KR20210118240A - B형 간염 바이러스 게놈 내의 인식 서열에 대해 특이적인 조작된 메가뉴클레아제 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV)의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 조작된 메가뉴클레아제를 포함한다. 본 발명은 이러한 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 감염의 증상을 치료하거나 감소시키거나 또는 간세포 암종 (HCC)을 치료하기 위해 제약 조성물 및 방법에서 사용하는 방법을 또한 포함한다. 추가로, 본 발명은 조작된 메가뉴클레아제 단백질 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물, 및 HBV 감염 또는 HCC를 치료하기 위한 이러한 조성물의 용도를 포함한다.
Description
발명의 분야
본 발명은 종양학, 분자 생물학 및 재조합 핵산 기술의 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 B형 간염 바이러스 게놈의 적어도 2개의 유전자형 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제에 관한 것이다. 이러한 조작된 메가뉴클레아제는 B형 간염 바이러스 감염 및 B형 간염 바이러스에 의해 야기되는 간세포 암종을 치료하는 방법에서 유용하다.
EFS-웹을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 ASCII 양식으로 EFS-웹을 통해 제출되고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 함유한다. 2017년 10월 13일에 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 P109070018WO00-SEQ-MJT.txt이고 크기가 169,011 바이트이다.
B형 간염 바이러스 (HBV)는 세계적으로 주요 건강 문제이고, 3억5천만명이 만성 보균자이다. HBV 감염은 간의 심각하고 통상적인 감염성 질환이다. 만성 감염은 가장 통상적인 형태의 인간 암 중 하나인 간세포 암종 (HCC) 및 간 경화를 포함하는 중증 간 질환을 발생할 증가된 위험과 연관된다. 만성 HBV 보균자에서의 HCC의 추정된 위험은 감염되지 않은 개체에서보다 약 100배 더 크다. 만성 감염을 갖는 2억4천만명 내지 3억5천만명을 포함하여 전세계 인구의 약 1/3이 일생 중 어느 시점에 감염된 바 있다. 매년 750,000명 초과의 사람들이 B형 간염으로 사망한다. 이들 중 약 300,000건이 간암으로 인한 것이다. 현재 이용가능한 항-HBV 약물은 한계가 있다. 예를 들어, 인터페론 알파 투여는 심각한 유해 반응과 연관된다. 뉴클레오시드 유사체는 바이러스억제성이고, 장기 투여를 필요로 한다.
HBV 게놈은 매년 부위당 1.4-3.2x10-5 뉴클레오티드 치환의 추정률로 유전적 변이성을 나타낸다. 바이러스 폴리머라제에 의한 임의의 교정 능력의 부재 시의 뉴클레오티드 오혼입의 결과로서 복제 동안 다수의 바이러스 변이체가 발생한다. 이러한 변이성은 바이러스의 잘 인식되어 있는 아유형을 초래하였다. HBV는 전체 게놈 서열에서의 8% 이상의 그룹간 분기를 기초로 잘 정의된 유전자형으로 분류되어 있고, 각각은 지리적 분포가 명확하다. 예를 들어, 유전자형 A는 사하라 이남의 아프리카, 북유럽, 및 서아프리카에 널리 퍼져 있고; 유전자형 B 및 C는 아시아에서 통상적이고; 유전자형 C는 주로 동남아시아에서 관찰되고; 유전자형 D는 아프리카, 유럽, 지중해 국가 및 인도에서 우세하고; 유전자형 G는 프랑스, 독일 및 미국에서 보고되며; 유전자형 H는 통상적으로 중남미에서 조우된다. 유전자형 I는 최근에 베트남 및 라오스에서 보고된 바 있다. 가장 새로운 HBV 유전자형인 유전자형 J는 일본의 류쿠 제도에서 확인된 바 있다.
HBV는 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae) 과에 속하는 외피보유 DNA 바이러스이다. 이는 RNA 중간체인 프리게놈 RNA (pgRNA)의 역전사에 의해 복제되는 소형의 부분적 이중-가닥 (DS) 이완 환형 DNA (rcDNA) 게놈을 함유한다. DNA가 완전히 이중-가닥이지 않기 때문에 HBV의 환형 DNA 게놈은 일반적이지 않다. 전장 가닥의 한쪽 단부는 바이러스 DNA 폴리머라제에 연결된다. 이러한 게놈은 대략적으로 뉴클레오티드 약 3020-3320개의 길이 (전장 가닥의 경우), 및 뉴클레오티드 1700-2800개의 길이 (짧은 길이 가닥의 경우)이다. 음성-센스 (비-코딩)가 바이러스 mRNA에 대해 상보적이다.
C, X, P, 및 S로 지칭되는, 이러한 게놈에 의해 코딩되는 4개의 공지된 유전자가 있다. 코어 단백질이 유전자 C에 의해 코딩되고 (HBcAg), 그의 개시 코돈에 상류의 인-프레임 AUG 개시 코돈이 선행하며, 이로부터 프리-코어 단백질이 생산된다. 프리-코어 단백질의 단백질분해 프로세싱에 의해 HBeAg가 생산된다. 유전자 P에 의해 DNA 폴리머라제가 코딩된다. 유전자 S는 표면 항원 (HBsAg)을 코딩한다. HBsAg 유전자는 1개의 긴 오픈 리딩 프레임이지만, 유전자를 프리-S1, 프리-S2, 및 S의 3개의 섹션으로 분할하는 3개의 인-프레임 "개시" (ATG) 코돈을 함유한다. 다중 개시 코돈으로 인해, 대형 (표면에서 내부로의 순서: 프리-S1/프리-S2/S), 중형 (프리-S2/S), 및 소형 (S)로 칭해지는 3개의 상이한 크기의 폴리펩티드가 생산된다. 유전자 X에 의해 코딩되는 단백질의 기능은 완전히 이해되지는 않았지만, 이는 간암의 발생과 연관된다. 이는 세포 성장을 촉진하는 유전자를 자극하고, 성장 조절 분자를 불활성화시킨다.
세포 감염 직후에 바이러스 DNA가 핵에서 발견된다. 부분적 이중-가닥 DNA가 (+) 센스 가닥의 완성, 및 (-) 센스 가닥으로부터의 단백질 분자 및 (+) 센스 가닥으로부터의 RNA의 짧은 서열의 제거에 의해 완전히 이중-가닥이게 된다. 비-코딩 염기가 (-) 센스 가닥의 단부로부터 제거되고, 단부들이 재연결된다.
바이러스가 숙주 세포에 부착하고 내재화될 때 HBV 생활 주기가 시작된다. 최근의 연구에서, 소듐-타우로콜레이트 공동-운반 폴리펩티드 (NTCP)가 HBV 감염에서의 기능성 수용체라는 것이 실연되었다. 비리온 이완 환형 DNA (rcDNA)가 핵으로 전달되며, 여기서 이는 복구되어 공유 폐환형 DNA (cccDNA)를 형성한다. 에피솜 cccDNA가 숙주 RNA 폴리머라제 II에 의한 프리게놈 RNA (pgRNA) 및 다른 바이러스 mRNA의 전사를 위한 주형으로서의 역할을 한다. 그 후, 전사체가 세포질로 외수송되며, 여기서 바이러스 단백질의 번역이 발생한다. 역전사효소 (RT)가 pgRNA에 결합하고, 코어 단백질이 RNA-함유 미성숙 뉴클레오캡시드 내로 어셈블리되는 것을 촉발한다. 그 후, 미성숙 뉴클레오캡시드에 성숙 프로세스가 진행되고, 이에 의해 pgRNA가 RT에 의해 역전사되어, 성숙 rcDNA가 제조된다. 헤파드나바이러스 역전사의 독특한 특색은 마이너스-가닥 DNA 합성의 RT-프라이밍 개시이고, 이는 RT가 마이너스-가닥 DNA의 5' 단부에의 공유 연결에 이른다.
그 후, rcDNA-함유 성숙 뉴클레오캡시드가 바이러스 표면 단백질에 의해 감싸지고, 비리온으로서 분비되거나 (분비 경로), 또는, 대안적으로, 핵으로 다시 재순환되어 cccDNA의 풀을 추가로 증폭시킨다 (재순환 경로). 간세포 내의 cccDNA의 지속은 바이러스 지속, 항바이러스 요법 중단 후의 바이러스 복제 재활성화, 및 요법에 대한 저항성에서 주요한 역할을 한다.
귀소 엔도뉴클레아제는 식물 및 진균의 게놈에서 통상적으로 발견되는 염기쌍 15-40개의 절단 분위를 인식하는 천연-발생 뉴클레아제 군이다. 이들은 기생충 DNA 요소, 예컨대 그룹 1 자가-스플라이싱 인트론 및 인테인과 빈번하게 연관된다. 천연적으로 이들은 세포 DNA-복구 기구를 동원하는 염색체 내의 이중-가닥 파단을 일으킴으로써 숙주 게놈 내의 특정 위치에서의 상동 재조합 또는 유전자 삽입을 촉진한다 (Stoddard (2006), Q. Rev. Biophys. 38: 49-95). 귀소 엔도뉴클레아제는 통상적으로 4개의 패밀리로 분류된다: LAGLIDADG (서열식별번호(SEQ ID NO): 2) 패밀리, GIY-YIG 패밀리, His-Cys 박스 패밀리 및 HNH 패밀리. 이러한 패밀리는 촉매 활성 및 인식 서열에 영향을 미치는 구조적 모티프를 특징으로 한다. 예를 들어, LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 패밀리의 구성원은 보존된 LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 모티프의 1개 또는 2개의 카피를 갖는 것을 특징으로 한다 (문헌 [Chevalier et al. (2001), Nucleic Acids Res. 29(18): 3757-3774] 참조). LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 모티프의 1개의 카피를 갖는 LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 귀소 엔도뉴클레아제는 동종이량체를 형성하는 반면, LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 모티프의 2개의 카피를 갖는 구성원은 단량체로서 발견된다. 귀소 엔도뉴클레아제를 생산하는 방법이 관련 분야에 공지되어 있다.
I-CreI (서열식별번호: 1)는 조류 클라미도모나스 레인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)의 엽록체 염색체 내의 염기쌍 22개의 인식 서열을 인식 및 절단하는 귀소 엔도뉴클레아제의 LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 패밀리의 구성원이다. 유전적 선별 기술이 야생형 I-CreI 절단 부위 선호도를 변형시키기 위해 사용된 바 있다 (Sussman et al. (2004), J. Mol. Biol. 342: 31-41; Chames et al. (2005), Nucleic Acids Res. 33: e178; Seligman et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30: 3870-9, Arnould et al. (2006), J. Mol. Biol. 355: 443-58). 모노-LAGLIDADG (서열식별번호: 2) 귀소 엔도뉴클레아제를 합리적으로 설계하는 방법이 기술되었고, 이는 포유동물, 효모, 식물, 박테리아 및 바이러스 게놈 내의 부위를 포함하는 광범위하게 분기성인 DNA 부위를 표적화하도록 I-CreI 및 다른 귀소 엔도뉴클레아제를 포괄적으로 재설계할 수 있다 (WO 2007/047859).
WO 2009/059195에 최초로 기술된 바와 같이, I-CreI 및 그의 조작된 유도체는 정상적으로는 이량체성이지만, 제1 서브유닛의 C-말단을 제2 서브유닛의 N-말단에 연결하는 짧은 펩티드 링커를 사용하여 단일 폴리펩티드로 융합될 수 있다 (Li et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37:1650-62; Grizot et al. (2009), Nucleic Acids Res. 37:5405-19). 따라서, 기능성 "단일쇄" 메가뉴클레아제가 단일 전사체로부터 발현될 수 있다.
HBV 감염의 치료를 위해 조작된 메가뉴클레아제의 사용이 시사된 바 있다. 예를 들어, WO2010/136841은 게놈에 통합되지 않는 바이러스의 게놈을 절단하기 위한 조작된 메가뉴클레아제의 사용을 시사한다. 이러한 메가뉴클레아제는 I-CreI의 변이체를 포함한다. '841 출원은 하나의 HBV 균주의 게놈 내에 존재하는 다수의 염기쌍 22개의 메가뉴클레아제 인식 서열을 개시한다. 그러나, '841 출원에서는 HBV 게놈의 다중 유전자형 내에 존재하는 어떠한 인식 서열도 확인되지 않는다.
본 발명은, 부분적으로, HBV 게놈의 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내에 있고 HBV 게놈의 적어도 2개의 상이한 유전자형 내에 있는 DNA 서열을 인식하도록 조작된 부위-특이적, 희귀-절단 엔도뉴클레아제의 개발에 의존적이다. 본 발명자들은 바이러스의 다중 유전자형을 불활성화시키기 위해 재조합 메가뉴클레아제에 의해 표적화될 수 있는 유전자형에 걸쳐 보존된 특이적 인식 서열을 확인하였다.
본 발명은 여러 측면에서 종래 기술을 개선한다. 본 발명자들은 HBV 게놈의 여러 유전자형의 ORF 내에서 인식 서열이 확인될 수 있다는 것을 뜻밖에 발견하였다. 바이러스의 여러 유전자형을 표적화함으로써, 세계의 국지적인 영역에 존재하는 상이한 유전자형에 대해 사용될 수 있는 단일 제약 조성물이 제조될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 방법 및 조성물은 전세계적으로 감염 개체에서 HBV의 증식을 치료하거나 감소시키는데 유용하다. 간에서의 HBV 복제의 억제 또는 근절은 간 병리학 개선 및 간 경화 및 간세포 암종으로의 진행 감소에 이른다. 따라서, 본 발명은 HBV 감염에 대한 추가의 유전자 요법 접근법에 대한 관련 기술분야의 요구를 충족시킨다. 추가적으로, 본 발명은 HCC 세포 내의 HBV 게놈 내로의 "자살 유전자"의 상동 재조합에 의한 삽입을 표적화하는 수단을 제공함으로써 간세포 암종의 치료 방법을 제공한다. 자살 유전자는 암 세포를 직접적으로 사멸시키는 독소 또는 프로-아폽토시스 단백질, 또는 대상체 자신의 면역계에게 암 세포를 사멸시키도록 지시하는 세포 표면 항원 또는 MHC 클래스 I 항원 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
본 발명은 B형 간염 바이러스 (HBV) 감염의 치료에 유용한 조작된 메가뉴클레아제를 제공한다. 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내의 인식 서열을 인식 및 절단한다. 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제에 의한 이러한 인식 서열에서의 절단은 절단 부위에서의 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)로 인해 하나 이상의 바이러스 단백질의 발현을 파괴할 수 있다. NHEJ는 삽입, 결실을 초래할 수 있거나, 또는 유전자 발현을 방해할 수 있는 프레임시프트 돌연변이를 초래할 수 있다. 따라서, 정상적인 유전자 발현을 방해함으로써, 본원에 개시된 방법에 따라 HBV의 감염 및 증식이 감소 또는 제거될 수 있다. 본 발명은 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내에 위치하는 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제를 활용하는 HBV의 치료를 위한 제약 조성물 및 방법을 또한 제공한다. 본 발명은 HBV 수준을 감소시키고/거나 HBV 감염과 연관된 증상을 감소시키기 위해 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 HBV에 감염된 대상체에게 전달하는 방법을 추가로 제공한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 조작된 메가뉴클레아제를 제공한다. 조작된 메가뉴클레아제는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 포함하며, 여기서 제1 서브유닛은 인식 서열의 제1 인식 절반-부위에 결합하고 제1 초가변 (HVR1) 영역을 포함하고, 여기서 제2 서브유닛은 인식 서열의 제2 인식 절반-부위에 결합하고 제2 초가변 (HVR2) 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인식 서열은 B형 간염 바이러스의 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 유전자형의 ORF 내에서 발견된다. 하나의 이러한 실시양태에서, 인식 서열은 B형 간염 바이러스의 유전자형 A (서열식별번호: 3)의 ORF 내에 있다. 이러한 실시양태는 서열식별번호: 3과 상이하지만 하나 이상의 본원에 기술된 HBV 메가뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 유전자형 A의 B형 간염 바이러스 단리물을 포함한다. 추가의 이러한 실시양태에서, 인식 서열은 유전자형 A, 및 유전자형 B, C, D, E, F 및 G (각각 서열식별번호: 4-9) 중 하나 이상의 ORF 내에 있다. 이러한 실시양태는 서열식별번호: 3-9와 상이하지만 하나 이상의 본원에 기술된 HBV 메가뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 유전자형 A, B, C, D, E, F 및 G의 B형 간염 바이러스 단리물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 인식 서열은 폴리머라제 (P) 단백질, 대형 표면 (프리S1/프리S2/S) 단백질, 중형 표면 (프리S2/S) 단백질, 및 소형 표면 (S) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 ORF 내에 있다. 일부 실시양태에서, 인식 서열은 서열식별번호: 10 (즉, HBV 1-2 인식 서열), 서열식별번호: 12 (즉, HBV 5-6 인식 서열), 서열식별번호: 14 (즉, HBV 7-8 인식 서열), 또는 서열식별번호: 16 (즉, HBV 11-12 인식 서열)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 10을 포함하는 경우, HVR1 영역은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 24-79 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 215-270에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, 및 77에 상응하는 잔기, 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, 및 268에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 24-79, 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 215-270을 포함할 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 10을 포함하는 경우, HVR2 영역은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 215-270 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 24-79에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, 및 268에 상응하는 잔기, 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, 및 77에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 215-270, 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 24-79를 포함할 수 있다.
이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 10을 포함하는 경우, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 7-153 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 198-344에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 198-344 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 7-153에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 7-153 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 잔기 198-344를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 18 또는 19의 잔기 198-344 또는 서열식별번호: 20 또는 21의 의 잔기 7-153을 포함할 수 있다.
특정의 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 10을 포함하는 경우, 조작된 메가뉴클레아제는 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 공유적으로 연결한다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 12를 포함하는 경우, HVR1 영역은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 215-270 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 24-79에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, 및 268에 상응하는 잔기, 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, 및 77에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 215-270 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 24-79를 포함할 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 12를 포함하는 경우, HVR2 영역은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 24-79 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 215-270에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, 및 77에 상응하는 잔기, 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, 및 268에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 24-79 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 215-270을 포함할 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 12를 포함하는 경우, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 198-344 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 7-153에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 7-153 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 198-344에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 198-344 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 7-153을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 22-24 중 어느 하나의 잔기 7-153 또는 서열식별번호: 25-28 중 어느 하나의 잔기 198-344를 포함할 수 있다.
특정의 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 12를 포함하는 경우, 조작된 메가뉴클레아제는 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 공유적으로 연결한다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 22-28 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 14를 포함하는 경우, HVR1 영역은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 215-270에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, 및 268에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 215-270을 포함할 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 14를 포함하는 경우, HVR2 영역은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 24-79에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, 및 77에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 24-79를 포함할 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 14를 포함하는 경우,제1 서브유닛은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 198-344에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 7-153에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 198-344를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 잔기 7-153을 포함할 수 있다.
특정의 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 14를 포함하는 경우, 조작된 메가뉴클레아제는 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 공유적으로 연결한다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 16을 포함하는 경우, HVR1 영역은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 215-270에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 259, 261, 266, 및 268에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR1 영역은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 215-270을 포함할 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 16을 포함하는 경우, HVR2 영역은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 24-79에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 68, 70, 75, 및 77에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, HVR2 영역은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 24-79를 포함할 수 있다.
이러한 실시양태에서, 인식 서열이 서열식별번호: 16을 포함하는 경우, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 198-344에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 7-153에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 서브유닛은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 198-344를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 일부 실시양태에서, 제2 서브유닛은 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 잔기 7-153을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 공유적으로 연결한다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 mRNA일 수 있다.
추가 실시양태에서, mRNA는 하나 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 폴리시스트론 mRNA일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리시스트론 mRNA는, 비제한적으로, 2개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 비시스트론 mRNA, 3개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 트리시스트론 mRNA, 또는 4개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 쿼드시스트론 mRNA일 수 있다. 2개 이상의 조작된 메가뉴클레아제가 폴리시스트론 mRNA에 의해 코딩되는 이러한 실시양태에서, 각각의 코딩된 조작된 메가뉴클레아제는 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 추가로, 이러한 실시양태에서, 본 발명의 폴리시스트론 mRNA는 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제의 임의의 조합을 코딩할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 폴리시스트론 mRNA는 HBV 1-2 메가뉴클레아제, HBV 5-6 메가뉴클레아제, HBV 7-8 메가뉴클레아제, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 폴리시스트론 mRNA는 HBV 5-6 메가뉴클레아제 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩하는 비시스트론 mRNA일 수 있다.
추가 실시양태에서, 본 발명의 폴리시스트론 mRNA는 하나 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 및 HBV-감염된 세포 및/또는 HBV-감염된 대상체에서 치료적으로 이로운 효과를 유도하는 하나 이상의 추가적인 단백질을 코딩할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 구축물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 2개 이상의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 2개의 카세트, 3개의 카세트, 4개의 카세트 또는 그 초과의 카세트를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시킨다.
특정한 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 임의의 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 코딩한다. 이러한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 AAV 벡터일 수 있다.
일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 2개 이상의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다.
다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 AAV 벡터일 수 있다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 2개 이상의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다.
추가 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시킨다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 (a) 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 또는 (b) 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 단백질을 포함하는, B형 간염 바이러스 (HBV) 또는 HBV에 의해 야기되는 간세포 암종을 갖는 대상체의 치료를 위한 제약 조성물이며; 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 것인 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인식 서열은 B형 간염 바이러스의 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 유전자형의 ORF 내에 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, 인식 서열은 HBV 유전자형 A (서열식별번호: 3) 또는 인식 서열을 포함하는 그의 단리물, 및 HBV의 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 다른 유전자형의 ORF 내에 있다. 다양한 실시양태에서, 추가적인 HBV 유전자형은 유전자형 B, C, D, E, F 및/또는 G (각각 서열식별번호: 4-9), 또는 하나 이상의 본원에 기술된 HBV 인식 서열을 포함하는 그의 단리물을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물의 조작된 메가뉴클레아제, 또는 제약 조성물의 핵산 서열에 의해 코딩되는 조작된 메가뉴클레아제는 폴리머라제 (P) 단백질, 대형 표면 (프리S1/프리S2/S) 단백질, 중형 표면 (프리S2/S) 단백질, 및 소형 표면 (S) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 ORF 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 인식 서열은 서열식별번호: 10, 12, 14, 또는 16을 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 제약 조성물의 핵산 서열은 본원에 기술된 mRNA일 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 2개 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제가 생체내에서 표적 세포에서 발현되도록 mRNA는 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 본원에 기술된 재조합 DNA 구축물을 포함한다. 일부 이러한 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 프로모터 및 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물의 재조합 DNA 구축물은 2개 이상의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 제약 조성물의 재조합 DNA 구축물은 2개의 카세트, 3개의 카세트, 4개의 카세트 또는 그 초과의 카세트를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 제약 조성물의 재조합 DNA 구축물은 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 생체내에서 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시켜, 2개 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제가 표적 세포에서 발현된다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 하나의 이러한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 또는 AAV일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 재조합 AAV 벡터일 수 있다.
일부 이러한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 바이러스 벡터는 2개 이상의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다.
다른 이러한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 생체내에서 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시켜, 2개 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제가 표적 세포에서 발현된다.
하나의 이러한 실시양태에서, 제약 조성물은 서열식별번호: 10을 인식 및 절단하는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 (또는 그를 코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 서열식별번호: 12를 인식 및 절단하는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 (또는 그를 코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 22-28 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 서열식별번호: 14를 인식 및 절단하는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 (또는 그를 코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 서열식별번호: 16을 인식 및 절단하는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 (또는 그를 코딩하는 핵산)를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 제약 조성물은 2개 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 2개 이상의 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 이러한 실시양태에서, 2개 이상의 핵산은 본원에 기술된 mRNA, 본원에 기술된 재조합 DNA 구축물, 및/또는 본원에 기술된 바이러스 벡터에 의해 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 단백질 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 하나 이상의 핵산 (즉, mRNA, 재조합 DNA 구축물, 또는 바이러스 벡터)을 포함할 수 있으며, 여기서 조작된 메가뉴클레아제 및 코딩된 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다.
추가 실시양태에서, 제약 조성물은 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 단백질의 조합물, 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 단백질을 코딩하는 핵산 (즉, mRNA, 재조합 DNA 구축물, 또는 바이러스 벡터)의 조합물, 또는 조작된 메가뉴클레아제 단백질 및 조작된 메가뉴클레아제 단백질을 코딩하는 핵산의 조합물을 포함할 수 있으며, 여기서 제약 조성물의 내의 조작된 메가뉴클레아제 및/또는 코딩된 조작된 메가뉴클레아제의 조합물은 각각의 HBV 유전자형 A, B, C, D, E, F 및 G (서열식별번호: 3-9), 및 본원에 기술된 HBV 인식 서열을 포함하는 각각의 유전자형의 단리물 내의 인식 서열을 인식 및 절단할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 지질 나노입자 내에 캡슐화된 하나 이상의 본원에 기술된 mRNA를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제약 조성물의 지질 나노입자는 2개 이상의 본원에 기술된 mRNA를 포함할 수 있으며, 각각은 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 것인 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 구체적 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개, 3개 또는 4개의 본원에 기술된 mRNA를 포함할 수 있으며, 각각은 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 제약 조성물의 지질 나노입자는 하나 이상의 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 폴리시스트론 mRNA는 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 2개 이상의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 특정한 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개, 3개 또는 4개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 폴리시스트론 mRNA를 포함할 수 있다. 다른 특정한 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개 이상의 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 포함할 수 있으며, 각각은 2개 이상의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 간에서, 구체적으로는 간세포 내에서 전달 및 흡수를 강화하는 조성을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HBV를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 마찬가지로, HBV의 수준 및/또는 증식을 감소시키거나 또는 HBV와 연관된 증상을 감소시키는 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 방법은 대상체 내의 표적 세포에 (a) 생체내에서 표적 세포에서 발현되는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 또는 (b) 조작된 메가뉴클레아제 단백질을 전달하는 것을 포함하며; 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖고, 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 인식 서열을 인식 및 절단하여, 표적 세포에서 HBV 게놈을 절단한다. 이러한 방법은 대상체에서 HBV의 감염 및/또는 증식을 감소시키거나 제거할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HBV에 의해 야기되는 HCC를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 대상체 내의 표적 세포에 (1) (a) 생체내에서 표적 세포에서 발현되는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 또는 (b) 조작된 메가뉴클레아제 단백질; 및 (2) 자살 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 메가뉴클레아제 절단 부위를 플랭킹하는 서열에 대해 상동성인 서열을 포함하는 핵산을 전달하는 것을 포함하며; 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖고, 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 인식 서열을 인식 및 절단하여, 표적 세포에서 HBV 게놈을 절단하고; 여기서 자살 유전자는 절단된 HBV 게놈 내로 상동 재조합에 의해 삽입되고; 여기서 자살 유전자의 발현은 표적 세포를 사멸시킨다.
일부 실시양태에서, 자살 유전자는 표적 세포에 대해 직접적으로 치사성이다. 일부 이러한 실시양태에서, 직접적으로 치사성인 자살 유전자는 독성 폴리펩티드 또는 프로-아폽토시스 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 자살 유전자는 표적 세포에 대해 간접적으로 치사성이고, 대상체 자신의 면역계에게 표적 세포를 사멸시키도록 지시한다. 일부 이러한 실시양태에서, 간접적으로 치사성인 자살 유전자는 대상체의 면역계에 의해 외래물로서 인식되고 체액성 또는 세포성 면역 반응에 의해 표적화되는 세포 표면 단백질을 코딩한다. 다른 이러한 실시양태에서, 간접적으로 치사성인 자살 유전자는 MHC 클래스 I 분자에 의해 제시되고, 대상체의 면역계에 의해 외래물로서 인식되며, 세포독성 면역 반응에 의해 표적화되는 폴리펩티드를 코딩한다.
HBV 감염 또는 HCC의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 인식 서열은 B형 간염 바이러스의 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 적어도 6개의 유전자형의 ORF 내에서 발견된다. 하나의 이러한 실시양태에서, 인식 서열은 B형 간염 바이러스의 유전자형 A (서열식별번호: 3)의 ORF 내에 있다. 이러한 실시양태는 서열식별번호: 3과 상이하지만 하나 이상의 본원에 기술된 HBV 메가뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 유전자형 A의 B형 간염 바이러스 단리물을 포함한다. 추가의 이러한 실시양태에서, 인식 서열은 유전자형 A, 및 유전자형 B, C, D, E, F 및 G (각각 서열식별번호: 4-9) 중 하나 이상의 ORF 내에 있다. 이러한 실시양태는 서열식별번호: 3-9와 상이하지만 하나 이상의 본원에 기술된 HBV 메가뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 유전자형 A, B, C, D, E, F 및 G의 B형 간염 바이러스 단리물을 포함한다.
HBV 감염 또는 HCC의 치료 방법의 이러한 실시양태에서, 인식 서열은 폴리머라제 (P) 단백질, 대형 표면 (프리S1/프리S2/S) 단백질, 중형 표면 (프리S2/S) 단백질, 및 소형 표면 (S) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 ORF 내에 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 인식 서열은 서열식별번호: 10 (즉, HBV 1-2 인식 서열), 서열식별번호: 12 (즉, HBV 5-6 인식 서열), 서열식별번호: 14 (즉, HBV 7-8 인식 서열), 또는 서열식별번호: 16 (즉, HBV 11-12 인식 서열)을 포함할 수 있다.
HBV 감염 또는 HCC의 치료 방법의 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제 단백질, 또는 코딩된 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제이다.
추가 실시양태에서, HBV 감염 또는 HCC의 치료 방법은 제약상 허용되는 담체 및 (a) 생체내에서 표적 세포에서 발현되는 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산; 또는 (b) 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 단백질을 적어도 포함하는 임의의 본원에 기술된 본 발명의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
HBV 감염 또는 HCC의 치료 방법의 일부 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제, 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 표적 간세포에 전달될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 유효량의 조작된 메가뉴클레아제, 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 표적 간세포에 전달될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 간세포로의 전달은 생체외에서 발생하며, 여기서 조작된 메가뉴클레아제, 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 전달되어 있는 유효량의 간세포가 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 간독성 단백질, 또는 간독성 단백질을 코딩하는 핵산 또는 AAV가 본원에 개시된 제약 조성물과 함께 투여된다.
방법의 특정한 실시양태에서, 제1 인식 서열은 서열식별번호: 10을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 10을 인식 및 절단하는 임의의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 18-21 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법의 또 다른 실시양태에서, 제1 인식 서열은 서열식별번호: 12를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 12를 인식 및 절단하는 임의의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 22-28 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법의 다른 실시양태에서, 제1 인식 서열은 서열식별번호: 14를 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 14를 인식 및 절단하는 임의의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 29-32 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법의 다른 실시양태에서, 제1 인식 서열은 서열식별번호: 16을 포함할 수 있다. 일부 이러한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 16을 인식 및 절단하는 임의의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제는 서열식별번호: 33-39 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
방법의 특정한 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대 인간일 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 제공한다. 본 발명은 HBV를 치료하거나, HBV의 수준 또는 증식을 감소시키거나, HBV와 연관된 증상을 감소시키거나, 또는 HCC를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제의 용도를 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 여기서 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 HBV를 치료하거나, HBV의 수준 또는 증식을 감소시키거나, HBV와 연관된 증상을 감소시키거나, 또는 HCC를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 단리된 폴리뉴클레오티드의 용도를 추가로 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 재조합 AAV 벡터를 제공하며, 여기서 재조합 AAV 벡터는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 HBV를 치료하거나, HBV의 수준 또는 증식을 감소시키거나, HBV와 연관된 증상을 감소시키거나, 또는 HCC를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 재조합 AAV 벡터의 용도를 추가로 제공하며, 여기서 재조합 AAV 벡터는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 상기 및 다른 측면 및 실시양태가 하기의 상세한 설명 및 청구범위를 참조로 더욱 충분하게 이해될 수 있다. 명확성을 위해 별개의 실시양태의 맥락에서 기술된 본 발명의 특정 특색이 단일 실시양태에서 조합되어 제공될 수도 있다. 실시양태의 모든 조합은 본 발명에 의해 구체적으로 포함되고, 각각의 모든 조합이 개별적으로 및 명시적으로 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 반대로, 간결성을 위해 단일 실시양태의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특색이 별개로 또는 임의의 적절한 하위-조합으로 제공될 수도 있다. 실시양태에서 열거된 특색의 모든 하위-조합이 또한 본 발명에 의해 구체적으로 포함되고, 각각의 모든 이러한 하위-조합이 개별적으로 및 명시적으로 본원에 개시된 것처럼 본원에 개시된다. 본원에 개시된 본 발명의 각각의 측면의 실시양태는 필요한 변경을 가하여 본 발명의 각각의 다른 측면에 적용된다.
도 1은 HBV 게놈의 게놈 지도를 제시하고 모든 ORF를 확인한다. 바이러스 입자는 각각의 가닥의 5' 영역을 스패닝하고 직접적 반복 서열 (DR1 및 DR2)에 의해 플랭킹되는 접착성 중첩부가 있는 부분적 이중-가닥 게놈 (점선으로 표시됨)을 갖는다. 유전자 S는 주요 B형 간염 표면 항원 (HBsAg) 단백질 및 그의 글리코실화 파트너를 코딩하며, 이들은 바이러스 외피 내의 막횡단 단백질이다. S 유전자로부터 상류의 인-프레임 서열은 프리-S 도메인을 코딩하고, 이는 S 서열과 함께 번역되어 간세포의 감염을 위한 바이러스 수용체를 함유하는 프리-S 및 S 폴리펩티드 (중형 및 대형 단백질)을 만든다. 유전자 C는 바이러스의 뉴클레오캡시드를 형성하는 B형 간염 코어 항원 (HBcAg)을 코딩한다. P 영역은 바이러스 복제에 요구되는 DNA-의존적 DNA 폴리머라제 활성 및 RNase H 활성을 또한 갖는 바이러스 역전사효소를 코딩한다. HBV는 DNA 바이러스이지만, 이는 프리-게놈 RNA 중간체를 통해 복제된다. 마지막으로, X 유전자는 바이러스의 소형 조절 단백질인 B형 간염 x (HBx) 항원을 코딩한다. HBx는 바이러스 유전자 및 복제를 자극하고, 바이러스-감염된 세포를 면역-매개 파괴에 대해 보호하며, 간세포 암종의 발생에 기여하는 트랜스활성화 단백질이다.
도 2. HBV 게놈 내의 조작된 메가뉴클레아제 인식 서열. A) 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제에 의해 표적화되는 각각의 인식 서열은 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. 각각의 인식 절반-부위는 염기쌍 4개의 중앙 서열에 의해 분리된 염기쌍 9개를 포함한다. HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10)은 HBV1 및 HBV2로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12)은 HBV5 및 HBV6으로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14)은 HBV7 및 HBV8로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)은 HBV11 및 HBV12로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다.
도 3. HBV 유전자형 A의 게놈 및 게놈 내의 HBV 1-2, HBV 5-6, HBV 7-8, 및 HBV 11-12 인식 서열의 위치의 예시. HBV 1-2 및 HBV 5-6 인식 서열 둘 다는 HBV 게놈의 4개의 ORF 내에 위치한다: P, 프리S1/프리S2/S, 프리S2/S, 및 S. HBV 7-8 및 HBV 11-12 인식 서열은 폴리머라제를 코딩하는 ORF 내에 각각 위치한다.
도 4. HBV 유전자형 A-G 내의 HBV 인식 서열의 정렬. 본 발명에 의해 표적화되는 인식 서열은 다중 HBV 유전자형에 걸쳐 보존된다. HBV 1-2 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 185-206을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, E, F, 및 G에서 전적으로 보존된다. 유전자형 D는 제1 절반-부위의 위치 -4에서의 G에서 T로의 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다. HBV 5-6 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 742-763을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, D, E, 및 G에서 전적으로 보존된다. 유전자형 F는 제1 절반-부위의 위치 -3에서의 G에서 C로의 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다. HBV 7-8 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 1183-1204을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, D, F, 및 G에서 전적으로 보존된다. 유전자형 E는 제1 절반-부위의 위치 -1에서의 G에서 C로의 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다. HBV 11-12 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 1259-1280을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, D, E, F 및 G에서 전적으로 보존된다.
도 5. 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 2개의 서브유닛을 포함하며, 여기서 HVR1 영역을 포함하는 제1 서브유닛은 제1 인식 절반-부위 (예를 들어, HBV1, HBV5, HBV7, 또는 HBV11)에 결합하고, HVR2 영역을 포함하는 제2 서브유닛은 제2 인식 절반-부위 (예를 들어, HBV2, HBV6, HBV8, 또는 HBV12)에 결합한다. 조작된 메가뉴클레아제가 단일쇄 메가뉴클레아제인 실시양태에서, HVR1 영역을 포함하는 제1 서브유닛은 N-말단 또는 C-말단 서브유닛으로서 위치할 수 있다. 마찬가지로, HVR2 영역을 포함하는 제2 서브유닛은 N-말단 또는 C-말단 서브유닛으로서 위치할 수 있다.
도 6. B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF를 표적화하는 조작된 메가뉴클레아제를 평가하기 위한 CHO 세포에서의 리포터 검정법의 개략도. 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제에 대해, 리포터 카세트가 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된 CHO 세포주를 생산하였다. 리포터 카세트는 5'에서 3'의 순서로 SV40 초기 프로모터; GFP 유전자의 5' 2/3; 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제에 대한 인식 서열 (예를 들어, HBV 1-2 인식 서열); CHO-23/24 메가뉴클레아제 (WO/2012/167192)에 대한 인식 서열; 및 GFP 유전자의 3' 2/3를 포함하였다. 이러한 카세트로 안정적으로 형질감염된 세포는 DNA 파단-유도제의 부재 하에 GFP를 발현하지 않았다. 메가뉴클레아제를 각각의 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA 또는 mRNA의 형질도입에 의해 도입하였다. DNA 파단이 메가뉴클레아제 인식 서열 중 어느 한 쪽에서 유도되었을 때, GFP 유전자의 중복 영역이 서로 재조합되어 기능성 GFP 유전자가 생산되었다. 그 후, GFP-발현 세포의 백분율을 메가뉴클레아제에 의한 게놈 절단의 빈도의 간접적인 척도로서 유동 세포측정법에 의해 결정할 수 있었다.
도 7. CHO 세포 리포터 검정법에서의 B형 간염 바이러스 유전자의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 것에 대한 조작된 메가뉴클레아제의 효율. 서열식별번호: 18-39에 기재된 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10), HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12), HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14), 또는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)를 표적화하도록 조작하고, CHO 세포 리포터 검정법에서 효능에 대해 스크리닝하였다. 제시된 결과는 각각의 검정법에서 관찰된 GFP-발현 세포의 백분율을 제공하고, 이는 표적 인식 서열 또는 CHO-23/24 인식 서열을 절단하는 것에 대한 각각의 메가뉴클레아제의 효능을 지시한다. 음성 대조군 (bs)이 각각의 검정법에 추가로 포함되었다. 도 7a는 HBV 1-2 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 7b는 HBV 5-6 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 7c는 HBV 7-8 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 7d는 HBV 11-12 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다.
도 8. CHO 세포 리포터 검정법에서의 B형 간염 바이러스 유전자의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 것에 대한 조작된 메가뉴클레아제의 효율. 서열식별번호: 18-39에 기재된 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10), HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12), HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14), 또는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)를 표적화하도록 조작하고, 뉴클레오펙션 이후의 12일에 걸쳐 다중 시점에 CHO 세포 리포터 검정법에서 효능에 대해 스크리닝하였다. 제시된 결과는 12일의 분석 기간에 걸쳐 각각의 검정법에서 관찰된 GFP-발현 세포의 백분율을 제공하고, 이는 시간의 함수로서 표적 인식 서열 또는 CHO-23/24 인식 서열을 절단하는 것에 대한 각각의 메가뉴클레아제의 효능을 지시한다. 도 8a는 HBV 1-2 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 8b는 HBV 5-6 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 8c는 HBV 7-8 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 8d는 HBV 11-12 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다.
도 9. HBV 메가뉴클레아제가 이. 콜라이(E. coli) 리포터 시스템에서 에피솜 DNA 플라스미드 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 능력의 평가. 도 9a는 플라스미드 pARCUS 및 플라스미드 pHBVa를 제시한다. 도 9b는 각각의 선별 플레이트 상에 존재하는 콜로니의 수를 제시하며, 이는 HBV 메가뉴클레아제가 pHBVa 플라스미드를 절단하는 능력의 증거를 제공한다.
도 10. AD38 세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. HBV 게놈을 발현하고 HBsAg를 분비하는 AD38 세포를 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 적색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA가 이러한 실험에서 대조군으로 사용되었다. 형질감염 후 제3일 및 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다.
도 11. AD38 세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. HBV 게놈을 발현하고 HBsAg를 분비하는 AD38 세포에 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 또는 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하거나, 또는 2개의 조합을 형질도입하였다. 적색 형광 단백질을 코딩하는 렌티바이러스가 이러한 실험에서 대조군으로서 사용되었다. 1, 2, 및 4의 MOI를 검사하였다. 형질도입 후 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다.
도 12. AD38 세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. HBV 게놈을 발현하고 HBsAg를 분비하는 AD38 세포에 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 (LV224), HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제 (LV225), 또는 적색 형광 단백질 (LV212)을 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하였다. MOI 4를 검사하였고, 형질도입 후 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, HBsAg의 존재 및 세포외 HBV DNA 카피수에 대해 검정하였다. 추가적으로, 세포 용해물을 형질도입 후 제7일에 수득하고, HBV cccDNA의 세포내 카피수에 대해 분석하였다. 도 12a는 세포 배양 배지 내의 HBsAg 농도를 제시한다. 도 12b는 세포 배양 배지 내의 세포외 HBV DNA 카피수를 제시한다. 도 12c는 세포 용해물 내의 세포내 HBV cccDNA 카피수를 제시한다.
도 13. HBV-감염된 1차 인간 간세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. RFP, HBV 5-6x.33, 또는 HBV 11-12x.26을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, HBV-감염된 1차 인간 간세포에 형질도입하여 HBsAg 및 HBeAg 생산에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. 1차 인간 간세포를 시딩하고, 24시간 후에 HBV로 감염시켰다. 감염 후 제1일에, 세포를 세정하고, 24시간 후 (감염 후 제2일)에 RFP, HBV 5-6x.33, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스, 또는 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입하였다. 추가적인 대조군으로서, 감염된 세포를 DMSO로 처리하였다. 형질도입 후 제4일, 제8일, 제11일 및 제13일에, 세포 상청액을 수확하고, 배지를 교체하였다. 각각의 시점에, ELISA에 의해 세포 상청액에서 HBsAg 및 HBeAg를 측정하였다. 감염 후 제13일에 상청액 내의 세포외 DNA를 또한 측정하였다. 렌티바이러스 형질도입이 일반적으로 HBsAg 또는 HBeAg의 분비에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, RFP-코딩 렌티바이러스가 형질도입된 세포로부터의 세포 상청액을 DMSO로 처리된 세포에 비교하였다. 도 13a는 RFP를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입이 1.25, 2.5, 또는 5의 MOI에서 HBsAg 발현에 거의 영향을 미치지 않았음을 제시한다. 도 13b는 RFP를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입이 1.25, 2.5, 또는 5의 MOI에서 HBeAg 발현에 거의 영향을 미치지 않았음을 제시한다. 도 13c는 RFP를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입이 1.25, 2.5, 또는 5의 MOI에서 HBV DNA 발현에 거의 영향을 미치지 않았음을 제시한다.
도 14. HBV-감염된 1차 인간 간세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. RFP, HBV 5-6x.33, 또는 HBV 11-12x.26을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, HBV-감염된 1차 인간 간세포에 형질도입하여 HBsAg 및 HBeAg 생산에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. 1차 인간 간세포를 시딩하고, 24시간 후에 HBV로 감염시켰다. 감염 후 제1일에, 세포를 세정하고, 24시간 후 (감염 후 제2일)에 RFP, HBV 5-6x.33, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스, 또는 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입하였다. 추가적인 대조군으로서, 감염된 세포를 DMSO로 처리하였다. 형질도입 후 제4일, 제8일, 제11일 및 제13일에, 세포 상청액을 수확하고, 배지를 교체하였다. 각각의 시점에, ELISA에 의해 세포 상청액에서 HBsAg 및 HBeAg를 측정하였다. 도 14a는 MOI 2.5에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBsAg를 제시한다. 도 14b는 MOI 1.25에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBsAg를 제시한다. 도 14c는 MOI 2.5에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBeAg를 제시한다. 도 14d는 MOI 1.25에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBeAg를 제시한다.
도 15. 지질 나노입자-캡슐화 mRNA의 간으로의 전달. 마우스 간에서 발현되는 마우스 CMP-NeuAc 히드롤라제 (Cmah) 유전자 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제를 개발하였다. Cmah 메가뉴클레아제를 코딩하는 ARCA-캡핑 mRNA를 3개의 상이한 상업적 LNP 제형 내에 캡슐화하였다. LNP-캡슐화 mRNA를 IV 주사에 의해 CD-1 마우스에 투여하고, 6일 후에 간을 수확하였다. 전체-간 게놈 DNA (gDNA)를 단리하고, Cmah 유전자에서의 삽입/결실 (indel) 돌연변이의 빈도를 T7 엔도뉴클레아제 I (T7E) 검정법 및 심층 시퀀싱을 사용하여 결정하였다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호: 1은 클라미도모나스 레인하르드티이로부터의 야생형 I-CreI 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 2는 LAGLIDADG의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 3은 HBV 유전자형 A의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 4는 HBV 유전자형 B의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 5는 HBV 유전자형 C의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 6은 HBV 유전자형 D의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 7은 HBV 유전자형 E의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 8은 HBV 유전자형 F의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 9는 HBV 유전자형 G의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 10은 HBV 1-2 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 11은 HBV 1-2 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 12는 HBV 5-6 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 13은 HBV 5-6 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 14는 HBV 7-8 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 15는 HBV 7-8 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 16은 HBV 11-12 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 17은 HBV 11-12 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 18은 HBV 1-2x.2 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 19는 HBV 1-2x.14 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 20은 HBV 1-2x.68 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 21은 HBV 1-2x.93 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 22는 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 23은 HBV 5-6x.84 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 24는 HBV 5-6x.90 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 25는 HBV 5-6x.4 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 26은 HBV 5-6x.5 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 27은 HBV 5-6x.68 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 28은 HBV 5-6x.79 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 29는 HBV 7-8x.2 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 30은 HBV 7-8x.9 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 31은 HBV 7-8x.17 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 32는 HBV 7-8x.44 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 33은 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 34는 HBV 11-12x.9 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 35는 HBV 11-12x.13 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 36은 HBV 11-12x.16 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 37은 HBV 11-12x.27 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 38은 HBV 11-12x.41 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 39는 HBV 11-12x.48 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 40은 HBV 1-2x.2 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 41은 HBV 1-2x.14 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 42는 HBV 1-2x.68 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 43은 HBV 1-2x.93 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 44는 HBV 1-2x.2 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 45는 HBV 1-2x.14 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 46은 HBV 1-2x.68 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 47은 HBV 1-2x.93 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 48은 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 49는 HBV 5-6x.84 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 50은 HBV 5-6x.90 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 51은 HBV 5-6x.4 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 52는 HBV 5-6x.5 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 53은 HBV 5-6x.68 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 54는 HBV 5-6x.79 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 55는 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 56은 HBV 5-6x.84 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 57은 HBV 5-6x.90 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 58은 HBV 5-6x.4 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 59는 HBV 5-6x.5 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 60은 HBV 5-6x.68 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 61은 HBV 5-6x.79 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 62는 HBV 7-8x.2 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 63은 HBV 7-8x.9 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 64는 HBV 7-8x.17 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 65는 HBV 7-8x.44 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 66은 HBV 7-8x.2 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 67은 HBV 7-8x.9 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 68은 HBV 7-8x.17 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 69는 HBV 7-8x.44 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 70은 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 71은 HBV 11-12x.9 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 72는 HBV 11-12x.13 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 73은 HBV 11-12x.16 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 74는 HBV 11-12x.27 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 75는 HBV 11-12x.41 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 76은 HBV 11-12x.48 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 77은 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 78은 HBV 11-12x.9 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 79는 HBV 11-12x.13 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 80은 HBV 11-12x.16 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 81은 HBV 11-12x.27 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 82는 HBV 11-12x.41 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 83은 HBV 11-12x.48 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 84는 제1 절반 부위의 위치 -4에 G에서 C로의 치환을 갖는 HBV 유전자형 A 내의 HBV 1-2 인식 서열에 상응하는 HBV 유전자형 D에 존재하는 인식 서열의 핵산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 85는 제1 절반 부위의 위치 -3에 G에서 C로의 치환을 갖는 HBV 유전자형 A 내의 HBV 5-6 인식 서열에 상응하는 HBV 유전자형 F에 존재하는 인식 서열의 핵산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 86은 제1 절반 부위의 위치 -1에 C에서 T로의 치환을 갖는 HBV 유전자형 A 내의 HBV 7-8 인식 서열에 상응하는 HBV 유전자형 E에 존재하는 인식 서열의 핵산 서열을 기재한다.
도 2. HBV 게놈 내의 조작된 메가뉴클레아제 인식 서열. A) 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제에 의해 표적화되는 각각의 인식 서열은 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. 각각의 인식 절반-부위는 염기쌍 4개의 중앙 서열에 의해 분리된 염기쌍 9개를 포함한다. HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10)은 HBV1 및 HBV2로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12)은 HBV5 및 HBV6으로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14)은 HBV7 및 HBV8로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다. HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)은 HBV11 및 HBV12로 지칭되는 2개의 인식 절반-부위를 포함한다.
도 3. HBV 유전자형 A의 게놈 및 게놈 내의 HBV 1-2, HBV 5-6, HBV 7-8, 및 HBV 11-12 인식 서열의 위치의 예시. HBV 1-2 및 HBV 5-6 인식 서열 둘 다는 HBV 게놈의 4개의 ORF 내에 위치한다: P, 프리S1/프리S2/S, 프리S2/S, 및 S. HBV 7-8 및 HBV 11-12 인식 서열은 폴리머라제를 코딩하는 ORF 내에 각각 위치한다.
도 4. HBV 유전자형 A-G 내의 HBV 인식 서열의 정렬. 본 발명에 의해 표적화되는 인식 서열은 다중 HBV 유전자형에 걸쳐 보존된다. HBV 1-2 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 185-206을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, E, F, 및 G에서 전적으로 보존된다. 유전자형 D는 제1 절반-부위의 위치 -4에서의 G에서 T로의 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다. HBV 5-6 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 742-763을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, D, E, 및 G에서 전적으로 보존된다. 유전자형 F는 제1 절반-부위의 위치 -3에서의 G에서 C로의 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다. HBV 7-8 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 1183-1204을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, D, F, 및 G에서 전적으로 보존된다. 유전자형 E는 제1 절반-부위의 위치 -1에서의 G에서 C로의 단일 뉴클레오티드 차이를 포함한다. HBV 11-12 인식 서열은 서열식별번호: 3에 기재된 HBV 유전자형 A의 잔기 1259-1280을 스패닝하고, 이러한 인식 서열은 유전자형 B, C, D, E, F 및 G에서 전적으로 보존된다.
도 5. 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 2개의 서브유닛을 포함하며, 여기서 HVR1 영역을 포함하는 제1 서브유닛은 제1 인식 절반-부위 (예를 들어, HBV1, HBV5, HBV7, 또는 HBV11)에 결합하고, HVR2 영역을 포함하는 제2 서브유닛은 제2 인식 절반-부위 (예를 들어, HBV2, HBV6, HBV8, 또는 HBV12)에 결합한다. 조작된 메가뉴클레아제가 단일쇄 메가뉴클레아제인 실시양태에서, HVR1 영역을 포함하는 제1 서브유닛은 N-말단 또는 C-말단 서브유닛으로서 위치할 수 있다. 마찬가지로, HVR2 영역을 포함하는 제2 서브유닛은 N-말단 또는 C-말단 서브유닛으로서 위치할 수 있다.
도 6. B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF를 표적화하는 조작된 메가뉴클레아제를 평가하기 위한 CHO 세포에서의 리포터 검정법의 개략도. 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제에 대해, 리포터 카세트가 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된 CHO 세포주를 생산하였다. 리포터 카세트는 5'에서 3'의 순서로 SV40 초기 프로모터; GFP 유전자의 5' 2/3; 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제에 대한 인식 서열 (예를 들어, HBV 1-2 인식 서열); CHO-23/24 메가뉴클레아제 (WO/2012/167192)에 대한 인식 서열; 및 GFP 유전자의 3' 2/3를 포함하였다. 이러한 카세트로 안정적으로 형질감염된 세포는 DNA 파단-유도제의 부재 하에 GFP를 발현하지 않았다. 메가뉴클레아제를 각각의 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA 또는 mRNA의 형질도입에 의해 도입하였다. DNA 파단이 메가뉴클레아제 인식 서열 중 어느 한 쪽에서 유도되었을 때, GFP 유전자의 중복 영역이 서로 재조합되어 기능성 GFP 유전자가 생산되었다. 그 후, GFP-발현 세포의 백분율을 메가뉴클레아제에 의한 게놈 절단의 빈도의 간접적인 척도로서 유동 세포측정법에 의해 결정할 수 있었다.
도 7. CHO 세포 리포터 검정법에서의 B형 간염 바이러스 유전자의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 것에 대한 조작된 메가뉴클레아제의 효율. 서열식별번호: 18-39에 기재된 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10), HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12), HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14), 또는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)를 표적화하도록 조작하고, CHO 세포 리포터 검정법에서 효능에 대해 스크리닝하였다. 제시된 결과는 각각의 검정법에서 관찰된 GFP-발현 세포의 백분율을 제공하고, 이는 표적 인식 서열 또는 CHO-23/24 인식 서열을 절단하는 것에 대한 각각의 메가뉴클레아제의 효능을 지시한다. 음성 대조군 (bs)이 각각의 검정법에 추가로 포함되었다. 도 7a는 HBV 1-2 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 7b는 HBV 5-6 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 7c는 HBV 7-8 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 7d는 HBV 11-12 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다.
도 8. CHO 세포 리포터 검정법에서의 B형 간염 바이러스 유전자의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 것에 대한 조작된 메가뉴클레아제의 효율. 서열식별번호: 18-39에 기재된 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10), HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12), HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14), 또는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)를 표적화하도록 조작하고, 뉴클레오펙션 이후의 12일에 걸쳐 다중 시점에 CHO 세포 리포터 검정법에서 효능에 대해 스크리닝하였다. 제시된 결과는 12일의 분석 기간에 걸쳐 각각의 검정법에서 관찰된 GFP-발현 세포의 백분율을 제공하고, 이는 시간의 함수로서 표적 인식 서열 또는 CHO-23/24 인식 서열을 절단하는 것에 대한 각각의 메가뉴클레아제의 효능을 지시한다. 도 8a는 HBV 1-2 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 8b는 HBV 5-6 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 8c는 HBV 7-8 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다. 도 8d는 HBV 11-12 인식 서열을 표적화하는 메가뉴클레아제를 제시한다.
도 9. HBV 메가뉴클레아제가 이. 콜라이(E. coli) 리포터 시스템에서 에피솜 DNA 플라스미드 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 능력의 평가. 도 9a는 플라스미드 pARCUS 및 플라스미드 pHBVa를 제시한다. 도 9b는 각각의 선별 플레이트 상에 존재하는 콜로니의 수를 제시하며, 이는 HBV 메가뉴클레아제가 pHBVa 플라스미드를 절단하는 능력의 증거를 제공한다.
도 10. AD38 세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. HBV 게놈을 발현하고 HBsAg를 분비하는 AD38 세포를 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 적색 형광 단백질을 코딩하는 플라스미드 DNA가 이러한 실험에서 대조군으로 사용되었다. 형질감염 후 제3일 및 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다.
도 11. AD38 세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. HBV 게놈을 발현하고 HBsAg를 분비하는 AD38 세포에 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 또는 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하거나, 또는 2개의 조합을 형질도입하였다. 적색 형광 단백질을 코딩하는 렌티바이러스가 이러한 실험에서 대조군으로서 사용되었다. 1, 2, 및 4의 MOI를 검사하였다. 형질도입 후 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다.
도 12. AD38 세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. HBV 게놈을 발현하고 HBsAg를 분비하는 AD38 세포에 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 (LV224), HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제 (LV225), 또는 적색 형광 단백질 (LV212)을 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하였다. MOI 4를 검사하였고, 형질도입 후 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, HBsAg의 존재 및 세포외 HBV DNA 카피수에 대해 검정하였다. 추가적으로, 세포 용해물을 형질도입 후 제7일에 수득하고, HBV cccDNA의 세포내 카피수에 대해 분석하였다. 도 12a는 세포 배양 배지 내의 HBsAg 농도를 제시한다. 도 12b는 세포 배양 배지 내의 세포외 HBV DNA 카피수를 제시한다. 도 12c는 세포 용해물 내의 세포내 HBV cccDNA 카피수를 제시한다.
도 13. HBV-감염된 1차 인간 간세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. RFP, HBV 5-6x.33, 또는 HBV 11-12x.26을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, HBV-감염된 1차 인간 간세포에 형질도입하여 HBsAg 및 HBeAg 생산에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. 1차 인간 간세포를 시딩하고, 24시간 후에 HBV로 감염시켰다. 감염 후 제1일에, 세포를 세정하고, 24시간 후 (감염 후 제2일)에 RFP, HBV 5-6x.33, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스, 또는 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입하였다. 추가적인 대조군으로서, 감염된 세포를 DMSO로 처리하였다. 형질도입 후 제4일, 제8일, 제11일 및 제13일에, 세포 상청액을 수확하고, 배지를 교체하였다. 각각의 시점에, ELISA에 의해 세포 상청액에서 HBsAg 및 HBeAg를 측정하였다. 감염 후 제13일에 상청액 내의 세포외 DNA를 또한 측정하였다. 렌티바이러스 형질도입이 일반적으로 HBsAg 또는 HBeAg의 분비에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, RFP-코딩 렌티바이러스가 형질도입된 세포로부터의 세포 상청액을 DMSO로 처리된 세포에 비교하였다. 도 13a는 RFP를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입이 1.25, 2.5, 또는 5의 MOI에서 HBsAg 발현에 거의 영향을 미치지 않았음을 제시한다. 도 13b는 RFP를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입이 1.25, 2.5, 또는 5의 MOI에서 HBeAg 발현에 거의 영향을 미치지 않았음을 제시한다. 도 13c는 RFP를 코딩하는 렌티바이러스의 형질도입이 1.25, 2.5, 또는 5의 MOI에서 HBV DNA 발현에 거의 영향을 미치지 않았음을 제시한다.
도 14. HBV-감염된 1차 인간 간세포에서의 HBV 메가뉴클레아제의 평가. RFP, HBV 5-6x.33, 또는 HBV 11-12x.26을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, HBV-감염된 1차 인간 간세포에 형질도입하여 HBsAg 및 HBeAg 생산에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. 1차 인간 간세포를 시딩하고, 24시간 후에 HBV로 감염시켰다. 감염 후 제1일에, 세포를 세정하고, 24시간 후 (감염 후 제2일)에 RFP, HBV 5-6x.33, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스, 또는 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입하였다. 추가적인 대조군으로서, 감염된 세포를 DMSO로 처리하였다. 형질도입 후 제4일, 제8일, 제11일 및 제13일에, 세포 상청액을 수확하고, 배지를 교체하였다. 각각의 시점에, ELISA에 의해 세포 상청액에서 HBsAg 및 HBeAg를 측정하였다. 도 14a는 MOI 2.5에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBsAg를 제시한다. 도 14b는 MOI 1.25에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBsAg를 제시한다. 도 14c는 MOI 2.5에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBeAg를 제시한다. 도 14d는 MOI 1.25에서의 형질도입 후의 세포 배양 배지 내의 HBeAg를 제시한다.
도 15. 지질 나노입자-캡슐화 mRNA의 간으로의 전달. 마우스 간에서 발현되는 마우스 CMP-NeuAc 히드롤라제 (Cmah) 유전자 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제를 개발하였다. Cmah 메가뉴클레아제를 코딩하는 ARCA-캡핑 mRNA를 3개의 상이한 상업적 LNP 제형 내에 캡슐화하였다. LNP-캡슐화 mRNA를 IV 주사에 의해 CD-1 마우스에 투여하고, 6일 후에 간을 수확하였다. 전체-간 게놈 DNA (gDNA)를 단리하고, Cmah 유전자에서의 삽입/결실 (indel) 돌연변이의 빈도를 T7 엔도뉴클레아제 I (T7E) 검정법 및 심층 시퀀싱을 사용하여 결정하였다.
서열의 간단한 설명
서열식별번호: 1은 클라미도모나스 레인하르드티이로부터의 야생형 I-CreI 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 2는 LAGLIDADG의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 3은 HBV 유전자형 A의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 4는 HBV 유전자형 B의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 5는 HBV 유전자형 C의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 6은 HBV 유전자형 D의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 7은 HBV 유전자형 E의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 8은 HBV 유전자형 F의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 9는 HBV 유전자형 G의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 10은 HBV 1-2 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 11은 HBV 1-2 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 12는 HBV 5-6 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 13은 HBV 5-6 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 14는 HBV 7-8 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 15는 HBV 7-8 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 16은 HBV 11-12 인식 서열 (센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 17은 HBV 11-12 인식 서열 (안티센스)의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 18은 HBV 1-2x.2 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 19는 HBV 1-2x.14 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 20은 HBV 1-2x.68 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 21은 HBV 1-2x.93 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 22는 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 23은 HBV 5-6x.84 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 24는 HBV 5-6x.90 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 25는 HBV 5-6x.4 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 26은 HBV 5-6x.5 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 27은 HBV 5-6x.68 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 28은 HBV 5-6x.79 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 29는 HBV 7-8x.2 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 30은 HBV 7-8x.9 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 31은 HBV 7-8x.17 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 32는 HBV 7-8x.44 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 33은 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 34는 HBV 11-12x.9 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 35는 HBV 11-12x.13 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 36은 HBV 11-12x.16 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 37은 HBV 11-12x.27 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 38은 HBV 11-12x.41 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 39는 HBV 11-12x.48 메가뉴클레아제의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 40은 HBV 1-2x.2 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 41은 HBV 1-2x.14 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 42는 HBV 1-2x.68 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 43은 HBV 1-2x.93 메가뉴클레아제 HBV1-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 44는 HBV 1-2x.2 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 45는 HBV 1-2x.14 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 46은 HBV 1-2x.68 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 47은 HBV 1-2x.93 메가뉴클레아제 HBV2-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 48은 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 49는 HBV 5-6x.84 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 50은 HBV 5-6x.90 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 51은 HBV 5-6x.4 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 52는 HBV 5-6x.5 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 53은 HBV 5-6x.68 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 54는 HBV 5-6x.79 메가뉴클레아제 HBV5-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 55는 HBV 5-6x.33 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 56은 HBV 5-6x.84 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 57은 HBV 5-6x.90 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 58은 HBV 5-6x.4 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 59는 HBV 5-6x.5 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 60은 HBV 5-6x.68 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 61은 HBV 5-6x.79 메가뉴클레아제 HBV6-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 62는 HBV 7-8x.2 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 63은 HBV 7-8x.9 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 64는 HBV 7-8x.17 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 65는 HBV 7-8x.44 메가뉴클레아제 HBV7-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 66은 HBV 7-8x.2 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 67은 HBV 7-8x.9 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 68은 HBV 7-8x.17 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 69는 HBV 7-8x.44 메가뉴클레아제 HBV8-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 70은 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 71은 HBV 11-12x.9 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 72는 HBV 11-12x.13 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 73은 HBV 11-12x.16 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 74는 HBV 11-12x.27 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 75는 HBV 11-12x.41 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 76은 HBV 11-12x.48 메가뉴클레아제 HBV11-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 77은 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 78은 HBV 11-12x.9 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 79는 HBV 11-12x.13 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 80은 HBV 11-12x.16 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 81은 HBV 11-12x.27 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 82는 HBV 11-12x.41 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 83은 HBV 11-12x.48 메가뉴클레아제 HBV12-결합 서브유닛의 아미노산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 84는 제1 절반 부위의 위치 -4에 G에서 C로의 치환을 갖는 HBV 유전자형 A 내의 HBV 1-2 인식 서열에 상응하는 HBV 유전자형 D에 존재하는 인식 서열의 핵산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 85는 제1 절반 부위의 위치 -3에 G에서 C로의 치환을 갖는 HBV 유전자형 A 내의 HBV 5-6 인식 서열에 상응하는 HBV 유전자형 F에 존재하는 인식 서열의 핵산 서열을 기재한다.
서열식별번호: 86은 제1 절반 부위의 위치 -1에 C에서 T로의 치환을 갖는 HBV 유전자형 A 내의 HBV 7-8 인식 서열에 상응하는 HBV 유전자형 E에 존재하는 인식 서열의 핵산 서열을 기재한다.
1.1 참고문헌 및 정의
본원에서 언급된 특허 및 과학 문헌은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에서 인용된 등록된 미국 특허, 허여된 출원, 공개된 외국 출원 및 참고문헌 (진뱅크(GenBank) 데이터베이스 서열 포함)은 이에 의해 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 지시된 것과 동일한 정도로 참조로 포함된다.
본 발명은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 기재된 실시양태에 제한되는 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, 이러한 실시양태가 제공되어, 본 개시내용이 철저하고 완전할 것이며, 본 발명의 범주를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 충분히 전달할 것이다. 예를 들어, 한 실시양태와 관련하여 예시된 특색이 다른 실시양태 내로 혼입될 수 있고, 특정한 실시양태와 관련하여 예시된 특색이 이러한 실시양태로부터 삭제될 수 있다. 추가적으로, 본원에서 시사된 실시양태에 대한 다수의 변동 및 부가가 본 개시내용의 견지에서 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이는 본 발명을 벗어나지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 설명에서 사용된 용어법은 단지 특정한 실시양태를 기술하기 위한 것이고, 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다.
본원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단수형은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다. 예를 들어, 세포는 단일 세포 또는 다수의 세포를 의미할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 단어 "또는"은 "및/또는"의 포괄적인 의미로 사용되고, "어느 하나/또는"의 배타적 의미가 아니다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레아제" 및 "엔도뉴클레아제"는 폴리뉴클레오티드 쇄 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 천연-발생 또는 조작 효소를 지칭하도록 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "메가뉴클레아제"는 12개 초과의 염기쌍인 인식 서열에서 이중-가닥 DNA에 결합하는 엔도뉴클레아제를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 메가뉴클레아제에 대한 인식 서열은 염기쌍 22개이다. 메가뉴클레아제는 I-CreI로부터 유래된 엔도뉴클레아제일 수 있고, 예를 들어, DNA-결합 특이성, DNA 절단 활성, DNA-결합 친화력, 또는 이량체화 성질과 관련하여, 천연 I-CreI에 비교하여 변형되어 있는 I-CreI의 조작된 변이체를 지칭할 수 있다. I-CreI의 이러한 변형 변이체를 생산하는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어 WO 2007/047859). 본원에서 사용된 바와 같은 메가뉴클레아제는 이종이량체로서 이중-가닥 DNA에 결합한다. 메가뉴클레아제는 한 쌍의 DNA-결합 도메인이 펩티드 링커를 사용하여 단일 폴리펩티드로 연결된 "단일쇄 메가뉴클레아제"일 수도 있다. 용어 "귀소 엔도뉴클레아제"는 용어 "메가뉴클레아제"와 동의어이다. 본 발명의 메가뉴클레아제는 본원에 기술된 방법을 사용하여 측정했을 때 세포 생육력에 대한 해로운 효과 또는 메가뉴클레아제 절단 활성의 유의한 감소가 관찰되지 않으면서 세포에서 발현될 때 실질적으로 비-독성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단일쇄 메가뉴클레아제"는 링커에 의해 연결된 한 쌍의 뉴클레아제 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 단일쇄 메가뉴클레아제는 하기의 구성을 갖는다: N-말단 서브유닛 - 링커 - C-말단 서브유닛. 2개의 메가뉴클레아제 서브유닛은 일반적으로 아미노산 서열 면에서 동일하지 않을 것이고, 동일하지 않은 DNA 서열을 인식할 것이다. 따라서, 단일쇄 메가뉴클레아제는 전형적으로 유사-회문식 또는 비-회문식 인식 서열을 절단한다. 단일쇄 메가뉴클레아제는 실제로는 이량체가 아니지만 "단일쇄 이종이량체" 또는 "단일쇄 이종이량체성 메가뉴클레아제"로 지칭될 수 있다. 명확성을 위해, 달리 상술되지 않는 한, 용어 "메가뉴클레아제"는 이량체성 또는 단일쇄 메가뉴클레아제를 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "링커"는 2개의 메가뉴클레아제 서브유닛을 단일 폴리펩티드로 연결하는데 사용되는 외인성 펩티드 서열을 지칭한다. 링커는 천연 단백질에서 발견되는 서열을 가질 수 있거나, 또는 어떠한 천연 단백질에서도 발견되지 않는 인공 서열일 수 있다. 링커는 가요성일 수 있고, 2차 구조가 결여될 수 있거나, 또는 생리학적 조건 하에 특이적인 3차원 구조를 형성하는 경향을 가질 수 있다. 링커는, 비제한적으로, 미국 특허 번호 8,445,251 및 미국 특허 번호 9,434,931에 포함된 것들을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 서열식별번호: 18-39 중 어느 하나의 잔기 154-195를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 단백질과 관련하여, 용어 "재조합" 또는 "조작된"은 단백질을 코딩하는 핵산, 및 단백질을 발현하는 세포 또는 생물에 유전 공학 기술을 적용한 결과로서 변경된 아미노산 서열을 갖는 것을 의미한다. 핵산과 관련하여, 용어 "재조합" 또는 "조작된"은 유전 공학 기술을 적용한 결과로서 변경된 핵산 서열을 갖는 것을 의미한다. 유전 공학 기술은 PCR 및 DNA 클로닝 기술; 형질감염, 형질전환 및 다른 유전자 전달 기술; 상동 재조합; 부위-지정 돌연변이유발; 및 유전자 융합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 정의에 따르면, 천연-발생 단백질과 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 이종성 숙주에서의 클로닝 및 발현에 의해 생산된 단백질은 재조합으로 간주되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "야생형"은 동일한 유형의 유전자의 대립유전자 집단 내의 가장 통상적인 천연 발생 대립유전자 (즉, 폴리뉴클레오티드 서열)를 지칭하며, 여기서 야생형 대립유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 그의 원래의 기능을 갖는다. 용어 "야생형"은 야생형 대립유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 또한 지칭한다. 야생형 대립유전자 (즉, 폴리뉴클레오티드) 및 폴리펩티드는 야생형 서열(들)에 비해 하나 이상의 돌연변이 및/또는 치환을 포함하는 돌연변이체 또는 변이체 대립유전자 및 폴리펩티드와 구별가능하다. 야생형 대립유전자 또는 폴리펩티드는 생물에서 정상 표현형을 부여할 수 있는 반면, 돌연변이체 또는 변이체 대립유전자 또는 폴리펩티드는, 일부 경우에, 변경된 표현형을 부여할 수 있다. 야생형 뉴클레아제는 재조합 또는 비-천연-발생 뉴클레아제와 구별가능하다. 용어 "야생형"은 특정 유전자의 야생형 대립유전자를 보유하는 세포, 생물 및/또는 대상체, 또는 비교 목적을 위해 사용되는 세포, 생물 및/또는 대상체를 또한 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전적으로 변형된"은 세포 또는 생물에서 또는 세포 또는 생물의 선조에서 게놈 DNA 서열이 재조합 기술에 의해 의도적으로 변형되어 있는 세포 또는 생물을 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "유전적으로 변형된"은 용어 "트랜스제닉"을 포함한다.
재조합 단백질과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변형"은 기준 서열 (예를 들어, 야생형 또는 천연 서열)에 비교된 재조합 서열 내의 아미노산 잔기의 임의의 삽입, 결실, 또는 치환을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인식 서열"은 엔도뉴클레아제에 의해 결합 및 절단되는 DNA 서열을 지칭한다. 메가뉴클레아제의 경우, 인식 서열은 염기쌍 4개에 의해 분리된, 한 쌍의 역전된 염기쌍 9개의 "절반 부위"를 포함한다. 단일쇄 메가뉴클레아제의 경우, 단백질의 N-말단 도메인은 제1 절반-부위와 접촉하고, 단백질의 C-말단 도메인은 제2 절반-부위와 접촉한다. 메가뉴클레아제에 의한 절단으로 염기쌍 4개의 3' "오버행"이 생산된다. "오버행", 또는 "점착성 단부"는 이중-가닥 DNA 서열의 엔도뉴클레아제 절단에 의해 생산될 수 있는 짧은 단일-가닥 DNA 분절이다. I-CreI로부터 유래된 메가뉴클레아제 및 단일쇄 메가뉴클레아제의 경우, 오버행은 염기쌍 22개의 인식 서열의 염기 10-13을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 뉴클레아제에 대한 인식 서열을 포함하는 세포의 염색체 DNA의 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "DNA-결합 친화력" 또는 "결합 친화력"은 메가뉴클레아제가 기준 DNA 분자 (예를 들어, 인식 서열 또는 임의 서열)와 비-공유적으로 회합하는 경향을 의미한다. 결합 친화력은 해리 상수 Kd에 의해 측정된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 기준 인식 서열에 대한 뉴클레아제의 Kd가 기준 뉴클레아제에 비해 통계적으로 유의한 (p<0.05) 양만큼 증가 또는 감소되면 뉴클레아제는 "변경된" 결합 친화력을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이성"은 메가뉴클레아제가 인식 서열로 지칭되는 특정 서열의 염기쌍에서만 또는 특정 세트의 인식 서열에서만 이중-가닥 DNA 분자를 인식 및 절단하는 능력을 의미한다. 인식 서열 세트는 특정의 보존된 위치 또는 서열 모티프를 공유할 것이지만, 하나 이상의 위치에서 축퇴성일 수 있다. 고도로 특이적인 메가뉴클레아제는 오직 1개 또는 매우 소수의 인식 서열만 절단할 수 있다. 특이성은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 생리학적 조건 하에 기준 메가뉴클레아제 (예를 들어, 야생형)에 의해 결합 및 절단되지 않는 인식 서열에 결합하여 그를 절단하거나, 또는 인식 서열의 절단 속도가 기준 메가뉴클레아제에 비해 생물학적으로 유의한 양 (예를 들어, 적어도 2×, 또는 2×-10×)만큼 증가 또는 감소되면, 메가뉴클레아제는 "변경된" 특이성을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "상동 재조합" 또는 "HR"은 상동성 DNA 서열을 복구 주형으로 사용하여 이중-가닥 DNA-파단이 복구되는 천연적인 세포 프로세스를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976] 참조). 상동성 DNA 서열은 내인성 염색체 서열 또는 세포에 전달된 외인성 핵산일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-상동성 말단-연결" 또는 "NHEJ"는 2개의 비-상동성 DNA 분절의 직접적인 연결에 의해 이중-가닥 DNA-파단이 복구되는 천연적인 세포 프로세스를 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Cahill et al. (2006), Front. Biosci. 11:1958-1976] 참조). 비-상동성 말단-연결에 의한 DNA 복구는 오류가 발생하기 쉽고, 빈번하게 복구 부위에서 DNA 서열의 비-주형화 부가 또는 결실을 초래한다. 일부 경우에, 표적 인식 서열에서의 절단이 표적 인식 부위에서 NHEJ를 초래한다. 유전자의 코딩 서열 내의 표적 부위의 뉴클레아제-유도된 절단에 이어지는 NHEJ에 의한 DNA 복구는 코딩 서열 내로 돌연변이, 예컨대 프레임시프트 돌연변이를 도입할 수 있고, 이는 유전자 기능을 파괴한다. 따라서, 조작된 메가뉴클레아제가 세포 집단에서 유전자를 효과적으로 녹-아웃시키는데 사용될 수 있다.
아미노산 서열 및 핵산 서열 둘 다와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "퍼센트 동일성", "서열 동일성", "백분율 유사성", "서열 유사성" 등은 정렬된 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 사이의 유사성을 최대화하고, 동일하거나 유사한 잔기 또는 뉴클레오티드의 개수, 총 잔기 또는 뉴클레오티드의 개수, 및 서열 정렬 내의 갭의 존재 및 길이의 함수인, 서열 정렬을 기초로 하는 2개의 서열의 유사성 정도의 척도를 지칭한다. 다양한 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램이 표준 파라미터를 이용하여 서열 유사성을 결정하기 위해 이용가능하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 서열 유사성은 아미노산 서열에 대한 BLASTp 프로그램 및 핵산 서열에 대한 BLASTn 프로그램을 사용하여 측정되며, 이들 둘 다는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 입수가능하고, 예를 들어, 문헌 [Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-410]; [Gish and States (1993), Nature Genet. 3:266-272]; [Madden et al. (1996), Meth. Enzymol.266:131-141]; [Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res. 25:33 89-3402]; [Zhang et al. (2000), J. Comput. Biol. 7(1-2):203-14]에 기술되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 아미노산 서열의 퍼센트 유사성은 BLASTp 알고리즘에 대한 하기의 파라미터를 기초로 하는 점수이다: 워드 크기=3; 갭 개방 패널티=-11; 갭 확장 패널티=-1; 및 채점 행렬=BLOSUM62. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 핵산 서열의 퍼센트 유사성은 BLASTn 알고리즘에 대한 하기의 파라미터를 기초로 하는 점수이다: 워드 크기=11; 갭 개방 패널티=-5; 갭 확장 패널티=-2; 매치 보상=1; 및 미스매치 패널티=-3.
2개의 단백질 또는 아미노산 서열의 변형과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에 상응하는"는 제1 단백질에서의 상술된 변형이 제2 단백질에서의 변형과 동일한 아미노산 잔기의 치환이라는 것과 2개의 단백질이 (예를 들어, BLASTp 프로그램을 사용하여) 표준 서열 정렬에 적용되었을 때 제1 단백질에서의 변형의 아미노산 위치가 제2 단백질에서의 변형의 아미노산 위치에 상응하거나 또는 이와 정렬된다는 것을 가리키도록 사용된다. 따라서, 서열 정렬에서 잔기 X 및 Y가 서로 상응한다면, 그리고 X 및 Y가 상이한 번호일 수 있다는 사실에도 불구하고, 제1 단백질에서 잔기 "X"가 아미노산 "A"로 변형되는 것은 제2 단백질에서 잔기 "Y"가 아미노산 "A"로 변형되는 것에 상응할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인식 절반-부위", "인식 서열 절반-부위", 또는 간단히 "절반-부위"는 동종이량체성 또는 이종이량체성 메가뉴클레아제의 단량체에 의해 또는 단일쇄 메가뉴클레아제의 하나의 서브유닛에 의해 인식되는 이중-가닥 DNA 분자 내의 핵산 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역"은 비교적 높은 가변성의 아미노산을 포함하는 메가뉴클레아제 단량체 또는 서브유닛 내의 국소화된 서열을 지칭한다. 초가변 영역은 약 50-60개의 인접한 잔기, 약 53-57개의 인접한 잔기, 또는 바람직하게는 약 56개의 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 초가변 영역의 잔기는 서열식별번호: 18-39 중 어느 하나의 위치 24-79 또는 위치 215-270에 상응할 수 있다. 초가변 영역은 인식 서열 내의 DNA 염기와 접촉하는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있고, 단량체 또는 서브유닛의 염기 선호도를 변경시키도록 변형될 수 있다. 초가변 영역은 메가뉴클레아제가 이중-가닥 DNA 인식 서열과 회합할 때 DNA 백본에 결합하는 하나 이상의 잔기를 또한 포함할 수 있다. 이러한 잔기는 DNA 백본 및 표적 인식 서열에 대한 메가뉴클레아제의 결합 친화력을 변경하도록 변형될 수 있다. 본 발명의 상이한 실시양태에서, 초가변 영역은 가변성을 나타내는 1-20개의 잔기를 포함할 수 있고, 염기 선호도 및/또는 DNA-결합 친화력에 영향을 미치도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 초가변 영역 내의 가변성 잔기는 서열식별번호: 18-39 중 어느 하나의 위치 24, 26, 28, 30, 32, 33, 38, 40, 42, 44, 46, 49, 50, 54, 64, 68, 70, 75, 및 77 중 하나 이상에 상응한다. 다른 실시양태에서, 초가변 영역 내의 가변 잔기는 서열식별번호: 18-39 중 어느 하나의 위치 215, 217, 219, 221, 223, 224, 229, 231, 233, 235, 237, 240, 241, 245, 255, 259, 261, 266, 및 268 중 하나 이상에 상응한다.
용어 "재조합 DNA 구축물", "재조합 구축물", "발현 카세트", "발현 구축물", "키메라 구축물", "구축물", 및 "재조합 DNA 단편"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 핵산 단편이다. 재조합 구축물은 천연적으로는 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 비제한적으로 포함하는, 핵산 단편의 인공 조합물을 포함한다. 예를 들어, 재조합 DNA 구축물은 상이한 공급원으로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되고, 천연적으로 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구축물은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 벡터와 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터" 또는 "재조합 DNA 벡터"는 소정의 숙주 세포에서의 폴리펩티드-코딩 서열의 전사 및 번역을 가능하게 하는 서열 및 복제 시스템을 포함하는 구축물일 수 있다. 벡터가 사용되면, 벡터의 선택은 관련 기술분야의 숙련된 기술자에게 널리 공지되어 있는 바와 같이 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 방법에 의존적이다. 벡터는, 비제한적으로, 플라스미드 벡터 및 재조합 AAV 벡터, 또는 본 발명의 메가뉴클레아제를 코딩하는 유전자를 표적 세포에 전달하는데 적절한 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 벡터를 포함할 수 있다. 숙련된 기술자는 임의의 본 발명의 단리된 뉴클레오티드 또는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포를 성공적으로 형질전환시키고, 선택하고, 증식시키기 위해 벡터 상에 존재하여야 하는 유전 요소를 잘 인지한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 또한 바이러스 벡터를 지칭할 수 있다. 바이러스 벡터는, 비제한적으로, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV)를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리시스트론" mRNA는 2개 이상의 코딩 서열 (즉, 시스트론)을 포함하고 1개 초과의 단백질을 코딩하는 단일 메신저 RNA를 지칭한다. 폴리시스트론 mRNA는 IRES 요소, T2A 요소, P2A 요소, E2A 요소 및 F2A 요소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 동일한 mRNA 분자로부터 2개 이상의 유전자의 번역을 허용하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 요소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "대조군" 또는 "대조군 세포"는 유전적으로 변형된 세포의 유전자형 또는 표현형에서의 변화를 측정하기 위한 기준점을 제공하는 세포를 지칭한다. 대조군 세포는, 예를 들어, (a) 야생형 세포, 즉 유전적으로 변형된 세포를 초래한 유전적 변경에 대한 출발 물질과 동일한 유전자형의 세포; (b) 유전적으로 변형된 세포와 동일한 유전자형이지만, 널 구축물로 (즉, 관심 형질에 대한 효과가 공지되어 있지 않은 구축물로) 형질전환되어 있는 세포; 또는 (c) 유전적으로 변형된 세포와 유전적으로 동일하지만, 변경된 유전자형 또는 표현형의 발현을 유도할 조건 또는 자극 또는 추가의 유전적 변형에 노출되지 않은 세포를 포함할 수 있다.
2개의 단백질 또는 아미노산 서열의 변형과 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "에 상응하는"는 제1 단백질에서의 상술된 변형이 제2 단백질에서의 변형과 동일한 아미노산 잔기의 치환이라는 것과 2개의 단백질이 (예를 들어, BLASTp 프로그램을 사용하여) 표준 서열 정렬에 적용되었을 때 제1 단백질에서의 변형의 아미노산 위치가 제2 단백질에서의 변형의 아미노산 위치에 상응하거나 또는 이와 정렬된다는 것을 가리키도록 사용된다. 따라서, 서열 정렬에서 잔기 X 및 Y가 서로 상응한다면, 그리고 X 및 Y가 상이한 번호일 수 있다는 사실에도 불구하고, 제1 단백질에서 잔기 "X"가 아미노산 "A"로 변형되는 것은 제2 단백질에서 잔기 "Y"가 아미노산 "A"로 변형되는 것에 상응할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "대상체를 치료하는"은 적어도 하나의 HBV 입자의 게놈을 절단함으로써 바이러스의 HBV 증식 속도를 느리게 하거나 또는 정지시키기 위한 목적으로 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제, 또는 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 HBV로 감염된 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 이러한 치료는 대상체에서의 HBV의 형질감염 또는 복제를 감소시키거나 또는 방지하고, 대상체에서 HBV의 하나 이상의 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화시킨다. HBV 감염의 증상의 경감을 평가하는 수단은 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 효소의 수준을 결정하는 것 또는 혈청전환, 즉 HbeAg의 소실을 측정하는 것에 의한 간 기능 측정을 포함할 수 있다. 추가로, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 방법에 의해 간 생검을 검사하고 조직 섬유화를 측정함으로써 HBV 증상의 경감 또는 감소를 결정할 수 있다. 예를 들어 PCR을 사용하여 HBV DNA 수준을 측정함으로써 또는 혈액 내의 HBsAg 수준을 검출함으로써 순환 바이러스 입자의 수를 결정할 수 있다. 용어 "치료" 또는 "대상체를 치료하는"은 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 세포 (예를 들어, 간세포)를 투여하는 것을 추가로 지칭할 수 있으며, 여기서 세포는 표적 조직 (예를 들어, 간)에 전달되고, 조작된 메가뉴클레아제를 대상체에서 HBV 감염을 치료하는데 충분한 양으로 생산하며, 이에 의해 HBV의 하나 이상의 증상의 부분적이거나 완전한 완화를 초래한다. 일부 측면에서, 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제, 그를 코딩하는 핵산, 또는 본 발명의 유전적으로 변형된 세포가 치료 동안 본 발명의 제약 조성물의 형태로 투여된다.
용어 "B형 간염 바이러스 감염"은 B형 간염 바이러스 감염과 관련되거나 이로부터 초래되는 임의의 상태, 예컨대 만성 간 질환/장애, 염증, 섬유화 상태 및 증식성 장애, 예컨대 간암을 지칭한다. 만성 지속 HBV 감염은 피로, 간 손상, 간경변, 및 1차 간암인 간세포 암종을 야기할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "증식하는" 및 "증식"은 HBV 세포가 활발하게 분열되고 인간 세포를 감염시키는 것을 지칭한다. 따라서, 증식 감소는 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 투여된 적이 없는 적합한 대조군과 비교했을 때 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 100%가 감소되는 것을 포함하는 HBV 증식의 임의의 감소를 지칭한다. 본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "증식성 장애"는 조직의 원치 않는 또는 비정상적인 증식으로 표시되는 임의의 질환/장애를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "증식성 장애"는 세포의 조절되지 않고/거나 비정상적인 성장이 암성 또는 비-암성일 수 있는 원치 않는 상태 또는 질환의 발생에 이를 수 있는 상태를 또한 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료적 유효량"은 이롭거나 바람직한 생물학적 및/또는 임상 결과를 일으키는데 충분한 양을 지칭한다. 치료적 유효량은 메가뉴클레아제 제형 또는 조성물, 질환 및 그의 중증도, 및 치료될 대상체의 연령, 체중, 신체 상태 및 반응성에 따라 변할 것이다. 구체적 실시양태에서, 유효량의 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 또는 제약 조성물은 HBV 감염을 갖는 대상체에서 HBV의 수준 또는 증식을 감소시키거나, 또는 HBV의 적어도 하나의 증상을 감소시킨다.
용어 "지질 나노입자"는 10 내지 1000 나노미터의 평균 직경으로 전형적으로 구형인 구조를 갖는 지질 조성물을 지칭한다. 일부 제형에서, 지질 나노입자는 적어도 하나의 양이온성 지질, 적어도 하나의 비-양이온성 지질, 및 적어도 하나의 접합된 지질을 포함할 수 있다. 핵산, 예컨대 mRNA를 캡슐화하는데 적절한, 관련 기술분야에 공지된 지질 나노입자가 본 발명에서의 사용에 구상된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 변수에 대한 수치 범위의 열거는 본 발명이 그러한 범위 내의 임의의 값과 동일한 변수로 실행될 수 있다는 것을 전하도록 의도된다. 따라서, 본질적으로 이산성인 변수의 경우에, 변수는 범위의 종점을 포함하여 수치 범위 내의 임의의 정수 값과 동일할 수 있다. 유사하게, 본질적으로 연속적인 변수의 경우, 변수는 범위의 종점을 포함하여 수치 범위 내의 임의의 실제 값과 동일할 수 있다. 예로서, 그리고 비제한적으로, 값이 0 내지 2인 것으로 기술된 변수는 변수가 본질적으로 이산성인 경우에는 0, 1 또는 2의 값을 취할 수 있고, 변수가 본질적으로 연속적인 경우에는 0.0, 0.1, 0.01, 0.001의 값, 또는 0 이상 및 2 이하의 임의의 다른 실제 값을 취할 수 있다.
2.1 발명의 원리
본 발명은, 부분적으로, 조작된 메가뉴클레아제가 HBV 게놈 내의 ORF를 절단하는 것에 의해 HBV의 수준을 감소시키거나 또는 HBV의 증식을 느리게 하는데 사용될 수 있다는 가설을 기초로 한다. 더욱 구체적으로, 메가뉴클레아제는 다중 HBV 유전자형의 게놈 내에 존재하는 인식 서열을 인식 및 절단하도록 조작될 수 있다. 따라서, 단일한 조작된 메가뉴클레아제가 B형 간염 바이러스의 다중 유전자형의 HBV 수준 또는 증식을 감소시키거나 또는 HBV 감염의 증상을 감소시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 HBV 게놈의 적어도 2개의 유전자형의 ORF 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 조작된 메가뉴클레아제를 포함한다. 본 발명은 이러한 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 감염을 치료하기 위해 제약 조성물 및 방법에서 사용하는 방법을 또한 포함한다. 추가로, 본 발명은 조작된 메가뉴클레아제 단백질 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물, 및 HBV 감염의 치료를 위한 이러한 조성물의 용도를 포함한다.
2.2 HBV 게놈 내의 인식 서열을 인식 및 절단하기 위한 메가뉴클레아제
부위-특이적 뉴클레아제를 사용하여 바이러스의 게놈 내에 DNA 파단을 만들 수 있다는 것과 이러한 DNA 파단이 HBV 비리온이 더 이상 분열하거나 인간 세포를 감염시킬 수 없도록 NHEJ를 통해 게놈의 영구적인 변형을 초래할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 조작된 재조합 메가뉴클레아제를 사용하여 실행될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명을 실행하는데 사용된 뉴클레오티드는 단일쇄 메가뉴클레아제이다. 단일쇄 메가뉴클레아제는 링커 펩티드에 의해 연결된 N-말단 서브유닛 및 C-말단 서브유닛을 포함한다. 2개의 도메인 각각이 인식 서열의 절반 (즉, 인식 절반-부위)을 인식하고, DNA 절단 부위는 2개의 서브유닛의 계면 근처에 있는 인식 서열의 중간에 있다. DNA 가닥 파단은 염기쌍 4개만큼 오프셋되어, 메가뉴클레아제에 의한 DNA 절단으로 염기쌍 4개의 3' 단일-가닥 오버행 한 쌍이 생성된다.
일부 예에서, 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10)을 인식 및 절단하도록 조작되어 있다. HBV 1-2 인식 서열은 다중 HBV 유전자형의 P 단백질, S, 프리S2/S, 및 프리S1/프리S2 ORF 내에 위치한다. HBV 1-2 인식 서열은 유전자형 A, B, C, E, F, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-5 및 7-9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 게놈 내에서 적어도 발견될 수 있다. 이러한 조작된 메가뉴클레아제는 본원에서 총괄적으로 "HBV 1-2 메가뉴클레아제"로 지칭된다. 예시적인 HBV 1-2 메가뉴클레아제가 서열식별번호: 18-21에서 제공된다.
추가적인 예에서, 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12)을 인식 및 절단하도록 조작되어 있다. HBV 5-6 인식 서열은 다중 HBV 유전자형의 P 단백질, S, 프리S2/S, 및 프리S1/프리S2 ORF 내에 위치한다. HBV 5-6 인식 서열은 유전자형 A, B, C, D, E, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-7 및 9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 게놈 내에서 적어도 발견될 수 있다. 이러한 조작된 메가뉴클레아제는 본원에서 총괄적으로 "HBV 5-6 메가뉴클레아제"로 지칭된다. 예시적인 HBV 5-6 메가뉴클레아제가 서열식별번호: 22-28에서 제공된다.
추가적인 예에서, 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14)을 인식 및 절단하도록 조작되어 있다. HBV 7-8 인식 서열은 다중 HBV 유전자형의 P 단백질 ORF 내에 위치한다. HBV 7-8 인식 서열은 유전자형 A, B, C, D, F, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-6, 8, 및 9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 게놈 내에서 적어도 발견될 수 있다. 이러한 조작된 메가뉴클레아제는 본원에서 총괄적으로 "HBV 7-8 메가뉴클레아제"로 지칭된다. 예시적인 HBV 7-8 메가뉴클레아제가 서열식별번호: 29-32에서 제공된다.
추가적인 예에서, 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)을 인식 및 절단하도록 조작되어 있다. HBV 11-12 인식 서열은 다중 HBV 유전자형의 P 단백질 ORF 내에 위치한다. HBV 11-12 인식 서열은 유전자형 A, B, C, D, E, F 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 게놈 내에서 적어도 발견될 수 있다. 이러한 조작된 메가뉴클레아제는 본원에서 총괄적으로 "HBV 11-12 메가뉴클레아제"로 지칭된다. 예시적인 HBV 11-12 메가뉴클레아제가 서열식별번호: 34-40에서 제공된다.
본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 제1 초가변 (HVR1) 영역을 포함하는 제1 서브유닛, 및 제2 초가변 (HVR2) 영역을 포함하는 제2 서브유닛을 포함한다. 추가로, 제1 서브유닛은 인식 서열 내의 제1 인식 절반-부위 (예를 들어, HBV1, HBV5, HBV7, 또는 HBV11 절반-부위)에 결합하고, 제2 서브유닛은 인식 서열 내의 제2 인식 절반-부위 (예를 들어, HBV2, HBV6, HBV8, 또는 HBV12 절반-부위)에 결합한다. 조작된 메가뉴클레아제가 단일쇄 메가뉴클레아제인 실시양태에서, 제1 및 제2 서브유닛은 HVR1 영역을 포함하고 제1 절반-부위에 결합하는 제1 서브유닛이 N-말단 서브유닛으로서 위치하고, HVR2 영역을 포함하고 제2 절반-부위에 결합하는 제2 서브유닛이 C-말단 서브유닛으로서 위치하도록 배향될 수 있다. 대안적 실시양태에서, 제1 및 제2 서브유닛은 HVR1 영역을 포함하고 제1 절반-부위에 결합하는 제1 서브유닛이 C-말단 서브유닛으로서 위치하고, HVR2 영역을 포함하고 제2 절반-부위에 결합하는 제2 서브유닛이 N-말단 서브유닛으로서 위치하도록 배향될 수 있다. 예시적인 본 발명의 HBV 1-2 메가뉴클레아제가 표 1에서 제공된다. 예시적인 본 발명의 HBV 5-6 메가뉴클레아제가 표 2에서 제공된다. 예시적인 본 발명의 HBV 7-8 메가뉴클레아제가 표 3에서 제공된다. 예시적인 본 발명의 HBV 11-12 메가뉴클레아제가 표 4에서 제공된다.
표 1. HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10)을 인식 및 절단하도록 조작된 예시적인 조작된 메가뉴클레아제
표 2. HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12)을 인식 및 절단하도록 조작된 예시적인 조작된 메가뉴클레아제
표 3. HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14)을 인식 및 절단하도록 조작된 예시적인 조작된 메가뉴클레아제
표 4. HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)을 인식 및 절단하도록 조작된 예시적인 조작된 메가뉴클레아제
2.3 엔도뉴클레아제의 전달 및 발현 방법
대상체에서 HBV 감염 또는 HCC를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 마찬가지로, 제약상 허용되는 담체 및 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제 (또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산)를 포함하는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 HBV 감염의 증상을 감소시키고 HBV의 양을 감소시키거나, HBV의 증식 속도를 감소시키거나 또는 HCC를 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 방법에서, 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제는 표적 세포로 전달되고/거나 표적 세포에서 DNA/RNA로부터 발현될 수 있고, 이러한 세포는 조작된 메가뉴클레아제를 HBV 게놈으로 제공할 수 있다.
본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제는 단백질의 형태로, 또는, 바람직하게는, 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산으로서 세포 내로 전달될 수 있다. 이러한 핵산은 DNA (예를 들어, 환형 또는 선형화 플라스미드 DNA 또는 PCR 생성물) 또는 RNA (예를 들어, mRNA)일 수 있다. 조작된 메가뉴클레아제 코딩 서열이 DNA 형태로 전달되는 실시양태의 경우, 이는 뉴클레아제 유전자의 전사를 용이하게 하는 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 본 발명에 적절한 포유동물 프로모터는 구성적 프로모터 예컨대 시토메갈로바이러스 초기 (CMV) 프로모터 (Thomsen et al. (1984), Proc Natl Acad Sci USA. 81(3):659-63) 또는 SV40 초기 프로모터 (Benoist and Chambon (1981), Nature. 290(5804):304-10), 뿐만 아니라 유도성 프로모터 예컨대 테트라시클린-유도성 프로모터 (Dingermann et al. (1992), Mol Cell Biol. 12(9):4038-45)를 포함한다. 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 또한 합성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 합성 프로모터는, 비제한적으로, JeT 프로모터 (WO 2002/012514)를 포함할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열은 간-특이적 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 간-특이적 프로모터의 예는, 비제한적으로, 인간 알파-1 안티트립신 프로모터 및 아포지질단백질 A-II 프로모터를 포함한다.
구체적 실시양태에서, 적어도 하나의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열이 재조합 DNA 구축물 또는 발현 카세트 상에서 전달된다. 예를 들어, 재조합 DNA 구축물은 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 (즉, "카세트")를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 2개 이상의 카세트를 포함하며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 2개의 카세트, 3개의 카세트, 4개의 카세트 또는 그 초과의 카세트를 포함할 수 있다. 예를 들어, 카세트 또는 카세트 조합물이 임의의 개수 또는 조합의 HBV 1-2 메가뉴클레아제, HBV 5-6 메가뉴클레아제, HBV 7-8 메가뉴클레아제, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 카세트가 HBV 1-2 메가뉴클레아제, HBV 5-6 메가뉴클레아제, HBV 7-8 메가뉴클레아제, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 카세트 또는 카세트 조합물이 HBV 5-6 메가뉴클레아제 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다.
다른 실시양태에서, 재조합 DNA 구축물은 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시킨다.
일부 실시양태에서, 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 mRNA가 세포에 전달되는데, 이것이 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 유전자가 세포의 게놈 내로 통합될 가능성을 감소시키기 때문이다. 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 이러한 mRNA는 관련 기술분야에 공지된 방법 예컨대 시험관내 전사를 사용하여 생산될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA가는 7-메틸-구아노신을 사용하여 캡핑된다. 일부 실시양태에서, mRNA는 폴리아데닐화될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 조작된 뉴클레아제를 코딩하는 mRNA는 세포에서 동시에 발현되는 2개 이상의 뉴클레아제를 코딩하는 폴리시스트론 mRNA일 수 있다. 일부 실시양태에서, HBV 게놈이 다중 부위에서 절단되도록, 폴리시스트론 mRNA는 HBV 게놈 내의 상이한 인식 서열을 표적화하는 2개 이상의 본원에 기술된 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 mRNA는 2개 이상의 본원에 기술된 메가뉴클레아제, 및 세포에서 치료적으로 이로운 효과를 유도하는 적어도 하나의 추가적인 단백질을 코딩할 수 있다. 본 발명의 폴리시스트론 mRNA는 IRES 요소, T2A 요소, P2A 요소, E2A 요소 및 F2A 요소를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 동일한 mRNA 분자로부터 2개 이상의 유전자의 번역을 허용하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 요소를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 폴리시스트론 mRNA는 2개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 비시스트론 mRNA, 3개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 트리시스트론 mRNA, 또는 4개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 쿼드시스트론 mRNA이며, 여기서 각각의 mRNA에 의해 코딩되는 뉴클레아제는 HBV 게놈 내의 상이한 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 예를 들어, 폴리시스트론 mRNA는 임의의 개수 또는 조합의 HBV 1-2 메가뉴클레아제, HBV 5-6 메가뉴클레아제, HBV 7-8 메가뉴클레아제, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론 mRNA는 HBV 1-2 메가뉴클레아제, HBV 5-6 메가뉴클레아제, HBV 7-8 메가뉴클레아제, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩할 수 있다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 폴리시스트론 mRNA는 HBV 5-6 메가뉴클레아제 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제를 코딩하는 비시스트론 mRNA일 수 있다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명의 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산은 단일-가닥 DNA 주형을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 단일-가닥 DNA는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 서열의 상류 및/또는 하류에 5' 및/또는 3' AAV 역전 말단 반복물 (ITR)을 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 단일-가닥 DNA는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 서열의 상류 및/또는 하류에 5' 및/또는 3' 상동성 아암(arm)을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 본 발명의 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자는 선형화 DNA 주형을 사용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 예에서, 세포 내로 도입되기 전에 환형 플라스미드 DNA가 선형화되도록, 엔도뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA가 하나 이상의 제한 효소에 의해 소화될 수 있다.
정제된 뉴클레아제 단백질이 본원에서 하기에 추가로 상술된 것들을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 다양한 상이한 메카니즘에 의해 게놈 DNA를 절단하도록 세포 내로 전달될 수 있다.
본 발명의 조작된 메가뉴클레아제의 전달을 위한 표적 조직(들)은, 비제한적으로, 간의 세포, 예컨대 간세포 또는 바람직하게는 1차 간세포, 더욱 바람직하게는 인간 간세포 또는 인간 1차 간세포, HepG2.2.15 또는 HepG2-hNTCP 세포를 포함한다. 논의된 바와 같이, 본 발명의 메가뉴클레아제는 정제된 단백질로서 또는 메가뉴클레아제를 코딩하는 RNA 또는 DNA로서 전달될 수 있다. 한 실시양태에서, 메가뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 mRNA 또는 DNA 벡터는 표적 조직으로의 직접적인 주사를 통해 표적 세포 (예를 들어, 간 내의 세포)로 공급된다. 대안적으로, 엔도뉴클레아제 단백질, mRNA, 또는 DNA는 순환계를 통해 전신적으로 전달될 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 공지된 기술에 따라 제약상 허용되는 담체 내에서 전신 투여 또는 표적 조직으로의 투여용으로 제형된다. 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)]을 참조한다. 본 발명에 따른 제약 제형의 제조에서, 단백질/RNA/mRNA는 전형적으로 제약상 허용되는 담체와 혼합된다. 물론, 담체는 제형 내의 임의의 다른 성분과 상용성이라는 면에서 허용가능하여야 하고, 환자에게 해롭지 않아야 한다. 담체는 고체 또는 액체, 또는 둘 다일 수 있고, 화합물과 함께 단위-용량 제형으로서 제형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 세포 흡수를 용이하게 하기 위해 세포 투과 펩티드 또는 표적화 리간드에 커플링된다. 관련 기술분야에 공지된 세포 투과 펩티드의 예는 폴리-아르기닌 (Jearawiriyapaisarn, et al. (2008) Mol Ther. 16:1624-9), HIV 바이러스로부터의 TAT 펩티드 (Hudecz et al. (2005), Med. Res. Rev. 25: 679-736), MPG (Simeoni, et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2717-2724), Pep-1 (Deshayes et al. (2004) Biochemistry 43: 7698-7706), 및 HSV-1 VP-22 (Deshayes et al. (2005) Cell Mol Life Sci. 62:1839-49)를 포함한다. 대안적 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질/DNA/mRNA가 표적 세포에 결합하고 표적 세포에 의해 내재화되도록, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 표적 세포 상에서 발현되는 특이적 세포-표면 수용체를 인식하는 항체에 공유적으로 또는 비-공유적으로 커플링된다. 대안적으로, 엔도뉴클레아제 단백질/DNA/mRNA는 이러한 세포-표면 수용체에 대한 천연 리간드 (또는 천연 리간드의 일부분)에 공유적으로 또는 비-공유적으로 커플링될 수 있다. (McCall, et al. (2014) Tissue Barriers. 2(4):e944449; Dinda, et al. (2013) Curr Pharm Biotechnol. 14:1264-74; Kang, et al. (2014) Curr Pharm Biotechnol. 15(3):220-30; Qian et al. (2014) Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10(11):1491-508).
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 간의 원하는 영역 (예를 들어, 간 동양 내피 세포 또는 조혈 내피 세포, 또는 이로 분화되는 선조 세포에 인접함) 내로의 주사 또는 이식을 위해 생물분해성 히드로겔 내에 캡슐화된다. 히드로겔은 빈번한 주사를 필요로 하지 않으면서 표적 조직의 원하는 영역으로의 치료용 페이로드의 지속적이고 조정가능한 방출을 제공할 수 있고, 환경적이거나 또는 외부에서 적용된 신호에 반응하여 페이로드를 방출하도록 자극-반응성 물질 (예를 들어, 온도- 및 pH-반응성 히드로겔)이 설계될 수 있다 (Kang Derwent et al. (2008) Trans Am Ophthalmol Soc. 106:206-214).
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 공유적으로 또는 바람직하게는 비-공유적으로 나노입자에 커플링되거나 또는 이러한 나노입자 내에 캡슐화된다 (Sharma, et al. (2014) Biomed Res Int. 2014). 나노입자는 길이 규모가 <1 μm, 바람직하게는 <100 nm인 나노규모의 전달 시스템이다. 이러한 나노입자는 금속, 지질, 중합체 또는 생물학적 거대분자로 구성된 코어를 사용하여 설계될 수 있고, 엔도뉴클레아제 단백질, mRNA, 또는 DNA의 다중 카피가 나노입자 코어에 부착되거나 또는 나노입자 코어로 캡슐화될 수 있다. 이는 각각의 세포에 전달되는 단백질/mRNA/DNA의 카피수를 증가시키고, 따라서, 각각의 엔도뉴클레아제의 세포내 발현을 증가시켜, 표적 인식 서열이 절단될 가능성을 최대화한다. 이러한 나노입자의 표면이 중합체 또는 지질 (예를 들어, 키토산, 양이온성 중합체, 또는 양이온성 지질)로 추가로 변형되어, 페이로드의 세포 전달 및 흡수를 강화하도록 표면이 추가적인 기능성을 부여하는 코어-쉘 나노입자가 형성될 수 있다 (Jian et al. (2012) Biomaterials. 33(30): 7621-30). 추가적으로 나노입자는 나노입자를 적합한 세포 유형으로 지시하고/거나 세포 흡수 가능성을 증가시키는 표적화 분자에 유리하게 커플링될 수 있다. 이러한 표적화 분자의 예는 세포-표면 수용체에 대해 특이적인 항체 및 세포 표면 수용체에 대한 천연 리간드 (또는 천연 리간드의 일부분)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 리포솜 내에 캡슐화되거나 또는 양이온성 지질을 사용하여 복합체화된다 (예를 들어, 리포펙타민(LIPOFECTAMINE) 형질감염 시약, 라이프 테크놀러지즈 코포레이션(Life Technologies Corp.), 캘리포니아주 칼스배드; 문헌 [Zuris et al. (2015) Nat Biotechnol. 33: 73-80]; [Mishra et al. (2011) J Drug Deliv. 2011:863734]을 참조한다). 리포솜 및 리포플렉스 제형은 페이로드를 분해로부터 보호할 수 있고, 표적 부위에서의 축적 및 유지를 강화할 수 있으며, 표적 세포의 세포막과의 융합 및/또는 그의 파괴를 통해 세포 흡수 및 전달 효율을 용이하게 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 중합체성 스캐폴드 (예를 들어, PLGA) 내에 캡슐화되거나 또는 양이온성 중합체 (예를 들어, PEI, PLL)를 사용하여 복합체화된다 (Tamboli et al. (2011) Ther Deliv. 2(4): 523-536). 중합체성 담체는 중합체 침식 및 약물 확산의 제어를 통한 조정가능한 약물 방출 속도를 제공하도록 설계될 수 있고, 높은 약물 캡슐화 효율이 원하는 표적 세포 집단으로의 세포내 전달까지 치료용 페이로드의 보호를 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 미셀로 자가-조립되는 양친매성 분자와 조합된다 (Tong et al. (2007) J Gene Med. 9(11): 956-66). 중합체성 미셀은 친수성 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌글리콜)로 형성된 미셀 쉘을 포함할 수 있고, 이는 응집을 방지할 수 있고, 전하 상호작용을 차폐할 수 있으며, 비-특이적 상호작용을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 표적 세포로의 투여 및/또는 전달을 위해 에멀젼 또는 나노에멀젼 (즉, 평균 입자 직경이 < 1 nm임) 내로 제형된다. 용어 "에멀젼"은, 비제한적으로, 임의의 수중유, 유중수, 수중유중수, 또는 유중수중유 분산액 또는 액적을 지칭하고, 물과 혼화성이지 않은 상이 수성 상과 혼합될 때, 무극성 잔기 (예를 들어, 긴 탄수화물 쇄)은 물에서 멀리, 극성 머리 기는 물로 보내는 소수성 힘의 결과로서 형성될 수 있는 지질 구조를 포함한다. 이러한 다른 지질 구조는 단층, 소수층, 및 다층 지질 소포, 미셀, 및 층판 상을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 에멀젼은 수성 상 및 친지성 상 (전형적으로 오일 및 유기 용매를 함유함)으로 구성된다. 또한 에멀젼은 하나 이상의 계면활성제를 빈번하게 함유한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 2002/0045667 및 2004/0043041, 및 미국 특허 번호 6,015,832, 6,506,803, 6,635,676, 및 6,559,189 (이들 각각은 전문이 본원에 참조된다)에 기술된 바와 같이, 나노에멀젼 제형은 널리 공지되어 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 단백질, 또는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA/mRNA는 다관능성 중합체 접합체, DNA 덴드리머, 및 중합체성 덴드리머에 공유적으로 부착되거나 또는 이와 비-공유적으로 회합된다 (Mastorakos et al. (2015) Nanoscale. 7(9): 3845-56; Cheng et al. (2008) J Pharm Sci. 97(1): 123-43). 덴드리머 생성은 페이로드 용량 및 크기를 제어할 수 있고, 높은 약물 페이로드 용량을 제공할 수 있다. 또한, 안정성을 개선시키고, 비-특이적 상호작용을 감소시키며, 세포-특이적 표적화 및 약물 방출을 강화하는데 다중 표면 기의 디스플레이가 활용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 엔도뉴클레아제를 코딩하는 유전자는 바이러스 벡터를 사용하여 전달된다. 이러한 벡터는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다 (문헌 [Vannucci, et al. (2013 New Microbiol. 36:1-22]에서 리뷰됨). 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 표적 조직 (예를 들어, 간 조직) 내로 직접적으로 주사된다. 대안적 실시양태에서, 바이러스 벡터는 순환계를 통해 전신적으로 전달된다. 상이한 AAV 벡터가 상이한 조직으로 국소화되는 경향을 갖는다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 간 표적 조직에서, 간세포의 효과적인 형질도입이, 예를 들어, AAV 혈청형 2, 8, 및 9로 제시된 바 있다 (Sands (2011) Methods Mol. Biol. 807:141-157). AAV 벡터는 또한 자가-상보적일 수 있어서, 숙주 세포에서의 제2 가닥 DNA 합성을 필요로 하지 않는다 (McCarty, et al. (2001) Gene Ther. 8:1248-54).
한 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 유전자 전달에 사용된 바이러스 벡터는 자가-제한 바이러스 벡터이다. 자가-제한 바이러스 벡터는 벡터 내의 조작된 메가뉴클레아제에 대한 인식 서열의 존재로 인해 세포 또는 생물 내에서의 지속 시간이 제한될 수 있다. 따라서, 자가-제한 바이러스 벡터는 프로모터, 본원에 기술된 엔도뉴클레아제, 및 ITR 내의 엔도뉴클레아제 인식 부위에 대한 코딩을 제공하도록 조작될 수 있다. 자가-제한 바이러스 벡터는 엔도뉴클레아제가 발현되고 게놈 내의 내인성 인식 서열에서 세포의 게놈을 절단할 수 있도록 엔도뉴클레아제 유전자를 세포, 조직 또는 생물에 전달한다. 전달된 엔도뉴클레아제는 자가-제한 바이러스 벡터 자체 내의 자신의 표적 부위를 또한 발견할 것이고, 이러한 표적 부위에서 벡터를 절단할 것이다. 절단되면, 바이러스 게놈의 5' 및 3' 단부가 노출되어 엑소뉴클레아제에 의해 분해될 것이고, 따라서 바이러스를 사멸시키고, 엔도뉴클레아제의 생산을 중단시킨다.
엔도뉴클레아제 유전자가 DNA 형태 (예를 들어 플라스미드)로 및/또는 바이러스 벡터 (예를 들어 AAV)를 통해 전달되면, 이러한 유전자는 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 일부 실시양태에서, 이는 바이러스 프로모터 예컨대 바이러스 벡터로부터의 내인성 프로모터 (예를 들어 렌티바이러스 벡터의 LTR) 또는 널리 공지되어 있는 시토메갈로바이러스- 또는 SV40 바이러스-초기 프로모터일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 메가뉴클레아제 유전자는 표적 세포에서 우선적으로 유전자 발현을 구동시키는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 간-특이적 프로모터의 예는, 비제한적으로, 인간 알파-1 안티트립신 프로모터 및 아포지질단백질 A-II 프로모터를 포함한다.
특정한 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 카세트를 포함한다. 바이러스 벡터는 또한 2개 이상의 카세트를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 카세트는 프로모터 및 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 프로모터 및 폴리시스트론 핵산 서열을 포함하는 하나의 카세트를 포함하며, 여기서 프로모터는 표적 세포에서 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA, 예컨대 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 폴리시스트론 mRNA를 생성시키도록 폴리시스트론 핵산 서열의 발현을 구동시킨다.
본원에 개시된 메가뉴클레아제를 HBV에 감염된 대상체의 간에 전달하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 한 실시양태에서, 포유동물로부터 제거된 천연 간세포에 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 벡터가 형질도입된다. 대안적으로, HBV-감염된 대상체의 천연 간세포에 조작된 메가뉴클레아제 및/또는 간 생성을 자극하는 분자, 예컨대 간독소를 코딩하는 아데노바이러스 벡터가 생체외에서 형질도입될 수 있다. 바람직하게는, 간독소는 uPA이고, 바이러스 벡터에 의해 발현되면 간세포로부터의 그의 분비를 억제하도록 변형되어 있다. 또 다른 예에서, 벡터는 tPA를 코딩하고, 이는 드 노보 간세포 재생을 자극할 수 있다. 그 후, 포유동물로부터 제거된 형질도입된 간세포를 포유동물로 복귀시킬 수 있으며, 여기서 조작된 메가뉴클레아제의 발현에 도움이 되는 상태가 제공된다. 전형적으로, 형질도입된 간세포는 비장 또는 문맥 혈관계를 통한 주입에 의해 환자에게 복귀될 수 있고, 투여는 단일 투여 또는 1 내지 5일 또는 그 초과의 기간에 걸친 다중 투여일 수 있다.
본 발명의 방법의 생체내 측면에서, 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하고 대상체 내로 투여되는 레트로바이러스, 슈도타입 또는 아데노바이러스 연관 벡터가 구축된다. 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 벡터의 투여는 분비-손상 간독소를 코딩하거나 또는 간독소로서 작용하지 않으면서 간세포 재생을 자극하는 tPA를 코딩하는 아데노바이러스 벡터의 투여로 일어날 수 있다.
적합한 용량은, 인자들 중에서도, 임의의 선택된 AAV 벡터 (예를 들어, 혈청형 등), 투여 경로, 치료되는 대상체 (즉, 대상체의 연령, 체중, 성별 및 일반적인 상태), 및 투여 방식에 좌우될 것이다. 따라서, 적합한 투여량은 환자마다 다를 수 있다. 적합한 유효량은 관련 기술분야의 기술자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 투여량 치료는 단일 용량 일정 또는 다중 용량 일정일 수 있다. 또한, 대상체에게 적합한 만큼의 다수의 용량으로 투여할 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 적합한 용량 횟수를 쉽게 결정할 수 있다. 대안적인 투여 경로를 고려하거나 또는 치료 이익 대 임의의 부작용의 균형을 맞추기 위해 투여량을 조정할 필요가 있을 수 있다.
2.4 제약 조성물
일부 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제, 또는 제약상 허용되는 담체 및 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체 및 세포가 본원에 개시된 바와 같은 조작된 메가뉴클레아제를 발현하는 표적 조직으로 전달될 수 있는 본 발명의 세포를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명의 제약 조성물은 HBV에 걸린 대상체를 치료하는데, HBV의 수준 또는 증식을 감소시키는데, HBV의 적어도 하나의 증상을 감소시키는데, 또는 HCC를 치료하는데 유용할 수 있다.
제약 조성물은 표적 HBV 균주의 유전자형에 따라 설계 또는 선택될 수 있다. 본원에 상세하게 기술된 바와 같이, 본 발명의 메가뉴클레아제는 HBV의 특이적 유전자형 내의 인식 서열을 인식 및 절단하도록 조작되어 있다. 예를 들어, HBV 1-2 메가뉴클레아제 (예를 들어, 서열식별번호: 18-21)는 HBV 유전자형 A, B, C, E, F, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-5 및 7-9)의 게놈에서 적어도 발견되는 HBV 1-2 인식 서열을 인식 및 절단한다. 추가로, 본원에 개시된 조작된 메가뉴클레아제의 인식 서열은 서열식별번호: 3-9에서 제공된 각각의 유전자형에 대해 100% 서열 동일성을 공유하지 않는 HBV 유전자형 A, B, C, D, E, F 및 G의 단리물에서 발견될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, HBV "단리물"은 서열식별번호: 3-9 중 어느 하나에서 제공된 상응하는 유전자형 예와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 공유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 서열식별번호: 10, 12, 14, 또는 16에 기재된 인식 서열을 포함하는 임의의 유전자형의 HBV를 갖는 대상체에게 투여될 수 있다.
이러한 제약 조성물은 공지된 기술에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington, The Science And Practice of Pharmacy (21st ed. 2005)]을 참조한다. 본 발명에 따른 제약 제형의 제조에서, 전형적으로 엔도뉴클레아제 폴리펩티드 (또는 그를 코딩하는 DNA/RNA)가 제약상 허용되는 담체와 혼합되고, 생성된 조성물이 대상체에게 투여된다. 물론, 담체는 제형 내의 임의의 다른 성분과 상용성이라는 면에서 허용가능하여야 하고, 대상체에게 해롭지 않아야 한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 대상체에서의 질환 치료에 유용한 하나 이상의 추가적인 작용제 또는 생물학적 분자를 추가로 포함할 수 있다. 마찬가지로, 추가적인 작용제(들) 및/또는 생물학적 분자(들)는 별개의 조성물로서 공동-투여될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 (또는 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산)의 조합물을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 조작된 메가뉴클레아제는 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성이 가져, 단일 제약 조성물이 대상체 내의 다양한 HBV 유전자형 및/또는 유전자형 단리물의 치료에 광범위하게 유용하다. 마찬가지로, 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 다수의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 폴리시스트론 mRNA (또는 발현되었을 때 폴리시스트론 mRNA를 생산하는 카세트를 갖는 재조합 DNA 구축물 또는 바이러스 벡터)를 포함할 수 있다. 이러한 제약 조성물이 또한 대상체 내의 다양한 HBV 유전자형 및/또는 유전자형 단리물의 치료에 광범위하게 유용하다. 어느 경우든, 이러한 제약 조성물은 특이적인 HBV 유전자형 또는 단리물이 대상체 내에 공지되어 있거나 또는 공지되어 있지 않은 경우에 단일 치료로서 유용할 수 있다.
예를 들어, 다수의 상이한 본원에 개시된 재조합 메가뉴클레아제를 포함하거나 또는 다수의 상이한 본원에 개시된 재조합 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물이 다중 유전자형의 HBV로 감염되었거나 또는 미지의 유전자형의 HBV로 감염된 환자에게 투여될 수 있다. 따라서, 다수의 상이한 재조합 메가뉴클레아제를 갖거나 또는 다수의 상이한 재조합 메가뉴클레아제를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것은 자원이 HBV의 정확한 유전자형 결정을 허용하지 않는 경우 및 신속하고 광범위한 치료 해법이 요망되는 경우에 HBV 감염의 치료 및 제어를 위한 융통성있는 옵션을 공급한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 제약 조성물은 본원의 다른 곳에 기술된 지질 나노입자 내에 캡슐화된 하나 이상의 본원에 기술된 mRNA를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개 이상의 본원에 기술된 mRNA를 포함할 수 있으며, 각각의 mRNA는 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 것인 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 구체적 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개, 3개 또는 4개의 본원에 기술된 mRNA를 포함할 수 있으며, 각각의 mRNA는 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 것인 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 다른 실시양태에서, 지질 나노입자는 하나 이상의 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 폴리시스트론 mRNA는 본원에 기술된 상이한 HBV 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 것인 2개 이상의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다. 특정한 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개, 3개 또는 4개의 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 폴리시스트론 mRNA를 포함할 수 있다. 다른 특정한 실시양태에서, 지질 나노입자는 2개 이상의 본원에 기술된 폴리시스트론 mRNA를 포함할 수 있으며, 각각의 폴리시스트론 mRNA는 2개 이상의 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제를 코딩한다.
본 발명에서의 사용에 대해 구상되는 일부 지질 나노입자는 적어도 하나의 양이온성 지질, 적어도 하나의 비-양이온성 지질, 및 적어도 하나의 접합된 지질을 포함한다. 더욱 특정한 예에서, 지질 나노입자는 약 50 몰% 내지 약 85 몰%의 양이온성 지질, 약 13 몰% 내지 약 49.5 몰%의 비-양이온성 지질, 및 약 0.5 몰% 내지 약 10 몰%의 지질 접합체를 포함할 수 있고, 층상이 아닌 (즉, 2층이 아닌) 형태를 갖는 방식으로 생산된다. 다른 특정 예에서, 지질 나노입자는 약 40 몰% 내지 약 85 몰%의 양이온성 지질, 약 13 몰% 내지 약 49.5 몰%의 비-양이온성 지질, 및 약 0.5 몰% 내지 약 10 몰%의 지질 접합체를 포함할 수 있고, 층상이 아닌 (즉, 2층이 아닌) 형태를 갖는 방식으로 생산된다.
양이온성 지질은, 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 팔미토일-올레일-노르-아르기닌 (PONA), MPDACA, GUADACA, ((6Z,9Z,28Z,31Z)헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노)부타노에이트) (MC3), LenMC3, CP-LenMC3, γ-LenMC3, CP-γ-LenMC3, MC3MC, MC2MC, MC3 에테르, MC4 에테르, MC3 아미드, Pan-MC3, Pan-MC4 및 Pan MC5, 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C2-DMA; "XTC2"), 2,2-디리놀레일-4-(3-디메틸아미노프로필)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C3-DMA), 2,2-디리놀레일-4-(4-디메틸아미노부틸)-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-C4-DMA), 2,2-디리놀레일-5-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥산 (DLin-K6-DMA), 2,2-디리놀레일-4-N-메틸페피아지노-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-MPZ), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란 (DLin-K-DMA), 1,2-디리놀레일카르바모일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-C-DAP), 1,2-디리놀레이옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC), 1,2-디리놀레이옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA), 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP), 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl), 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl), 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ), 3-(N,N-디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP), 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디오 (DOAP), 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA), N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DODMA), 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DSDMA), N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP), 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카르바모일)콜레스테롤 (DC-Chol), N-(1,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미니움트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 디옥타데실아미도글리실 스페르민 (DOGS), 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-1-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판 (CLinDMA), 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메티-1-(시스,시스-9',1-2'-옥타데카디엔옥시)프로판 (CpLinDMA), N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민 (DMOBA), 1,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DOcarbDAP), 1,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판 (DLincarbDAP), 또는 이들의 혼합물. 양이온성 지질은 또한 DLinDMA, DLin-K-C2-DMA ("XTC2"), MC3, LenMC3, CP-LenMC3, γ-LenMC3, CP-γ-LenMC3, MC3MC, MC2MC, MC3 에테르, MC4 에테르, MC3 아미드, Pan-MC3, Pan-MC4, Pan MC5, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 90 몰%, 약 50 몰% 내지 약 85 몰%, 약 50 몰% 내지 약 80 몰%, 약 50 몰% 내지 약 75 몰%, 약 50 몰% 내지 약 70 몰%, 약 50 몰% 내지 약 65 몰%, 또는 약 50 몰% 내지 약 60 몰%를 구성할 수 있다.
다른 실시양태에서, 양이온성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 40 몰% 내지 약 90 몰%, 약 40 몰% 내지 약 85 몰%, 약 40 몰% 내지 약 80 몰%, 약 40 몰% 내지 약 75 몰%, 약 40 몰% 내지 약 70 몰%, 약 40 몰% 내지 약 65 몰%, 또는 약 40 몰% 내지 약 60 몰%를 구성할 수 있다.
비-양이온성 지질은, 예를 들어, 하나 이상의 음이온성 지질 및/또는 중성 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 비-양이온성 지질은 하기의 중성 지질 성분 중 하나를 포함한다: (1) 콜레스테롤 또는 그의 유도체; (2) 인지질; 또는 (3) 인지질 및 콜레스테롤 또는 그의 유도체의 혼합물. 콜레스테롤 유도체의 예는 콜레스타놀, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 콜레스테릴-2'-히드록시에틸 에테르, 콜레스테릴-4'-히드록시부틸 에테르, 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 인지질은 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 팔미토일올레이올-포스파티딜글리세롤 (POPG), 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일-포스파티딜에탄올아민 (DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 모노메틸-포스파티딜에탄올아민, 디메틸-포스파티딜에탄올아민, 디엘라이도일-포스파티딜에탄올아민 (DEPE), 스테아로일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 에그 포스파티딜콜린 (EPC), 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 중성 지질일 수 있다. 특정의 바람직한 실시양태에서, 인지질은 DPPC, DSPC, 또는 이들의 혼합물이다.
일부 실시양태에서, 비-양이온성 지질 (예를 들어, 하나 이상의 인지질 및/또는 콜레스테롤)은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 60 몰%, 약 15 몰% 내지 약 60 몰%, 약 20 몰% 내지 약 60 몰%, 약 25 몰% 내지 약 60 몰%, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 10 몰% 내지 약 55 몰%, 약 15 몰% 내지 약 55 몰%, 약 20 몰% 내지 약 55 몰%, 약 25 몰% 내지 약 55 몰%, 약 30 몰% 내지 약 55 몰%, 약 13 몰% 내지 약 50 몰%, 약 15 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 20 몰% 내지 약 50 몰%를 구성할 수 있다. 비-양이온성 지질이 인지질 및 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체의 혼합물인 경우, 혼합물은 입자 내에 존재하는 총 지질의 최대 약 40, 50, 또는 60 몰%를 구성할 수 있다.
입자의 응집을 억제하는 접합된 지질은, 예를 들어, 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 폴리에틸렌글리콜 (PEG)-지질 접합체, 폴리아미드 (ATTA)-지질 접합체, 양이온성 중합체-지질 접합체 (CPL), 또는 이들의 혼합물. 한 바람직한 실시양태에서, 핵산-지질 입자는 PEG-지질 접합체 또는 ATTA-지질 접합체를 포함한다. 특정 실시양태에서, PEG-지질 접합체 또는 ATTA-지질 접합체는 CPL과 함께 사용된다. 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질은 PEG-디아실글리세롤 (DAG), PEG 디알킬옥시프로필 (DAA), PEG-인지질, PEG-세라마이드 (Cer), 또는 이들의 혼합물을 예를 들어 포함하는 PEG-지질을 포함할 수 있다. PEG-DAA 접합체는 PEG-디라우릴옥시프로필 (C12), PEG-디미리스틸옥시프로필 (C14), PEG-디팔미틸옥시프로필 (C16), PEG-디스테아릴옥시프로필 (C18), 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적절한 추가적인 PEG-지질 접합체는 mPEG2000-1,2-디-O-알킬-sn3-카르바모일글리세리드 (PEG-C-DOMG)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. PEG-C-DOMG의 합성이 PCT 출원 번호 PCT/US08/88676에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적절한 또 다른 추가적인 PEG-지질 접합체는, 비제한적으로, 1-[8'-(1,2-디미리스토일-3-프로판옥시)-카르복스아미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-ω-메틸-폴리(에틸렌 글리콜) (2KPEG-DMG)을 포함한다. 2KPEG-DMG의 합성이 미국 특허 번호 7,404,969에 기술되어 있다.
일부 경우에, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질 (예를 들어, PEG-지질 접합체)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%, 약 1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.6 몰% 내지 약 1.9 몰%, 약 0.7 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 0.8 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1.3 몰% 내지 약 1.6 몰%, 약 1.4 몰% 내지 약 1.5 몰%, 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 몰% (또는 그의 임의의 분획 또는 이들 내의 범위)를 구성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 경우에, PEG 모이어티는 평균 분자량이 약 2,000 달톤이다. 다른 경우에, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질 (예를 들어, PEG-지질 접합체)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5.0 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 9 몰%, 약 5 몰% 내지 약 8 몰%, 약 6 몰% 내지 약 9 몰%, 약 6 몰% 내지 약 8 몰%, 또는 약 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰% (또는 그의 임의의 분획 또는 이들 내의 범위)를 구성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 경우에, PEG 모이어티는 평균 분자량이 약 750 달톤이다.
다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 양성 전하 캐리어 및 양성의 것과 상이한 적어도 하나의 음성 전하 캐리어를 함유하는 양쪽성 리포솜을 포함할 수 있고, 리포솜의 등전점은 4 내지 8이다. 이러한 목표는 리포솜이 pH-의존적인 변화되는 전하로 제조된다는 사실로 인해 달성된다.
예를 들어, 막-형성 또는 막-기반 양이온성 전하 캐리어의 양이 낮은 pH에서 음이온성 전하 캐리어의 것을 초과하고, 더 높은 pH에서 이러한 비가 역전될 때, 원하는 성질을 갖는 리포솜 구조가 형성된다. 이는 이온화가능한 화합물의 pKa 값이 4 내지 9일 때 항상 그러하다. 매질의 pH가 하락함에 따라, 모든 양이온성 전하 캐리어가 더 많이 하전되고, 모든 음이온성 전하 캐리어는 그의 전하를 잃는다.
양쪽성 리포솜에 유용한 양이온성 화합물은 본원에서 상기에 이전에 기술된 양이온성을 포함한다. 비제한적으로, 강하게 양이온성인 화합물은, 예를 들어, DC-Chol 3-β-[N-(N',N'-디메틸메탄) 카르바모일] 콜레스테롤, TC-Chol 3-β-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄) 카르바모일 콜레스테롤, BGSC 비스구아니디늄-스페르미딘-콜레스테롤, BGTC 비스-구아니디늄-트렌-콜레스테롤, DOTAP (1,2-디올레오일옥시프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드, DOSPER (1,3-디올레오일옥시-2-(6-카르복시-스페르밀)-프로필아미드, DOTMA (1,2-디올레오일옥시프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드) (리포펙틴(Lipofectin)®), DORIE 1,2-디올레오일옥시프로필)-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드, DOSC (1,2-디올레오일-3-숙시닐-sn-글리세릴 콜린 에스테르), DOGSDSO (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-숙시닐-2-히드록시에틸 디술피드 오르니틴), DDAB 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드, DOGS ((C18)2GlySper3+) N,N-디옥타데실아미도--글리콜-스페르민 (트랜스펙탐(Transfectam)®) (C18)2Gly+ N,N-디옥타데실아미도-글리신, CTAB 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, CpyC 세틸피리디늄 클로라이드, DOEPC 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 또는 다른 O-알킬-포스파티딜콜린 또는 에탄올아민, 라이신, 아르기닌 또는 오르니틴으로부터의 아미드 및 포스파티딜 에탄올아민을 포함할 수 있다.
약하게 양이온성인 화합물의 예는, 비제한적으로, His-Chol (히스타미닐-콜레스테롤 헤미숙시네이트), Mo-Chol (모르폴린-N-에틸아미노-콜레스테롤 헤미숙시네이트), 또는 히스티디닐-PE를 포함한다.
중성 화합물의 예는, 비제한적으로, 콜레스테롤, 세라마이드, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 에탄올아민, 테트라에테르 지질 또는 디아실 글리세롤을 포함한다.
양쪽성 리포솜에 유용한 음이온성 화합물은 이전에 본원에 기술된 비-양이온성 화합물을 포함한다. 비제한적으로, 약하게 음이온성인 화합물의 예는 CHEMS (콜레스테롤 헤미숙시네이트), 8 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 카르복실산, 또는 디아실 글리세롤 헤미숙시네이트를 포함할 수 있다. 추가적인 약하게 음이온성인 화합물은 아스파르트산 또는 글루탐산 및 PE 뿐만 아니라 PS의 아미드 및 이와 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 세린, 시스테인, 트레오닌, 타이로신, 글루탐삼, 아스파르트산 또는 다른 아미노산 또는 아미노디카르복실산의 아미드를 포함할 수 있다. 동일한 원리에 따르면, 히드록시카르복실산 또는 히드록시디카르복실산 및 PS의 에스테르가 또한 약하게 음이온성인 화합물이다.
일부 실시양태에서, 양쪽성 리포솜은 접합된 지질, 예컨대 본원에서 상기에 기술된 것들을 함유할 수 있다. 유용한 접합된 지질의 특정 예는, 비제한적으로, PEG-변형된 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티드산, PEG-세라마이드 접합체 (예를 들어, PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20), PEG-변형된 디알킬아민 및 PEG-변형된 1,2-디아실옥시프로판-3-아민을 포함한다. PEG-변형된 디아실글리세롤 및 디알킬글리세롤이 특히 바람직하다.
일부 실시양태에서, 중성 지질은 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 10 몰% 내지 약 60 몰%, 약 15 몰% 내지 약 60 몰%, 약 20 몰% 내지 약 60 몰%, 약 25 몰% 내지 약 60 몰%, 약 30 몰% 내지 약 60 몰%, 약 10 몰% 내지 약 55 몰%, 약 15 몰% 내지 약 55 몰%, 약 20 몰% 내지 약 55 몰%, 약 25 몰% 내지 약 55 몰%, 약 30 몰% 내지 약 55 몰%, 약 13 몰% 내지 약 50 몰%, 약 15 몰% 내지 약 50 몰% 또는 약 20 몰% 내지 약 50 몰%를 구성할 수 있다.
일부 경우에, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질 (예를 들어, PEG-지질 접합체)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 0.1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.5 몰% 내지 약 2 몰%, 약 1 몰% 내지 약 2 몰%, 약 0.6 몰% 내지 약 1.9 몰%, 약 0.7 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 0.8 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.8 몰%, 약 1.2 몰% 내지 약 1.7 몰%, 약 1.3 몰% 내지 약 1.6 몰%, 약 1.4 몰% 내지 약 1.5 몰%, 또는 약 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 또는 2 몰% (또는 그의 임의의 분획 또는 이들 내의 범위)를 구성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 경우에, PEG 모이어티는 평균 분자량이 약 2,000 달톤이다. 다른 경우에, 입자의 응집을 억제하는 접합된 지질 (예를 들어, PEG-지질 접합체)는 입자 내에 존재하는 총 지질의 약 5.0 몰% 내지 약 10 몰%, 약 5 몰% 내지 약 9 몰%, 약 5 몰% 내지 약 8 몰%, 약 6 몰% 내지 약 9 몰%, 약 6 몰% 내지 약 8 몰%, 또는 약 5 몰%, 6 몰%, 7 몰%, 8 몰%, 9 몰%, 또는 10 몰% (또는 그의 임의의 분획 또는 이들 내의 범위)를 구성할 수 있다. 전형적으로, 이러한 경우에, PEG 모이어티는 평균 분자량이 약 750 달톤이다.
중성 및 접합된 지질의 총량을 고려하여, 양쪽성 리포솜의 나머지 잔량은 다양한 비로 제형된 양이온성 화합물 및 음이온성 화합물의 혼합물을 포함할 수 있다. 핵산 캡슐화의 원하는 성질, 제타 전위, pKa, 또는 하전된 지질 성분의 존재에 적어도 부분적으로 의존적인 다른 물리화학적 성질을 달성하기 위해 양이온성 대 음이온성 지질의 비가 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 지질 나노입자는 간에서, 구체적으로는 간세포 내에서 전달 및 흡수를 특이적으로 강화하는 조성을 갖는다.
2.5 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법
일부 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 재조합 AAV 벡터를 제공한다. 재조합 AAV 벡터는 전형적으로 포유동물 세포주 예컨대 HEK-293에서 생산된다. 전달될 치료 유전자(들) (예를 들어, 엔도뉴클레아제 유전자)에 대한 공간을 제공하기 위해 바이러스의 cap 및 rep 유전자가 벡터로부터 제거되어 그의 자가-복제를 방지하기 때문에, 이들을 패키징 세포주에서 인-트랜스(in trans)로 제공하는 것이 필요하다. 추가적으로, 복제를 지지하기 위해 "헬퍼" (예를 들어, 아데노바이러스) 성분을 제공하는 것이 필요하다 (Cots D, Bosch A, Chillon M (2013) Curr. Gene Ther. 13(5): 370-81). 빈번하게, 재조합 AAV 벡터는 세포주가 "헬퍼" 성분을 코딩하는 제1 플라스미드, cap 및 rep 유전자를 포함하는 제2 플라스미드, 및 바이러스 내로 패키징될 개재 DNA 서열을 함유하는 바이러스 ITR을 포함하는 제3 플라스미드로 형질감염되는 삼중-형질감염을 사용하여 생산된다. 그 후, 캡시드 내에 넣어진 게놈 (ITR 및 개재된 관심 유전자(들))을 포함하는 바이러스 입자가 동결-해동 사이클, 초음파처리, 세제, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 수단에 의해 세포로부터 단리된다. 그 후, 입자가 염화세슘 밀도 구배 원심분리 또는 친화력 크로마토그래피를 사용하여 정제되고, 이어서 관심 유전자(들)을 세포, 조작 또는 생물 예컨대 인간 환자에게 전달한다.
전형적으로 재조합 AAV 입자는 세포에서 생산 (제조)되기 때문에, 부위-특이적 엔도뉴클레아제가 패키징 세포에서 발현되지 않는 것을 확실히 하도록 본 발명을 실행할 때 주의를 기울여야 한다. 본 발명의 바이러스 게놈은 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 포함하기 때문에, 패키징 세포주에서 발현된 임의의 엔도뉴클레아제는 바이러스 게놈이 바이러스 입자 내로 패키징될 수 있기 전에 그를 절단할 수 있을 것이다. 이는 패키징 효율 감소 및/또는 단편화된 게놈의 패키징을 초래할 것이다. 하기를 포함하는 여러 접근법을 사용하여 패키징 세포에서의 엔도뉴클레아제의 발현을 방지할 수 있다.
엔도뉴클레아제가 패키징 세포에서 활성이지 않은 조직-특이적 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터가 근육 조직으로의 엔도뉴클레아제(들)의 전달을 위해 개발되면, 근육-특이적 프로모터가 사용될 수 있다. 근육-특이적 프로모터의 예는 C5-12 (Liu, et al. (2004) Hum Gene Ther. 15:783-92), 근육-특이적 크레아틴 키나제 (MCK) 프로모터 (Yuasa, et al. (2002) Gene Ther. 9:1576-88), 또는 평활근 22 (SM22) 프로모터 (Haase, et al. (2013) BMC Biotechnol. 13:49-54)를 포함한다. CNS (뉴런)-특이적 프로모터의 예는 NSE, 시냅신, 및 MeCP2 프로모터 (Lentz, et al. (2012) Neurobiol Dis. 48:179-88)를 포함한다. 간-특이적 프로모터의 예는 알부민 프로모터 (예컨대 Palb), 인간 α1-항트립신 (예컨대 Pa1AT), 및 헤모펙신 (예컨대 Phpx) (Kramer, MG et al., (2003) Mol. Therapy 7:375-85)을 포함한다. 눈-특이적 프로모터의 예는 옵신, 및 각막 상피-특이적 K12 프로모터 (Martin KRG, Klein RL, and Quigley HA (2002) Methods (28): 267-75) (Tong Y, et al., (2007) J Gene Med, 9:956-66)를 포함한다. 이러한 프로모터, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 조직-특이적 프로모터는 HEK-293 세포에서 고도로 활성이지 않고, 따라서 본 발명의 바이러스 벡터 내로 혼입되었을 때 패키징 세포에서 유의한 수준의 엔도뉴클레아제 유전자 발현을 산출할 것으로 예상되지 않을 것이다. 유사하게, 본 발명의 바이러스 벡터는 비-혼화성 조직 특이적 프로모터를 사용하는 것과 함께 다른 세포주를 사용하는 것을 구상한다 (즉, 널리 공지되어 있는 HeLa 세포주 (인간 상피 세포) 및 간-특이적 헤모펙신 프로모터를 사용함). 조직-특이적 프로모터의 다른 예는 활막 육종 PDZD4 (소뇌), C6 (간), ASB5 (근육), PPP1R12B (심장), SLC5A12 (신장), 콜레스테롤 조절 APOM (간), ADPRHL1 (심장), 및 단일유전자 기형 증후군 TP73L (근육)을 포함한다. (Jacox E, et al., (2010) PLoS One v.5(8):e12274).
대안적으로, 벡터는 엔도뉴클레아제가 발현될 가능성이 낮은 상이한 종으로부터의 세포 내에 패키징될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 입자가 비-포유동물 패키징 세포에서 활성이지 않은 포유동물 프로모터, 예컨대 널리 공지되어 있는 시토메갈로바이러스- 또는 SV40 바이러스-초기 프로모터를 사용하여 미생물, 곤충 또는 식물 세포에서 생산될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 바이러스 입자는 문헌 [Gao, et al. (Gao, H., et al. (2007) J. Biotechnol. 131(2):138-43)]에 기술된 바와 같이 배큘로바이러스 시스템을 사용하여 곤충 세포에서 생산된다. 포유동물 프로모터 제어 하의 엔도뉴클레아제는 이러한 세포에서 발현될 가능성이 낮다 (Airenne, KJ, et al. (2013) Mol. Ther. 21(4):739-49). 또한, 곤충 세포는 포유동물 세포와 상이한 mRNA 스플라이싱 모티프를 사용한다. 따라서, 포유동물 인트론, 예컨대 인간 성장 호르몬 (HGH) 인트론 또는 SV40 대형 T 항원 인트론을 엔도뉴클레아제의 코딩 서열 내로 혼입하는 것이 가능하다. 이러한 인트론은 곤충 세포에서 프리-mRNA 전사체로부터 효율적으로 스플라이싱되지 않기 때문에, 곤충 세포는 기능성 엔도뉴클레아제를 발현하지 않을 것이고, 전장 게놈을 패키징할 것이다. 대조적으로, 생성된 재조합 AAV 입자가 전달되는 포유동물 세포는 프리-mRNA를 적당하게 스플라이싱시킬 것이고, 기능성 엔도뉴클레아제 단백질을 발현할 것이다. 해이펭 첸(Haifeng Chen)은 곤충 패키징 세포에서의 독소 단백질 바르나제 및 디프테리아 독소 단편 A의 발현을 약화시키기 위해 HGH 및 SV40 대형 T 항원 인트론을 사용하여, 이러한 독소 유전자를 보유하는 재조합 AAV 벡터의 생산을 가능하게 하는 것을 보고하였다 (Chen, H (2012) Mol Ther Nucleic Acids. 1(11): e57).
소형 분자 유도제가 엔도뉴클레아제 발현에 요구되도록 엔도뉴클레아제 유전자가 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 유도성 프로모터의 예는 Tet-온(Tet-On) 시스템 (클론테크(Clontech); Chen H., et al., (2015) BMC Biotechnol. 15(1):4)) 및 레오스위치(RheoSwitch) 시스템 (인트렉손(Intrexon); Sowa G., et al., (2011) Spine, 36(10): E623-8)을 포함한다. 상기 시스템 둘 다, 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 유사한 시스템은 소형 분자 활성화제 (각각 독시시클린 또는 엑디손)에 반응하여 전사를 활성화시키는 리간드-유도성 전사 인자 (각각 Tet 억제인자 및 엑디손 수용체의 변이체)에 의존한다. 이러한 리간드-유도성 전사 활성화제를 사용하여 본 발명을 실행하는 것은 1) 엔도뉴클레아제 유전자를 상응하는 전사 인자에 반응하는 프로모터의 제어 하에 두어, 엔도뉴클레아제 유전자가 전사 인자에 대한 결합 부위(들)을 갖는 것; 및 2) 패키징된 바이러스 게놈 내에 전사 인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 것을 포함한다. 후자의 단계는 전사 활성화제가 동일한 세포에 또한 제공되지 않으면 재조합 AAV 전달 후에 엔도뉴클레아제가 표적 세포 또는 조직에서 발현되지 않을 것이기 때문에 필요하다. 그 후, 전사 활성화제가 동족 소형 분자 활성화제로 처리된 세포 또는 조직에서만 엔도뉴클레아제 유전자 발현을 유도한다. 이러한 접근법은 소형 분자 유도제가 언제, 그리고 어느 조직으로 전달되는지를 선택하는 것에 의해 엔도뉴클레아제 유전자 발현을 시공간 방식으로 조절할 수 있게 하기 때문에 유리하다. 그러나, 보유 용량이 유의하게 제한된 바이러스 게놈 내에 유도제를 포함하여야 하는 요구사항이 이러한 접근법에 단점을 생성시킨다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 재조합 AAV 입자는 엔도뉴클레아제의 발현을 방지하는 전사 억제인자를 발현하는 포유동물 세포주에서 생산된다. 전사 억제인자는 관련 기술분야에 공지되어 있고, Tet-억제인자, Lac-억제인자, Cro 억제인자, 및 람다-억제인자를 포함한다. 다수의 핵 호르몬 수용체 예컨대 엑디손 수용체가 또한 그의 동족 호르몬 리간드의 부재 하에 전사 억제인자로서 작용한다. 본 발명을 실행하기 위해, 패키징 세포에 전사 억제인자를 코딩하는 벡터가 형질감염/형질도입되고, 바이러스 게놈 (패키징 벡터) 내의 엔도뉴클레아제는 억제인자에 대한 결합 부위를 포함하여 억제인자가 프로모터를 침묵화시키도록 변형된 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 전사 억제인자를 코딩하는 유전자는 다양한 위치에 놓일 수 있다. 이는 별개의 벡터 상에서 코딩될 수 있거나, ITR 서열의 외부에서 패키징 벡터 내로 혼입될 수 있거나, cap/rep 벡터 또는 아데노바이러스 헬퍼 벡터 내로 혼입될 수 있거나, 또는, 가장 바람직하게는, 구성적으로 발현되도록 패키징 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있다. 전사 억제인자 부위가 혼입되도록 통상적인 포유동물 프로모터를 변형시키는 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 창(Chang) 및 로닌슨(Roninson)은 Lac 억제인자에 대한 오퍼레이터를 포함하도록 강력한 구성적 CMV 및 RSV 프로모터를 변형시켰고, 변형된 프로모터로부터의 유전자 발현이 억제인자를 발현하는 세포에서 크게 약화되었음을 제시하였다 (Chang BD, and Roninson IB (1996) Gene 183:137-42). 비-인간 전사 억제인자의 사용은 엔도뉴클레아제 유전자의 전사가 억제인자를 발현하는 패키징 세포에서만 억제되고, 생성된 재조합 AAV 벡터가 형질도입된 표적 세포 또는 조직에서는 억제되지 않을 것임을 확실하게 한다
2.6 조작된 메가뉴클레아제 변이체
본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 조작된 메가뉴클레아제 및 그의 변이체를 포함한다. 본 발명의 추가 실시양태는 본원에 기술된 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드의 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변이체"는 실질적으로 유사한 서열을 의미하도록 의도된다. "변이체" 폴리펩티드는 천연 단백질 내의 하나 이상의 내부 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 부가 및/또는 천연 폴리펩티드 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 아미노산의 치환에 의해 "천연" 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드를 의미하도록 의도된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "천연" 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변이체가 유래되는 모체 서열을 포함한다. 실시양태에 의해 포함되는 변이체 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이다. 다시 말하면, 이는 천연 단백질의 원하는 생물학적 활성, 즉, B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열, 예를 들어, HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10), HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12), HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14), 또는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)을 인식 및 절단하는 능력을 계속 보유한다. 이러한 변이체는, 예를 들어, 인간 조작으로부터 초래될 수 있다. 본원에 기술된 서열 정렬 프로그래 및 파라미터에 의해 결정되었을 때, 실시양태의 천연 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 18-39)의 생물학적으로 활성인 변이체, 또는 본원에 기술된 인식 절반-부위 결합 서브유닛의 생물학적으로 활성인 변이체는 천연 폴리펩티드 또는 천연 서브유닛의 아미노산 서열에 대해 적어도 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99%의 서열 동일성을 가질 것이다. 실시양태의 폴리펩티드 또는 서브유닛의 생물학적으로 활성인 변이체는 이러한 폴리펩티드 또는 서브유닛과 적게는 약 1-40개의 아미노산 잔기, 적게는 약 1-20개, 적게는 약 1-10개, 적게는 약 5개, 적게는 4, 3, 2, 또는 심지어 1개의 아미노산 잔기만큼 상이할 수 있다.
실시양태의 폴리펩티드는 아미노산 치환, 결실, 말단절단 및 삽입을 포함하는 다양한 방식으로 변경될 수 있다. 이러한 조작 방법은 관련 기술분야에 일반적으로 공지되어 있다. 예를 들어, DNA에서의 돌연변이에 의해 아미노산 서열 변이체가 제조될 수 있다. 돌연변이유발 및 폴리뉴클레오티드 변경을 위한 방법이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492]; [Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382]; 미국 특허 번호 4,873,192; [Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다. 관심 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 적합한 아미노산 치환에 관한 지침을 본원에 참조로 포함된 문헌 [Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)]의 모델에서 확인할 수 있다. 보존적 치환, 예컨대 하나의 아미노산을 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 교환하는 것이 최적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조작된 메가뉴클레아제는 본원에 개시된 HVR1 및 HVR2 영역의 변이체를 포함할 수 있다. 모체 HVR 영역은, 예를 들어, 예시된 조작된 메가뉴클레아제의 잔기 24-79 또는 잔기 215-270을 포함할 수 있다. 따라서, 변이체 HVR은 본원에 예시된 조작된 메가뉴클레아제의 잔기 24-79 또는 잔기 215-270에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있어, 변이체 HVR 영역이 조작된 메가뉴클레아제의 생물학적 활성 (즉, 인식 서열에 결합하고 그를 절단함)을 유지한다. 추가로, 본 발명의 일부 실시양태에서, 변이체 HVR1 영역 또는 변이체 HVR2 영역은 모체 HVR 내의 특정 위치에서 발견되는 아미노산 잔기에 상응하는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 문맥에서, "에 상응하는"은 변이체 HVR 내의 아미노산 잔기가 모체 HVR 서열 내에 같은 관련된 위치에 (즉, 모체 서열 내의 나머지 아미노산들과 관련하여) 존재하는 것과 같은 아미노산 잔기 (즉, 별개의 동일한 잔기)라는 것을 의미한다. 예를 들어, 모체 HVR 서열이 위치 26에 세린 잔기를 포함하면, 잔기 26"에 상응하는 잔기를 포함하는" 변이체 HVR이 또한 모체 위치 26에 관련되는 위치에 세린을 포함할 것이다.
야생형 I-CreI 메가뉴클레아제의 DNA 인식 도메인에 대한 실질적인 개수의 아미노산 변형이 기존에 확인된 바 있고 (예를 들어, U.S. 8,021,867), 이는, 단독으로 또는 조합되어, 생성된 합리적으로 설계된 메가뉴클레아제가 야생형 효소와 상이한 절반-부위 특이성을 갖도록, DNA 인식 서열 절반-부위 내의 개별적인 염기에서 변경된 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제를 초래한다. 표 5는 인식 절반-부위의 각각의 절반-부위 위치 (-1 내지 -9)에 존재하는 염기를 기초로 특이성을 강화하도록 조작된 메가뉴클레아제 단량체 또는 서브유닛에서 이루어질 수 있는 잠재적인 치환을 제공한다.
표 5.
폴리뉴클레오티드의 경우, "변이체"는 천연 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 부위에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실 및/또는 부가를 포함한다. 관련 기술의 기술자는 오픈 리딩 프레임이 유지되도록 실시양태의 핵산의 변이체가 구축될 것임을 인지할 것이다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 보존적 변이체는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 실시양태의 폴리펩티드 중 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 변이체 폴리뉴클레오티드는 합성으로 유도된 폴리뉴클레오티드, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발을 사용하여 예를 들어 생성되었지만, 실시양태의 조작된 메가뉴클레아제를 여전히 코딩하는 것을 포함한다. 일반적으로, 본원의 다른 곳에 기술된 서열 정렬 프로그램 및 파라미터에 의해 결정되었을 때, 실시양태의 특정 폴리뉴클레오티드의 변이체는 특정 폴리뉴클레오티드에 대해 적어도 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 가질 것이다. 실시양태의 특정 폴리뉴클레오티드 (즉, 기준 폴리뉴클레오티드)의 변이체는 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드와 기준 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드 사이의 퍼센트 서열 동일성의 비교에 의해 또한 평가될 수 있다.
본원에 포함되는 단백질 서열의 결실, 삽입, 및 치환은 폴리펩티드의 특징에서 과격한 변화를 일으킬 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 치환, 결실 또는 삽입의 정확한 효과를 사전에 예측하는 것이 어려운 경우, 관련 기술분야의 기술자는 폴리펩티드를 B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 ORF 내의 인식 서열을 우선적으로 인식 및 절단하는 그의 능력에 대해 스크리닝함으로써 효과가 평가될 것임을 이해할 것이다.
실시예
본 발명이 제한적인 것으로 해석되지 않아야 하는 하기의 실시예에 의해 추가로 설명된다. 관련 기술분야의 기술자는, 일상적일 뿐인 실험을 사용하여, 본원에 기술된 특정 물질 및 절차에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 실시예에 이어지는 청구범위의 범주 내에 포함되도록 의도된다.
실시예 1
HBV 인식 서열을 인식 및 절단하는 메가뉴클레아제의 특성화
HBV 1-2 인식 서열을 인식 및 절단하는 메가뉴클레아제
유전자형 A, B, C, E, F, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-5 및 7-9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 P 단백질, S, 프리S2/S, 및 프리S1/프리S2 ORF 내에 위치하는 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10)을 인식 및 절단하도록 본원에서 "HBV 1-2 메가뉴클레아제"로 총괄적으로 지칭되는 조작된 메가뉴클레아제 (서열식별번호: 18-21)를 조작하였다. 각각의 HBV 1-2 조작된 메가뉴클레아제는 SV40으로부터 유래된 N-말단 뉴클레아제-국소화 신호, 제1 메가뉴클레아제 서브유닛, 링커 서열, 및 제2 메가뉴클레아제 서브유닛을 포함한다. 각각의 HBV 1-2 메가뉴클레아제 내의 제1 서브유닛은 서열식별번호: 10의 HBV1 인식 절반-부위에 결합하는 한편, 제2 서브유닛은 HBV2 인식 절반-부위에 결합한다 (도 2 참조).
HBV1-결합 서브유닛 및 HBV2-결합 서브유닛 각각은 HVR1 및 HVR2로 각각 지칭되는 염기쌍 56개의 초가변 영역을 포함한다. HBV1-결합 서브유닛은 HVR1 영역 외부에서 고도로 보존된다. 유사하게, HBV2-결합 서브유닛이 또한 HVR2 영역 외부에서 고도로 보존된다. 서열식별번호: 18-21의 HBV1-결합 영역은 각각 서열식별번호: 40-43으로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 40-43은 메가뉴클레아제 HBV 1-2x.2 (서열식별번호: 18)의 HBV1-결합 영역인 서열식별번호: 40에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다. 서열식별번호: 18-21의 HBV2-결합 영역은 각각 서열식별번호: 44-47로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 44-47은 메가뉴클레아제 HBV 1-2x.2 (서열식별번호: 18)의 HBV2-결합 영역인 서열식별번호: 44에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다.
HBV 5-6 인식 서열을 인식 및 절단하는 메가뉴클레아제
유전자형 A, B, C, D, E, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-7 및 9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 P 단백질, S, 프리S2/S, 및 프리S1/프리S2 ORF 내에 위치하는 HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12)을 인식 및 절단하도록 본원에서 "HBV 5-6 메가뉴클레아제"로 총괄적으로 지칭되는 조작된 메가뉴클레아제 (서열식별번호: 22-28)를 조작하였다. 각각의 HBV 5-6 조작된 메가뉴클레아제는 SV40으로부터 유래된 N-말단 뉴클레아제-국소화 신호, 제1 메가뉴클레아제 서브유닛, 링커 서열, 및 제2 메가뉴클레아제 서브유닛을 포함한다. 각각의 HBV 5-6 메가뉴클레아제 내의 제1 서브유닛은 서열식별번호: 12의 HBV5 인식 절반-부위에 결합하는 한편, 제2 서브유닛은 HBV6 인식 절반-부위에 결합한다 (도 2 참조).
HBV5-결합 서브유닛 및 HBV6-결합 서브유닛 각각은 HVR1 및 HVR2로 각각 지칭되는 염기쌍 56개의 초가변 영역을 포함한다. HBV5-결합 서브유닛은 HVR1 영역 외부에서 고도로 보존된다. 유사하게, HBV6-결합 서브유닛이 또한 HVR2 영역 외부에서 고도로 보존된다. 서열식별번호: 22-28의 HBV5-결합 영역은 각각 서열식별번호: 48-54로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 48-54는 메가뉴클레아제 HBV 5-6x.33 (서열식별번호: 22)의 HBV5-결합 영역인 서열식별번호: 49에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다. 서열식별번호: 22-28의 HBV6-결합 영역은 각각 서열식별번호: 55-61로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 55-61은 메가뉴클레아제 HBV 5-6x.33 (서열식별번호: 22)의 HBV5-결합 영역인 서열식별번호: 55에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다.
HBV 7-8 인식 서열을 인식 및 절단하는 메가뉴클레아제
유전자형 A, B, C, D, F, 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-6, 8, 및 9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 P 단백질 ORF 내에 위치하는 HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 14)을 인식 및 절단하도록 본원에서 "HBV 7-8 메가뉴클레아제"로 총괄적으로 지칭되는 조작된 메가뉴클레아제 (서열식별번호: 29-32)를 조작하였다. 각각의 HBV 7-8 조작된 메가뉴클레아제는 SV40으로부터 유래된 N-말단 뉴클레아제-국소화 신호, 제1 메가뉴클레아제 서브유닛, 링커 서열, 및 제2 메가뉴클레아제 서브유닛을 포함한다. 각각의 HBV 7-8 메가뉴클레아제 내의 제1 서브유닛은 서열식별번호: 14의 HBV7 인식 절반-부위에 결합하는 한편, 제2 서브유닛은 HBV8 인식 절반-부위에 결합한다 (도 2 참조).
HBV7-결합 서브유닛 및 HBV8-결합 서브유닛 각각은 HVR1 및 HVR2로 각각 지칭되는 염기쌍 56개의 초가변 영역을 포함한다. HBV7-결합 서브유닛은 HVR1 영역 외부에서 고도로 보존된다. 유사하게, HBV8-결합 서브유닛이 또한 HVR2 영역 외부에서 고도로 보존된다. 서열식별번호: 29-32의 HBV7-결합 영역은 각각 서열식별번호: 62-65로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 62-65는 메가뉴클레아제 HBV 7-8x.2 (서열식별번호: 29)의 HBV7-결합 영역인 서열식별번호: 62에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다. 서열식별번호: 29-32의 HBV8-결합 영역은 각각 서열식별번호: 66-69로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 66-69는 메가뉴클레아제 HBV 7-8x.2 (서열식별번호: 29)의 HBV8-결합 영역인 서열식별번호: 66에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다.
HBV 11-12 인식 서열을 인식 및 절단하는 메가뉴클레아제
유전자형 A, B, C, D, E, F 및 G (예를 들어, 각각 서열식별번호: 3-9)를 포함하는 다중 HBV 유전자형의 P 단백질 ORF 내에 위치하는 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)을 인식 및 절단하도록 본원에서 "HBV 11-12 메가뉴클레아제"로 총괄적으로 지칭되는 조작된 메가뉴클레아제 (서열식별번호: 33-39)를 조작하였다. 각각의 HBV 11-12 조작된 메가뉴클레아제는 SV40으로부터 유래된 N-말단 뉴클레아제-국소화 신호, 제1 메가뉴클레아제 서브유닛, 링커 서열, 및 제2 메가뉴클레아제 서브유닛을 포함한다. 각각의 HBV 11-12 메가뉴클레아제 내의 제1 서브유닛은 서열식별번호: 16의 HBV11 인식 절반-부위에 결합하는 한편, 제2 서브유닛은 HBV12 인식 절반-부위에 결합한다 (도 2 참조).
HBV11-결합 서브유닛 및 HBV12-결합 서브유닛 각각은 HVR1 및 HVR2로 각각 지칭되는 염기쌍 56개의 초가변 영역을 포함한다. HBV11-결합 서브유닛은 HVR1 영역 외부에서 고도로 보존된다. 유사하게, HBV12-결합 서브유닛이 또한 HVR2 영역 외부에서 고도로 보존된다. 서열식별번호: 33-39의 HBV11-결합 영역은 각각 서열식별번호: 70-76으로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 70-76은 메가뉴클레아제 HBV 11-12x.26 (서열식별번호: 33)의 HBV11-결합 영역인 서열식별번호: 70에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다. 서열식별번호: 33-39의 HBV12-결합 영역은 각각 서열식별번호: 77-83으로서 제공된다. 각각의 서열식별번호: 77-83은 메가뉴클레아제 HBV 11-12x.26 (서열식별번호: 33)의 HBV12-결합 영역인 서열식별번호: 77에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 공유한다.
CHO 세포 리포터 검정법에서의 HBV 인식 서열의 절단
HBV 1-2, HBV 5-6, HBV 7-8, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제가 이들 각각의 인식 서열 (각각 서열식별번호: 10, 12, 14, 및 16)을 인식 및 절단할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 각각의 조작된 메가뉴클레아제를 기존에 기술된 CHO 세포 리포터 검정법을 사용하여 평가하였다 (WO/2012/167192 및 도 6 참조). 검정법을 수행하기 위해, 세포의 게놈 내로 통합된 비-기능성 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 발현 카세트를 보유하는 CHO 리포터 세포주가 생산되었다. 각각의 세포주 내의 GFP 유전자가 한 쌍의 인식 서열에 의해 중단되어, 메가뉴클레아제에 의한 인식 서열의 세포내 절단이 기능성 GFP 유전자를 초래하는 상동 재조합 이벤트를 자극하였을 것이다.
이러한 연구를 위해 개발된 CHO 리포터 세포주에서, GFP 유전자 내로 삽입된 하나의 인식 서열은 HBV 1-2 인식 서열 (서열식별번호: 10), HBV 5-6 인식 서열 (서열식별번호: 12), HBV 7-8 인식 서열 (서열식별번호: 12), 및 HBV 11-12 인식 서열 (서열식별번호: 16)이었다. GFP 유전자 내로 삽입된 제2 인식 서열은 CHO-23/24 인식 서열이었고, 이는 "CHO-23/24"로 칭해지는 대조군 메가뉴클레아제에 의해 인식 및 절단된다. HBV 1-2 인식 서열 및 CHO-23/24 인식 서열을 포함하는 CHO 리포터 세포는 "HBV 1-2 세포"로 지칭된다. HBV 5-6 인식 서열 및 CHO-23/24 인식 서열을 포함하는 CHO 리포터 세포는 "HBV 5-6 세포"로 지칭된다. HBV 7-8 인식 서열 및 CHO-23/24 인식 서열을 포함하는 CHO 리포터 세포는 "HBV 7-8 세포"로 지칭된다. HBV 11-12 인식 서열 및 CHO-23/24 인식 서열을 포함하는 CHO 리포터 세포는 "HBV 11-12 세포"로 지칭된다.
CHO 리포터 세포를 그의 상응하는 조작된 메가뉴클레아제 (예를 들어, HBV 1-2 세포는 HBV 1-2 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질감염되었음)를 코딩하거나 또는 CHO-23/34 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다. 각각의 검정법에서, 4e5개의 CHO 리포터 세포가 제조사의 설명서에 따라 리포펙타민 2000 (써모피셔(ThermoFisher))을 사용하여 96-웰 플레이트에서 50 ng의 플라스미드 DNA로 형질감염되었다. 형질감염 48시간 후, 세포를 유동 세포측정법에 의해 평가하여, 형질감염되지 않은 음성 대조군 (HBV bs)에 비교된 GFP-양성 세포의 백분율을 결정하였다. 도 7a-7d에 제시된 바와 같이, 모든 HBV 메가뉴클레아제가 그의 상응하는 인식 서열을 포함하는 세포주에서 음성 대조군을 유의하게 초과하는 빈도로 GFP-양성 세포를 생산하는 것으로 발견되었다.
HBV 1-2, HBV 5-6, HBV 7-8, 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제의 효능을 메가뉴클레아제를 CHO 리포터 세포 내로 도입하고 나서 2, 5, 7, 9, 및 12일 후에 시간-의존적 방식으로 또한 결정하였다. 이러한 연구에서, HBV 1-2, HBV 5-6, HBV 7-8, 또는 HB 11-12 세포 (1.0x106)에 제조사의 설명서에 따라 바이오래드 진 펄서 엑스셀(BioRad Gene Pulser Xcell)을 사용하여 세포당 1x106개의 카피의 메가뉴클레아제 mRNA를 전기천공시켰다. 형질감염 후의 지정된 시점에, 세포를 유동 세포측정법에 의해 평가하여, GFP-양성 세포의 백분율을 결정하였다. 각각의 시점에 양성 대조군으로서 CHO-23/24 메가뉴클레아제가 또한 포함되었다.
도 8a-8d에 제시된 바와 같이, 시간에 따라 상이한 HBV 메가뉴클레아제에 의해 생산된 %GFP가 변하였다. HBV 5-6 및 HBV 11-12 메가뉴클레아제는 12일의 분석 기간에 걸쳐 실질적으로 일관된 반면 (도 8b 및 8d), HBV 1-2 및 HBV 7-8 메가뉴클레아제는 초기 시점에 높은 수준의 GFP-양성 세포를 생산하였고, 이는 실험 과정 동안 감소하였다.
결론
이러한 연구는 본 발명에 의해 포함되는 HBV 메가뉴클레아제가 세포 내의 그의 각각의 인식 서열을 효율적으로 표적화 및 절단할 수 있다는 것과 이러한 효과가 경시적으로 일관적이거나 또는 일시적일 수 있다는 것을 실연하였다.
실시예 2
HBV-특이적 뉴클레아제가 이. 콜라이에서 플라스미드 DNA를 제거한다
에피솜 DNA를 이용하는 박테리아 리포터 시스템
이러한 실험의 목적은 본 발명의 HBV 메가뉴클레아제를 이. 콜라이 리포터 시스템 내의 에피솜 DNA 플라스미드 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 그의 능력에 대해 평가하는 것이었다. ARCUS 뉴클레아제의 유도성 발현을 구동시키도록 "pARCUS"로 칭해지는 플라스미드가 생성되었다 (도 9a). pARCUS에서, ARCUS 뉴클레아제 (여기서는, HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x)가 IPTG-유도성 프로모터의 제어 하에 놓인다. 추가적으로, 형질전환된 박테리아의 선별을 허용하기 위해, pARCUS는 암피실린 저항성 유전자를 코딩한다. pARCUS는 저 카피 플라스미드여서, ARCUS 뉴클레아제의 유도된 발현이 과발현을 초래하지 않는다.
"pHBVa"로 칭해지는 추가적인 플라스미드가 생성되었다 (도 9a). pHBVa는 HBV 5-6 및 HBV 11-12에 대한 인식 서열을 포함하는 HBV 게놈의 대형 단편을 보유한다. 이러한 플라스미드는 카나마이신 저항성 유전자 및 SacB 유전자를 또한 코딩한다. 카나마이신 저항성 유전자는 형질전환된 박테리아의 선별을 허용하고, SacB 유전자는 수크로스의 존재 하에 활성인 독소이다. 따라서, pHBVa로 형질전환된 박테리아는 배지 내의 카나마이신의 존재 하에 생존할 것이지만, 카나마이신 및 수크로스의 존재 하에서는 생존하지 않을 것이다. pHBVa는 HBV 게놈의 다수의 카피가 있을 수 있는 HBV-감염된 세포를 복제시키려는 시도로 고 카피 플라스미드이도록 설계되었다. 중요하게, pHBVa는 pARCUS와 상이한 복제 기원을 이용하여, 양쪽 플라스미드로의 박테리아의 공동-형질전환을 허용한다.
박테리아가 이러한 플라스미드로 공동-형질전환되고, 다양한 조합의 선별 압력 (암피실린, 카나마이신, 또는 수크로스)을 함유하는 배지에서 성장되는 경우, 다수의 가능한 결과가 있다. pARCUS로 형질전환되고 암피실린의 존재 하에 성장된 박테리아는 pARCUS 플라스미드를 보유할 것이지만, 성장 배지에 IPTG가 공급되지 않는 한 코딩된 뉴클레아제를 발현하지 않을 것이다. IPTG로 유도된 경우에, 코딩된 뉴클레아제가 발현될 것이다. pHBVa로 형질전환된 박테리아는 카나마이신의 존재 하에 성장할 것이지만, 카나마이신 및 수크로스의 존재 하에서는 그렇지 않을 것이다. 암피실린 및/또는 카나마이신의 존재 하에 pARCUS 및 pHBVa로 공동-형질전환된 박테리아는 수크로스에 대해 민감성일 것이다. pARCUS 및 pHBV로 공동-형질전환된 박테리아에서, IPTG로의 ARCUS 뉴클레아제 유도가 뉴클레아제의 발현을 초래할 것이고, 그 후, 이는 pHBVa 상에 코딩된 표적 부위를 절단할 수 있다. 이러한 부위에서의 절단은 pHBVa 플라스미드의 선형화를 초래할 것으로 예상되었고, 이는 박테리아 뉴클레아제에 의해 신속하게 분해될 것이다. pHBV 플라스미드의 분해는 2가지 결과를 초래할 것이다: 박테리아가 카나마이신에 대한 저항성을 상실할 것이지만, 수크로스의 존재 하에 생존할 수 있을 것이다.
공동-형질전환의 결과를 테스트하기 위해, 박테리아를 (전기천공에 의해) pARCUS 및 pHBVa로 공동-형질전환시키고, 암피실린의 존재 하에 3시간 동안 배양한 후 플레이팅하였다. 병행 배양물에서, 공동-형질전환된 세포를 IPTG로 처리하여 (3시간), 뉴클레아제 발현을 유도하고, pHBVa의 절단을 허용하였다. 그 후, 암피실린, 암피실린 및 수크로스, 또는 암피실린 및 카나마이신의 존재 하에 세포를 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 철야로 인큐베이션하고, 콜로니를 카운팅하여 박테리아 생존을 평가하였다.
결과
각각의 선별 플레이트 상에 존재하는 콜로니의 개수가 ARCUS 뉴클레아제가 pHBVa 플라스미드를 절단하는 능력의 극적인 증거를 제공하였다. 대조군 암피실린 플레이트 상에서는, 비-유도된 배양물 또는 IPTG-유도된 배양물로부터의 콜로니의 개수가 pHBVa 및 어느 하나의 pARCUS 플라스미드로 공동-형질전환된 세포에 대해 등가였다 (도 9b). HBV 5-6x.33을 코딩하는 pARCUS가 공동-형질전환된 박테리아와 HBV 11-12x.26을 코딩하는 pARCUS가 공동-형질전환된 박테리아 사이에 콜로니 개수의 차이가 있었지만, 이는 아마도 형질전환 효율을 반영할 것이다.
뚜렷하게 대조적으로, 암피실린 및 수크로스 둘 다를 함유하는 플레이트 상의 IPTG로 유도되지 않은 배양물로부터의 콜로니의 개수가 극적으로 감소하였고, 이는 SacB 유전자가 수크로스가 이용가능하였을 때 세포를 사멸시키는데 효과적이었음을 가리킨다 (도 9b). 그러나, IPTG로 유도된 배양물이 암피실린 및 수크로스 둘 다를 함유하는 플레이트 상에서 꽤 잘 성장하였고, 이는 SacB 유전자의 제거를 가리킨다. pHBVa 및 HBV 11-12x.26을 코딩하는 pARCUS로 공동-형질감염된 (그러나 IPTG로 유도되지 않은) 박테리아에 대한 콜로니 카운트는 암피실린 대조군 플레이트 상에서와 동일하였고, pARCUS 5-6x.33으로 공동-형질전환된 박테리아는 대조군 플레이트에 비교하여 단지 약간만 감소되었다.
IPTG로 유도되지 않은 배양물이 암피실린 및 카나마이신 둘 다를 함유하는 플레이트 상에서 성장하였다 (도 9b). HBV 11-12x.26을 코딩하는 pARCUS로 공동-형질전환된 박테리아로부터의 콜로니 카운트는 대조군 암피실린-단독 플레이트와 대략적으로 등가였고, pARCUS HBV 5-6x.33으로 공동-형질전환된 세포는 대조군에 비교하여 단지 약간만 감소되었다. 그러나, IPTG-유도된 세포가 암피실린 및 카나마이신을 함유하는 플레이트 상에서 성장되었을 때, 콜로니 카운트가 0에 가까웠고, 이는 카나마이신 저항성 유전자를 보유하는 플라스미드의 제거를 가리킨다 (도 9b).
결론
이러한 데이터는 HBV 게놈 내의 부위를 인식하는 본 발명의 HBV 메가뉴클레아제가 pHBVa 플라스미드를 절단하여 pHBVa 플라스미드의 제거를 초래할 수 있다는 것을 명확하게 실연한다. IPTG-유도된 배양물에서, 세포가 수크로스의 존재 하에 성장하였고, 이는 SacB-함유 플라스미드의 효율적인 제거를 가리킨다. 유사하게, IPTG-유도된 배양물에서, 세포가 카나마이신의 존재 하에 사멸하였고, 이는 pHBVa 플라스미드의 파괴를 또한 강력하게 가리킨다. HBV cccDNA를 절단하는 본 발명의 HBV 메가뉴클레아제를 사용하여, 유사한 결과가 HBV-감염된 포유동물 세포에서 발생할 수 있는 것이 가능하다. 박테리아에서, 선형 DNA는 신속하게 제거된다. 포유동물 세포 내의 선형화된 cccDNA가 세포 뉴클레아제에 의해 또한 소화될 것으로 생각할 수 있다. 절단이 cccDNA의 선형화 및 제거에 이르지 않더라도, HBV ARCUS 뉴클레아제에 의해 야기된 indel 돌연변이가 코딩 영역을 파괴하고 cccDNA가 기능성 HBV 단백질을 생산할 수 없게 할 가능성이 있다. 따라서, HBV 게놈 내의 부위를 표적화하는 본 발명의 메가뉴클레아제는 HBV cccDNA를 제거하거나 또는 불활성화시키는 효과적인 방법일 것이다.
실시예 3
세포 내의 HBV 바이러스 게놈의 표적화
HBV 게놈을 발현하는 AD38 세포의 처리
이러한 실시예의 1차 목적은 본 발명의 메가뉴클레아제가 HBV-감염된 포유동물 세포 내의 HBV 게놈을 불활성화 및/또는 제거할 수 있었는지 여부를 평가하는 것이었다.
1차 연구에서, 메가뉴클레아제 유효성을 Tet 프로모터 하에 HBV 게놈을 안정적으로 발현하는 AD38 세포주에서 평가하였다. 이러한 AD38 세포주는 활성 바이러스 입자를 생성시키지 않지만, 세포 배지에서 검출가능한 HBV S 항원 (HBsAg)을 생성시킨다. 이러한 연구에서, 세포를 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26을 코딩하는 DNA 플라스미드로 형질감염시켰다. HBV 5-6x.33은 중첩된 S (HBsAg 유전자) 및 P (폴리머라제 유전자) 리딩 프레임 내의 서열을 표적화하고, HBV 11-12x.26은 P 유전자를 표적화하여, 이러한 조작된 메가뉴클레아제 둘 다가 HBV 게놈에 대해 특이적인 서열을 표적화한다. 대조군으로서, AD38 세포를 적색 형광 단백질 (RFP) 유전자를 코딩하는 플라스미드로 형질감염시켰다. 세포를 시딩하고, 24시간 후에 리포솜-기반 형질감염 프로토콜을 사용하여 플라스미드로 형질감염시켰다. 형질감염 24시간 후, AD38 세포를 세정하여 잔여 리포솜 복합체를 제거하였다. 형질감염 후 제3일 및 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다.
결과
형질감염 후 제3일 및 제7일에 RFP-형질감염 AD38 세포의 상청액 내에 존재하는 HBsAg의 양에 대해 ELISA 데이터를 정규화하였다. 형질감염 후 제3일에, HBV 11-12x.26을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포가 RFP-형질감염 세포에 비교하여 상청액에서 약 25% 더 적은 HBsAg를 제시하였다 (도 10). 동일한 시점에, HBV 5-6x.33을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포는 RFP-형질감염 세포에 비교하여 상청액에서 약 50% 더 적은 HBsAg를 제시하였다 (도 10). 형질감염되지 않은 대조군 세포는 RFP-형질감염 세포와 본질적으로 동일하였다. HBsAg 감소는 형질감염 후 제7일에 더욱 더 명백하였다. HBV 11-12x.26으로 형질감염된 AD38 세포는 RFP로 형질감염된 세포보다 약 50% 더 낮은 HBsAg 수준을 제시하였고, HBV 5-6x.33으로 형질감염된 세포는 RFP 대조군보다 수준이 약 75% 더 낮았다 (도 10). 형질감염 후 제7일에, RFP로 형질감염된 세포는 형질감염되지 않은 세포에 비교하여 상청액 내의 HBsAg가 유의하게 더 적었고, 이는 형질감염 프로세스가 세포가 HBsAg를 생산하는 능력에 부정적인 영향을 미쳤다는 것을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 이러한 영향은 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 세포에서 훨씬 더 뚜렷하였고, 이는 상청액 HBsAg 수준의 감소가 메가뉴클레아제 활성에 기인하였음을 강하게 시사한다.
결론
이러한 데이터는 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 AD38 세포가 형질감염되지 않은 세포 또는 RFP 리포터 유전자로 형질감염된 세포에 비교하여 상청액 내의 HBsAg의 극적인 감소를 나타낸다는 것을 실연한다. HBV 메가뉴클레아제 중 어느 하나로 형질감염된 세포에서의 상청액 HBsAg 수준의 감소는 감소가 AD38 세포 내의 HBV 게놈에 대한 메가뉴클레아제 활성에 기인한다는 것을 강하게 시사한다.
실시예 4
세포 내의 HBV 바이러스 게놈 표적화
HBV 게놈을 발현하는 AD38 세포의 처리
상기 실시예 3의 연구는 HBV 게놈-발현 AD38 세포주로부터의 HBsAg 분비를 감소시키는 것에서의 메가뉴클레아제 유효성을 실연한다. 플라스미드 형질감염 대신 렌티바이러스 전달을 사용하여 HBsAg 분비의 더 큰 감소가 달성될 수 있는지를 결정하기 위해, 이러한 연구를 HBV11-12x.26 및 HBV5-6x.33 메가뉴클레아제를 개별적으로 또는 조합하여 사용하여 렌티바이러스 전달로 반복하였다.
RFP, HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, AD38 세포에 형질도입하여 HBsAg 생산에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. AD38 세포를 시딩하고, 24시간 후에 RFP, HBV 5-6x.33, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스, 또는 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입하였다. 1, 2, 또는 4의 MOI로 단일 렌티바이러스를 세포에 형질도입하였다. HBV 메가뉴클레아제-코딩 렌티바이러스의 1:1 혼합물이 형질도입되는 세포는 2 및 4의 총 MOI로 형질도입하였다. 형질도입된 세포 상의 배지를 형질도입 후 제1일 및 제3일에 교환하였다. 형질도입 후 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다.
결과
형질감염 후 제7일에 RFP-형질도입 AD38 세포의 상청액 내에 존재하는 HBsAg의 양에 대해 ELISA 데이터를 정규화하였다. MOI 1에서, HBV 5-6x.33이 형질도입된 AD38 세포는 RFP-발현 렌티바이러스가 형질도입된 AD38 세포보다 약 60% 더 적은 상청액 내의 HBsAg를 제시하였다 (도 11). 또한 MOI 1에서, HBV 11-12x.26은 RFP보다 약 40% 더 적은 HBsAg를 제시하였다. 더 높은 MOI에서, HBV 메가뉴클레아제의 영향이 더욱 뚜렷하였다. MOI 2에서, HBV 5-6x.33을 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포는 RFP-형질도입 세포에 비교하여 약 80%의 HBsAg 감소를 제시하였고, MOI 4에서는, 비교하여 감소가 약 90%였다. 유사하게, MOI 2에서, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포는 RFP-형질도입 세포보다 약 70% 더 적은 HBsAg를 제시하였고, MOI 4에서는 HBsAg가 약 80%만큼 더 낮았다. 마지막으로, HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물이 형질도입된 세포 또한 RFP-형질도입 대조군 세포에 비교하여 극적으로 감소된 수준의 상청액 내의 HBsAg를 제시하였다 (도 11). 2의 총 MOI에서, HBV-발현 렌티바이러스는 HBsAg 발현을 약 80%만큼 감소시켰고, 4의 총 MOI에서는 발현이 약 90%만큼 감소되었다.
결론
이러한 데이터는 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26 중 어느 하나를 코딩하는 렌티바이러스 또는 둘 다의 조합이 형질도입된 AD38 세포가 RFP를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포에 비교하여 상청액 내의 HBsAg의 극적인 감소를 제시한다는 것을 실연한다. HBV 메가뉴클레아제 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포에서의 상청액 HBsAg 수준의 감소는 감소가 AD38 세포 내의 HBV 게놈에 대한 메가뉴클레아제 활성에 기인한다는 것을 강하게 시사한다. 추가로, 이러한 데이터는 HBV 메가뉴클레아제의 공동-발현이 HBsAg의 발현을 효과적으로 감소시킨다는 것을 실연하고, 이는 공동-발현된 메가뉴클레아제가 HBV 게놈을 효과적으로 할 수 있다는 것을 강하게 시사한다.
실시예 5
세포 내의 HBV 바이러스 게놈의 표적화
HBV 게놈을 발현하는 AD38 세포의 처리
추가 연구에서, HBsAg 분비, 세포 배양 배지 내에 존재하는 HBV DNA 카피, 및 세포내 HBV cccDNA 카피에 대한 메가뉴클레아제 처리의 효과를 관찰하기 위해 AD38 세포에 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하였다.
상기 실시예 4와 유사하게, RFP (LV212), HBV 5-6x.33 (LV224), 또는 HBV 11-12x.26 (LV225)을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, AD38 세포에 형질도입하여 각각의 실험 결과에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. AD38 세포를 테트라시클린의 존재 하에 시딩하고, 24시간 후에 RFP, HBV 5-6x.33, 또는 HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스를 MOI 4로 형질도입하였다. 형질도입된 세포 상의 배지를 형질도입 24시간 후에 교환하였다. 형질도입 후 제7일에, 세포 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 HBsAg의 존재에 대해 검정하였다. 5 μL의 세포 배양물당 세포외 HBV DNA의 카피를 정량적 PCR에 의해 결정하였다. 세포 용해물을 수득하고, 5 μL의 세포 용해물당 HBV cccDNA의 세포내 카피를 정량적 PCR에 의해 결정하였다.
결과
MOI 4에서, HBV 5-6x.33 및 HBV 11-12x.26이 형질도입된 AD38 세포는 형질도입 후 제7일에 RFP-발현 렌티바이러스가 형질도입된 AD38 세포보다 각각 약 58% 및 25% 더 적은 세포 배양 배지 내의 HBsAg를 제시하였다 (도 12a). 세포외 HBV DNA 카피수가 또한 HBV 5-6x.33 및 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제의 형질도입에 의해 RFP-발현 렌티바이러스의 형질도입에 비교했을 때 각각 약 28% 및 50%만큼 감소되었다 (도 12b). 마지막으로, 세포내 HBV cccDNA 카피수 또한 HBV 5-6x.33 및 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제의 형질도입에 의해 RFP-발현 렌티바이러스의 형질도입에 비교했을 때 각각 약 71% 및 60%만큼 감소되었다 (도 12c).
결론
이러한 데이터는 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 AD38 세포가 RFP를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포에 비교하여 상청액 내의 HBsAg의 극적인 감소를 제시한다는 것을 추가로 실연한다. 추가적으로, 이러한 데이터는 본 발명의 HBV 메가뉴클레아제가 또한 세포외 HBV DNA 카피수를 감소시키고, 중요하게, HBV cccDNA의 세포내 카피수를 유의하게 감소시킨다는 것을 실연한다.
실시예 6
HBV-감염된 1차 인간 간세포의 처리
HBV-감염된 1차 인간 간세포의 처리
상기 실시예에서의 연구는 HBV 게놈-발현 AD38 세포주로부터의 HBsAg 분비를 감소시키는 것에서의 메가뉴클레아제 유효성을 실연한다. 본 실시예의 연구는 HBV-감염된 1차 인간 간세포에서의 본 발명의 HBV 메가뉴클레아제의 유효성을 결정하기 위해 수행되었다.
RFP, HBV 5-6x.33, 또는 HBV 11-12x.26을 발현하는 렌티바이러스를 생성시키고, HBV-감염된 1차 인간 간세포에 형질도입하여 HBsAg 및 HBeAg 생산에 대한 메가뉴클레아제의 영향을 결정하였다. 간략하게, 1차 인간 간세포를 시딩하고, 24시간 후에 HBV로 감염시켰다. 감염 후 제1일에, 세포를 세정하고, 24시간 후 (감염 후 제2일)에 RFP, HBV 5-6x.33, HBV 11-12x.26을 코딩하는 렌티바이러스, 또는 HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입하였다. 추가적인 대조군으로서, 감염된 세포를 DMSO로 처리하였다. 형질도입 후 제4일, 제8일, 제11일 및 제13일에, 세포 상청액을 수확하고, 배지를 교체하였다. 각각의 시점에, ELISA에 의해 세포 상청액에서 HBsAg 및 HBeAg를 측정하였다. 감염 후 제13일에 상청액 내의 세포외 DNA를 또한 측정하였다.
결과
렌티바이러스 형질도입이 일반적으로 HBsAg 또는 HBeAg의 분비에 영향을 미쳤는지 여부를 결정하기 위해, RFP-코딩 렌티바이러스가 형질도입된 세포로부터의 세포 상청액을 DMSO로 처리된 세포에 비교하였다 (도 13). HBV-감염된 1차 인간 간세포에 RFP를 코딩하는 렌티바이러스를 형질도입하는 것은 HBsAg 또는 HBeAg의 분비에 대한 영향이 있더라도 미미하였다 (도 13a 및 13b). MOI 5 또는 2.5에서는, HBsAg 수준이 DMSO로 처리된 세포와 동일하고, MOI 1.25에서는, 수수한 감소만 있다 (도 13a). 유사하게, DMSO 처리 세포에 비교했을 때, RFP-렌티바이러스가 형질도입된 세포의 상청액에서의 HBeAg 수준이 1.25, 2.5 또는 5의 MOI에서 수수한 감소만 제시한다 (도 13b). 추가적으로, HBV-감염된 1차 인간 간세포의 상청액에서 검출된 세포외 HBV의 양이 DMSO 처리 세포와 RFP-코딩 렌티바이러스가 형질도입된 세포 사이에서 차이를 거의 제시하지 않는다 (도 13c).
렌티바이러스 형질도입이, 일반적으로, 감염된 1차 인간 간세포에서의 HBV 기능에 영향을 미치지 않았다는 것이 제시된 후, HBV 메가뉴클레아제를 코딩하는 렌티바이러스를 RFP 렌티바이러스에 비교하였다. 형질도입 후 제3일, 제8일, 제11일 및 제13일에 RFP가 형질도입된 HBV-감염된 1차 인간 간세포의 상청액 내에 존재하는 HBsAg의 양에 대해 HBsAg ELISA 데이터를 정규화하였다 (도 14). MOI 2.5 및 1.25 둘 다에서, HBV 5-6x.33을 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포가 실험의 시간 과정에 걸쳐 HBsAg의 지속적인 감소를 제시하였고, RFP 대조군에 비교하여 제3일에는 약간 감소된 수준, 제8일까지는 약 50-60%의 감소, 제11일 및 제13일까지는 약 90%의 감소를 제시하였다 (도 14a 및 14b). HBV 11-12x.26이 형질도입된 감염 세포는 MOI 2.5 및 1.25 둘 다에서 유사한 패턴을 제시하였고, 이때 제3일 시점에 더욱 주목할 만한 감소가 있었으며 (약 50% 감소), 여전히 형질도입 후 제11일 및 제13일까지 약 90% 감소를 달성하였다 (도 14a 및 14b). 감염 세포에 HBV 메가뉴클레아제-코딩 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입했을 때, HBsAg의 유사한 감소가 시간 과정에 걸쳐 관찰되었다. MOI 2.5에서, 형질도입 후 제3일에 수준이 약 50%만큼 감소하였고, 감소가 계속되어, 형질도입 후 제11일 및 제13일까지 90%에 도달하였다 (도 14a 및 14b).
형질도입 후 제3일, 제8일, 제11일 및 제13일에 RFP가 형질도입된 HBV-감염된 1차 인간 간세포의 상청액 내에 존재하는 HBeAg의 양에 대해 HBeAg ELISA 데이터를 정규화하였다 (도 14). MOI 2.5 및 1.25 둘 다에서, HBV 5-6x.33을 코딩하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포가 실험의 시간 과정에 걸쳐 HBeAg의 지속적인 감소를 제시하였고, RFP 대조군에 비교하여 제3일에는 약 25%만큼 감소된 수준, 제8일까지는 약 50%의 감소, 제11일 및 제13일까지는 약 90%의 감소를 제시하였다 (도 14c 및 14d). HBV 11-12x.26이 형질도입된 감염 세포는 MOI 2.5 및 1.25 둘 다에서 유사한 패턴을 제시하였고, 이때 제3일 시점에 감소가 유사하였고 (약 30% 감소), 여전히 형질도입 후 제11일 및 제13일까지 HBeAg의 약 90% 감소를 달성하였다 (도 14c 및 14d). 감염 세포에 HBV 메가뉴클레아제-코딩 렌티바이러스의 1:1 혼합물을 형질도입했을 때, HBeAg의 유사한 감소가 시간 과정에 걸쳐 관찰되었다. 2.5 및 1.25의 MOI에서, 형질도입 후 제3일에 수준이 약 50%만큼 감소하였고, 감소가 계속되어, 형질도입 후 제11일 및 제13일까지 90%에 도달하였다 (도 14c 및 14d).
결론
이러한 데이터는 HBV 5-6x.33 또는 HBV 11-12x.26 중 어느 하나를 코딩하는 렌티바이러스 또는 2가지의 조합이 형질도입된 HBV-감염된 1차 인간 간세포가 RFP를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 세포에 비교하여 상청액 내의 HBsAg 및 HBeAg의 극적인 감소를 제시한다는 것을 실연한다. HBV 메가뉴클레아제 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하는 렌티바이러스가 형질도입된 감염 세포에서의 상청액 HBsAg 및 HBeAg 수준의 감소는 감소가 감염성 바이러스에 대한 메가뉴클레아제 활성에 기인한다는 것을 강하게 시사한다.
실시예 7
LNP-캡슐화 뉴클레아제 mRNA의 간으로의 전달
mRNA의 지질 나노입자 내의 캡슐화 및 마우스로의 전달
이러한 연구의 목적은 조작된 메가뉴클레아제를 코딩하는 지질 나노입자 (LNP)-캡슐화 mRNA가 제조되어 생체내에서 투여될 수 있다는 것과 간에서의 유전자 편집이 발생하고 관찰될 수 있다는 것을 실연하는 것이었다.
마우스 간에서 발현되는 마우스 CMP-NeuAc 히드롤라제 (Cmah) 유전자 내의 인식 서열에 대한 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제를 개발하였다. Cmah 메가뉴클레아제를 코딩하는 ARCA-캡핑 mRNA를 트리링크 바이오테크놀러지즈 엘엘씨(TriLink BioTechnologies LLC) (캘리포니아주 샌디에고)에 의해 제조하고, 다양한 비의 이온화가능한 양이온성 지질, PEG 지질 및 콜레스테롤을 각각 포함하는 3개의 상이한 상업적 LNP 제형 내에 캡슐화하였다. LNP-캡슐화 mRNA를 IV 주사에 의해 1.0 mg/kg의 용량으로 CD-1 마우스에 투여하였다. 투여 6일 후에 간을 수확하였다. 장기 수집 전에, 동물에 염수를 관류시켰다. 전체-간 게놈 DNA (gDNA)를 단리하고, Cmah 유전자에서의 삽입/결실 (indel) 돌연변이의 빈도를 T7 엔도뉴클레아제 I (T7E) 검정법 및 심층 시퀀싱을 사용하여 결정하였다. T7E 검정법에서, Cmah 인식 서열을 함유하는 게놈 영역이 PCR 증폭되어, 야생형 및 돌연변이체 증폭 대립유전자의 이질성 혼합물이 초래되었다. PCR 생성물이 변성되고, 천천히 다시 어닐링되게 허용되어, 야생형과 돌연변이체 대립유전자 사이의 헤테로듀플렉스의 형성을 허용하였다. 이러한 헤테로듀플렉스는 미스매치를 절단하는 T7 엔도뉴클레아제 I에 의한 절단에 대해 감수성이다. T7E-절단 생성물이 겔 상에서 가시화되었을 때, 헤테로듀플렉스의 T7E 절단으로 인해 다중 밴드가 존재하는 반면, 야생형 샘플에서는 단일 밴드가 존재한다. 절단 대 미절단 생성물의 비가 뉴클레아제 절단 활성의 수준의 척도를 제공한다.
결과
본 연구의 결과가 도 15에서 제시된다. 레인 1 및 2에 제시된 바와 같이, 루시페라제를 코딩하는 LNP-캡슐화 mRNA가 투여된 대조군 마우스로부터 수득된 gDNA는 Cmah 인식 서열에서의 절단의 증거를 나타내지 않았다. 루시페라제 mRNA-처리 동물에서 관찰된 절단:미절단 비는 mRNA가 투여되지 않은 동물 (레인 8)에서 관찰된 비에 필적하였다. 대조적으로, 각각의 레인 내의 다중 밴드의 존재에 의해 지시되는 바와 같이, 레인 3-7 및 9-18 각각은 Cmah 메가뉴클레아제를 코딩하는 LNP-캡슐화 mRNA가 동물에게 투여되었을 때 Cmah 인식 서열에서의 변형을 실연한다. Cmah 인식 서열에서의 유전자 변형의 백분율을 확인 및 정량하기 위해 각각의 간으로부터 수득된 gDNA 상에서 심층 시퀀싱을 또한 수행하였다. 심층 시퀀싱에 의해 수득된 백분율이 도 15에서 각각의 레인 아래에 %KO로 제시된다. 레인 3-7은 LNP 제형 #1이 투여된 복제 동물에서 3.41% 내지 21.49% 범위의 변형을 제시한다. 레인 9-13은 LNP 제형 #2가 투여된 복제 동물에서 18.4% 내지 23.2% 범위의 변형을 제시한다. 레인 14-18은 LNP 제형 #3이 투여된 복제 동물에서 51.1% 내지 64.8% 범위의 변형을 제시한다.
결론
이러한 연구는 조작된 메가뉴클레아제, 예컨대 본 발명의 HBV-특이적 메가뉴클레아제를 코딩하는 mRNA가 LNP 내에 캡슐화될 수 있고, 생체내에서 표적 간 세포 (즉, 간세포)에 전달될 수 있으며, 게놈 내의 표적화된 인식 서열에서 유전자 편집을 유도할 수 있다는 것을 명확하게 실연한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Precision Biosciences, Inc.
<120> ENGINEERED NUCLEASES SPECIFIC FOR RECOGNITION SEQUENCES IN THE
HEPATITIS B VIRUS GENOME
<130> P1090.70018WO00
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 163
<212> PRT
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<220>
<221> wild-type I-CreI meganuclease
<222> (1)..(163)
<400> 1
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Ile Ala Gln Ile Lys Pro Asn Gln Ser
20 25 30
Tyr Lys Phe Lys His Gln Leu Ser Leu Ala Phe Gln Val Thr Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Val Arg Asp Arg Gly Ser Val Ser Asp Tyr Ile Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Trp Arg Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Pro
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<220>
<221> LAGLIDADG
<222> (1)..(9)
<400> 2
Leu Ala Gly Leu Ile Asp Ala Asp Gly
1 5
<210> 3
<211> 3221
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype A
<222> (1)..(3221)
<400> 3
ttccactgcc ttccaccaag ctctgcagga tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc 60
tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc 120
aatctccgcg aggactgggg accctgtggc gaacatggag aacatcacat caggattcct 180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttcttgttg acaagaatcc tcacaatacc 240
gcagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta gggggatcac ccgtgtgtct 300
tggccaaaat tcgcagtccc caacctccaa tcactcacca acctcctgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcata ttcctcttca tcctgctgct 420
atgcctcatc ttcttattgg ttcttctgga ttatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct 480
aattccagga tcaacaacaa ccagtacggg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca 540
aggcaactct atgtttccct catgttgctg tacaaaacct acggatggaa attgcacctg 600
tattcccatc ccatcgtcct gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcttgg ctcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtttggctt tcagctatat ggatgatgtg gtattggggg ccaagtctgt acagcatcgt 780
gagtcccttt ataccgctgt taccaatttt cttttgtctc tgggtataca tttaaaccct 840
aacaaaacaa aaagatgggg ttattcccta aacttcatgg gttacataat tggaagttgg 900
ggaactttgc cacaggatca tattgtacaa aagatcaaac actgttttag aaaacttcct 960
gttaacaggc ctattgattg gaaagtatgt caaagaattg tgggtctttt gggctttgct 1020
gctccattta cacaatgtgg atatcctgcc ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct 1080
aaacaggctt tcactttctc gccaacttac aaggcctttc taagtaaaca gtacatgaac 1140
ctttaccccg ttgctcggca acggcctggt ctgtgccaag tgtttgctga cgcaaccccc 1200
actggctggg gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctctg 1260
ccgatccata ctgcggaact cctagccgct tgttttgctc gcagccggtc tggagcaaag 1320
ctcatcggaa ctgacaattc tgtcgtcctc tcgcggaaat atacatcgtt tccatggctg 1380
ctaggctgtg ctgccaactg gatccttcgc ggaacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg 1440
ctgaatcccg cggacgaccc ctctcggggc cgcttgggac tctctcgtcc ccttctccgt 1500
ctgccgttcc agccgaccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtctgtgcct 1560
tctcatctgc cggtccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgttgcatg gagaccaccg 1620
tgaacgccca tcagatcctg cccaaggtct tacataagag gactcttgga ctcccagcaa 1680
tgtcaacgac cgaccttgag gcctacttca aagactgtgt gtttaaggac tgggaggagc 1740
tgggggagga gattaggtta aaggtctttg tattaggagg ctgtaggcat aaattggtct 1800
gcgcaccagc accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcttgta catgtcccac 1860
tgttcaagcc tccaagctgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa 1920
agaatttgga gctactgtgg agttactctc gtttttgcct tctgacttct ttccttccgt 1980
cagagatctc ctagacaccg cctcagctct gtatcgagaa gccttagagt ctcctgagca 2040
ttgctcacct caccatactg cactcaggca agccattctc tgctgggggg aattgatgac 2100
tctagctacc tgggtgggta ataatttgga agatccagca tccagggatc tagtagtcaa 2160
ttatgttaat actaacatgg gtttaaagat caggcaacta ttgtggtttc atatatcttg 2220
ccttactttt ggaagagaga ctgtacttga atatttggtc tctttcggag tgtggattcg 2280
cactcctcca gcctatagac caccaaatgc ccctatctta tcaacaattc cggaaactac 2340
tgttgttaga cgacgggacc gaggcaggtc ccctagaaga agaactccct cgcctcgcag 2400
acgcagatct caatcgccgc gtcgcagaag atctcaatct cgggaatctc aatgttagta 2460
ttccttggac tcataaggtg ggaaacttta cggggcttta ttcctctaca gtacctatct 2520
ttaatcctga atggcaaact ccttcctttc ctaagattca tttacaagag gacattatta 2580
ataggtgtca acaatttgtg ggccctctca ctgtaaatga aaagagaaga ttgaaattaa 2640
ttatgcctgc tagattctat cctacccaca ctaaatattt gcccttagac aaaggaatta 2700
aaccttatta tccagatcag gtagttaatc attacttcca aaccagacat tatttacata 2760
ctctttggaa ggctggtatt ctatataaga gggaaaccac acgtagcgca tcattttgcg 2820
ggtcaccata ttcttgggaa caagagctac agcatgggag gttggtcatc aaaacctcgc 2880
aaaggcatgg ggacgaatct ttctgttccc aaccctctgg gattctttcc cgatcatcag 2940
ttggaccctg cattcggagc caactcaaac aatccagatt gggacttcaa ccccatcaag 3000
gaccactggc caacagccaa ccaggtagga gtgggagcat tcgggccagg gctcacccct 3060
ccacacggcg gtattttggg ggggagccct caggctcagg gcatattgac cacagtgtca 3120
acaattcctc ctcctgcctc caccaatcgg cagtcaggaa ggcagcctac tcccatctct 3180
ccacctctaa gagacagtca tcctcaggcc atgcagtgga a 3221
<210> 4
<211> 3214
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype B
<222> (1)..(3214)
<400> 4
tccaccactt tccaccaaac tcttcaagat cccagagtca gggccctgta ctttcctgct 60
ggtggctcca gttcaggaac agtgagccct gctcagacta ctgtctctgc catatcgtca 120
atcttatcga agactgggga ccctgtaccg aacatggaga acatcgcatc aggactccta 180
ggacccctgc tcgtgttaca ggcggggttt ttcttgttga caaaaatcct cacaatacca 240
cagagtctag actcgtggtg gacttctctc aattttctag ggggaamacc cgtgtgtctt 300
ggccaaaatt cgcagtccca aatctccagt cactcacyaa cctgttgtcc tccaatttgt 360
cctggttatc gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatct tcctytgcat cctgctgcta 420
tgcctcatct tcttgttggt tcttctggac tatcraggta tgttgcccgt ttgtcctcwa 480
mttccaggat cawcaacaac cagcaccgga ccatgcaaaa cctgcacgac tcctgctcaa 540
ggaacctcta tryktccctc atgttgctgt acaaaaccta cggacggaaa ctgcacctgt 600
attcccatcc catcatcttg ggctttcgca aaatacctat gggagtsggc ctcagyccgt 660
ttctcttggc tcagtttact agcgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact 720
gtctggcttt cagttatatg gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta caacatcttg 780
agtcccttta tgccgctgtt accaatttyc ttttgtcttt gggtatacay ttgaaccctc 840
acaaaacaaa aagatgggga tattccctta acttcatggg atatgtaatt gggtgttggg 900
gcacattgcc acaggaacat attgtacaaa aaatcaaaat gtgttttmgg aaacttcctg 960
taaacagacc tattgattgg aaagtatgtc aacgaattgt gggtcttttg gggtttgccg 1020
cccctttcac gcaatgtgga tatcctgctt tratgccttt atatgcatgt atacaagcaa 1080
aacaggcttt tactttctcg ccaacttaca aggcctttct aagtaaacag tatctgaacc 1140
tttaccccgt tactcggcaa cggtctggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 1200
ctggttgggg cttggccata ggccwtcagc gcatgcgtgg aacctttgtg tctcctctgc 1260
cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagcaggtct ggggcaaaac 1320
tcatcgggac tgacaattct gtcgtgctct cccgcaagta tacatcgttc ccatggctgc 1380
taggctgtgc tgccaactgg atcctgcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcggcgc 1440
tgaatcccgc ggacgacccc tcccggggcc gcttggggct ctaccgcccg cttctccgcc 1500
tgttgtaccg tccgaccacg gggcgcacct ctctttacgc ggactccccg tctgtgcctt 1560
ctcatctrcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca cgtcgcatgg agaccaccgt 1620
gaacgcccac cggaacctgc ccaaggtctt gcataagagg actcttggac tttccgcaat 1680
gtcaacgacc gaccttgagg catacttcaa agactgtgtg tttamtgagt gggaggagtt 1740
gggggaggag aktaggttaa aggtctttgt actaggaggc tgtaggcata aattggtgtg 1800
ttcaccagca ccatgcaact ttttcacctc tgcctaatca tctcwtgttc atgtcctact 1860
gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg ctttagggca tggacattga cccgtataaa 1920
gaatttggag cttctgtgga gttactctct tttttgcctm mtgacttctt tccttctatt 1980
cgagatctcc tcgacaccgc ctctgctttg tatcgggagg ccttagagtc tccggaacat 2040
tgttcacctc accatacggc actcaggcaa gctattctgt gttggggtga gttgatgaat 2100
ctagccacct gggtgggaag taatttggaa gatccagcat ccagggaatt agtmgttagc 2160
tatgtcaacg ttaatatggg cmtaaaaatc agacaactat tgtggtttca catttcctgt 2220
cttacttttg ggaragamac tgttcttgaa tatttggtgt cttttggagt gtggattcgc 2280
actcctcctg catatagacc aycaaatgcc cctatcttat caacacttcc ggaaactact 2340
gttgttagac gaagaggcag gtcccctaga agaagaactc cctcgcctcg cagacgaagg 2400
tctcaatcgc cgcgtcgcag aagatctcaa tctcgggaat ctcaatgtta gtattccttg 2460
gacacataag gtgggaaact ttacggggct ttattcttct acggtacctt gctttaatcc 2520
taawtggcaa actccttctt ttcctgacat tcatttgcag gaggacattg ttgatagatg 2580
taagcamttt gtggggcccc ttacagtaaa tgaaaacagg agactaaaat taattatgcc 2640
tgctaggttt tatcccaatg ttaccaaata tttgccctta gataaaggga tcaaacctta 2700
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<210> 5
<211> 3214
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<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype C
<222> (1)..(3214)
<400> 5
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tgagtggcaa actccctcct ttcctaacat tcatttacag gaagacatta ttaatagatg 2580
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gaaggctggc attctatata aaagagaaac tacacgcagc gcttcatttt gtgggtcacc 2820
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<210> 6
<211> 3182
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype D
<222> (1)..(3182)
<400> 6
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<211> 3212
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype E
<222> (1)..(3212)
<400> 7
ttccacaaca ttccaccaag ctcascagga tcccagagta agrggcctgt atyttcctgc 60
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<210> 8
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype F
<222> (1)..(3205)
<400> 8
ttccatcagg ctctgttgga tcccagggta agggctctgt atcttcctgc tggtggctcc 60
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catcacactg ccctcaggca agttattttg tgctggggtg agttaatgac tttggcttcc 2100
tgggtgggca ataacttgga agaccctgct gccagggatt tagtagttaa ctatgttaac 2160
actaacatgg gcctaaaaat tagacaacta ctgtggtttc acatttcctg ccttactttt 2220
ggaagagata tagttcttga gtatttggtg tcctttggag tgtggattcg cactcctcct 2280
gcttacagac cacaaaatgc ccctatccta tccacacttc cggaaactac tgttgttaga 2340
cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg 2400
ccgcgtcgcc gaagatctca atctccagct tcccaatgtt agtattcctt ggactcataa 2460
ggtgggaaat tttacggggc tttactcttc tactgtgcct gcttttaatc ctgactggtt 2520
aactccttct tttcctaata ttcatttaca tcaagaccta atttctaaat gtgaacaatt 2580
tgtaggccca ctcactaaaa atgaattaag gaggttaaaa ttggttatgc cagctagatt 2640
ttatcctaag gttaccaaat attttcctat ggagaaagga atcaagcctt attatcctga 2700
gcatgcagtt aatcattact ttaaaacaag acattatttg catactttat ggaaggcggg 2760
aattttatat aagagagaat ccacacgtag cgcatcattt tgtgggtcac catattcctg 2820
ggaacaagag ctacagcatg ggagcacctc tctcaacgac aagaagaggc atgggacaga 2880
atctttctgt gcccaatcct ctgggattct ttccagacca tcagctggat ccgctattca 2940
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ctcatccaca ggcaatgcag tggaa 3205
<210> 9
<211> 3247
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV genotype G
<222> (1)..(3247)
<400> 9
tctacagcat tccaccaagc tctacaaaat cccaaagtca ggggcctgta ttttcctgct 60
ggtggctcca gttcagggat agtgaaccct gttccgacta ttgcctctca catctcgtca 120
atcttctcca ggattgggga ccctgcaccg aacatggaga acatcacatc aggattccta 180
ggacccctgc tcgtgttaca ggcggggttt ttcttgttga caagaatcct cacaataccg 240
cagaatctag actcgtggtg gacttctctc aattttctag ggggagtgcc cgtgtgtcct 300
ggcctaaatt cgcagtcccc aacctccaat cactcaccaa tctcctgtcc tccaacttgt 360
cctggctatc gctggatgtg tctgcggcgt tttatcatat tcctcttcat cctgctgcta 420
tgcctcatct tcttgttggt tcttctggac tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctctg 480
attccaggat cctcgaccac cagtacggga ccctgcaaaa cctgcacgac tcctgctcaa 540
ggcaactcta tgtatccctc atgttgctgt acaaaacctt cggacggaaa ttgcacctgt 600
attcccatcc catcatcttg ggctttcgca aaatacctat gggagtgggc ctcagtccgt 660
ttctcttggc tcagtttact agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact 720
gtctggcttt cagctatatg gatgatgtgg tattgggggc caaatctgta caacatcttg 780
agtcccttta taccgctgtt accaattttc ttttgtcttt gggtatacat ctaaacccta 840
acaaaacaaa aagatggggt tattccttaa attttatggg atatgtaatt ggaagttggg 900
gtactttgcc acaagaacac atcacacaga aaattaagca atgttttcgg aaactccctg 960
ttaacaggcc aattgattgg aaagtctgtc aacgaataac tggtctgttg ggtttcgctg 1020
ctccttttac ccaatgtggt taccctgcct taatgccttt atatgcatgt atacaagcta 1080
agcaggcttt tactttctcg ccaacttata aggcctttct ctgtaaacaa tacatgaacc 1140
tttaccccgt tgctaggcaa cggcccggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 1200
ctggttgggg cttggccatc ggccatcagc gcatgcgtgg aacctttgtg gctcctctgc 1260
cgatccatac tgcggaactc ctagctgctt gttttgctcg cagccggtct ggagcaaaac 1320
tcattgggac tgacaattct gtcgtccttt ctcggaaata tacatccttt ccatggctgc 1380
taggctgtgc tgccaactgg atccttcgcg ggacgtcctt tgtttacgtc ccgtcagcgc 1440
tgaatccagc ggacgacccc tcccggggcc gtttggggct ctgtcgcccc cttctccgtc 1500
tgccgttcct gccgaccacg gggcgcacct ctctttacgc ggtctccccg tctgttcctt 1560
ctcatctgcc ggaccgtgtg cacttcgctt cacctctgca cgttacatgg aaaccgccat 1620
gaacacctct catcatctgc caaggcagtt atataagagg actcttggac tgtttgttat 1680
gtcaacaacc ggggtggaga aatacttcaa ggactgtgtt tttgctgagt gggaagaatt 1740
aggcaatgag tccaggttaa tgacctttgt attaggaggc tgtaggcata aattggtctg 1800
cgcaccagca ccatgtaact ttttcacctc tgcctaatca tctcttgttc atgtcctact 1860
gttcaagcct ccaagctgtg ccttgggtgg ctttagggca tggatagaac aactttgcca 1920
tatggccttt ttggcttaga cattgaccct tataaagaat ttggagctac tgtggagttg 1980
ctctcgtttt tgccttctga ctttttcccg tctgttcgtg atcttctcga caccgcttca 2040
gctttgtacc gggaatcctt agagtcctct gatcattgtt cgcctcacca tacagcactc 2100
aggcaagcaa tcctgtgctg gggtgagttg atgactctag ccacctgggt gggtaataat 2160
ttggaagatc cagcatccag agatttggtg gtcaattatg ttaatactaa tatgggttta 2220
aaaatcaggc aactattgtg gtttcacatt tcctgtctta cttttgggag agaaaccgtt 2280
cttgagtatt tggtgtcttt tggagtgtgg attcgcactc ctcctgctta tagaccacca 2340
aatgccccta tcctatcaac acttccggag actactgttg ttagacgaag aggcaggtcc 2400
cctcgaagaa gaactccctc gcctcgcaga cgaagatctc aatcgccgcg tcgcagaaga 2460
tctgcatctc cagcttccca atgttagtat tccttggact cacaaggtgg gaaactttac 2520
ggggctgtat tcttctacta tacctgtctt taatcctgat tggcaaactc cttcttttcc 2580
aaatatccat ttgcatcaag acattataac taaatgtgaa caatttgtgg gccctctcac 2640
agtaaatgag aaacgaagat taaaactagt tatgcctgcc agatttttcc caaactctac 2700
taaatattta ccattagaca aaggtatcaa accgtattat ccagaaaatg tagttaatca 2760
ttacttccag accagacatt atttacatac cctttggaag gcgggtattc tatataagag 2820
agaaacatcc cgtagcgctt cattttgtgg gtcaccatat acttgggaac aagatctaca 2880
gcatggggct ttcttggacg gtccctctcg agtggggaaa gaacctttcc accagcaatc 2940
ctctaggatt ccttcccgat caccagttgg acccagcatt cagagcaaat accaacaatc 3000
cagattggga cttcaatccc aaaaaggacc cttggccaga ggccaacaag gtaggagttg 3060
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cagggaggca gccgactccc atctctccac cactaagaga cagtcatcct caggccatgc 3240
agtggaa 3247
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<211> 22
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
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<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 1-2 recognition sequence (antisense)
<222> (1)..(22)
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 5-6 recognition sequence (sense)
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gatgatgtgg tattgggggc ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 5-6 recognition sequence (antisense)
<222> (1)..(22)
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<211> 22
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 7-8 recognition sequence (sense)
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 7-8 recognition sequence (antisense)
<222> (1)..(22)
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<211> 22
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 11-12 recognition sequence (sense)
<222> (1)..(22)
<400> 16
tgccgatcca tactgcggaa ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<220>
<221> HBV 11-12 recognition sequence (antisense)
<222> (1)..(22)
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<213> Artificial
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<222> (1)..(354)
<223> full sequence
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50 55 60
Gly Tyr Val His Asp Tyr Gly Ser Val Ser Ala Tyr Arg Leu Ser Gln
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Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Ser Ile Arg Pro Ser Gln Asp Gln
210 215 220
Lys Phe Lys His Arg Leu Ile Leu Val Phe Ala Val Ser Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
Tyr Val Arg Asp Thr Gly Ser Val Ser Glu Tyr Arg Leu Ser Glu Ile
260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
305 310 315 320
Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser
325 330 335
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340 345 350
Ser Pro
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
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<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 19
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
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Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Cys Ile Ala Pro Arg Gln Trp
20 25 30
Ser Lys Phe Lys His Ser Leu Glu Leu Arg Phe Ala Val Phe Gln Lys
35 40 45
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50 55 60
Gly Tyr Val Ser Asp Tyr Gly Ser Val Ser Arg Tyr His Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Cys Ile Arg Pro Ala Gln Asp Ser
210 215 220
Lys Phe Lys His Arg Leu Ile Leu Ala Leu Glu Val Gly Gln Lys Thr
225 230 235 240
Arg Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
Tyr Val Val Asp Asn Gly Ser Val Ser Arg Tyr Ile Leu Ser Gln Ile
260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
305 310 315 320
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325 330 335
Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser
340 345 350
Ser Pro
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
<221> HBV 1-2x.68
<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 20
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Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Cys Ile Arg Pro Asp Gln Ser
20 25 30
Ser Lys Phe Lys His Arg Leu Val Leu Gly Phe Glu Val Gly Gln Lys
35 40 45
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50 55 60
Gly Tyr Val Val Asp Asn Gly Ser Val Ser Arg Tyr Ile Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Cys Ile Ala Pro Arg Gln Trp Ser
210 215 220
Lys Phe Lys His Ser Leu Glu Leu Arg Phe Ala Val Phe Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
Tyr Val Ser Asp Tyr Gly Ser Val Ser Arg Tyr His Leu Ser Glu Ile
260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
305 310 315 320
Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser
325 330 335
Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser
340 345 350
Ser Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
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<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 21
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
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Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Thr Ile Arg Pro Asp Gln Thr
20 25 30
Tyr Lys Phe Lys His Arg Leu Ile Leu Gln Phe Ala Val Ser Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Val Arg Asp Thr Gly Ser Val Ser Glu Tyr Arg Leu Ser Gln
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Phe Ala Cys Ile Arg Pro Val Gln Trp Ser
210 215 220
Lys Phe Lys His Ser Leu Glu Leu Cys Phe Thr Val Thr Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
Tyr Val His Asp Tyr Gly Ser Val Ser Ala Tyr Arg Leu Ser Gln Ile
260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
305 310 315 320
Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser
325 330 335
Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser
340 345 350
Ser Pro
<210> 22
<211> 354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
<221> HBV 5-6x.33
<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 22
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Arg Ile Arg Pro Ser Gln Ser
20 25 30
Ser Lys Phe Lys His Lys Leu Thr Leu Val Phe Ala Val Ala Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Val His Asp Glu Gly Ser Val Ser Gln Tyr Arg Leu Ser Gln
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Trp Ala Thr Ile Glu Pro Leu Gln Lys Arg
210 215 220
Lys Phe Lys His Ala Leu His Leu Met Phe Thr Val Ser Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
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260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
305 310 315 320
Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser
325 330 335
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340 345 350
Ser Pro
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
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<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 23
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1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Phe Ala Arg Ile Arg Pro Gly Gln Asp
20 25 30
Tyr Lys Phe Lys His Asn Leu Val Leu Thr Phe Arg Val Ala Gln Lys
35 40 45
Thr Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val
50 55 60
Gly Tyr Val Leu Asp Glu Gly Ser Val Ser Gln Tyr Tyr Leu Ser Glu
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Ala Ser Ile Glu Pro Val Gln Lys Pro
210 215 220
Lys Phe Lys His Thr Leu His Leu Arg Phe Glu Val Ser Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
Tyr Val Tyr Asp Gln Gly Ser Val Ser Ser Tyr Arg Leu Ser Glu Ile
260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
305 310 315 320
Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser
325 330 335
Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser
340 345 350
Ser Pro
<210> 24
<211> 354
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
<221> HBV 5-6x.90
<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 24
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
Val Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Arg Ile Arg Pro Arg Gln Asn
20 25 30
Phe Lys Phe Lys His Ala Leu Val Leu Gln Phe Arg Val Ser Gln Lys
35 40 45
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50 55 60
Gly Tyr Val Leu Asp Glu Gly Ser Val Ser Gln Tyr Tyr Leu Ser Gln
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Val Ala Gln Ile His Pro Ala Gln Lys Asn
210 215 220
Lys Phe Lys His Gly Leu Arg Leu Gln Phe Tyr Val Tyr Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
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260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
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260 265 270
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Lys Phe Lys His Ala Leu Arg Leu Glu Phe Thr Val Arg Gln Lys Thr
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Lys Phe Lys His Ala Leu Arg Leu Glu Phe Ala Val Arg Gln Lys Thr
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165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
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Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Ser Ile Arg Pro Arg Gln Tyr Ala
210 215 220
Lys Phe Lys His Asp Leu Glu Leu Arg Phe Asn Val Arg Gln Lys Thr
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
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260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
290 295 300
Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val
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Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser
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Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Lys Lys Ser
340 345 350
Ser Pro
<210> 34
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Sequence
<220>
<221> HBV 11-12x.9
<222> (1)..(354)
<223> full sequence
<400> 34
Met Asn Thr Lys Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Tyr Val Tyr Asp Asn Gly Ser Val Ser Val Tyr Glu Leu Ser Gln
65 70 75 80
Ile Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys
85 90 95
Leu Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu
100 105 110
Pro Ser Ala Lys Glu Ser Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp
115 120 125
Val Asp Gln Ile Ala Ala Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr
130 135 140
Ser Glu Thr Val Arg Ala Val Leu Asp Ser Leu Pro Gly Ser Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Ser Pro Ser Gln Ala Ser Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ser
165 170 175
Ser Pro Gly Ser Gly Ile Ser Glu Ala Leu Arg Ala Gly Ala Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Gly Tyr Asn Lys Glu Phe Leu Leu Tyr Leu Ala Gly Phe Val
195 200 205
Asp Gly Asp Gly Ser Ile Tyr Ala Ala Ile Arg Pro Lys Gln Thr Arg
210 215 220
Lys Phe Lys His Glu Leu Gln Leu Thr Phe Asn Val Arg Gln Lys Ser
225 230 235 240
Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
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260 265 270
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Lys Phe Lys His Glu Leu Gln Leu Thr Phe Asn Val Arg Gln Lys Thr
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Gln Arg Arg Trp Phe Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly
245 250 255
Tyr Val Leu Asp Trp Gly Ser Val Ser Thr Tyr Ile Leu Ser Gln Ile
260 265 270
Lys Pro Leu His Asn Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu
275 280 285
Lys Gln Lys Gln Ala Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro
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Val Leu Asp
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20 25 30
Leu Leu Leu Phe Phe Arg Val Ser Gln Lys Thr Gln Arg Arg Trp Phe
35 40 45
Leu Asp Lys Leu Val Asp Glu Ile Gly Val Gly Tyr Val Leu Asp Glu
50 55 60
Gly Ser Val Ser Gln Tyr Tyr Leu Ser Glu Ile Lys Pro Leu His Asn
65 70 75 80
Phe Leu Thr Gln Leu Gln Pro Phe Leu Lys Leu Lys Gln Lys Gln Ala
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100 105 110
Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala
115 120 125
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Val Leu Asp
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Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala
115 120 125
Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala
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Val Leu Asp
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Val Leu Asp
145
<210> 69
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<220>
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Asn Leu Val Leu Lys Ile Ile Glu Gln Leu Pro Ser Ala Lys Glu Ser
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Pro Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Trp Val Asp Gln Ile Ala Ala
115 120 125
Leu Asn Asp Ser Lys Thr Arg Lys Thr Thr Ser Glu Thr Val Arg Ala
130 135 140
Val Leu Asp
145
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ccccttctcg tgttacaggc gg 22
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<212> DNA
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Claims (1)
- B형 간염 바이러스의 적어도 2개의 유전자형의 게놈의 오픈 리딩 프레임 (ORF) 내의 인식 서열을 인식 및 절단하는 조작된 메가뉴클레아제이며, 여기서 조작된 메가뉴클레아제는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 포함하며, 여기서 상기 제1 서브유닛은 상기 인식 서열의 제1 인식 절반-부위에 결합하고 제1 초가변 (HVR1) 영역을 포함하고, 여기서 상기 제2 서브유닛은 상기 인식 서열의 제2 인식 절반-부위에 결합하고 제2 초가변 (HVR2) 영역을 포함하는 것인 조작된 메가뉴클레아제.
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