID NOs: 62-65 compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 62, que é a região de ligação ao VHB7da meganuclease VHB 7-8x.2 (SEQ ID NO: 29). As regiões de ligação ao VHB8 de SEQ ID NOs: 29-32 são fornecidas como SEQ ID NOs: 66-69, respectivamen- te. Cada uma das SEQ ID NOs: 66-69 compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 66, que é a região de ligação ao VHB8 da meganuclease VHB 7-8x.2 (SEQ ID NO: 29). Meganucleases que reconhecem e clivam a sequência de reconheci- mento do VHB 11-12
[00300] Meganucleases modificadas (SEQ ID NOs: 33-39), coleti- vamente referidas aqui como "meganucleases de VHB 11-12," foram modificadas para reconhecer e clivar a sequência de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16), que é posicionada dentro da ORF de proteína P de múltiplos genótipos de VHB, incluindo genótipo A, B, C, D, E, F, e G (por exemplo, SEQ ID NOs: 3-9, respectivamente). Cada meganuclease modificada de VHB 11-12 compreende um sinal de lo- calização de nuclease de terminal N derivado de SV40, uma primeira subunidade de meganuclease, uma sequência de ligante, e uma se- gunda subunidade de meganuclease. Uma primeira subunidade em cada meganuclease de VHB 11-12 se liga ao meio sítio de reconheci- mento de VHB11 de SEQ ID NO: 16, enquanto uma segunda subuni- dade se liga ao meio sítio de reconhecimento de VHB12 (veja, Figura 2).
[00301] As subunidades de ligação ao VHB11 e subunidades de ligação ao VHB12 subunidades, cada qual, compreendem uma região hipervariável de 56 pares de base, referidas como HVR1 e HVR2, res- pectivamente. As subunidades de ligação ao VHB11 são altamente conservadas fora da região de HVR1. Similarmente, subunidades de ligação ao VHB12 são também altamente conservadas fora da região de HVR2. As regiões de ligação ao VHB11 de SEQ ID NOs: 33-39 são fornecidas como SEQ ID NOs: 70-76, respectivamente. Cada uma das SEQ ID NOs: 70-76 compartilha pelo menos 90% de identidade de se- quência à SEQ ID NO: 70, que é a região de ligação ao VHB11da me- ganuclease VHB 11-12x.26 (SEQ ID NO: 33). As regiões de ligação ao VHB12 de SEQ ID NOs: 33-39 são fornecidas como SEQ ID NOs: 77-
83, respectivamente. Cada uma das SEQ ID NOs: 77-83 compartilha pelo menos 90% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 77, que é a região de ligação ao VHB12 da meganuclease VHB 11-12x.26 (SEQ ID NO: 33). Clivagem de Sequências de Reconhecimento de VHB em um ensaio repórter de célula CHO
[00302] Para determinar se as meganucleases de VHB 1-2, VHB 5- 6, VHB 7-8, e VHB 11-12 reconhecem e clivam suas respectivas se- quências de reconhecimento (SEQ ID NOs: 10, 12, 14, e 16, respecti- vamente), cada meganuclease modificada foi avaliada usando o en- saio repórter de célula CHO anteriormente descrito (veja, WO/2012/167192 e Figura 6). Para realizar os ensaios, linhagens re- pórter de célula CHO foram produzidas que transportam um cassete de expressão de gene de Proteína Fluorescente Verde (GFP) não fun- cional integrado no genoma das células. O gene de GFP em cada li- nhagem celular foi interrompido por um par de sequências de reco- nhecimento, de modo que a clivagem intracelular de qualquer sequên- cia de reconhecimento por uma meganuclease estimularia um evento de recombinação homóloga resultando em um gene de GFP funcional.
[00303] Em linhagem de célula de CHO repórter desenvolvidas para este estudo, uma sequência de reconhecimento inserida no gene de GFP foi a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 (SEQ ID NO: 10), a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 (SEQ ID NO: 12), a se- quência de reconhecimento do VHB 7-8 (SEQ ID NO: 12), e a sequên- cia de reconhecimento do VHB 11-12 (SEQ ID NO: 16). A segunda sequência de reconhecimento inserida no gene de GFP foi uma se- quência de reconhecimento de CHO-23/24, que é reconhecida e cliva- da por uma meganuclease de controle chamada "CHO-23/24". Células de CHO repórter compreendendo a sequência de reconhecimento do VHB 1-2 e a sequência de reconhecimento de CHO-23/24são referidas como "células de VHB 1-2." Células de CHO repórter compreendendo a sequência de reconhecimento do VHB 5-6 e a sequência de reco- nhecimento de CHO-23/24 são referidas como "células de VHB 5-6." Células de CHO repórter compreendendo a sequência de reconheci- mento do VHB 7-8 e a sequência de reconhecimento de CHO-23/24 são referidas como "células VHB 7-8." Células de CHO repórter com- preendendo a sequência de reconhecimento do VHB 11-12 e a se- quência de reconhecimento de CHO-23/24são referidas como "células de VHB 11-12."
[00304] Células de CHO repórter foram transfectadas com DNA plasmidial codificando suas meganucleases modificadas correspon- dentes (por exemplo, células de VHB 1-2 foram transfectadas com DNA plasmidial codificando meganucleases de VHB 1-2) ou codifican- do a meganuclease de CHO-23/34. Em cada ensaio, 4e5 Células de CHO repórter foram transfectadas com 50 ng de DNA plasmidial em uma placa de 96 cavidades usando Lipofectamina 2000 (ThermoFis- her) de acordo com as instruções do fabricante. Em 48 horas pós- transfecção, as células foram avaliadas por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células positivas de GFP em compara- ção com um controle negativo não transfectadas (VHB bs). Como mostrado nas Figuras 7A-7D, todas as meganucleases de VHB foram constatadas produzir células positivas de GFP em linhagens celulares compreendendo sua sequência de reconhecimento correspondente em frequências excedendo significantemente o controle negativo.
[00305] A eficácia das meganucleases de VHB 1-2, VHB 5-6, VHB 7-8, e VHB 11-12 foi também determinada de uma maneira dependen- te de tempo 2, 5, 7, 9, e 12 dias após a introdução das meganucleases em células de CHO repórter. Neste estudo, as células de VHB 1-2, VHB 5-6, VHB 7-8, ou HB 11-12 (1,0x106) foram eletroparadas com 1x106 cópias de mRNA de meganuclease por célula usando um Bio-
Rad Gene Pulser Xcell de acordo com as instruções do fabricante. Nos pontos de tempo designados pós-transfecção, as células foram avalia- das por citometria de fluxo para determinar a porcentagem de células positivas de GFP. Uma meganuclease de CHO-23/24 foi também in- cluída em cada ponto de tempo como um controle positivo.
[00306] Como mostrado nas Figuras 8A-8D, a % de GFP produzida por meganucleases de VHB variou ao longo do tempo. Meganucleases de VHB 5-6 e VHB 11-12 foram substancialmente consistentes durante o período de 12 dias de análise (Figuras 8B e 8D), enquanto as me- ganucleases de VHB 1-2 e VHB 7-8 produziram um nível elevado de células positivas de GFP em pontos de tempo precoces que diminuí- ram durante o curso do experimento. Conclusões
[00307] Estes estudos demonstraram que meganucleases de VHB abrangidas pela invenção podem eficientemente alvejar e clivar as respectivas sequências de reconhecimentos em células e que este efeito pode ser consistente ou transitório ao longo do tempo. EXEMPLO 2 Nucleases Específicas de VHB Eliminam o DNA Plasmidial em E. coli Sistema repórter bacteriano utilizando o DNA epissômico
[00308] O propósito deste experimento foi avaliar as meganuclea- ses de VHB da invenção quanto a sua capacidade de reconhecer e clivar as sequências de reconhecimento dentro de plasmídeos de DNA epissômicos em um sistema repórter de E. coli.
[00309] Um plasmídeo chamado "pARCUS" foi gerado para regular a expressão induzível de uma ARCUS nuclease (Figura 9A). Em pARCUS, uma ARCUS nuclease (aqui, ou VHB 5-6x.33 ou VHB 11- 12x) é colocada sob o controle de um promotor induzível por IPTG. Adicionalmente, para permitir a seleção de bactérias transformadas, pARCUS codifica um gene de resistência à ampicilina. pARCUS é um plasmídeo de baixo número de cópias a fim de que a expressão indu- zida de uma ARCUS nuclease não resulte em super expressão.
[00310] Um plasmídeo adicional chamado "pVHBa" foi gerado (Fi- gura 9A). pVHBa transporta um grande fragmento do genoma do VHB, incluindo as sequências de reconhecimento para VHB 5-6 e VHB 11-
12. O plasmídeo também codifica um gene de resistência de canami- cina e um gene de SacB. O gene de resistência de canamicina permite a seleção de bactérias transformadas e o gene de SacB é uma toxina que é aiva na presença de sacarose. Desse modo, bactérias transfor- madas com pVHBa sobreviverão na presença de camamicina no meio, porém não sobreviverão na presença de uma canamicina e sacarose. pVHBa foi designado ser um plasmídeo de elevado número de cópias, em uma tentativa de replicar uma célula infectada com o VHB, na qual pode haver muitas cópias do genoma do VHB. Importantemente, pVHBa utiliza uma diferente origem de replicação daquela de pAR- CUS, permitindo a cotransformação de bactérias com ambos os plas- mídeos.
[00311] Quando as bactérias são cotransformadas com estes plas- mídeos e desenvolvidas em meio contendo várias combinações de pressão seletiva (ampicilina, canamicina, ou sacarose), existem vários resultados possíveis. As bactérias transformadas com pARCUS e cul- tivadas na presença de ampicilina transportarão o plasmídeo de pAR- CUS, porém não expressarão a nuclease codificada a menos que o meio de crescimento seja suplementado com IPTG. Quando induzida com IPTG, a nuclease codificada será expressa. As bactérias trans- formadas com pVHBa crescerão na presença de canamicina, porém não canamicina e sacarose. As bactérias cotransformadas com pAR- CUS e pVHBa na presença de ampicilina e/ou canamicina serão sen- síveis à sacarose. Foi previsto que em bactérias cotransformadas com pARCUS e pVHB, a indução da ARCUS nuclease com IPTG resultará na expressão da nuclease, que poderia então clivar o sítio alvo codifi- cado em pVHBa. Espera-se que a clivagem naquele sítio resulte na linearização do plasmídeo de pVHBa, que deveria ser rapidamente degradado por nucleases baterianas. A degradação do plasmídeo de pVHB resultará em dois resultados: as bactérias perderão a resistência à canamicina, porém serão capazes de sobreviver na presença de sa- carose.
[00312] Para testar os resultados de cotransformação, as bactérias foram cotransformadas (por eletroporação) com pARCUS e pVHBa e cultivadas na presença de ampicilina durante 3 horas antes da semea- dura. Em culturas paralelas, células cotransformadas foram tratadas com IPTG (3 horas) para induzir a expressão de nuclease e permitir a clivagem de pVHBa. Células foram em seguida semeadas em placas de ágar na presença de ampicilina, ampicilina e sacarose, ou ampicili- na e canamicina. As placas foram incubadas durante a noite, e as co- lônias foram contadas para avaliar a sobrevivência bacteriana. Resultados
[00313] O número de colônias presentes em cada placa seletiva forneceu efvidência dramática da capacidade de ARCUS nucleases para clivar o plasmídeo de pVHBa. Nas placas de controle de amplici- lina, o número de colônias de culturas induzidas por IPTG ou não in- duzidas foi igual para células cotransformadas com pVHBa e quais- quer plasmídeos (Figura 9B). Houve uma diferença número de colônia entre bactérias cotransformadas com pARCUS codificando VHB 5- 6x.33 e bactérias cotransformadas com pARCUS codificando VHB 11- 12x.26, porém provavelmente reflete a eficiência de transformação.
[00314] Em contraste acentuado, o número de colônias de culturas não induzidas por IPTG em placas contendo tanto a ampicilina quanto sacarose foi dramaticamente reduzido, indicando que o gene de SacB foi eficaz em matar células quando a sacarose estava disponível (Figu-
ra 9B). Entretanto, culturas que foram induzidas com IPTG, cresceram muito be mem placas contendo tanto ampicilina e sacarose, indicando a eliminação do gene de SacB. Contagens de colônia para bactérias cotransformadas (porém não induzida com IPTG) com pVHBa e pAR- CUS codificando VHB 11-12x.26 foram iguais como em placas de con- trole de ampicilina, e bactérias cotransformadascom pARCUS 5-6x.33 foram apenas levemente reduzidas em comparação com placas de controle.
[00315] Culturas não induzidas por IPTG foram capazes de crescer em placas contendo tanto ampicilina e canamicina (Figura 9B). As con- tagens de colônia de bactérias cotransformadas com pARCUS codifi- cando VHB 11-12x.26 foram aproximadamente iguais para controlar placas de apenas de ampicilina, e células cotransformadas com pAR- CUS VHB 5-6x.33 foram apenas levemente reduzidas em comparação com os controles. Entretanto, quando células induzidas por IPTG fo- ram cultivadas em placas contendo ampicilina e canamicina, as conta- gens de colônia foram próximas a zero, indicando a eliminação de plasmídeos transportando um gene de resistência de canamicina (Fi- gura 9B). Conclusões
[00316] Estes dados claramente demonstram que as meganuclea- ses de VHB da invenção reconhecendo sítios no genoma de VHB são capazes de cortar o plasmídeo de pVHBa, resultando na eliminação do plasmídeo de pVHBa. Em culturas induzidas por IPTG, as células na presença de sacarose, indicando a eliminação eficiente do plasmídeo contendo SacB. Similarmente, em culturas induzidas por IPTG, as cé- lulas morreram na presença de canamicina, também fortemente indi- cando a destruição do plasmídeo de pVHBa. É possível que resultados similares ocorrem em células mamíferas infectadas por VHB, usando meganucleases de VHB da invenção para clivar o cccDNA de VHB.
Em bactérias, DNA linear é rapidamente eliminado. É concebível que o cccDNA linearizado em células de mamíferos será digerido por nu- cleases celulares. Mesmo se a clivagem não induzir à linearização e eliminação de cccDNA, é provável que mutações internas causadas pelas VHB ARCUS nucleases romperão as regiões de codificação e tornarão o cccDNA incapaz de produzir proteínas de VHB funcionais. Desse modo, o direcionamento de meganucleases da invenção aos sítios no genoma de VHB deve ser um método eficaz para eliminar ou inativar o cccDNA de VHB. EXEMPLO 3 Direcionamento de genomas virais de VHB em células Tratamento de células AD38 expressando um genoma de VHB
[00317] O propósito principal destes exemplos foi avaliar se as me- ganucleases da invenção foram capazes de inativar e/ou eliminar os genomas do VHB em células de mamíferos infectadas pelo VHB.
[00318] Em um primeiro estudo, a eficácia da meganuclease foi avaliada em uma linhagem de célula AD38 que expressa estavelmente um genoma VHB sob um promotor Tet. Esta linhagem de célula AD38 não gera partículas virais ativas, porém não gera o antígeno de VHB S (HBsAg) que é detectável no meio celular. Neste estudo, células foram transfectadas com um plasmídeo de DNA codificando ou VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26. Ambas estas meganucleases modificadas direcio- nam uma sequência específica para o genoma de VHB, com VHB 5- 6x.33 direcionando uma sequência dentro das estruturas de leitura de S (HBsAg gene) e P (polimerase gene) sobrepostas e VHB 11-12x.26 direcionando o gene P. Como um controle, as células AD38 foram transfectadas com um plasmídeo codificando o gene de proteína fluo- rescente vermelha (RFP). As céluls foram semeadas e 24 horas de- pois foram transfectadas com plasmídeos usando um protocolo de transfecção com base em lipossoma. 24 horas pós-transfecção, as cé-
lulas AD38 foram lavadas para remover os complexos de lipossoma restantes. Nos dias 3 e 7 pós-transfecção, o sobrenadante celular foi colhido e ensaiado quanto à presença de HBsAg por ELISA. Resultados
[00319] Os dados de ELISA foram normalizados para a quantidade de HBsAg presente no sobrenadante de celulas AD38 transfectadas por RFP no dia 3 e dia 7 pós-transfecção. No dia 3 pós-transfecção, células transfectadas com um plasmídeo codificando VHB 11-12x.26 mostraram aproximadamente 25% menos HBsAg no sobrenadante de células transfectadas por RFP (Figura 10). No mesmo ponto de tempo, células transfectadas com um plasmídeo codificando VHB 5-6x.33 mostraram aproximadamente 50% menos HBsAg no sobrenadante em comparação com células transfectadas com RFP (Figura 10). Células de controle não transfectadas foram essencialmente iguas às células transfectadas com RFP. A redução em HBsAg foi ainda mais evidente no dia 7 pós-transfecção. Células AD38 transfectadas com VHB 11- 12x.26 mostraram níveis de HBsAg aproximadamente 50% menores do que células transfectadas com RFP, e células transfectadas com VHB 5-6x.33 tiveram níveis aproximadamente 75% menores do que o controle de RFP (Figura 10). No dia 7 pós-transfecção, as células transfectadas com RFP tiveram significantemente menos HBsAg no sobrenadante em comparação com células não transfectadas, suge- rindo que o processo de transfecção teve um impacto negative sobre a capacidade das células em produzir HBsAg. No entanto, o impacto foi muito mais pronunciado nas células transfectadas com plasmídeos codificando as meganucleases de VHB, fortemente sugerindo que a redução nos níveis de HBsAg no sobrenadante foi devido à atividade de meganuclease. Conclusões
[00320] Estes dados demonstram que células AD38 transfectadas com plasmídeos codificando ou o VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26 mostram uma redução dramática em HBsAg no sobrenadante em comparação com either células não transfectadas ou células transfec- tadas com um gene repóter de RFP. A redução de níveis de HBsAg no sobrenadante em células transfectadas com qualquer uma das me- ganucleases de VHB fortemente sugere que a redução é devido à ati- vidade de meganuclease contra o genoma de VHB em células AD38. EXEMPLO 4 Direcionamento de genomas virais de VHB em células Tratamento de células AD38 expressando um genoma de VHB
[00321] Os estudos no Exemplo 3 acima demonstram eficácia da meganuclease na redução da secreção de HBsAg da linhagem de cé- lula Ad38 expressando o genoma de VHB. Para determinar se uma redução maior na secreção de HBsAg poderia ser obtida usando libe- ração lentiviral em vez de transfecção de plasmídeo, este estudo foi repetido com liberação lentiviral usando as meganucleases de VHB11- 12x.26 e VHB5-6x.33 individualmente ou em combinação.
[00322] Lentivírus foram gerados que expressam RFP, VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26, e células AD38 foram transduzidas para determinar o impacto das meganucleases sobre a produção de HBsAg. As células AD38 foram semeadas e 24 horas depois foram transduzidas com um lentivírus codificando RFP, VHB 5-6x.33, VHB 11-12x.26, ou uma mis- tura de 1:1 dos lentivírus codificando as meganucleases de VHB. As células foram transduzidas com lentivirus simples em um MOI de 1, 2, ou 4. Células que foram transduzidas com a mistura de 1:1 de lentivi- rus codificando a meganuclease de VHB foram transduzidas em MOIs totais de 2 e 4. Os meios nas células transduzidas foram mudados no dia 1 e dia 3 pós-transdução. No dia 7 pós-transdução, os sobrenadan- tes celulares foram colhidos e ensaiados quanto à presença de HBsAg por ELISA.
Resultados
[00323] Os dados de ELISA foram normalizados para a quantidade de HBsAg presente no sobrenadante de células AD38 transduzidas por RFP no dia 7 pós-transfecção. Em um MOI de 1, células AD38 transduzidas com VHB 5-6x.33 mostraram aproximadamente 60% menos HBsAg no sobrenadante do que células AD38 transduzidas com lentivírus expressando RFP (Figura 11). Também em um MOI de 1, VHB 11-12x.26 mostrou cerca de 40% menos HBsAg do que RFP. Em MOIs superiores, o impacto das meganucleases de VHB foi mais pronunciado. Em um MOI de 2, células transduzida com lentivírus co- dificando VHB 5-6x.33 mostraram uma redução em HBsAg de cerca de 80% em comparação às células transduzidas por RFP e, em um MOI de 4, a redução foi de cerca de 90% em comparação. Similarmen- te, em um MOI de 2, células transduzida com lentivírus codificando VHB 11-12x.26 mostraram cerca de 70% menos HBsAg do que as cé- lulas transduzidas por RFP e, em um MOI de 4, HBsAg foi menor em aproximadamente 80%. Finalmente, células transduzidas com uma mistura de 1:1 de lentiviruses codificando as meganucleases de VHB também mostraram níveis dramaticamente reduzidos HBsAg no so- brenadante em comparação com células de controle transduzidas por RFP (Figura 11). Em um MOI total de de 2, o lentivírus expressando o VHB reduziu a expressão de HBsAg em cerca de 80% e, em um MOI total de 4, a expressão foi reduzida em aproximadamente 90%. Conclusões
[00324] Estes dados demonstram que células AD38 transduzidas com lentivírus codificando ou o VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26, ou uma combinação de ambos, mostram uma redução dramática em HBsAg no sobrenadante em comparação com as células transduzidas com um lentivírus expressando RFP. A redução de níveis de HBsAg no sobrenadante em células transduzidas com lentivírus expressando qualquer uma ou ambas as meganucleases de VHB fortemente sugere que a redução é devido à atividade de meganuclease contra o genoma de VHB em células AD38. Além disso, estes dados demonstram que a coexpressão das meganucleases de VHB reduz eficientemente a ex- pressão de HBsAg, fortemente sugerindo que as meganucleases coe- xpressam podem eficazmente reduzir o genoma de VHB. EXEMPLO 5 Direcionamento de genomas virais de VHB em células Tratamento de células AD38 expressando um genoma de VHB
[00325] Em um outro estudo, células AD38 foram transduzidas com lentivírus codificando as meganucleases de VHB 5-6x.33 ou VHB 11- 12x.26 a fim de observar o efeito de tratamento com meganuclease na secreção de HBsAg, cópias de DNA de VHB presentes no meio de cul- tura celular, e cópias de cccDNA de VHB intracelular.
[00326] Similar ao Exemplo 4 acima, lentivírus foram gerados que expressam RFP (LV212), VHB 5-6x.33 (LV224), ou VHB 11-12x.26 (LV225), e células AD38 foram transduzidas para determinar o impacto das meganucleases sobre cada resultado experimental. As células AD38 foram semeadas na presença de tetraciclina e 24 horas depois foram transduzidas com lentivírus codificando RFP, VHB 5-6x.33, ou VHB 11-12x.26 em um MOI de 4. Os meios nas células transduzidas foram mudados 24 horas pós-transdução. No dia 7 pós-transdução, os sobrenadantes celulares foram colhidos e ensaiados quanto à presen- ça de HBsAg por ELISA. Cópias de DNA de VHB extracelular por 5 µL de cultura celular foram determinadas por PCR quantitativa. Lisados de célula foram obtidos e cópias intracelulares de cccDNA de VHB por 5 µL de lisado celular foram determinados por PCR quantitativa. Resultados
[00327] Em um MOI de 4, células AD38 transduzidas com VHB 5- 6x.33 e VHB 11-12x.26 mostraram aproximadamente 58% e 25% me-
nos HBsAg no meio de cultura celular, respectivamente, 7 dias após a transdução de tais células AD38 transduzidas com lentivírus expres- sando RFP (Figura 12A). Número de cópia de DNA de VHB extracelu- lar foi também reduzido por transdução com meganucleases de VHB 5-6x.33 e VHB 11-12x.26 em aproximadamente 28% e 50%, respecti- vamente, quando em comparação com transducção com lentivírus ex- pressando RFP (Figura 12B). Finalmente, o número de cópia de cccDNA de VHB intracelular foi também reduzida por transdução com meganucleases de VHB 5-6x.33 e VHB 11-12x.26 em aproximada- mente 71% e 60%, respectivamente, quando em comparação com transdução com lentivírus expressando RFP (Figura 12C). Conclusões
[00328] Estes dados também demonstram que células AD38 trans- duzidas com lentivírus codificando as meganucleases de VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26 mostram uma redução dramática em HBsAg no so- brenadante em comparação com as células transduzidas com um len- tivírus expressando RFP. Adicionalmente, estes dados demonstram que meganucleases de VHB da invenção também reduzem o número de cópia de DNA de VHB extracelular e, importantemente, reduzem significantemente o número de cópia intracelular de cccDNA de VHB. EXEMPLO 6 Tratamento de hepatócitos humanos primários infectados por VHB Tratamento de hepatócitos humanos primários infectados por VHB
[00329] Os estudos nos Exemplos acima demonstram a eficácia da meganuclease na redução da secreção de HBsAg da linhagem de cé- lula Ad38 expressando o genoma de VHB. Os estudos do presente Exemplo foram conduzidos para determinar a eficácia de meganuclea- ses de VHB da invenção em hepatócitos humanos primários infecta- dos por VHB.
[00330] Lentivírus foram gerados que expressam RFP, VHB 5-
6x.33, ou VHB 11-12x.26, e hepatócitos humanos primários infectados por VHB foram transduzidos para determinar o impacto das meganu- cleases sobre a produção de HBsAg e HBeAg. Resumidamente, os hepatócitos humanos primários foram semeados e 24 horas depois infectados com VHB. 1 dia pós-infecção, as células foram lavadas e 24 horas depois (dia 2 pós-infecção) foram transduzidas com um lentiví- rus codificando RFP, VHB 5-6x.33, VHB 11-12x.26, ou uma mistura de 1:1 dos lentivírus codificando as meganucleases de VHB. Como um controle adicional, células infectadas foram tratadas com DMSO. Os sobrenadantes celulares foram colhidos e o meio foi substituído nos dias 4, 8, 11, e 13 pós-transdução. Em cada ponto de tempo, HBsAg e HBeAg foram medidos nos sobrenadantes celulares por ELISA. O DNA extracelular no sobrenadante foi também medido no dia 13 pós- infecção. Resultados
[00331] Para determinar se a transdução de lentivírus, em geral, a secreção afetou o HBsAg ou HBeAg, sobrenadantes celulares de célu- las transduzidas com um lentivírus codificando RFP foram comparados às células tratadas com DMSO (Figura 13). A transdução de hepatóci- tos humanos primários infectados por VHB com um lentivírus codifi- cando RFP teve impacto menor, se houver, sobre a secreção de HBsAg ou HBeAg (Figura 13A e 13B). Em um MOI de 5 ou 2.5, os ní- veis de HBsAg são idênticos às células tratadas com DMSO, e em um MOI de 1,25, houve apenas um decréscimo modesto (Figura 13A). Similarmente, os níveis de HBeAg nos sobrenadantes de células transduzidas por RFP-lentivírus mostram apenas decréscimos em um MOI de 1,25, 2,5 ou 5, quando em comparação com células tratadas com DMSO (Figura 13B). Adicionalmente, a quantidade de VHB extra- celular detectada no sobrenadante de hepatócitos humanos primários infectados por VHB mostra pouca diferença entre DMSO e células transduzidas com lentivirus codificando RFP (Figura 13C).
[00332] Tendo mostrado que a transdução lentiviral, em geral, não impactou a função de VHB em hepatócitos humanos primários infecta- dos, lentivírus codificando meganucleases de VHB foram comparados aos lentivírus de RFP. Os dados de ELISA de HBsAg foram normali- zados para a quantidade de HBsAg presente no sobrenadante de he- patócitos humanos primários infectados por VHB, transduzidos por RFP nos dias 3, 8, 11, e 13 pós-transdução (Figura 14). Tanto em um MOI de 2,5 quanto 1,25, células transduzida com lentivírus codificando VHB 5-6x.33 mostraram um decréscimo constante em HBsAg durante o curso de tempo do experiment, mostrando níveis levemente reduzi- dos no dia 3, uma redução de aproximadamente 50-60% no dia 8, e uma redução de cerca de 90% nos dias 11 e 13 quando em compara- ção com o controle de RFP (Figura 14A e 14B). Células infectadas transduzidas com VHB 11-12x.26 mostraram um padrão similar tanto em um MOI de 2,5 quanto 1,25, com uma redução mais perceptível no ponto de tempo do dia 3 (cerca de 50% de redução), e ainda atingindo cerca de 90% de redução nos dias 11 e 13 pós-transdução (Figura 14A e 14B). Quando células infectadas foram transduzidas com uma mistura 1:1 do lentivirus codificando meganuclease de VHB, uma re- dução similar em HBsAg foi observada durante o curso de tempo. Em um MOI de 2.5, os níveis foram reduzidos em aproximadamente 50% no dia 3 pós-transdução, e uma redução continuou alcançando 90% nos dias 11 e 13 pós-transdução (Figura 14A e 14B).
[00333] Os dados de ELISA de HBeAg foram também normalizados para a quantidade de HBeAg presente no sobrenadante de hepatóci- tos humanos primários infectados por VHB, transduzidos por RFP nos dias 3, 8, 11 e 13 pós-transdução (Figura 14). Tanto em um MOI de 2,5 quanto 1,25, células transduzida com lentivírus codificando VHB 5- 6x.33 mostraram um decréscimo constante em HBeAg durante o curso de tempo do experimento, mostrando níveis reduzidos em cerca de 25% no dia 3, uma redução de aproximadamente 50% no dia 8, e uma redução de cerca de 90% nos dias 11 e 13 quando em comparação ao controle de RFP (Figura 14C e 14D). Células infectadas transduzidas com VHB 11-12x.26 mostraram um padrão similar tanto em um MOI de 2,5 quanto 1,25, com uma redução similar no ponto de tempo do dia 3 (cerca de 30% de redução), e ainda alcançando cerca de 90% de re- dução em HBeAg nos dias 11 e 13 pós-transdução (Figura 14C e 14D). Quando as células infectadas foram transduzidas com uma mis- tura de 1:1 do lentivirus codificando a meganuclease de VHB, uma re- dução similar em HBeAg foi observada durante o curso de tempo. Em um MOI de 2,5 e 1,25, os níveis foram reduzidos em aproximadamente 50% no dia 3 pós-transdução, e a redução continuou alcançando 90% nos dias 11 e 13 pós-transdução (Figura 14C e 14D). Conclusões
[00334] Estes dados demonstram que hepatócitos humanos primá- rios infectados por VHB, transduzidos com lentivírus codificando ou o VHB 5-6x.33 ou VHB 11-12x.26, ou uma combinação dos dois, mos- tram uma redução dramática em HBsAg e HBeAg no sobrenadante comparados às células transduzidas com um lentivírus expressando RFP. A redução nos níveis de HBsAg e HBeAg no sobrenadante em células infectadas, transduzidas com lentivírus expressando qualquer uma ou ambas as meganucleases de VHB, fortemente sugere que a redução é devido à atividade de meganuclease contra o vírus infeccio- so. EXEMPLO 7 Liberação de Nuclease mRNA Encapsulada por LNP para o fígado Encapsulação de mRNA em nanopartículas de lipídio e liberação para os camundongos
[00335] O propósito deste estudo foi demonstrar que o mRNA en-
capsulado por nanopartícula de lipídio (LNP) codificando uma me- ganuclease modificada seria preparado e administrado in vivo, e que a edição de gene no fígado ocorre e seria observada.
[00336] Uma meganuclease modificada foi desenvolvida que tem es- pecificidade para uma sequência de reconhecimento no gene de CMP- NeuAc hidrolase (Cmah) de camundongo, que é expresso no fígado de camundongo. MRNA tamponado por ARCA codificando a meganuclease de Cmah foi preparado por TriLink BioTechnologies LLC (San Diego, CA) e encapsulado em três diferentes formulações de LNP comerciais, cada qual compreendendo várias relações de um lipídio catiônico ionizá- vel, um lipídio de PEG, e colesterol. O mRNA encapsulado por LNP foi administrado aos camundongos CD-1 por injeção IV em uma dose de 1,0 mg/kg. Os fígados foram colhidos 6 dias após administração. Antes da coleta dos órgãos, os animais formam perfundidos com salina. DNA genômico de fígado inteiro (gDNA) foi isolado e a frequência de muta- ções de inserção/deleção (indel) no gene de Cmah foi determinada usando um ensaio de T7 endonuclease I (T7E) e sequenciamento pro- fundo. No ensaio de T7E, a região genômica contendo a sequência de reconhecimento de Cmah foi PCR amplificada, resultando em uma mis- tura heterogênea de alelos amplificados do tipo selvagem e mutantes. O produto de PCR foi desnaturado e deixado lentamente reanimar, permi- tindo a formação de heteroduplexes entre os alelos do tipo selvagem e mutantes. Tais heteroduplexes são suscetíveis à clivagem pela T7 en- donuclease I, que corta em incompatibilidades. Quando os produtos cli- vados por T7E são visualizados em um gel, múltiplas bandas estão pre- sentes devido a clivagem de heteroduplexes, enquanto uma única ban- da está presente em amostras do tipo selvagem. A relação de produto clivado para não clivado fornece uma medida do nível de atividade de clivagem de nuclease. Resultados
[00337] Os resultados do presente estudo são apresentados na Fi- gura 15. Como mostrado nas linhas 1 e 2, gDNA obtidos de camun- dongos de controle, que foram administrados com mRNA encapsulado com LNP codificando luciferase, não mostraram nenhuma evidência de clivagem na sequência de reconhecimento de Cmah. A relação de clivado:não clivado observada nos animais tratados com luciferase mRNA foi comparável à relação observada em animais que não foram administrados com mRNA (linha 8). Ao contrário, as 3-7 e 9-18 cada qual demonstram a modificação na sequência de reconhecimento de Cmah quando os animais foram administrados com o mRNA encapsu- lado com LNP codificando uma meganuclease de Cmah, como indica- do pela presença de múltiplas bandas em cada linha. Sequenciamento profundo foi realizado em gDNA obtido de cada fígado a fim de confir- mar e quantificar a porcentagem de modificação de gene na sequência de reconhecimento de Cmah. As porcentagens obtidas por sequenci- amento profundo são mostradas na Figura 15 abaixo de cada linha como %KO. As linhas 3-7 mostram as modificações variando de 3,41% a 21,49% em animais replicados administrados com a formula- ção de LNP #1. As linhas 9-13 mostram modificações variando de 18,4% a 23,2% em animais replicados administrados com a formula- ção de LNP #2. As linhas 14-18 mostram modificações variando de 51,1% a 64,8% em animais replicados administrados com a formula- ção de LNP #3. Conclusões
[00338] Este estudo claramente demonstra que o mRNA codifican- do uma meganuclease modificada, tal como as meganucleases espe- cíficas de VHB da invenção, pode ser encapsulado em uma LNP, libe- rada às células do fígado alvo (isto é, hepatócitos) in vivo, e podem induzir à edição genética na sequência de reconhecimento direcionada no genoma.

Claims (65)

REIVINDICAÇÕES
1. Meganuclease modificada que reconhece e cliva uma sequência de reconhecimento dentro de uma estrutura de leitura aber- ta (ORF) do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepati- te B, caracterizada pelo fato de que a meganuclease modificada com- preende uma primeira subunidade e uma segunda subunidade, em que a referida primeira subunidade se liga a um primeiro meio sítio de reconhecimento da referida sequência de reconhecimento e compre- ende uma primeira região hipervariável (HVR1), e em que a referida segunda subunidade se liga a um segundo meio sítio de reconheci- mento da referida sequência de reconhecimento e compreende uma segunda região hipervariável (HVR2).
2. Meganuclease modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de reconheci- mento está dentro de uma ORF de genótipo A (SEQ ID NO: 3) e uma ou mais de genótipo B (SEQ ID NO: 4), genótipo C (SEQ ID NO: 5), genótipo D (SEQ ID NO: 6), genótipo E (SEQ ID NO: 7), genótipo F (SEQ ID NO: 8), e genótipo G (SEQ ID NO: 9).
3. Meganuclease modificada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a referida sequência de reco- nhecimento está dentro pelo menos uma ORF codificando uma proteí- na selecionada do grupo que consiste em a proteína polimerase (P), a proteína de superfície grande (preS1/preS2/S), a proteína de superfí- cie média (preS2/S), e a proteína de superfície pequena (S).
4. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida se- quência de reconhecimento compreende a SEQ ID NO: 12.
5. Meganuclease modificada de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR1 compre- ende sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resíduos 215 a 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou re- síduos 24 a 79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
6. Meganuclease modificada de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR1 com- preende resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24, ou resíduos correspondendo aos resí- duos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
7. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizada pelo fato de que a referida re- gião de HVR1 compreende resíduos 215 a 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 24 a 79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
8. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizada pelo fato de que a referida re- gião de HVR2 compreende sequência de aminoácido tendo pelo me- nos 80% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácido correspondendo aos resíduos 24 a 79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 215 a 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
9. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizada pelo fato de que a referida re- gião de HVR2 compreende resíduos correspondendo aos resíduos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24, ou resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
10. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizada pelo fato de que a referida re- gião de HVR2 compreende resíduos 24 a 79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 215 a 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
11. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 10, caracterizada pelo fato de que a referida primeira subunidade compreende a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência aos resíduos 198 a 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 7 a 153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28, e em que a referida segunda subunidade compreende a sequência de aminoácido tendo pelo me- nos 80% de identidade de sequência aos resíduos 7 a 153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 198 a 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
12. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 11, caracterizada pelo fato de que a referida primeira subunidade compreende os resíduos 198-344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 7 a 153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
13. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, caracterizada pelo fato de que a referida segunda subunidade compreende os resíduos 7 a 153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 24 ou resíduos 198 a 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 25 a 28.
14. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 13, caracterizada pelo fato de que a referida meganuclease modificada compreende um ligante, em que o referido ligante covalentemente liga a referida primeira subunidade e a referida segunda subunidade.
15. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 14, caracterizada pelo fato de que a referida meganuclease modificada compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 22 a 28.
16. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a referida se- quência de reconhecimento compreende a SEQ ID NO: 16.
17. Meganuclease modificada de acordo com a reivindica- ção 16, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR1 compreende a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência aos resíduos 215 a 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
18. Meganuclease modificada de acordo com a reivindica- ção 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR1 compreende os resíduos correspondendo aos resíduos 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, e 268 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
19. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR1 compreende os resíduos 215 a 270 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
20. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR2 compreende a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência aos resíduos 24 a 79 de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
21. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 20, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR2 compreende os resíduos correspondendo aos resí- duos 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, e 77 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
22. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 21, caracterizada pelo fato de que a referida região de HVR2 compreende os resíduos 24 a 79 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
23. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 22, caracterizada pelo fato de que a referida primeira subunidade compreende a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência aos resíduos 198 a 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39, e em que a referida se- gunda subunidade compreende a sequência de aminoácido tendo pelo menos 80% de identidade de sequência aos resíduos 7 a 153 de qual- quer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
24. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 23, caracterizada pelo fato de que a referida primeira subunidade compreende os resíduos 198 a 344 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
25. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizada pelo fato de que a referida segunda subunidade compreende os resíduos 7 a 153 de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
26. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 25, caracterizada pelo fato de que a referida meganuclease modificada compreende um ligante, em que o referido ligante covalentemente liga a referida primeira subunidade e a referida segunda subunidade.
27. Meganuclease modificada de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 26, caracterizada pelo fato de que a referida meganuclease modificada compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 33 a 39.
28. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compre-
ende uma sequência de ácido nucleico codificando a referida meganu- clease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
29. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 28, ca- racterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo é um mRNA.
30. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 29, ca- racterizado pelo fato de que o referido mRNA é um mRNA policistônico codificando uma ou mais das referidas meganucleases modificadas como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
31. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 30, ca- racterizado pelo fato de que o referido mRNA policistrônico codifica: (a) uma meganuclease modificada que reconhece e cliva uma sequência de reconhecimento compreendendo SEQ ID NO: 12; e (b) uma meganuclease modificada que reconhece e cliva uma sequência de reconhecimento compreendendo SEQ ID NO: 16.
32. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o referido mRNA policistrônico codi- fica: (a) a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 15; e (b) a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 16 a 27.
33. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 30 a 32, caracterizado pelo fato de que o referido mRNA policistrônico codifica uma meganuclease modificada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e codifica uma me- ganuclease modificada compreendendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 33.
34. Construção de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico codificando a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
35. Construção de DNA recombinante de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a referida construção de DNA recombinante compreende um cassete compreendendo um pro- motor e uma sequência de ácido nucleico codificando a referida me- ganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindi- cações 1 a 27.
36. Construção de DNA recombinante de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a referida construção de DNA recombinante compreende dois ou mais cassetes, em que cada um dos referidos cassetes compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, e em que cada da referida meganucleases modificadas tem especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB.
37. Construção de DNA recombinante de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a referida construção de DNA recombinante compreende um cassete compreendendo um pro- motor e uma sequência de ácido nucleico policistrônico codificando uma ou mais das referidas meganucleases modificadas como defini- das em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, em que o referido promotor regula a expressão da referida sequência de ácido nucleico policistrônico para gerar um mRNA policistrônico em uma célula alvo.
38. Construção de DNA recombinante de acordo com a rei- vindicação 36, caracterizada pelo fato de que o referido mRNA policis- trônico é o referido mRNA policistrônico como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 33.
39. Construção de DNA recombinante de acordo com a rei- vindicação 34, caracterizada pelo fato de que a referida construção de
DNA recombinante codifica um vetor viral compreendendo a referida sequência de ácido nucleico codificando a referida meganuclease mo- dificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
40. Construção de DNA recombinante de acordo com a rei- vindicação 39, caracterizada pelo fato de que o referido vetor viral é um vetor de AVV recombinante.
41. Vetor viral, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico codificando a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
42. Vetor viral de acordo com a reivindicação 41, caracteri- zado pelo fato de que o referido vetor viral é um vetor de AVV recom- binante.
43. Vetor viral de acordo com a reivindicação 41, caracteri- zado pelo fato de que o referido vetor viral compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico codi- ficando a referida meganuclease modificada como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 27.
44. Vetor viral de acordo com a reivindicação 41, caracteri- zado pelo fato de que o referido vetor viral compreende dois ou mais cassetes, em que cada um dos referidos cassetes compreende um promotor e uma sequência de ácido nucleico codificando a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivin- dicações 1 a 27, e em que cada da referida meganuclease modificada tem especificidade para uma diferente sequência de reconhecimento de VHB.
45. Vetor viral de acordo com a reivindicação 41, caracteri- zado pelo fato de que o referido vetor viral compreende um cassete compreendendo um promotor e uma sequência de ácido nucleico poli- cistrônico codificando uma ou mais da referida meganucleases modifi- cadas como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, em que o referido promotor regula a expressão da referida sequência de ácido nucleico para gerar um mRNA policistrônico em uma célula alvo.
46. Vetor viral de acordo com a reivindicação 45, caracteri- zado pelo fato de que o referido mRNA policistrônico é o referido mRNA policistrônico como definido em qualquer uma das reivindica- ções 30 a 33.
47. Composição farmacêutica para o tratamento de um in- divíduo tendo vírus da hepatite B (VHB) ou carcinoma hepatocelular causado por VHB, a referida composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e: (a) um ácido nucleico codificando a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27; ou (b) a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
48. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que o referido ácido nucleico codifi- cando a referida meganuclease modificada é o referido mRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 29 a 33.
49. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a referida composição farma- cêutica compreende a referida construção de DNA recombinante como definida em qualquer uma das reivindicações 34 a 40.
50. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a referida composição farma- cêutica compreende o referido vetor viral como definido em qualquer uma das reivindicações 41 a 46.
51. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a referida composição farma-
cêutica compreende a referida meganuclease modificada como defini- da em qualquer uma das reivindicações 1 a 27.
52. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a referida composição farma- cêutica compreende duas ou mais da referida meganuclease modifi- cada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 27, em que as referidas meganucleases modificadas têm especificidade para diferentes sequências de reconhecimento de VHB.
53. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a referida composição farma- cêutica compreende dois ou mais ácidos nucleicos codificando duas ou mais da referida meganuclease modificada como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 27, em que as referidas meganuclea- ses modificadas têm especificidade para diferentes sequências de re- conhecimento de VHB.
54. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizada pelo fato de que a referida composição farma- cêutica compreende um ou mais dos referidos mRNAs como definidos em qualquer uma das reivindicações 29 a 33 encapsulados dentro de nanopartículas de lipídio.
55. Método para tratamento de um indivíduo tendo VHB, caracterizado pelo fato de que o referido método compreende liberar para uma célula alvo no referido indivíduo: (a) um ácido nucleico codificando uma meganuclease modi- ficada, em que a referida meganuclease modificada é expressa na re- ferida célula alvo in vivo; ou (b) uma meganuclease modificada; em que a referida meganuclease modificada tem especificidade para uma sequência de reconhecimento em uma ORF do genoma de pelo menos dois genótipos do vírus da Hepatite B, e em que a referida me-
ganuclease modificada reconhece e cliva a referida sequência de re- conhecimento na referida célula alvo, e em que a infecção e/ou prolife- ração de VHB no referido indivíduo é reduzida ou eliminada.
56. Método de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do pelo fato de que a referida sequência de reconhecimento está den- tro de uma ORF de genótipo A e um ou mais de genótipo B (SEQ ID NO: 4), genótipo C (SEQ ID NO: 5), genótipo D (SEQ ID NO: 6), genó- tipo E (SEQ ID NO: 7), genótipo F (SEQ ID NO: 8), e genótipo G (SEQ ID NO: 9).
57. Método de acordo com a reivindicação 55 ou 56, carac- terizado pelo fato de que a referida sequência de reconhecimento é encontrada dentro de uma ORF de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 genótipos do vírus da Hepatite B.
58. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de reconhecimento está dentro pelo menos uma ORF codificando uma proteína selecionada do grupo que consiste na proteína polimerase (P), na proteína de superfície grande (preS1/preS2/S), na proteína de superfície média (preS2/S), e na proteína de superfície pequena (S).
59. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 58, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de reconhecimento compreende a SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 14.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de reconhecimento compreende a SEQ ID NO: 12.
61. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a referida meganuclease modificada é a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 15.
62. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 59, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de reconhecimento compreende a SEQ ID NO: 16.
63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracteriza- do pelo fato de que a referida meganuclease modificada é a referida meganuclease modificada como definida em qualquer uma das reivin- dicações 16 a 27.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 63, caracterizado pelo fato de que o referido método com- preende administrar a um referido indivíduo a referida composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 47 a
54.
65. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 55 a 64, caracterizado pelo fato de que a referida meganuclease modificada, ou o referido ácido nucleico codificando a referida me- ganuclease modificada, é liberada para uma célula de hepatócito alvo.
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