JP2023153824A - B型肝炎ウイルスゲノムの認識配列に特異的な遺伝子操作メガヌクレアーゼ - Google Patents
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Abstract
【課題】B型肝炎ウイルスゲノムの認識配列に特異的な遺伝子操作メガヌクレアーゼを提供する。【解決手段】B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認識配列を認識して切断する、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであって、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、前記第1のサブユニットが前記認識配列の第1の認識した半分の部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、前記第2のサブユニットは、前記認識配列の第2の認識した半分の部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域を含む、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、腫瘍学、分子生物学、及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は
、B型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも2つの遺伝子型の中の認識配列に対する特異性を
有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに関する。そのような遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、B型肝炎ウイルスの感染及びB型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝
細胞がんを治療するための方法において有用である。
、B型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも2つの遺伝子型の中の認識配列に対する特異性を
有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに関する。そのような遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、B型肝炎ウイルスの感染及びB型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝
細胞がんを治療するための方法において有用である。
EFS-WEBを介したテキストファイルとして提出された配列表への言及
本願は、EFS-Webを介してASCIIのフォーマットで提出された配列表を含み
、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。2017年10月13日に作成され
た上記のASCIIのコピーは、P109070018WO00-SEQ-MJT.tx
tという名前で、サイズは169,011バイトである。
本願は、EFS-Webを介してASCIIのフォーマットで提出された配列表を含み
、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。2017年10月13日に作成され
た上記のASCIIのコピーは、P109070018WO00-SEQ-MJT.tx
tという名前で、サイズは169,011バイトである。
B型肝炎ウイルス(HBV)は世界的に大きな健康問題であり、3億5千万人を超える
人々が慢性的なキャリアである。HBV感染症は、肝臓の深刻且つ一般的な感染症である
。慢性感染症は、肝硬変及びヒトのがんの最も一般的な形態の1つである肝細胞がん(H
CC)を含む、重篤な肝疾患を発症するリスクの増大と関連している。慢性HBVキャリ
アにおけるHCCの推定のリスクは、感染していない個人におけるよりも約100倍大き
い。世界の人口の約3分の1が、生きている一時点で感染しており、それは2億4千万人
から3億5千万人の慢性感染症を含んでいる。毎年75万人を超える人々がB型肝炎で死
亡している。これらのうち約30万人が肝がんによる。現在入手可能な抗HBV薬には限
界がある。例えば、インターフェロンアルファの投与は重篤な有害反応と関連している。
ヌクレオシド類似体は、静ウイルス性であり、長期の投与が必要となる。
人々が慢性的なキャリアである。HBV感染症は、肝臓の深刻且つ一般的な感染症である
。慢性感染症は、肝硬変及びヒトのがんの最も一般的な形態の1つである肝細胞がん(H
CC)を含む、重篤な肝疾患を発症するリスクの増大と関連している。慢性HBVキャリ
アにおけるHCCの推定のリスクは、感染していない個人におけるよりも約100倍大き
い。世界の人口の約3分の1が、生きている一時点で感染しており、それは2億4千万人
から3億5千万人の慢性感染症を含んでいる。毎年75万人を超える人々がB型肝炎で死
亡している。これらのうち約30万人が肝がんによる。現在入手可能な抗HBV薬には限
界がある。例えば、インターフェロンアルファの投与は重篤な有害反応と関連している。
ヌクレオシド類似体は、静ウイルス性であり、長期の投与が必要となる。
HBVゲノムは、1つの部位あたり1年につき1.4~3.2×10-5ヌクレオチド
置換という推定速度での遺伝的多様性を示す。ウイルスのポリメラーゼによるいずれかの
プルーフリーディング能力の不在下でヌクレオチドを誤った取り込んだ結果として、複製
している間、多数のウイルス変異体が生じる。その多様性により、ウイルスのよく認識さ
れている亜型が生じた。HBVは、完全なゲノムの配列における8%以上の群間の相違に
基づいた明確な遺伝子型に分類されており、それぞれ異なる地理的分布を有する。例えば
、遺伝子型Aは、サハラ以南のアフリカ、北ヨーロッパ、及び西アフリカで広く見られる
。遺伝子型BとCはアジアで一般的である。遺伝子型Cは主に東南アジアで観察される。
遺伝子型Dは、アフリカ、ヨーロッパ、地中海諸国、及びインドで優勢である。遺伝子型
Gはフランス、ドイツ、アメリカ合衆国で報告されている。また、遺伝子型Hは中南米で
よく見られる。遺伝子型Iは最近ベトナムとラオスで報告されている。最新のHBV遺伝
子型、遺伝子型Jは、日本の琉球諸島で確認されている。
置換という推定速度での遺伝的多様性を示す。ウイルスのポリメラーゼによるいずれかの
プルーフリーディング能力の不在下でヌクレオチドを誤った取り込んだ結果として、複製
している間、多数のウイルス変異体が生じる。その多様性により、ウイルスのよく認識さ
れている亜型が生じた。HBVは、完全なゲノムの配列における8%以上の群間の相違に
基づいた明確な遺伝子型に分類されており、それぞれ異なる地理的分布を有する。例えば
、遺伝子型Aは、サハラ以南のアフリカ、北ヨーロッパ、及び西アフリカで広く見られる
。遺伝子型BとCはアジアで一般的である。遺伝子型Cは主に東南アジアで観察される。
遺伝子型Dは、アフリカ、ヨーロッパ、地中海諸国、及びインドで優勢である。遺伝子型
Gはフランス、ドイツ、アメリカ合衆国で報告されている。また、遺伝子型Hは中南米で
よく見られる。遺伝子型Iは最近ベトナムとラオスで報告されている。最新のHBV遺伝
子型、遺伝子型Jは、日本の琉球諸島で確認されている。
HBVは、ヘパドナウイルス科に属するエンベロープDNAウイルスである。それは、
RNA中間体、プレゲノムRNA(pgRNA)の逆転写によって複製する、小さい、部
分的に二本鎖(DS)の、弛緩型環状DNA(rcDNA)ゲノムを含む。HBVの環状
DNAゲノムは珍しい。DNAが完全に二本鎖であるわけではないからである。全長の鎖
の一端が、ウイルスDNAポリメラーゼに結合している。ゲノムは約3020~3320
ヌクレオチド長(全長の鎖)、1700~2800ヌクレオチド長(長さの短い鎖)であ
る。ネガティブセンス(非コード)は、ウイルスmRNAに相補的である。
RNA中間体、プレゲノムRNA(pgRNA)の逆転写によって複製する、小さい、部
分的に二本鎖(DS)の、弛緩型環状DNA(rcDNA)ゲノムを含む。HBVの環状
DNAゲノムは珍しい。DNAが完全に二本鎖であるわけではないからである。全長の鎖
の一端が、ウイルスDNAポリメラーゼに結合している。ゲノムは約3020~3320
ヌクレオチド長(全長の鎖)、1700~2800ヌクレオチド長(長さの短い鎖)であ
る。ネガティブセンス(非コード)は、ウイルスmRNAに相補的である。
C、X、P、及びSと呼ばれる、ゲノムによってコードされる4つの既知の遺伝子があ
る。コアタンパク質は遺伝子C(HBcAg)によってコードされ、その開始コドンは上
流のフレーム内AUG開始コドンが先行し、そこからプレコアタンパク質が産生される。
HBeAgはプレコアタンパク質のタンパク質分解処理によって産生される。DNAポリ
メラーゼは、表面抗原(HBsAg)に対する遺伝子P.Gene Sコードによりコー
ドされる。HBsAg遺伝子は1つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝
子を3つの部分、即ちpre-S1、pre-S2、及びSに分割する3つのインフレー
ムの「開始」(ATG)コドンを含む。複数の開始コドンにより、大(表面から内側への
順序で、pre-S1/pre-S2/S)、中(pre-S2/S)、及び小(S)と
呼ばれる3つの異なる大きさのポリペプチドが生成される。遺伝子Xによってコードされ
るタンパク質の機能は完全には理解されていないが、それは肝がんの発症と関連している
。それは細胞の増殖を促進する遺伝子を刺激して、増殖調節分子を不活化する。
る。コアタンパク質は遺伝子C(HBcAg)によってコードされ、その開始コドンは上
流のフレーム内AUG開始コドンが先行し、そこからプレコアタンパク質が産生される。
HBeAgはプレコアタンパク質のタンパク質分解処理によって産生される。DNAポリ
メラーゼは、表面抗原(HBsAg)に対する遺伝子P.Gene Sコードによりコー
ドされる。HBsAg遺伝子は1つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝
子を3つの部分、即ちpre-S1、pre-S2、及びSに分割する3つのインフレー
ムの「開始」(ATG)コドンを含む。複数の開始コドンにより、大(表面から内側への
順序で、pre-S1/pre-S2/S)、中(pre-S2/S)、及び小(S)と
呼ばれる3つの異なる大きさのポリペプチドが生成される。遺伝子Xによってコードされ
るタンパク質の機能は完全には理解されていないが、それは肝がんの発症と関連している
。それは細胞の増殖を促進する遺伝子を刺激して、増殖調節分子を不活化する。
ウイルスのDNAは、細胞の感染直後、核にて見出される。部分的に二本鎖のDNAは
、(+)センスの鎖の完成及び(-)のセンスの鎖からのタンパク質分子の除去、並びに
(+)センスの鎖からの短いRNA配列の除去によって完全に二本鎖にされる。非コード
の塩基が(-)センスの鎖の末端から除去され、末端は再結合される。
、(+)センスの鎖の完成及び(-)のセンスの鎖からのタンパク質分子の除去、並びに
(+)センスの鎖からの短いRNA配列の除去によって完全に二本鎖にされる。非コード
の塩基が(-)センスの鎖の末端から除去され、末端は再結合される。
HBVのライフサイクルは、ウイルスが宿主細胞に付着して、内在化すると始まる。最
近の研究は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)がHBVの感染
における機能的受容体であることを証明している。ビリオン弛緩型環状DNA(rcDN
A)は核に送達され、そこでそれは修復されて共有結合閉環状DNA(cccDNA)を
形成する。エピソームcccDNAは、宿主RNAポリメラーゼIIによるプレゲノムR
NA(pgRNA)及び他のウイルスmRNAの転写のための鋳型として機能する。転写
物は次に細胞質に輸送され、そこでウイルスタンパク質の翻訳が起こる。逆転写酵素(R
T)はpgRNAに結合し、コアタンパク質の未成熟なRNA含有ヌクレオカプシドへの
集合を引き起こす。未成熟なヌクレオカプシドは次に成熟の過程を経る。それによってp
gRNAがRTによって逆転写されて、成熟rcDNAが作られる。ヘパドナウイルス逆
転写の独特の特徴は、マイナス鎖DNA合成のRTにプライミングされた開始であり、こ
れはマイナス鎖DNAの5’末端へのRTの共有結合をもたらす。
近の研究は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド(NTCP)がHBVの感染
における機能的受容体であることを証明している。ビリオン弛緩型環状DNA(rcDN
A)は核に送達され、そこでそれは修復されて共有結合閉環状DNA(cccDNA)を
形成する。エピソームcccDNAは、宿主RNAポリメラーゼIIによるプレゲノムR
NA(pgRNA)及び他のウイルスmRNAの転写のための鋳型として機能する。転写
物は次に細胞質に輸送され、そこでウイルスタンパク質の翻訳が起こる。逆転写酵素(R
T)はpgRNAに結合し、コアタンパク質の未成熟なRNA含有ヌクレオカプシドへの
集合を引き起こす。未成熟なヌクレオカプシドは次に成熟の過程を経る。それによってp
gRNAがRTによって逆転写されて、成熟rcDNAが作られる。ヘパドナウイルス逆
転写の独特の特徴は、マイナス鎖DNA合成のRTにプライミングされた開始であり、こ
れはマイナス鎖DNAの5’末端へのRTの共有結合をもたらす。
次いで、成熟したrcDNA含有ヌクレオカプシドは、ウイルス表面タンパク質によっ
てエンベロープされ、ビリオンとして分泌される(分泌経路)か、別法として、cccD
NAのプールを更に増幅するために核に再循環される(再循環経路)。肝細胞におけるc
ccDNAの持続性は、ウイルスの持続性、抗ウイルス療法の中止後のウイルス複製の再
活性化、及び治療に対する抵抗性において、重要な役割を果たす。
てエンベロープされ、ビリオンとして分泌される(分泌経路)か、別法として、cccD
NAのプールを更に増幅するために核に再循環される(再循環経路)。肝細胞におけるc
ccDNAの持続性は、ウイルスの持続性、抗ウイルス療法の中止後のウイルス複製の再
活性化、及び治療に対する抵抗性において、重要な役割を果たす。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見られる15~4
0塩基対の切断部位を認識する一群の天然のヌクレアーゼである。それらは、グループ1
自己スプライシングイントロンやインテイン等の寄生のDNAの要素と関連していること
が多い。それらは、染色体にて二本鎖の切断を生じさせることによって宿主ゲノムの特定
の位置で相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、これは細胞のDNA修復機構を動員
する(非特許文献1)。ホーミングエンドヌクレアーゼは一般に4つのファミリーに分類
される:LAGLIDADG(配列番号2)ファミリー、GIY-YIGファミリー、H
is-Cysボックスファミリー及びHNHファミリーである。これらのファミリーは、
触媒の活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、
LAGLIDADG(配列番号2)ファミリーのメンバーは、保存されたLAGLIDA
DG(配列番号2)モチーフの1つ又は2つのコピーを有することを特徴とする(非特許
文献2を参照)。単一コピーのLAGLIDADG(配列番号2)モチーフを有するLA
GLIDADG(配列番号2)ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成し、一
方、2コピーのLAGLIDADG(配列番号2)モチーフを有するメンバーは単量体と
して見出される。ホーミングエンドヌクレアーゼを産生する方法は、当技術分野において
公知である。
0塩基対の切断部位を認識する一群の天然のヌクレアーゼである。それらは、グループ1
自己スプライシングイントロンやインテイン等の寄生のDNAの要素と関連していること
が多い。それらは、染色体にて二本鎖の切断を生じさせることによって宿主ゲノムの特定
の位置で相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、これは細胞のDNA修復機構を動員
する(非特許文献1)。ホーミングエンドヌクレアーゼは一般に4つのファミリーに分類
される:LAGLIDADG(配列番号2)ファミリー、GIY-YIGファミリー、H
is-Cysボックスファミリー及びHNHファミリーである。これらのファミリーは、
触媒の活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、
LAGLIDADG(配列番号2)ファミリーのメンバーは、保存されたLAGLIDA
DG(配列番号2)モチーフの1つ又は2つのコピーを有することを特徴とする(非特許
文献2を参照)。単一コピーのLAGLIDADG(配列番号2)モチーフを有するLA
GLIDADG(配列番号2)ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成し、一
方、2コピーのLAGLIDADG(配列番号2)モチーフを有するメンバーは単量体と
して見出される。ホーミングエンドヌクレアーゼを産生する方法は、当技術分野において
公知である。
I-CreI(配列番号1)は、緑藻クラミドモナスの葉緑体染色体にある22塩基対
の認識配列を認識し切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのLAGLIDADG(配
列番号2)ファミリーのメンバーである。遺伝的選択技術を用いて、野生型I-CreI
切断部位選択性を改変した(非特許文献3~6)。哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウ
イルスゲノムの部位を含む、広範囲に異なるDNAの部位を標的とするためにI-Cre
I及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ-L
AGLIDADG(配列番号2)ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法
が記載された(特許文献1)。
の認識配列を認識し切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのLAGLIDADG(配
列番号2)ファミリーのメンバーである。遺伝的選択技術を用いて、野生型I-CreI
切断部位選択性を改変した(非特許文献3~6)。哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウ
イルスゲノムの部位を含む、広範囲に異なるDNAの部位を標的とするためにI-Cre
I及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ-L
AGLIDADG(配列番号2)ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法
が記載された(特許文献1)。
特許文献2に最初に記載されているように、I-CreI及びその遺伝子操作された誘
導体は、通常二量体であるが、第1のサブユニットのC末端を第2のサブユニットのN末
端に結合する短いペプチドリンカーを用いて、単一ポリペプチドに融合できる(非特許文
献7、非特許文献8)。従って、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物
から発現させることができる。
導体は、通常二量体であるが、第1のサブユニットのC末端を第2のサブユニットのN末
端に結合する短いペプチドリンカーを用いて、単一ポリペプチドに融合できる(非特許文
献7、非特許文献8)。従って、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物
から発現させることができる。
HBV感染の治療のために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを使用することが、示さ
れている。例えば、特許文献3は、非ゲノム組み込み型ウイルスのゲノムを切断するため
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの使用を示唆している。そのようなメガヌクレアー
ゼは、I-CreIの変異体を含む。特許文献3は、1つのHBV株のゲノムに存在する
多数の22塩基対メガヌクレアーゼ認識配列を開示している。しかし、特許文献3は、H
BVゲノムの複数の遺伝子型の中に存在するいずれの認識配列も同定しない。
れている。例えば、特許文献3は、非ゲノム組み込み型ウイルスのゲノムを切断するため
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの使用を示唆している。そのようなメガヌクレアー
ゼは、I-CreIの変異体を含む。特許文献3は、1つのHBV株のゲノムに存在する
多数の22塩基対メガヌクレアーゼ認識配列を開示している。しかし、特許文献3は、H
BVゲノムの複数の遺伝子型の中に存在するいずれの認識配列も同定しない。
Stoddard(2006),Q.Rev.Biophys.38:49-95
Chevalier et al.(2001),Nucleic Acids Res.29(18):3757-3774
Sussman et al.(2004),J.Mol.Biol.342:31-41
Chames et al.(2005),Nucleic Acids Res.33:e178
Seligman et al.(2002),Nucleic Acids Res.30:3870-9
Arnould et al.(2006),J.Mol.Biol.355:443-58
Li et al.(2009),Nucleic Acids Res.37:1650-62
Grizot et al.(2009),Nucleic Acids Res.37:5405-19
本発明は、部分的には、HBVゲノムの少なくとも1つのオープンリーディングフレー
ム(ORF)内及びHBVのゲノムの少なくとも2つの異なる遺伝子型内のDNA配列を
認識するように遺伝子操作される部位特異的な希少切断エンドヌクレアーゼの開発に依存
する。本発明者らは、ウイルスの複数の遺伝子型を不活化するために、組換えメガヌクレ
アーゼによって標的とされ得る遺伝子型にわたって保存されている特定の認識配列を同定
した。
ム(ORF)内及びHBVのゲノムの少なくとも2つの異なる遺伝子型内のDNA配列を
認識するように遺伝子操作される部位特異的な希少切断エンドヌクレアーゼの開発に依存
する。本発明者らは、ウイルスの複数の遺伝子型を不活化するために、組換えメガヌクレ
アーゼによって標的とされ得る遺伝子型にわたって保存されている特定の認識配列を同定
した。
本発明はいくつかの態様で従来技術を改良する。本発明者らは驚くべきことに、認識配
列がHBVゲノムのいくつかの遺伝子型のORF内で同定され得ることを見出した。ウイ
ルスのいくつかの遺伝子型を標的とすることによって、世界の局所的な領域に存在する異
なる遺伝子型に対して使用することができる単一の医薬組成物を調製することができる。
従って、本明細書に開示されている方法及び組成物は、世界中の感染した個人におけるH
BVの増殖を治療又は低減するのに有用である。肝臓におけるHBVの複製の抑制又は根
絶は、肝病理の改善、及び肝硬変や肝細胞がんへの進行の減少をもたらす。従って、本発
明は、HBV感染に対する更なる遺伝子治療アプローチに対する当技術分野における必要
性を満たすものである。更に、本発明は、HCC細胞のHBVゲノムへの「自殺遺伝子」
の相同組換えによる挿入を標的とする手段を提供することによって肝細胞がんを治療する
方法を提供する。自殺遺伝子は、がん細胞を直接死滅させる毒素若しくはアポトーシス促
進タンパク質、又はがん細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する細胞表面抗
原若しくはMHCクラスI抗原ポリペプチドをコードすることができる。
列がHBVゲノムのいくつかの遺伝子型のORF内で同定され得ることを見出した。ウイ
ルスのいくつかの遺伝子型を標的とすることによって、世界の局所的な領域に存在する異
なる遺伝子型に対して使用することができる単一の医薬組成物を調製することができる。
従って、本明細書に開示されている方法及び組成物は、世界中の感染した個人におけるH
BVの増殖を治療又は低減するのに有用である。肝臓におけるHBVの複製の抑制又は根
絶は、肝病理の改善、及び肝硬変や肝細胞がんへの進行の減少をもたらす。従って、本発
明は、HBV感染に対する更なる遺伝子治療アプローチに対する当技術分野における必要
性を満たすものである。更に、本発明は、HCC細胞のHBVゲノムへの「自殺遺伝子」
の相同組換えによる挿入を標的とする手段を提供することによって肝細胞がんを治療する
方法を提供する。自殺遺伝子は、がん細胞を直接死滅させる毒素若しくはアポトーシス促
進タンパク質、又はがん細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する細胞表面抗
原若しくはMHCクラスI抗原ポリペプチドをコードすることができる。
本発明は、B型肝炎ウイルス(HBV)感染の治療に有用な遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼを提供する。本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、少なくとも2つの
B型肝炎ウイルスの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認
識配列を認識して切断する。本明細書において開示される遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼによるそのような認識配列での切断は、切断部位での非相同末端結合(NHEJ)に
起因して、1以上のウイルスタンパク質の発現を乱し得る。NHEJは、挿入、欠失を引
き起こす可能性がある、又は遺伝子の発現を妨げる可能性のあるフレームシフト突然変異
を引き起こす可能性がある。従って、正常な遺伝子発現を妨害することによって、HBV
の感染及び増殖は、本明細書に開示されている方法に従って、減少又は排除することがで
きる。本発明はまた、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのORF内
に位置する認識配列に対する特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用す
るHBVの治療のための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は更に、HBVのレベル
を低下させる、及び/又はHBVの感染に関連する症状を低下させるために、本明細書に
開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをHBVに感染した対象に送達する方法を
提供する。
レアーゼを提供する。本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、少なくとも2つの
B型肝炎ウイルスの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認
識配列を認識して切断する。本明細書において開示される遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼによるそのような認識配列での切断は、切断部位での非相同末端結合(NHEJ)に
起因して、1以上のウイルスタンパク質の発現を乱し得る。NHEJは、挿入、欠失を引
き起こす可能性がある、又は遺伝子の発現を妨げる可能性のあるフレームシフト突然変異
を引き起こす可能性がある。従って、正常な遺伝子発現を妨害することによって、HBV
の感染及び増殖は、本明細書に開示されている方法に従って、減少又は排除することがで
きる。本発明はまた、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのORF内
に位置する認識配列に対する特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用す
るHBVの治療のための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は更に、HBVのレベル
を低下させる、及び/又はHBVの感染に関連する症状を低下させるために、本明細書に
開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをHBVに感染した対象に送達する方法を
提供する。
従って、一態様において、本発明は、少なくとも2つのB型肝炎ウイルスの遺伝子型の
ゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認識配列を認識して切断する、遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第
1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、第1のサブユニットが認識配列の第1
の認識した半分の部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、第2のサブユニ
ットは、認識配列の第2の認識した半分の部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域
を含む。
ゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認識配列を認識して切断する、遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第
1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、第1のサブユニットが認識配列の第1
の認識した半分の部位に結合し、第1の超可変(HVR1)領域を含み、第2のサブユニ
ットは、認識配列の第2の認識した半分の部位に結合し、第2の超可変(HVR2)領域
を含む。
いくつかの実施形態では、認識配列は、B型肝炎ウイルスの少なくとも3つ、少なくと
も4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のORF内に見出される。その
ような一実施形態では、認識配列はB型肝炎ウイルスの遺伝子型A(配列番号3)のOR
F内にある。そのような実施形態は、配列番号3と異なるが本明細書に記載の1又は複数
のHBVメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型AのB型肝炎ウイルス単離体を含む
。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型AのORF並びに遺伝子型B、C
、D、E、F、及びG(それぞれ配列番号4~9)の1又は複数のORF内にある。その
ような実施形態は、配列番号3~9と異なるが本明細書に記載の1又は複数のHBVメガ
ヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型A、B、C、D、E、F、及びGのB型肝炎ウイ
ルス単離体を含む。
も4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のORF内に見出される。その
ような一実施形態では、認識配列はB型肝炎ウイルスの遺伝子型A(配列番号3)のOR
F内にある。そのような実施形態は、配列番号3と異なるが本明細書に記載の1又は複数
のHBVメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型AのB型肝炎ウイルス単離体を含む
。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型AのORF並びに遺伝子型B、C
、D、E、F、及びG(それぞれ配列番号4~9)の1又は複数のORF内にある。その
ような実施形態は、配列番号3~9と異なるが本明細書に記載の1又は複数のHBVメガ
ヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型A、B、C、D、E、F、及びGのB型肝炎ウイ
ルス単離体を含む。
いくつかの実施形態では、認識配列は、ポリメラーゼ(P)タンパク質、大表面(pr
eS1/preS2/S)タンパク質、中表面(preS2/S)タンパク質、及び小表
面(S)タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも1つ
のORF内にある。いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号10(即ち、H
BV1-2認識配列)、配列番号12(即ち、HBV5-6認識配列)、配列番号14(
即ち、HBV7-8認識配列)、又は配列番号16(即ち、HBV11-12認識配列)
を含み得る。
eS1/preS2/S)タンパク質、中表面(preS2/S)タンパク質、及び小表
面(S)タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも1つ
のORF内にある。いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号10(即ち、H
BV1-2認識配列)、配列番号12(即ち、HBV5-6認識配列)、配列番号14(
即ち、HBV7-8認識配列)、又は配列番号16(即ち、HBV11-12認識配列)
を含み得る。
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号10を含み、HVR1領域は、配列番号
18若しくは19の残基24~79、又は配列番号20若しくは21の残基215~27
0に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも9
0%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかのこのような実施形態において、HVR1領域は、配列番号18若しくは19の
残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70
、75、及び77に対応する残基、又は配列番号20若しくは21の残基215、217
、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259
、261、266、及び268に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、H
VR1領域は、配列番号18若しくは19の残基24~79、又は配列番号20若しくは
21の残基215~270を含み得る。
18若しくは19の残基24~79、又は配列番号20若しくは21の残基215~27
0に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも9
0%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかのこのような実施形態において、HVR1領域は、配列番号18若しくは19の
残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70
、75、及び77に対応する残基、又は配列番号20若しくは21の残基215、217
、219、221、223、224、229、231、233、235、237、259
、261、266、及び268に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、H
VR1領域は、配列番号18若しくは19の残基24~79、又は配列番号20若しくは
21の残基215~270を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号10を含み、HVR2領域は
、配列番号18若しくは19の残基215~270、又は配列番号20若しくは21の残
基24~79に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR2領域は、配列番号18若し
くは19の残基215、217、219、221、223、224、229、231、2
33、235、237、259、261、266、及び268に対応する残基、又は配列
番号20若しくは21の残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、
44、46、68、70、75、及び77に対応する残基を含み得る。特定の実施形態に
おいて、HVR2領域は、配列番号18若しくは19の残基215~270、又は配列番
号20若しくは21の残基24~79を含み得る。
、配列番号18若しくは19の残基215~270、又は配列番号20若しくは21の残
基24~79に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR2領域は、配列番号18若し
くは19の残基215、217、219、221、223、224、229、231、2
33、235、237、259、261、266、及び268に対応する残基、又は配列
番号20若しくは21の残基24、26、28、30、32、33、38、40、42、
44、46、68、70、75、及び77に対応する残基を含み得る。特定の実施形態に
おいて、HVR2領域は、配列番号18若しくは19の残基215~270、又は配列番
号20若しくは21の残基24~79を含み得る。
このような実施形態では、認識配列が配列番号10を含み、第1のサブユニットは、配
列番号18若しくは19の残基7~153、又は配列番号20若しくは21の残基198
~344に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも
95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第2のサブユニット
は、配列番号18若しくは19の残基198~344、又は配列番号20若しくは21の
残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの
実施形態において、第1のサブユニットは、配列番号18若しくは19の残基7~153
、又は配列番号20若しくは21の残基198~344を含み得る。同様に、いくつかの
実施形態において、第2のサブユニットは、配列番号18若しくは19の残基198~3
44、又は配列番号20若しくは21の残基7~153を含み得る。
列番号18若しくは19の残基7~153、又は配列番号20若しくは21の残基198
~344に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも
95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第2のサブユニット
は、配列番号18若しくは19の残基198~344、又は配列番号20若しくは21の
残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの
実施形態において、第1のサブユニットは、配列番号18若しくは19の残基7~153
、又は配列番号20若しくは21の残基198~344を含み得る。同様に、いくつかの
実施形態において、第2のサブユニットは、配列番号18若しくは19の残基198~3
44、又は配列番号20若しくは21の残基7~153を含み得る。
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号10を含み、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第1のサブユニットと第2のサ
ブユニットを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレ
アーゼは、配列番号18~21のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第1のサブユニットと第2のサ
ブユニットを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレ
アーゼは、配列番号18~21のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
他の実施形態では、認識配列が配列番号12を含み、HVR1領域は、配列番号22~
24のいずれか1つの残基215~270、又は配列番号25~28のいずれか1つの残
基24~79に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR1領域は、配列番号22~2
4のいずれか1つの残基215、217、219、221、223、224、229、2
31、233、235、237、259、261、266、及び268に対応する残基、
又は配列番号25~28のいずれか1つの残基24、26、28、30、32、33、3
8、40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応する残基を含み得る。
特定の実施形態において、HVR1領域は、配列番号22~24のいずれか1つの残基2
15~270、又は配列番号25~28のいずれか1つの残基24~79を含み得る。
24のいずれか1つの残基215~270、又は配列番号25~28のいずれか1つの残
基24~79に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少
なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR1領域は、配列番号22~2
4のいずれか1つの残基215、217、219、221、223、224、229、2
31、233、235、237、259、261、266、及び268に対応する残基、
又は配列番号25~28のいずれか1つの残基24、26、28、30、32、33、3
8、40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応する残基を含み得る。
特定の実施形態において、HVR1領域は、配列番号22~24のいずれか1つの残基2
15~270、又は配列番号25~28のいずれか1つの残基24~79を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号12を含み、HVR2領域は
、配列番号22~24のいずれか1つの残基24~79、又は配列番号25~28のいず
れか1つの残基215~270に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR2領域は、
配列番号22~24のいずれか1つの残基24、26、28、30、32、33、38、
40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応する残基、又は配列番号2
5~28のいずれか1つの残基215、217、219、221、223、224、22
9、231、233、235、237、259、261、266、及び268に対応する
残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR2領域は、配列番号22~24のいず
れか1つの残基24~79、又は配列番号25~28のいずれか1つの残基215~27
0を含み得る。
、配列番号22~24のいずれか1つの残基24~79、又は配列番号25~28のいず
れか1つの残基215~270に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR2領域は、
配列番号22~24のいずれか1つの残基24、26、28、30、32、33、38、
40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応する残基、又は配列番号2
5~28のいずれか1つの残基215、217、219、221、223、224、22
9、231、233、235、237、259、261、266、及び268に対応する
残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR2領域は、配列番号22~24のいず
れか1つの残基24~79、又は配列番号25~28のいずれか1つの残基215~27
0を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号12を含み、第1のサブユニ
ットは、配列番号22~24のいずれか1つの残基198~344又は配列番号25~2
8のいずれか1つの残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
み得、第2のサブユニットは、配列番号22~24のいずれか1つの残基7~153又は
配列番号25~28のいずれか1つの残基198~344に対する少なくとも80%、少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第1のサブユニットは、配
列番号22~24のいずれか1つの残基198~344又は配列番号25~28のいずれ
か1つの残基7~153を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第2のサブ
ユニットは、配列番号22~24のいずれか1つの残基7~153又は配列番号25~2
8のいずれか1つの残基198~344を含み得る。
ットは、配列番号22~24のいずれか1つの残基198~344又は配列番号25~2
8のいずれか1つの残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少な
くとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
み得、第2のサブユニットは、配列番号22~24のいずれか1つの残基7~153又は
配列番号25~28のいずれか1つの残基198~344に対する少なくとも80%、少
なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第1のサブユニットは、配
列番号22~24のいずれか1つの残基198~344又は配列番号25~28のいずれ
か1つの残基7~153を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第2のサブ
ユニットは、配列番号22~24のいずれか1つの残基7~153又は配列番号25~2
8のいずれか1つの残基198~344を含み得る。
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号12を含み、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第1のサブユニットと第2のサ
ブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号22~28のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第1のサブユニットと第2のサ
ブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号22~28のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号14を含み、HVR1領域は、配列番号
29~32のいずれか1つの残基215~270に対応するアミノ酸配列に対する少なく
とも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の
配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、
HVR1領域は、配列番号29~32のいずれか1つの残基215、217、219、2
21、223、224、229、231、233、235、237、259、261、2
66、及び268に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR1領域は
、配列番号29~32のいずれか1つの残基215~270を含み得る。
29~32のいずれか1つの残基215~270に対応するアミノ酸配列に対する少なく
とも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の
配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、
HVR1領域は、配列番号29~32のいずれか1つの残基215、217、219、2
21、223、224、229、231、233、235、237、259、261、2
66、及び268に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR1領域は
、配列番号29~32のいずれか1つの残基215~270を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号14を含み、HVR2領域は
、配列番号29~32のいずれか1つの残基24~79に対応するアミノ酸配列に対する
少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ
以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態にお
いて、HVR2領域は、配列番号29~32のいずれか1つの残基24、26、28、3
0、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応す
る残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR2領域は、配列番号29~32のい
ずれか1つの残基24~79を含み得る。
、配列番号29~32のいずれか1つの残基24~79に対応するアミノ酸配列に対する
少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ
以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態にお
いて、HVR2領域は、配列番号29~32のいずれか1つの残基24、26、28、3
0、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応す
る残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR2領域は、配列番号29~32のい
ずれか1つの残基24~79を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号14を含み、第1のサブユニ
ットは、配列番号29~32のいずれか1つの残基198~344に対する少なくとも8
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含み得、第2のサブユニットは、配列番号29~32のいず
れか1つの残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも9
0%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、第1のサブユニットは、配列番号29~32のいずれか1
つの残基198~344を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第2のサブ
ユニットは、配列番号29~32のいずれか1つの残基7~153を含み得る。
ットは、配列番号29~32のいずれか1つの残基198~344に対する少なくとも8
0%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含み得、第2のサブユニットは、配列番号29~32のいず
れか1つの残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも9
0%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、第1のサブユニットは、配列番号29~32のいずれか1
つの残基198~344を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第2のサブ
ユニットは、配列番号29~32のいずれか1つの残基7~153を含み得る。
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号14を含み、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第1のサブユニットと第2のサ
ブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号29~32のいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第1のサブユニットと第2のサ
ブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号29~32のいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号16を含み、HVR1領域は、配列番号
33~39のいずれか1つの残基215~270に対する少なくとも80%、少なくとも
85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR1領域は、配列番
号33~39のいずれか1つの残基215、217、219、221、223、224、
229、231、233、235、237、259、261、266、及び268に対応
する残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR1領域は、配列番号33~39の
いずれか1つの残基215~270を含み得る。
33~39のいずれか1つの残基215~270に対する少なくとも80%、少なくとも
85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR1領域は、配列番
号33~39のいずれか1つの残基215、217、219、221、223、224、
229、231、233、235、237、259、261、266、及び268に対応
する残基を含み得る。特定の実施形態において、HVR1領域は、配列番号33~39の
いずれか1つの残基215~270を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号16を含み、HVR2領域は
、配列番号33~39のいずれか1つの残基24~79に対する少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR2領域は、
配列番号33~39のいずれか1つの残基24、26、28、30、32、33、38、
40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応する残基を含み得る。特定
の実施形態において、HVR2領域は、配列番号33~39のいずれか1つの残基24~
79を含み得る。
、配列番号33~39のいずれか1つの残基24~79に対する少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、HVR2領域は、
配列番号33~39のいずれか1つの残基24、26、28、30、32、33、38、
40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応する残基を含み得る。特定
の実施形態において、HVR2領域は、配列番号33~39のいずれか1つの残基24~
79を含み得る。
このような実施形態では、認識配列が配列番号16を含み、第1のサブユニットは、配
列番号33~39のいずれか1つの残基198~344に対する少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得、第2のサブユニットは、配列番号33~39のいずれか1つの
残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの
実施形態において、第1のサブユニットは、配列番号33~39のいずれか1つの残基1
98~344を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第2のサブユニットは
、配列番号33~39のいずれか1つの残基7~153を含み得る。
列番号33~39のいずれか1つの残基198~344に対する少なくとも80%、少な
くとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得、第2のサブユニットは、配列番号33~39のいずれか1つの
残基7~153に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少な
くとも95%、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの
実施形態において、第1のサブユニットは、配列番号33~39のいずれか1つの残基1
98~344を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第2のサブユニットは
、配列番号33~39のいずれか1つの残基7~153を含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ
、リンカーは第1のサブユニットと第2のサブユニットとを共有結合で結合させる。特定
の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号33~39のいずれか
1つのアミノ酸配列を含み得る。
、リンカーは第1のサブユニットと第2のサブユニットとを共有結合で結合させる。特定
の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号33~39のいずれか
1つのアミノ酸配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示されている任意の遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定
の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドはmRNAであり得る。
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定
の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドはmRNAであり得る。
更なる実施形態では、mRNAは、本明細書に記載の1又は複数の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmRNAであり得る。特定の実施形態に
おいて、本発明のポリシストロニックmRNAは、限定するものではなく、本明細書に記
載の2つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンmRNA、本
明細書に記載の3つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンm
RNA、又は本明細書に記載の4つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするク
アドシストロンmRNAであり得る。そのような実施形態において、2以上の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼがポリシストロニックmRNAによってコードされ、それぞれの
コードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるHBV認識配列に対する特異
性を有する。更に、そのような実施形態では、本発明のポリシストロニックmRNAは、
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの任意の組み合わせをコードし得る
。特定の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、HBV1-2メガヌクレア
ーゼ、HBV5-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11
-12メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニック
mRNAは、HBV5-6メガヌクレアーゼ及びHBV11-12メガヌクレアーゼをコ
ードするバイシストロンmRNAであり得る。
ガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmRNAであり得る。特定の実施形態に
おいて、本発明のポリシストロニックmRNAは、限定するものではなく、本明細書に記
載の2つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンmRNA、本
明細書に記載の3つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンm
RNA、又は本明細書に記載の4つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするク
アドシストロンmRNAであり得る。そのような実施形態において、2以上の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼがポリシストロニックmRNAによってコードされ、それぞれの
コードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるHBV認識配列に対する特異
性を有する。更に、そのような実施形態では、本発明のポリシストロニックmRNAは、
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの任意の組み合わせをコードし得る
。特定の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、HBV1-2メガヌクレア
ーゼ、HBV5-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11
-12メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニック
mRNAは、HBV5-6メガヌクレアーゼ及びHBV11-12メガヌクレアーゼをコ
ードするバイシストロンmRNAであり得る。
更なる実施形態において、本発明のポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載の
1以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、並びにHBV感染細胞及び/又はHBV感
染対象において治療上有益な効果を誘導する1以上の更なるタンパク質をコードし得る。
1以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、並びにHBV感染細胞及び/又はHBV感
染対象において治療上有益な効果を誘導する1以上の更なるタンパク質をコードし得る。
別の態様において、本発明は、本発明の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含む組換えDNA構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換
えDNA構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
をコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、組換えDNA構築物
は、2以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形
態において、組換えDNA構築物は、2つのカセット、3つのカセット、4つのカセット
、又はそれ以上を含み得る。
ードする核酸配列を含む組換えDNA構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換
えDNA構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
をコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、組換えDNA構築物
は、2以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形
態において、組換えDNA構築物は、2つのカセット、3つのカセット、4つのカセット
、又はそれ以上を含み得る。
他の実施形態において、組換えDNA構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核
酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
特定の実施形態では、組換えDNA構築物は、本明細書に開示されている任意の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターをコードする
。そのような実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデ
ノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり得る。特定の実施形態で
は、ウイルスベクターは組換えAAVベクターであり得る。
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターをコードする
。そのような実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデ
ノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであり得る。特定の実施形態で
は、ウイルスベクターは組換えAAVベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットとを含む。他の実
施形態では、ウイルスベクターは、2つ以上のカセットを含み、各カセットがプロモータ
と、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み
、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対
する特異性を有する。
子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットとを含む。他の実
施形態では、ウイルスベクターは、2つ以上のカセットを含み、各カセットがプロモータ
と、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み
、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対
する特異性を有する。
他の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列
を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
別の態様において、本発明は、本発明の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイル
スベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイル
ス(AAV)ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAA
Vベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセ
ットを含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、2以上のカセットを含み、各カセ
ットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるH
BV認識配列に対する特異性を有する。
ードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイル
スベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイル
ス(AAV)ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAA
Vベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセ
ットを含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、2以上のカセットを含み、各カセ
ットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるH
BV認識配列に対する特異性を有する。
更なる実施形態においてウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸
配列を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を
駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
配列を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を
駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
別の態様では、本発明は、HBVによって引き起こされるB型肝炎ウイルス(HBV)
又は肝細胞がんを有する対象を治療するための医薬組成物であって、医薬的に許容される
担体と、(a)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸、
又は(b)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質とを含む医薬
組成物を提供し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも
2つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認識配列に対す
る特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識配列は、B型肝炎ウイルスの少なくと
も3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のORF内に
ある。そのような一実施形態では、認識配列は、HBV遺伝子型A(配列番号3)のOR
F内にあるか、認識配列、及びHBVの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3
つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの他の遺伝子型を含むその単
離体である。様々な実施形態において、更なるHBV遺伝子型は、遺伝子型B、C、D、
E、F、及び/若しくはG(それぞれ配列番号4~9)、又は本明細書に記載の1以上の
HBV認識配列を含むその単離体を含み得る。
又は肝細胞がんを有する対象を治療するための医薬組成物であって、医薬的に許容される
担体と、(a)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸、
又は(b)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質とを含む医薬
組成物を提供し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも
2つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム(ORF)内の認識配列に対す
る特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識配列は、B型肝炎ウイルスの少なくと
も3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のORF内に
ある。そのような一実施形態では、認識配列は、HBV遺伝子型A(配列番号3)のOR
F内にあるか、認識配列、及びHBVの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3
つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの他の遺伝子型を含むその単
離体である。様々な実施形態において、更なるHBV遺伝子型は、遺伝子型B、C、D、
E、F、及び/若しくはG(それぞれ配列番号4~9)、又は本明細書に記載の1以上の
HBV認識配列を含むその単離体を含み得る。
いくつかの実施形態において、医薬組成物の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は医
薬組成物の核酸配列によってコードされるものは、ポリメラーゼ(P)タンパク質、大表
面(preS1/preS2/S)タンパク質、中表面(preS2/S)タンパク質、
及び小表面(S)タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なく
とも1つのORF内の認識配列に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識
配列は配列番号10、12、14、又は16を含み得る。
薬組成物の核酸配列によってコードされるものは、ポリメラーゼ(P)タンパク質、大表
面(preS1/preS2/S)タンパク質、中表面(preS2/S)タンパク質、
及び小表面(S)タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なく
とも1つのORF内の認識配列に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識
配列は配列番号10、12、14、又は16を含み得る。
一実施形態において、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを
コードする医薬組成物の核酸配列は、本明細書に記載されているmRNAであり得る。い
くつかのそのような実施形態において、mRNAは、本明細書に記載のポリシストロニッ
クmRNAであり得、その結果、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレ
アーゼが、インビボで標的細胞において発現される。
コードする医薬組成物の核酸配列は、本明細書に記載されているmRNAであり得る。い
くつかのそのような実施形態において、mRNAは、本明細書に記載のポリシストロニッ
クmRNAであり得、その結果、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレ
アーゼが、インビボで標的細胞において発現される。
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載される組換えDNA構築物を含む
。いくつかのそのような実施形態では、組換えDNA構築物は、プロモータと、本発明の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の
実施形態では、医薬組成物の組換えDNA構築物は、2以上のカセットを含み、各カセッ
トがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHB
V認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形態において、医薬組成物の組換えDN
A構築物は、2つのカセット、3つのカセット、4つのカセット、又はそれ以上を含み得
る。
クレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載される組換えDNA構築物を含む
。いくつかのそのような実施形態では、組換えDNA構築物は、プロモータと、本発明の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の
実施形態では、医薬組成物の組換えDNA構築物は、2以上のカセットを含み、各カセッ
トがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHB
V認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形態において、医薬組成物の組換えDN
A構築物は、2つのカセット、3つのカセット、4つのカセット、又はそれ以上を含み得
る。
他の実施形態では、医薬組成物の組換えDNA構築物は、プロモータ及びポリシストロ
ニック核酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発
現を駆動して、標的細胞においてインビボで本明細書に記載のポリシストロニックmRN
Aを生成し、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞に
おいて発現されるようにする。
ニック核酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発
現を駆動して、標的細胞においてインビボで本明細書に記載のポリシストロニックmRN
Aを生成し、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞に
おいて発現されるようにする。
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む。そのような一実施形態
では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はAA
Vであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAAVベクターであり得
る。
クレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む。そのような一実施形態
では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はAA
Vであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えAAVベクターであり得
る。
いくつかのそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む
。他の実施形態では、ウイルスベクターは、2以上のカセットを含み、各カセットがプロ
モータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列と
を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配
列に対する特異性を有する。
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む
。他の実施形態では、ウイルスベクターは、2以上のカセットを含み、各カセットがプロ
モータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列と
を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配
列に対する特異性を有する。
他のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニッ
ク核酸配列を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の
発現を駆動して、標的細胞においてインビボで、本明細書に記載のポリシストロニックm
RNAを生成し、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細
胞において発現されるようにする。
ク核酸配列を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の
発現を駆動して、標的細胞においてインビボで、本明細書に記載のポリシストロニックm
RNAを生成し、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細
胞において発現されるようにする。
そのような一実施形態では、医薬組成物は、配列番号10を認識して切断する、本明細
書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むこと
ができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号18~
21のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むこと
ができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号18~
21のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号12を認識して切断する、本明細書に開示
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号22~28のう
ちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号22~28のう
ちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号14を認識して切断する、本明細書に開示
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号29~32のい
ずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号29~32のい
ずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号16を認識して切断する、本明細書に開示
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号33~39のい
ずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又はそれをコードする核酸)を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号33~39のい
ずれか1つのアミノ酸配列を含み得る。
様々な実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の2以上の遺伝子操作された
メガヌクレアーゼタンパク質を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、
本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する。他の実施形態では、医
薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする2以上の
核酸を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の異なる
HBV認識配列に対する特異性を有する。そのような実施形態では、2以上の核酸は、本
明細書に記載のmRNA、本明細書に記載の組換えDNA構築物、及び/又は本明細書に
記載のウイルスベクターに含まれ得る。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記
載の1以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、及び本明細書に記載の遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードする1以上の核酸(即ち、mRNA、組換えDN
A構築物、又はウイルスベクター)を含み得、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びコ
ードされる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載された異なるHBV認
識配列に対して特異性を有する。
メガヌクレアーゼタンパク質を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、
本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する。他の実施形態では、医
薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする2以上の
核酸を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の異なる
HBV認識配列に対する特異性を有する。そのような実施形態では、2以上の核酸は、本
明細書に記載のmRNA、本明細書に記載の組換えDNA構築物、及び/又は本明細書に
記載のウイルスベクターに含まれ得る。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記
載の1以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、及び本明細書に記載の遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードする1以上の核酸(即ち、mRNA、組換えDN
A構築物、又はウイルスベクター)を含み得、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びコ
ードされる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載された異なるHBV認
識配列に対して特異性を有する。
更なる実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼタンパク質の組み合わせ、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸の組み合わせ(即ち、mRNA、組換えDNA構築物、ウイルスベクター)
、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質と遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼタンパク質をコードする核酸の組み合わせを含み得、医薬組成物の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ及び/又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの組み合わせ
は、HBV遺伝子型A、B、C、D、E、F、及びG(配列番号3~9)のそれぞれにお
ける認識配列、並びに本明細書に記載のHBV認識配列を含む各遺伝子型の単離体を認識
して切断することができる。
ーゼタンパク質の組み合わせ、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸の組み合わせ(即ち、mRNA、組換えDNA構築物、ウイルスベクター)
、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質と遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼタンパク質をコードする核酸の組み合わせを含み得、医薬組成物の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ及び/又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの組み合わせ
は、HBV遺伝子型A、B、C、D、E、F、及びG(配列番号3~9)のそれぞれにお
ける認識配列、並びに本明細書に記載のHBV認識配列を含む各遺伝子型の単離体を認識
して切断することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に記載
の1又は複数のmRNAを含むことができる。特定の実施形態において、医薬組成物の脂
質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する本発明の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の2以上のm
RNAを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒子は、それぞれが異なるHBV認識配
列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする、本
明細書に記載の2つ、3つ、又は4つのmRNAを含み得る。他の実施形態では、医薬組
成物の脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する
本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に
記載の1以上のポリシストロニックmRNAを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒
子は、本明細書に記載の2つ、3つ、又は4つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードするポリシストロニックmRNAを含むことができる。他の特定の実施形態で、脂質
ナノ粒子は、本明細書に記載の2以上のポリシストロニックmRNAを含むことができ、
各々本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施
形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込みを増強する組成を
有する。
の1又は複数のmRNAを含むことができる。特定の実施形態において、医薬組成物の脂
質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する本発明の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の2以上のm
RNAを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒子は、それぞれが異なるHBV認識配
列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする、本
明細書に記載の2つ、3つ、又は4つのmRNAを含み得る。他の実施形態では、医薬組
成物の脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する
本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に
記載の1以上のポリシストロニックmRNAを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒
子は、本明細書に記載の2つ、3つ、又は4つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードするポリシストロニックmRNAを含むことができる。他の特定の実施形態で、脂質
ナノ粒子は、本明細書に記載の2以上のポリシストロニックmRNAを含むことができ、
各々本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施
形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込みを増強する組成を
有する。
別の態様において、本発明は、HBVを有する対象を治療するための方法を提供する。
同様に、本明細書で提供されるのは、HBVのレベル及び/又は増殖を減少させるため、
あるいはHBVに関連する症状を減少させるための方法である。方法は、対象の標的細胞
に、(a)遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで発現される核酸、又は(b)遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼタンパク質を送達することを含み、遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのORF中の認識
配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識配列を認識して
切断し、そのため標的細胞のHBVゲノムを切断する。この方法は、対象におけるHBV
の感染及び/又は増殖を減少又は排除することができる。
同様に、本明細書で提供されるのは、HBVのレベル及び/又は増殖を減少させるため、
あるいはHBVに関連する症状を減少させるための方法である。方法は、対象の標的細胞
に、(a)遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで発現される核酸、又は(b)遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼタンパク質を送達することを含み、遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのORF中の認識
配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識配列を認識して
切断し、そのため標的細胞のHBVゲノムを切断する。この方法は、対象におけるHBV
の感染及び/又は増殖を減少又は排除することができる。
別の態様において、本発明は、HBVによって引き起こされたHCCを有する対象を治
療するための方法を提供する。方法は、対象の標的細胞に、(1)(a)遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標
的細胞においてインビボで発現される核酸、又は(b)遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼタンパク質、及び(2)自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列及びメガヌクレ
アーゼ切断部位に隣接する配列と相同な配列を含む核酸を送達することを含み、遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムの
ORF中の認識配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識
配列を認識して切断し、そのため標的細胞のHBVゲノムを切断し、自殺遺伝子は、相同
組換えによって切断されたHBVゲノムに挿入され、自殺遺伝子の発現は標的細胞を死滅
させる。
療するための方法を提供する。方法は、対象の標的細胞に、(1)(a)遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標
的細胞においてインビボで発現される核酸、又は(b)遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼタンパク質、及び(2)自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列及びメガヌクレ
アーゼ切断部位に隣接する配列と相同な配列を含む核酸を送達することを含み、遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムの
ORF中の認識配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識
配列を認識して切断し、そのため標的細胞のHBVゲノムを切断し、自殺遺伝子は、相同
組換えによって切断されたHBVゲノムに挿入され、自殺遺伝子の発現は標的細胞を死滅
させる。
いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は標的細胞に対して直接致死性である。いくつか
のそのような態様において、直接致死性な自殺遺伝子は、毒性ポリペプチド又はアポトー
シス促進タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は標的細胞
に対して間接致死性であり、標的細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する。
いくつかのそのような態様において、間接致死性な自殺遺伝子は、対象の免疫系によって
異物であると認識され、体液性又は細胞性免疫応答によって標的化される細胞表面タンパ
ク質をコードする。他のそのような実施形態において、間接致死性な自殺遺伝子は、MH
CクラスI分子によって提示され、対象の免疫系によって異物であると認識され、細胞傷
害性免疫応答によって標的化されるポリペプチドをコードする。
のそのような態様において、直接致死性な自殺遺伝子は、毒性ポリペプチド又はアポトー
シス促進タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は標的細胞
に対して間接致死性であり、標的細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する。
いくつかのそのような態様において、間接致死性な自殺遺伝子は、対象の免疫系によって
異物であると認識され、体液性又は細胞性免疫応答によって標的化される細胞表面タンパ
ク質をコードする。他のそのような実施形態において、間接致死性な自殺遺伝子は、MH
CクラスI分子によって提示され、対象の免疫系によって異物であると認識され、細胞傷
害性免疫応答によって標的化されるポリペプチドをコードする。
HBV感染又はHCCの治療方法のいくつかの実施形態では、認識配列は少なくとも3
つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のB型肝炎ウイル
スのORF内に見られる。そのような一実施形態では、認識配列はB型肝炎ウイルスの遺
伝子型A(配列番号3)のORF内にある。そのような実施形態は、配列番号3と異なる
が本明細書に記載の1又は複数のHBVメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Aの
B型肝炎ウイルス単離体を含む。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型A
のORF並びに遺伝子型B、C、D、E、F、及びG(それぞれ配列番号4~9)の1又
は複数のORF内にある。そのような実施形態は、配列番号3~9と異なるが本明細書に
記載の1又は複数のHBVメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型A、B、C、D、
E、F、及びGのB型肝炎ウイルス単離体を含む。
つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のB型肝炎ウイル
スのORF内に見られる。そのような一実施形態では、認識配列はB型肝炎ウイルスの遺
伝子型A(配列番号3)のORF内にある。そのような実施形態は、配列番号3と異なる
が本明細書に記載の1又は複数のHBVメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Aの
B型肝炎ウイルス単離体を含む。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型A
のORF並びに遺伝子型B、C、D、E、F、及びG(それぞれ配列番号4~9)の1又
は複数のORF内にある。そのような実施形態は、配列番号3~9と異なるが本明細書に
記載の1又は複数のHBVメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型A、B、C、D、
E、F、及びGのB型肝炎ウイルス単離体を含む。
HBV感染又はHCCの治療方法のそのような実施形態において、認識配列は、ポリメ
ラーゼ(P)タンパク質、大表面(preS1/preS2/S)タンパク質、中表面(
preS2/S)タンパク質、及び小表面(S)タンパク質からなる群から選択されるタ
ンパク質をコードする、少なくとも1つのORF内にあってよい。いくつかの実施形態に
おいて、認識配列は、配列番号10(即ち、HBV1-2認識配列)、配列番号12(即
ち、HBV5-6認識配列)、配列番号14(即ち、HBV7-8認識配列)、又は配列
番号16(即ち、HBV11-12認識配列)を含み得る。
ラーゼ(P)タンパク質、大表面(preS1/preS2/S)タンパク質、中表面(
preS2/S)タンパク質、及び小表面(S)タンパク質からなる群から選択されるタ
ンパク質をコードする、少なくとも1つのORF内にあってよい。いくつかの実施形態に
おいて、認識配列は、配列番号10(即ち、HBV1-2認識配列)、配列番号12(即
ち、HBV5-6認識配列)、配列番号14(即ち、HBV7-8認識配列)、又は配列
番号16(即ち、HBV11-12認識配列)を含み得る。
HBV感染症又はHCCの治療方法の特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼタンパク質又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。
レアーゼタンパク質又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。
更なる実施形態において、HBV感染又はHCCの治療方法は、少なくとも、医薬的に
許容される担体、及び(a)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで
発現される核酸、又は(b)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパ
ク質を含む本明細書に記載の本発明の任意の医薬組成物を対象に投与することを含む。
許容される担体、及び(a)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで
発現される核酸、又は(b)本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパ
ク質を含む本明細書に記載の本発明の任意の医薬組成物を対象に投与することを含む。
HBV感染又はHCCの治療方法のいくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を標的肝細胞の細胞
に送達することができる。特定の実施形態では、有効量の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、標的肝細胞の細胞に送
達することができる。
クレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を標的肝細胞の細胞
に送達することができる。特定の実施形態では、有効量の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、標的肝細胞の細胞に送
達することができる。
特定の実施形態では、肝細胞の細胞への送達はエクスビボで生じ、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸が送達された有
効量の肝細胞の細胞が、対象に投与される。
ガヌクレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸が送達された有
効量の肝細胞の細胞が、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、肝毒性タンパク質、又は肝毒性タンパク質をコードする核酸
若しくはAAVが、本明細書に開示されている医薬組成物と共に投与される。
若しくはAAVが、本明細書に開示されている医薬組成物と共に投与される。
本方法の特定の実施形態では、第1の認識配列は配列番号10を含み得る。いくつかの
そのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号10を認
識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の
実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号18~21のうちのいず
れか1つのアミノ酸配列を含み得る。
そのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号10を認
識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の
実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号18~21のうちのいず
れか1つのアミノ酸配列を含み得る。
方法の別の実施形態では、第1の認識配列は配列番号12を含み得る。いくつかのその
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号12を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号22~28のうちのいずれか
1つのアミノ酸配列を含み得る。
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号12を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号22~28のうちのいずれか
1つのアミノ酸配列を含み得る。
方法の他の実施形態では、第1の認識配列は配列番号14を含み得る。いくつかのその
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号14を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号29~32のいずれか1つの
アミノ酸配列を含み得る。
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号14を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号29~32のいずれか1つの
アミノ酸配列を含み得る。
方法の他の実施形態では、第1の認識配列は配列番号16を含み得る。いくつかのその
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号16を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号33~39のいずれか1つの
アミノ酸配列を含み得る。
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号16を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号33~39のいずれか1つの
アミノ酸配列を含み得る。
本方法の特定の実施形態では、対象はヒト等の哺乳動物であり得る。
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための本明細書に記載の遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、HBVを治療するため、HBVのレベル
若しくは増殖を減少させるため、HBVに関連する症状を減少させるため、又はHCCを
治療するための医薬品の製造において、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼを使用することを提供する。
たメガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、HBVを治療するため、HBVのレベル
若しくは増殖を減少させるため、HBVに関連する症状を減少させるため、又はHCCを
治療するための医薬品の製造において、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼを使用することを提供する。
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための単離されたポリヌクレオチドを提
供し、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発明は更に、HBVを治療するため、HB
Vのレベル若しくは増殖を減少させるため、HBVに関連する症状を減少させるため、又
はHCCを治療するための医薬品の製造において、単離されたポリヌクレオチドを使用す
ることを提供する。
供し、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発明は更に、HBVを治療するため、HB
Vのレベル若しくは増殖を減少させるため、HBVに関連する症状を減少させるため、又
はHCCを治療するための医薬品の製造において、単離されたポリヌクレオチドを使用す
ることを提供する。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための組換えAAVベクターを提供し
、組換えAAVベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオ
チドは本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む
。本発明は更に、HBVを治療するため、HBVのレベル若しくは増殖を減少させるため
、HBVに関連する症状を軽減するため、又はHCCを治療するための医薬品の製造にお
いて組換えAAVベクターを使用することを提供し、組換えAAVベクターは、単離され
たポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。
、組換えAAVベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオ
チドは本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む
。本発明は更に、HBVを治療するため、HBVのレベル若しくは増殖を減少させるため
、HBVに関連する症状を軽減するため、又はHCCを治療するための医薬品の製造にお
いて組換えAAVベクターを使用することを提供し、組換えAAVベクターは、単離され
たポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。
本発明の前述及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参
照することによって、より十分に理解することができる。明確にするために別々の実施形
態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて
提供することもできる。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含さ
れ、あたかもそれぞれの、また全ての組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているか
のように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈
で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切なサブコンビネーション
で提供することもできる。実施形態に列挙された特徴の全てのサブコンビネーションはま
た、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの、また全てのそのようなサブ
コンビネーションが本明細書に個々にそして明示的に開示されたかのように、本明細書に
開示される。本明細書に開示された本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本
発明の他の各々の態様に適用される。
照することによって、より十分に理解することができる。明確にするために別々の実施形
態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて
提供することもできる。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含さ
れ、あたかもそれぞれの、また全ての組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているか
のように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈
で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切なサブコンビネーション
で提供することもできる。実施形態に列挙された特徴の全てのサブコンビネーションはま
た、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの、また全てのそのようなサブ
コンビネーションが本明細書に個々にそして明示的に開示されたかのように、本明細書に
開示される。本明細書に開示された本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本
発明の他の各々の態様に適用される。
配列の簡単な説明
配列番号1は、緑藻クラミドモナスからの野生型I-CreIメガヌクレアーゼのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号1は、緑藻クラミドモナスからの野生型I-CreIメガヌクレアーゼのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号2は、LAGLIDADGのアミノ酸配列を示す。
配列番号3は、HBV遺伝子型Aのアミノ酸配列を示す。
配列番号4は、HBV遺伝子型Bのアミノ酸配列を示す。
配列番号5は、HBV遺伝子型Cのアミノ酸配列を示す。
配列番号6は、HBV遺伝子型Dのアミノ酸配列を示す。
配列番号7は、HBV遺伝子型Eのアミノ酸配列を示す。
配列番号8は、HBV遺伝子型Fのアミノ酸配列を示す。
配列番号9は、HBV遺伝子型Gのアミノ酸配列を示す。
配列番号10は、HBV1-2認識配列(センス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号11は、HBV1-2認識配列(アンチセンス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号12は、HBV5-6認識配列(センス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号13は、HBV5-6認識配列(アンチセンス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号14は、HBV7-8認識配列(センス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号15は、HBV7-8認識配列(アンチセンス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号16は、HBV11-12認識配列(センス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号17は、HBV11-12認識配列(アンチセンス)のアミノ酸配列を示す。
配列番号18は、HBV1-2×.2メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号19は、HBV1-2×.14メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号20は、HBV1-2×.68メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号21は、HBV1-2×.93メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号22は、HBV5-6×.33メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号23は、HBV5-6×.84メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号24は、HBV5-6×.90メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号25は、HBV5-6×.4メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号26は、HBV5-6×.5メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号27は、HBV5-6×.68メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号28は、HBV5-6×.79メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号29は、HBV7-8×.2メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号30は、HBV7-8×.9メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号31は、HBV7-8×.17メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号32は、HBV7-8×.44メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号33は、HBV11-12×.26メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号34は、HBV11-12×.9メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号35は、HBV11-12×.13メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号36は、HBV11-12×.16メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号37は、HBV11-12×.27メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号38は、HBV11-12×.41メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号39は、HBV11-12×.48メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号40は、HBV1-2×.2メガヌクレアーゼHBV1結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号41は、HBV1-2×.14メガヌクレアーゼHBV1結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号42は、HBV1-2×.68メガヌクレアーゼHBV1結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号43は、HBV1-2×.93メガヌクレアーゼHBV1結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号44は、HBV1-2×.2メガヌクレアーゼHBV2結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号45は、HBV1-2×.14メガヌクレアーゼHBV2-結合サブユニット
のアミノ酸配列を示す。
のアミノ酸配列を示す。
配列番号46は、HBV1-2×.68メガヌクレアーゼHBV2結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号47は、HBV1-2×.93メガヌクレアーゼHBV2結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号48は、HBV5-6×.33メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号49は、HBV5-6×.84メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号50は、HBV5-6×.90メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号51は、HBV5-6×.4メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号52は、HBV5-6×.5メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号53は、HBV5-6×.68メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号54は、HBV5-6×.79メガヌクレアーゼHBV5結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号55は、HBV5-6×.33メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号56は、HBV5-6×.84メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号57は、HBV5-6×.90メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号58は、HBV5-6×.4メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号59は、HBV5-6×.5メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号60は、HBV5-6×.68メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号61は、HBV5-6×.79メガヌクレアーゼHBV6結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号62は、HBV7-8×.2メガヌクレアーゼHBV7結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号63は、HBV7-8×.9メガヌクレアーゼHBV7結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号64は、HBV7-8×.17メガヌクレアーゼHBV7結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号65は、HBV7-8×.44メガヌクレアーゼHBV7結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号66は、HBV7-8×.2メガヌクレアーゼHBV8結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号67は、HBV7-8×.9メガヌクレアーゼHBV8結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
ミノ酸配列を示す。
配列番号68は、HBV7-8×.17メガヌクレアーゼHBV8-結合サブユニット
のアミノ酸配列を示す。
のアミノ酸配列を示す。
配列番号69は、HBV7-8×.44メガヌクレアーゼHBV8結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
アミノ酸配列を示す。
配列番号70は、HBV11-12×.26メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号71は、HBV11-12×.9メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
トのアミノ酸配列を示す。
配列番号72は、HBV11-12×.13メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号73は、HBV11-12×.16メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号74は、HBV11-12×.27メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号75は、HBV11-12×.41メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号76は、HBV11-12×.48メガヌクレアーゼHBV11結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号77は、HBV11-12×.26メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号78は、HBV11-12×.9メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
トのアミノ酸配列を示す。
配列番号79は、HBV11-12×.13メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号80は、HBV11-12×.16メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号81は、HBV11-12×.27メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号82は、HBV11-12×.41メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号83は、HBV11-12×.48メガヌクレアーゼHBV12結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号84は、第1の半分の部位の-4位でのGからCへの置換を伴うHBV遺伝子
型AのHBV1-2認識配列に対応する、HBV遺伝子型Dに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
型AのHBV1-2認識配列に対応する、HBV遺伝子型Dに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
配列番号85は、第1の半分の部位の-3位にてGからCへの置換を伴うHBV遺伝子
型AのHBV5-6認識配列に対応する、HBV遺伝子型Fに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
型AのHBV5-6認識配列に対応する、HBV遺伝子型Fに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
配列番号86は、第1の半分の部位の-1位にてCからTへの置換を伴うHBV遺伝子
型AのHBV7-8認識配列に対応する、HBV遺伝子型Eに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
型AのHBV7-8認識配列に対応する、HBV遺伝子型Eに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
1.1 基準及び定義
本明細書で言及している特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本
明細書に引用されている、発行された米国特許、許可出願、公開された外国出願、及びG
enBankデータベースの配列を含む参考文献は、あたかも各々が具体的且つ個別に参
照により組み込まれることが示されているような程度で、参照により本明細書に組み込ま
れる。
明細書に引用されている、発行された米国特許、許可出願、公開された外国出願、及びG
enBankデータベースの配列を含む参考文献は、あたかも各々が具体的且つ個別に参
照により組み込まれることが示されているような程度で、参照により本明細書に組み込ま
れる。
本発明は様々な形で具現化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるも
のと解釈されるべきではない。むしろ、本開示が徹底的且つ完全なものであり、本発明の
範囲を当業者に十分に伝えるようにするために、これらの実施形態が提供されている。例
えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実
施形態に関して例示した特徴を、当該の実施形態から削除することができる。更に、本明
細書で示唆している実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示からみて当業者には
明らかであり、それらは本発明から逸脱しない。
のと解釈されるべきではない。むしろ、本開示が徹底的且つ完全なものであり、本発明の
範囲を当業者に十分に伝えるようにするために、これらの実施形態が提供されている。例
えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実
施形態に関して例示した特徴を、当該の実施形態から削除することができる。更に、本明
細書で示唆している実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示からみて当業者には
明らかであり、それらは本発明から逸脱しない。
他に定義されない限り、本明細書で使用している全ての専門用語及び科学的用語は、本
発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書の本発
明の説明で使用している専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としてお
り、本発明を限定することを意図してはいない。
発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書の本発
明の説明で使用している専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としてお
り、本発明を限定することを意図してはいない。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参
照により本明細書に組み入れられる。
照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用しているとき、「a」、「an」、又は「the」は、1又は複数を意
味し得る。例えば、「a cell(細胞)」は、単一の細胞又は多数の細胞を意味し得
る。
味し得る。例えば、「a cell(細胞)」は、単一の細胞又は多数の細胞を意味し得
る。
本明細書で使用しているとき、他に具体的に示されない限り、「又は」という語は、「
及び/又は」の包括的な意味で使用しており、「いずれか/又は」の排他的な意味では使
用していない。
及び/又は」の包括的な意味で使用しており、「いずれか/又は」の排他的な意味では使
用していない。
本明細書で使用しているとき、「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」の用語は
、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在する又は遺伝子操
作された酵素について言及するために、互換的に使用されている。
、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在する又は遺伝子操
作された酵素について言及するために、互換的に使用されている。
本明細書で使用しているとき、「メガヌクレアーゼ」の用語は、12塩基対より大きい
認識配列で二本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼのことを示す。好ましくは、本発
明のメガヌクレアーゼの認識配列は22塩基対である。メガヌクレアーゼは、I-Cre
Iに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、DNAの結合特異性、DNAの切断
活性、DNAの結合親和性、又は二量体化の特性に関して、天然のI-CreIに対して
改変されているI-CreIの遺伝子操作された変異体を示すことができる。そのような
改変されたI-CreIの変異体を産生するための方法は、当技術分野において公知であ
る(例えば、国際公開第2007/047859号パンフレット)。本明細書で使用して
いるとき、メガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖DNAに結合する。メガヌク
レアーゼはまた、ペプチドリンカーを用いて一対のDNA結合ドメインが単一のポリペプ
チドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンド
ヌクレアーゼ」の用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本発明のメガ
ヌクレアーゼは、細胞内で発現したとき細胞の生存率に対する有害な影響を観察せずに実
質的に無毒であるか、本明細書に記載の方法を用いて測定したときにメガヌクレアーゼ切
断活性の顕著な低下がある。
認識配列で二本鎖DNAに結合するエンドヌクレアーゼのことを示す。好ましくは、本発
明のメガヌクレアーゼの認識配列は22塩基対である。メガヌクレアーゼは、I-Cre
Iに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、DNAの結合特異性、DNAの切断
活性、DNAの結合親和性、又は二量体化の特性に関して、天然のI-CreIに対して
改変されているI-CreIの遺伝子操作された変異体を示すことができる。そのような
改変されたI-CreIの変異体を産生するための方法は、当技術分野において公知であ
る(例えば、国際公開第2007/047859号パンフレット)。本明細書で使用して
いるとき、メガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖DNAに結合する。メガヌク
レアーゼはまた、ペプチドリンカーを用いて一対のDNA結合ドメインが単一のポリペプ
チドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンド
ヌクレアーゼ」の用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本発明のメガ
ヌクレアーゼは、細胞内で発現したとき細胞の生存率に対する有害な影響を観察せずに実
質的に無毒であるか、本明細書に記載の方法を用いて測定したときにメガヌクレアーゼ切
断活性の顕著な低下がある。
本明細書で使用しているとき、「一本鎖メガヌクレアーゼ」の用語は、リンカーによっ
て結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドをいう。一本鎖メガヌ
クレアーゼは、N末端サブユニット-リンカー-C末端サブユニットという構成を有する
。2つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般にアミノ酸配列において同一ではなく、非
同一DNA配列を認識する。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリ
ンドローム認識配列又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼ
は実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌ
クレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌ
クレアーゼ」の用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを示すことができる。
て結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドをいう。一本鎖メガヌ
クレアーゼは、N末端サブユニット-リンカー-C末端サブユニットという構成を有する
。2つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般にアミノ酸配列において同一ではなく、非
同一DNA配列を認識する。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリ
ンドローム認識配列又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼ
は実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌ
クレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌ
クレアーゼ」の用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを示すことができる。
本明細書で使用しているとき、「リンカー」の用語は、2つのメガヌクレアーゼサブユ
ニットを単一のポリペプチドに結合するために使用する外因性ペプチド配列をいう。リン
カーは、天然タンパク質に見られる配列を有しても、いかなる天然タンパク質にも見られ
ない人工的な配列であってもよい。リンカーは柔軟で二次構造を欠いていることがあり、
又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していることがある。リンカ
ーとしては、米国特許第8,445,251号及び米国特許第9,434,931号に包
含されるものを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態にお
いて、リンカーは、配列番号18~39のいずれか1つの残基154~195を含むアミ
ノ酸配列を有し得る。
ニットを単一のポリペプチドに結合するために使用する外因性ペプチド配列をいう。リン
カーは、天然タンパク質に見られる配列を有しても、いかなる天然タンパク質にも見られ
ない人工的な配列であってもよい。リンカーは柔軟で二次構造を欠いていることがあり、
又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していることがある。リンカ
ーとしては、米国特許第8,445,251号及び米国特許第9,434,931号に包
含されるものを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態にお
いて、リンカーは、配列番号18~39のいずれか1つの残基154~195を含むアミ
ノ酸配列を有し得る。
本明細書で使用しているとき、タンパク質に関する、「組換え」又は「遺伝子操作され
た」の用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物へ
遺伝子工学技術を適用した結果として、改変させたアミノ酸配列を有することを意味する
。核酸に関する、「組換え」又は「遺伝子操作された」の用語は、遺伝子工学技術を適用
した結果として、改変させた核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては
、PCR及びDNAクローニング技術;形質移入、形質転換、及び他の遺伝子導入技術;
相同組換え;部位特異的変異誘発;並びに遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定され
ない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、
異種の宿主におけるクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換えとは
見なされない。
た」の用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物へ
遺伝子工学技術を適用した結果として、改変させたアミノ酸配列を有することを意味する
。核酸に関する、「組換え」又は「遺伝子操作された」の用語は、遺伝子工学技術を適用
した結果として、改変させた核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては
、PCR及びDNAクローニング技術;形質移入、形質転換、及び他の遺伝子導入技術;
相同組換え;部位特異的変異誘発;並びに遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定され
ない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、
異種の宿主におけるクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換えとは
見なされない。
本明細書で使用しているとき、「野生型」の用語は、同じ型の遺伝子の対立遺伝子集団
において最も一般的な、天然に存在する対立遺伝子(即ち、ポリヌクレオチド配列)をい
い、この場合野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その本来の機能を
有する。「野生型」の用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチド
も示す。野生型対立遺伝子(即ち、ポリヌクレオチド)及びポリペプチドは、野生型配列
に対して1又は複数の突然変異及び/又は置換を含む突然変異型又は変異型の対立遺伝子
及びポリペプチドと、区別可能である。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは生物に正常
な表現型を付与することができるが、突然変異型又は変異型の対立遺伝子又はポリペプチ
ドは、場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは
、組換えヌクレアーゼ又は天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」
の用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、及び/又は対象、
あるいは比較する目的のために使用する細胞、生物、及び/又は対象を示すことができる
。
において最も一般的な、天然に存在する対立遺伝子(即ち、ポリヌクレオチド配列)をい
い、この場合野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その本来の機能を
有する。「野生型」の用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチド
も示す。野生型対立遺伝子(即ち、ポリヌクレオチド)及びポリペプチドは、野生型配列
に対して1又は複数の突然変異及び/又は置換を含む突然変異型又は変異型の対立遺伝子
及びポリペプチドと、区別可能である。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは生物に正常
な表現型を付与することができるが、突然変異型又は変異型の対立遺伝子又はポリペプチ
ドは、場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは
、組換えヌクレアーゼ又は天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」
の用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、及び/又は対象、
あるいは比較する目的のために使用する細胞、生物、及び/又は対象を示すことができる
。
本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、細胞又は生物において、ある
いはその先祖において、ゲノムDNA配列が組換え技術によって意図的に改変されている
細胞又は生物をいう。本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、「トラン
スジェニック」という用語を包含する。
いはその先祖において、ゲノムDNA配列が組換え技術によって意図的に改変されている
細胞又は生物をいう。本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、「トラン
スジェニック」という用語を包含する。
組換えタンパク質に関して本明細書で使用しているとき、「改変」の用語は、参照配列
(例えば、野生型又は天然の配列)に対する組換え配列のアミノ酸残基の任意の挿入、欠
失、又は置換を意味する。
(例えば、野生型又は天然の配列)に対する組換え配列のアミノ酸残基の任意の挿入、欠
失、又は置換を意味する。
本明細書で使用しているとき、「認識配列」の用語は、エンドヌクレアーゼによって結
合及び切断されるDNA配列をいう。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、4塩基対に
よって分離されている一対の反転した9塩基対の「半分の部位」を含む。一本鎖メガヌク
レアーゼの場合、タンパク質のN末端ドメインが第1の半分の部位と接触し、タンパク質
のC末端ドメインが第2の半分の部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、4塩
基対の3’の「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着性の末端」は
、二本鎖DNA配列のエンドヌクレアーゼの切断によって産生され得る短い一本鎖DNA
セグメントである。I-CreI由来のメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレアーゼの
場合、オーバーハングは22塩基対認識配列の10~13塩基を含む。
合及び切断されるDNA配列をいう。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、4塩基対に
よって分離されている一対の反転した9塩基対の「半分の部位」を含む。一本鎖メガヌク
レアーゼの場合、タンパク質のN末端ドメインが第1の半分の部位と接触し、タンパク質
のC末端ドメインが第2の半分の部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、4塩
基対の3’の「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着性の末端」は
、二本鎖DNA配列のエンドヌクレアーゼの切断によって産生され得る短い一本鎖DNA
セグメントである。I-CreI由来のメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレアーゼの
場合、オーバーハングは22塩基対認識配列の10~13塩基を含む。
本明細書で使用しているとき、「標的部位」又は「標的配列」の用語は、ヌクレアーゼ
の認識配列を含む細胞の染色体DNAの領域をいう。
の認識配列を含む細胞の染色体DNAの領域をいう。
本明細書で使用しているとき、「DNA結合親和性」又は「結合親和性」の用語は、メ
ガヌクレアーゼが参照DNA分子と非共有結合で会合する傾向(例えば、認識配列又は任
意の配列)を意味する。結合親和性は解離定数Kdによって測定される。本明細書で使用
しているとき、参照認識配列に対するヌクレアーゼのKdが、参照ヌクレアーゼに対して
統計的に有意な(p<0.05)量だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化し
た」結合親和性を有する。
ガヌクレアーゼが参照DNA分子と非共有結合で会合する傾向(例えば、認識配列又は任
意の配列)を意味する。結合親和性は解離定数Kdによって測定される。本明細書で使用
しているとき、参照認識配列に対するヌクレアーゼのKdが、参照ヌクレアーゼに対して
統計的に有意な(p<0.05)量だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化し
た」結合親和性を有する。
本明細書で使用しているとき、「特異性」の用語は、認識配列と呼ばれる特定の塩基対
の配列においてのみ、又は特定の認識配列の組においてのみ、メガヌクレアーゼが二本鎖
DNA分子を認識して切断できることを意味する。認識配列の組は、特定の保存された位
置又は配列のモチーフを共有するが、1以上の位置で変性している場合もある。非常に特
異的なメガヌクレアーゼは、1つのみ又はごく少数の認識配列を切断することができる。
特異性は当技術分野において公知の任意の方法により判断することができる。本明細書で
使用しているとき、メガヌクレアーゼが、生理学的条件下で参照メガヌクレアーゼ(例え
ば野生型)に結合せずまた切断されない認識配列に、結合及び切断する場合、又は認識配
列の切断の速さが、参照メガヌクレアーゼと比較して生物学的に顕著な量(例えば、少な
くとも2倍、又は2倍~10倍)増加又は減少する場合、メガヌクレアーゼは「改変した
」特異性を有する。
の配列においてのみ、又は特定の認識配列の組においてのみ、メガヌクレアーゼが二本鎖
DNA分子を認識して切断できることを意味する。認識配列の組は、特定の保存された位
置又は配列のモチーフを共有するが、1以上の位置で変性している場合もある。非常に特
異的なメガヌクレアーゼは、1つのみ又はごく少数の認識配列を切断することができる。
特異性は当技術分野において公知の任意の方法により判断することができる。本明細書で
使用しているとき、メガヌクレアーゼが、生理学的条件下で参照メガヌクレアーゼ(例え
ば野生型)に結合せずまた切断されない認識配列に、結合及び切断する場合、又は認識配
列の切断の速さが、参照メガヌクレアーゼと比較して生物学的に顕著な量(例えば、少な
くとも2倍、又は2倍~10倍)増加又は減少する場合、メガヌクレアーゼは「改変した
」特異性を有する。
本明細書で使用しているとき、「相同組換え」又は「HR」の用語は、修復テンプレー
トとして相同DNA配列を使用して二本鎖DNAの切断が修復される自然の細胞のプロセ
スをいう(例えば、Cahill et al.(2006),Front.Biosc
i.11:1958-1976を参照)。相同DNA配列は、内因性染色体配列又は細胞
に送達された外因性核酸であり得る。
トとして相同DNA配列を使用して二本鎖DNAの切断が修復される自然の細胞のプロセ
スをいう(例えば、Cahill et al.(2006),Front.Biosc
i.11:1958-1976を参照)。相同DNA配列は、内因性染色体配列又は細胞
に送達された外因性核酸であり得る。
本明細書で使用しているとき、「非相同末端結合」又は「NHEJ」の用語は、二本鎖
DNAの切断が2つの非相同DNAセグメントの直接的な結合によって修復される自然の
細胞のプロセスをいう(例えば、Cahill et al.(2006),Front
.Biosci.11:1958-1976を参照)。非相同末端結合によるDNAの修
復には誤りがありがちで、修復部位でのDNA配列の非鋳型化(untemplated
)付加又は欠失が頻繁にもたらされる。いくつかの例において、標的認識配列での切断が
、標的認識部位でのNHEJを生じている。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレア
ーゼ誘導性の切断、続くNHEJによるDNAの修復は、遺伝子の機能を破壊するフレー
ムシフトの突然変異などの突然変異を、コード配列に導入することができる。従って、遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼは、細胞集団の遺伝子を効果的にノックアウトするため
に使用できる。
DNAの切断が2つの非相同DNAセグメントの直接的な結合によって修復される自然の
細胞のプロセスをいう(例えば、Cahill et al.(2006),Front
.Biosci.11:1958-1976を参照)。非相同末端結合によるDNAの修
復には誤りがありがちで、修復部位でのDNA配列の非鋳型化(untemplated
)付加又は欠失が頻繁にもたらされる。いくつかの例において、標的認識配列での切断が
、標的認識部位でのNHEJを生じている。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレア
ーゼ誘導性の切断、続くNHEJによるDNAの修復は、遺伝子の機能を破壊するフレー
ムシフトの突然変異などの突然変異を、コード配列に導入することができる。従って、遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼは、細胞集団の遺伝子を効果的にノックアウトするため
に使用できる。
アミノ酸の配列と核酸の配列の両方に関して本明細書で使用しているとき、「パーセン
トの同一性」、「配列同一性」、「パーセントの類似性」、「配列の類似性」等の用語は
、整列したアミノ酸の残基又はヌクレオチド間の類似性を最大限にする配列の整列、同一
又は類似している残基又はヌクレオチドの数、全体の残基又はヌクレオチドの数、並びに
配列の整列における空隙の存在及び長さの関数である配列の整列に基づいた、2つの配列
の類似性の程度の尺度を示す。標準的なパラメータを使用して配列の類似性を判断するた
めの様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用
しているとき、配列の類似性は、アミノ酸の配列についてのBLASTpプログラム、及
び核酸の配列についてのBLASTnプログラムを使用して測定され、これらは両方とも
、国立生物工学情報センター(www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して
利用でき、例えば、Altschul et al.(1990),J.Mol.Bio
l.215:403-410;Gish and States (1993),Nat
ure Genet.3:266-272;Madden et al.(1996),
Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul et al.
(1997),Nucleic Acids Res.25:33 89-3402);
Zhang et al.(2000),J.Comput.Biol.7(1-2):
203-14に記載されている。本明細書で使用しているとき、2つのアミノ酸配列のパ
ーセントの類似性は、BLASTpアルゴリズムについての、ワードサイズ=3、ギャッ
プオープニングペナルティ=-11、ギャップエクステンションペナルティ=-1、スコ
アリングのマトリックス=BLOSUM62というパラメータに基づくスコアである。本
明細書で使用しているとき、2つの核酸配列のパーセントの類似性は、BLASTnアル
ゴリズムについての、ワードサイズ=11、ギャップオープニングペナルティ=-5、ギ
ャップエクステンションペナルティ=-2、マッチした報酬=1、及びミスマッチのペナ
ルティ=-3というパラメータに基づくスコアである。
トの同一性」、「配列同一性」、「パーセントの類似性」、「配列の類似性」等の用語は
、整列したアミノ酸の残基又はヌクレオチド間の類似性を最大限にする配列の整列、同一
又は類似している残基又はヌクレオチドの数、全体の残基又はヌクレオチドの数、並びに
配列の整列における空隙の存在及び長さの関数である配列の整列に基づいた、2つの配列
の類似性の程度の尺度を示す。標準的なパラメータを使用して配列の類似性を判断するた
めの様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用
しているとき、配列の類似性は、アミノ酸の配列についてのBLASTpプログラム、及
び核酸の配列についてのBLASTnプログラムを使用して測定され、これらは両方とも
、国立生物工学情報センター(www.ncbi.nlm.nih.gov/)を通して
利用でき、例えば、Altschul et al.(1990),J.Mol.Bio
l.215:403-410;Gish and States (1993),Nat
ure Genet.3:266-272;Madden et al.(1996),
Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul et al.
(1997),Nucleic Acids Res.25:33 89-3402);
Zhang et al.(2000),J.Comput.Biol.7(1-2):
203-14に記載されている。本明細書で使用しているとき、2つのアミノ酸配列のパ
ーセントの類似性は、BLASTpアルゴリズムについての、ワードサイズ=3、ギャッ
プオープニングペナルティ=-11、ギャップエクステンションペナルティ=-1、スコ
アリングのマトリックス=BLOSUM62というパラメータに基づくスコアである。本
明細書で使用しているとき、2つの核酸配列のパーセントの類似性は、BLASTnアル
ゴリズムについての、ワードサイズ=11、ギャップオープニングペナルティ=-5、ギ
ャップエクステンションペナルティ=-2、マッチした報酬=1、及びミスマッチのペナ
ルティ=-3というパラメータに基づくスコアである。
2つのタンパク質又はアミノ酸の配列の改変に関して本明細書で使用している場合、「
対応する」の用語は、第1のタンパク質における特定の改変が第2のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第1のタンパク質における改変のアミノ
酸の位置が、2つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき(例えば、BLAS
Tpプログラムを使用したとき)に、第2のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応し
ているか整列していることを示すために使用される。従って、残基X及びYが配列の整列
において互いに対応している場合、XとYが異なる数であり得るという事実にもかかわら
ず、第1のタンパク質における残基「X」のアミノ酸「A」への改変は、第2のタンパク
質におけるアミノ酸「A」への残基「Y」の改変に対応している。
対応する」の用語は、第1のタンパク質における特定の改変が第2のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第1のタンパク質における改変のアミノ
酸の位置が、2つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき(例えば、BLAS
Tpプログラムを使用したとき)に、第2のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応し
ているか整列していることを示すために使用される。従って、残基X及びYが配列の整列
において互いに対応している場合、XとYが異なる数であり得るという事実にもかかわら
ず、第1のタンパク質における残基「X」のアミノ酸「A」への改変は、第2のタンパク
質におけるアミノ酸「A」への残基「Y」の改変に対応している。
本明細書で使用しているとき、「認識した半分の部位」、「認識配列の半分の部位」又
は単に「半分の部位」の用語は、ホモ二量体又はヘテロ二量体のメガヌクレアーゼの単量
体によって、あるいは一本鎖メガヌクレアーゼの1つのサブユニットによって認識される
二本鎖DNA分子の核酸の配列を意味する。
は単に「半分の部位」の用語は、ホモ二量体又はヘテロ二量体のメガヌクレアーゼの単量
体によって、あるいは一本鎖メガヌクレアーゼの1つのサブユニットによって認識される
二本鎖DNA分子の核酸の配列を意味する。
本明細書で使用しているとき、「超可変領域」の用語は、比較的高い可変性を有するア
ミノ酸を含む、メガヌクレアーゼの単量体又はサブユニット内の局在化された配列をいう
。超可変領域は、約50~60の隣接残基、約53~57の隣接残基、又は好ましくは約
56の残基を含み得る。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号18~
39のいずれか1つの24~79位又は215~270位に対応し得る。超可変領域は、
認識配列におけるDNA塩基と接触する1以上の残基を含むことができ、単量体又はサブ
ユニットの塩基の選択性を変えるために改変することができる。超可変領域はまた、メガ
ヌクレアーゼが二本鎖DNA認識配列と会合するときに、DNA骨格に結合する1以上の
残基を含み得る。そのような残基は、DNA骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレア
ーゼの結合親和性を変えるために改変することができる。本発明の異なる実施形態では、
超可変領域は、1~20個の残基を含むことができ、それは可変性を示し、塩基の選択性
及び/又はDNA結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いくつかの実
施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号18~39のいずれか1つの24
位、26位、28位、30位、32位、33位、38位、40位、42位、44位、46
位、49位、50位、54位、64位、68位、70位、75位、及び77位の1以上に
対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号18~39のいずれ
か1つの215位、217位、219位、221位、223位、224位、229位、2
31位、233位、235位、237位、240位、241位、245位、255位、2
59位、261位、266位、及び268位の1以上に対応する。
ミノ酸を含む、メガヌクレアーゼの単量体又はサブユニット内の局在化された配列をいう
。超可変領域は、約50~60の隣接残基、約53~57の隣接残基、又は好ましくは約
56の残基を含み得る。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号18~
39のいずれか1つの24~79位又は215~270位に対応し得る。超可変領域は、
認識配列におけるDNA塩基と接触する1以上の残基を含むことができ、単量体又はサブ
ユニットの塩基の選択性を変えるために改変することができる。超可変領域はまた、メガ
ヌクレアーゼが二本鎖DNA認識配列と会合するときに、DNA骨格に結合する1以上の
残基を含み得る。そのような残基は、DNA骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレア
ーゼの結合親和性を変えるために改変することができる。本発明の異なる実施形態では、
超可変領域は、1~20個の残基を含むことができ、それは可変性を示し、塩基の選択性
及び/又はDNA結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いくつかの実
施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号18~39のいずれか1つの24
位、26位、28位、30位、32位、33位、38位、40位、42位、44位、46
位、49位、50位、54位、64位、68位、70位、75位、及び77位の1以上に
対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号18~39のいずれ
か1つの215位、217位、219位、221位、223位、224位、229位、2
31位、233位、235位、237位、240位、241位、245位、255位、2
59位、261位、266位、及び268位の1以上に対応する。
「組換えDNA構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「
キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えDNA断片」の用語は、本明細書で互換的に
用いられ、核酸の断片である。組換え構築物は、天然には一緒に見出さない調節及びコー
ド配列を含むがこれらに限定されない、核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、
組換えDNA構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給
源に由来して天然に見出せる様式とは異なる様式で配置されている調節配列及びコード配
列を含み得る。そのような構築物はそれ自体で使用しても、ベクターと共に使用してもよ
い。
キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えDNA断片」の用語は、本明細書で互換的に
用いられ、核酸の断片である。組換え構築物は、天然には一緒に見出さない調節及びコー
ド配列を含むがこれらに限定されない、核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、
組換えDNA構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給
源に由来して天然に見出せる様式とは異なる様式で配置されている調節配列及びコード配
列を含み得る。そのような構築物はそれ自体で使用しても、ベクターと共に使用してもよ
い。
本明細書で使用しているとき、「ベクター」又は「組換えDNAベクター」は、複製の
システム、及び所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード化配列の転写及び翻訳が可能
である配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当
業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依拠する。ベクター
は、制限なく、プラスミドベクター及び組換えAAVベクター、又は本発明のメガヌクレ
アーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した、当技術分野で公知の他の任
意のベクターを含み得る。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のい
ずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択及び増殖させるために、ベクターに存在
していなければならない遺伝的な要素を十分に知っている。
システム、及び所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード化配列の転写及び翻訳が可能
である配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当
業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依拠する。ベクター
は、制限なく、プラスミドベクター及び組換えAAVベクター、又は本発明のメガヌクレ
アーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した、当技術分野で公知の他の任
意のベクターを含み得る。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のい
ずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択及び増殖させるために、ベクターに存在
していなければならない遺伝的な要素を十分に知っている。
本明細書で使用しているとき、「ベクター」はまた、ウイルスベクターを示すことがで
きる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を含み得るが、これらに
限定されない。
きる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を含み得るが、これらに
限定されない。
本明細書で使用しているとき、「ポリシストロニック」mRNAとは、2つ以上のコー
ド配列(即ち、シストロン)を含み、2以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジ
ャーRNAをいう。ポリシストロニックmRNAは、IRES要素、T2A要素、P2A
要素、E2A要素、及びF2A要素を含むがこれらに限定されない、同じmRNA分子に
由来する2つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を
含み得る。
ド配列(即ち、シストロン)を含み、2以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジ
ャーRNAをいう。ポリシストロニックmRNAは、IRES要素、T2A要素、P2A
要素、E2A要素、及びF2A要素を含むがこれらに限定されない、同じmRNA分子に
由来する2つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を
含み得る。
本明細書で使用しているとき、「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝
子型又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞をいう。対照細胞は、例え
ば、(a)野生型細胞、即ち、遺伝子変化細胞をもたらした遺伝子改変用の出発材料と同
じ遺伝子型のもの;(b)遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌルの構築物(即ち
、対象となる形質に既知の効果を及ぼさない構築物)で形質転換された細胞;又は(c)
遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、改変した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する
条件又は刺激又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
子型又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞をいう。対照細胞は、例え
ば、(a)野生型細胞、即ち、遺伝子変化細胞をもたらした遺伝子改変用の出発材料と同
じ遺伝子型のもの;(b)遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌルの構築物(即ち
、対象となる形質に既知の効果を及ぼさない構築物)で形質転換された細胞;又は(c)
遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、改変した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する
条件又は刺激又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
2つのタンパク質又はアミノ酸の配列の改変に関して本明細書で使用している場合、「
対応する」の用語は、第1のタンパク質における特定の改変が第2のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第1のタンパク質における改変のアミノ
酸の位置が、2つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき(例えば、BLAS
Tpプログラムを使用したとき)に、第2のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応し
ているか整列していることを示すために使用される。従って、残基X及びYが配列の整列
において互いに対応している場合、XとYが異なる数であり得るという事実にもかかわら
ず、第1のタンパク質における残基「X」のアミノ酸「A」への改変は、第2のタンパク
質におけるアミノ酸「A」への残基「Y」の改変に対応している。
対応する」の用語は、第1のタンパク質における特定の改変が第2のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第1のタンパク質における改変のアミノ
酸の位置が、2つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき(例えば、BLAS
Tpプログラムを使用したとき)に、第2のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応し
ているか整列していることを示すために使用される。従って、残基X及びYが配列の整列
において互いに対応している場合、XとYが異なる数であり得るという事実にもかかわら
ず、第1のタンパク質における残基「X」のアミノ酸「A」への改変は、第2のタンパク
質におけるアミノ酸「A」への残基「Y」の改変に対応している。
本明細書で使用しているとき、「治療」又は「対象を治療する」の用語は、少なくとも
1つのHBV粒子のゲノムを切断することによってウイルスのHBV増殖速度を緩徐化又
は停止させる目的で、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は本発明の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、HBVに感染した対象へ投与すること
をいう。そのような治療は、対象におけるHBVの形質移入及び複製を低減又は防止し、
対象におけるHBVの1又は複数の症状を部分的又は完全に取り除く。HBV感染の症状
の軽減を評価するための手段は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレ
ベルを判定すること、又は血清の転換、即ちHbeAgの消失を測定することによる、肝
機能の測定を含み得る。更に、HBVの症状の軽減又は低減は、肝生検で検査し、当技術
分野で周知の方法で組織線維症のレベルを測定することによって判断できる。循環ウイル
ス粒子の数は、例えば、PCRを用いてHBV DNAのレベルを測定することによって
、又は血中のHBsAgレベルを検出することによって、判断することができる。「治療
」又は「対象を治療する」の用語は更に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸を含む細胞(例えば肝細胞)の投与を示すことができ、この場合細胞は標的組織(
例えば肝臓)に送達され、対象においてHBVの感染を治療するのに十分な量で遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼを産生し、それによりHBVの1以上の症状の部分的又は完全
な軽減をもたらす。いくつかの態様では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、
それをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞は、本発明の医薬組成物の形態で、
治療中に投与される。
1つのHBV粒子のゲノムを切断することによってウイルスのHBV増殖速度を緩徐化又
は停止させる目的で、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は本発明の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、HBVに感染した対象へ投与すること
をいう。そのような治療は、対象におけるHBVの形質移入及び複製を低減又は防止し、
対象におけるHBVの1又は複数の症状を部分的又は完全に取り除く。HBV感染の症状
の軽減を評価するための手段は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)のレ
ベルを判定すること、又は血清の転換、即ちHbeAgの消失を測定することによる、肝
機能の測定を含み得る。更に、HBVの症状の軽減又は低減は、肝生検で検査し、当技術
分野で周知の方法で組織線維症のレベルを測定することによって判断できる。循環ウイル
ス粒子の数は、例えば、PCRを用いてHBV DNAのレベルを測定することによって
、又は血中のHBsAgレベルを検出することによって、判断することができる。「治療
」又は「対象を治療する」の用語は更に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸を含む細胞(例えば肝細胞)の投与を示すことができ、この場合細胞は標的組織(
例えば肝臓)に送達され、対象においてHBVの感染を治療するのに十分な量で遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼを産生し、それによりHBVの1以上の症状の部分的又は完全
な軽減をもたらす。いくつかの態様では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、
それをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞は、本発明の医薬組成物の形態で、
治療中に投与される。
「B型肝炎ウイルス感染」の用語は、慢性肝疾患/障害、炎症、線維症の状態、及び肝
がんをはじめとした増殖性障害等の、B型肝炎ウイルスによる感染に関連する、又は感染
に起因するいずれかの状態を示す。持続性の慢性HBV感染は、疲労、肝障害、肝硬変、
及び原発性肝がんである肝細胞がんを引き起こし得る。
がんをはじめとした増殖性障害等の、B型肝炎ウイルスによる感染に関連する、又は感染
に起因するいずれかの状態を示す。持続性の慢性HBV感染は、疲労、肝障害、肝硬変、
及び原発性肝がんである肝細胞がんを引き起こし得る。
本明細書で使用しているとき、「増殖する」及び「増殖」の用語は、活発に分裂してヒ
ト細胞に感染するHBV細胞を示す。従って、増殖の減少は、本明細書に開示の遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼ、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を
投与していない適切な対照と比較したとき少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、1
0%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、9
0%、95%、又は100%の減少を含む、HBVの増殖の任意の減少を示す。本願を通
して、「増殖性障害」の用語は、組織の望まれない又は異常な増殖によって特徴付けられ
るいずれかの疾患/障害を示す。また、本明細書で使用しているとき、「増殖性障害」の
用語は、細胞の調節されていない及び/又は異常な増殖が、がん性又は非がん性であり得
る望まれない状態又は疾患の発症をもたらし得る状態をいう。
ト細胞に感染するHBV細胞を示す。従って、増殖の減少は、本明細書に開示の遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼ、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を
投与していない適切な対照と比較したとき少なくとも1%、2%、3%、4%、5%、1
0%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、9
0%、95%、又は100%の減少を含む、HBVの増殖の任意の減少を示す。本願を通
して、「増殖性障害」の用語は、組織の望まれない又は異常な増殖によって特徴付けられ
るいずれかの疾患/障害を示す。また、本明細書で使用しているとき、「増殖性障害」の
用語は、細胞の調節されていない及び/又は異常な増殖が、がん性又は非がん性であり得
る望まれない状態又は疾患の発症をもたらし得る状態をいう。
「有効量」又は「治療有効量」の用語は、有益な又は望ましい生物学的及び/又は臨床
的な結果をもたらすのに十分な量を示す。治療有効量は、メガヌクレアーゼ製剤又は組成
物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重、健康状態、及び反応性に
応じて変わる。特定の実施形態では、本明細書に開示される有効量の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ又は医薬的組成物は、HBVに感染している対象におけるHBVのレベル
又は増殖を減少させるか、HBVの少なくとも1つの症状を低減させる。
的な結果をもたらすのに十分な量を示す。治療有効量は、メガヌクレアーゼ製剤又は組成
物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重、健康状態、及び反応性に
応じて変わる。特定の実施形態では、本明細書に開示される有効量の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ又は医薬的組成物は、HBVに感染している対象におけるHBVのレベル
又は増殖を減少させるか、HBVの少なくとも1つの症状を低減させる。
「脂質ナノ粒子」の用語は、平均直径が10~1000ナノメートルの典型的には球形
の構造を有する脂質組成物を示す。いくつかの製剤において、脂質ナノ粒子は、少なくと
も1つのカチオン性脂質、少なくとも1つの非カチオン性脂質、及び少なくとも1つの複
合脂質を含み得る。mRNA等の核酸を封入するのに適している、当技術分野において公
知の脂質ナノ粒子が、本発明にて使用するために企図される。
の構造を有する脂質組成物を示す。いくつかの製剤において、脂質ナノ粒子は、少なくと
も1つのカチオン性脂質、少なくとも1つの非カチオン性脂質、及び少なくとも1つの複
合脂質を含み得る。mRNA等の核酸を封入するのに適している、当技術分野において公
知の脂質ナノ粒子が、本発明にて使用するために企図される。
本明細書で使用するとき、変数に対する数値範囲の記載は、その範囲内の任意の値に等
しい変数で本発明を実施できることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散
的な変数については、その変数は、範囲の端点を含んだ数値範囲内の任意の整数の値に等
しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数については、その変数は、範囲の端点を含
んだ数値範囲内の任意の実数の値に等しくなり得る。限定するものではなく例として、0
~2の値を有すると記載された変数は、その変数が本質的に離散的である場合には0、1
又は2の値を取り得、変数が本質的に連続的である場合には、0.0、0.1、0.01
、0.001の値、又は0以上2以下の他のいずれかの実数の値を取り得る。
しい変数で本発明を実施できることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散
的な変数については、その変数は、範囲の端点を含んだ数値範囲内の任意の整数の値に等
しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数については、その変数は、範囲の端点を含
んだ数値範囲内の任意の実数の値に等しくなり得る。限定するものではなく例として、0
~2の値を有すると記載された変数は、その変数が本質的に離散的である場合には0、1
又は2の値を取り得、変数が本質的に連続的である場合には、0.0、0.1、0.01
、0.001の値、又は0以上2以下の他のいずれかの実数の値を取り得る。
2.1 発明の原理
本発明は、部分的に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、HBVゲノム内のORF
を切断することによってHBVのレベルを低下させる、又はHBVの増殖を遅くするため
に使用され得るという仮説に基づく。より具体的には、メガヌクレアーゼは、複数のHB
V遺伝子型のゲノム内に存在する認識配列を認識して切断するように遺伝子操作すること
ができる。従って、単一の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用して、HBVのレベ
ル又は増殖を減少させたり、B型肝炎ウイルスの複数の遺伝子型のHBV感染の症状を低
減させたりすることができる。
を切断することによってHBVのレベルを低下させる、又はHBVの増殖を遅くするため
に使用され得るという仮説に基づく。より具体的には、メガヌクレアーゼは、複数のHB
V遺伝子型のゲノム内に存在する認識配列を認識して切断するように遺伝子操作すること
ができる。従って、単一の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用して、HBVのレベ
ル又は増殖を減少させたり、B型肝炎ウイルスの複数の遺伝子型のHBV感染の症状を低
減させたりすることができる。
従って、本発明は、HBVゲノムの少なくとも2つの遺伝子型のORF内の認識配列を
認識して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを包含する。また、本発明は、その
ような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを、医薬組成物中で、及びHBV感染を治療す
るための方法において使用する方法を包含する。更に、本発明は、遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼのタンパク質、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を
含む医薬組成物、及びHBVの感染を治療するためのそのような組成物を使用することを
包含する。
認識して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを包含する。また、本発明は、その
ような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを、医薬組成物中で、及びHBV感染を治療す
るための方法において使用する方法を包含する。更に、本発明は、遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼのタンパク質、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を
含む医薬組成物、及びHBVの感染を治療するためのそのような組成物を使用することを
包含する。
2.2 HBVのゲノム内の認識配列を認識して切断するためのメガヌクレアーゼ
部位特異的ヌクレアーゼを使用してウイルスのゲノムにてDNAを切断することは可能
であるという点、及びそのようなDNAの切断がNHEJを介したゲノムの永続的な改変
をもたらすことができて、その結果HBVビリオンがヒトの細胞を分裂させたり感染させ
ることはもはやできなくなるという点は、当技術分野において公知である。従って、一実
施形態では、本発明は、遺伝子操作された組換えメガヌクレアーゼを使用して実施するこ
とができる。
であるという点、及びそのようなDNAの切断がNHEJを介したゲノムの永続的な改変
をもたらすことができて、その結果HBVビリオンがヒトの細胞を分裂させたり感染させ
ることはもはやできなくなるという点は、当技術分野において公知である。従って、一実
施形態では、本発明は、遺伝子操作された組換えメガヌクレアーゼを使用して実施するこ
とができる。
好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは一本鎖メガ
ヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合された
N末端サブユニット及びC末端サブユニットを含む。2つのドメインのそれぞれは、認識
配列の半分(即ち、認識した半分の部位)を認識し、DNA切断の部位は、2つのサブユ
ニットの界面付近の認識配列の中にある。DNA鎖の切断は、4塩基対によって相殺させ
て、メガヌクレアーゼによるDNAの切断が一対の4塩基対、3’一本鎖オーバーハング
を生成するようにする。
ヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合された
N末端サブユニット及びC末端サブユニットを含む。2つのドメインのそれぞれは、認識
配列の半分(即ち、認識した半分の部位)を認識し、DNA切断の部位は、2つのサブユ
ニットの界面付近の認識配列の中にある。DNA鎖の切断は、4塩基対によって相殺させ
て、メガヌクレアーゼによるDNAの切断が一対の4塩基対、3’一本鎖オーバーハング
を生成するようにする。
いくつかの例において、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、HBV1-2
認識配列(配列番号10)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV1-2
認識配列は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質、S、preS2/S、及びpreS
1/preS2のORFの中に位置している。HBV1-2認識配列は、遺伝子型A、B
、C、E、F、及びGを含む複数のHBV遺伝子型(例えば、それぞれ配列番号3~5及
び7~9)のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「HBV1-2メガヌクレアーゼ」と呼ばれ
る。例示的なHBV1-2メガヌクレアーゼは、配列番号18~21に提供されている。
認識配列(配列番号10)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV1-2
認識配列は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質、S、preS2/S、及びpreS
1/preS2のORFの中に位置している。HBV1-2認識配列は、遺伝子型A、B
、C、E、F、及びGを含む複数のHBV遺伝子型(例えば、それぞれ配列番号3~5及
び7~9)のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「HBV1-2メガヌクレアーゼ」と呼ばれ
る。例示的なHBV1-2メガヌクレアーゼは、配列番号18~21に提供されている。
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、HBV5-6認識配列
(配列番号12)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV5-6認識配列
は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質、S、preS2/S、及びpreS1/pr
eS2のORFの中に位置している。HBV5-6認識配列は、遺伝子型A、B、C、D
、E、及びGを含む複数のHBV遺伝子型(例えば、それぞれ配列番号3~7及び9)の
ゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
は、本明細書において集合的に「HBV5-6メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的な
HBV5-6メガヌクレアーゼは、配列番号22~28に提供されている。
(配列番号12)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV5-6認識配列
は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質、S、preS2/S、及びpreS1/pr
eS2のORFの中に位置している。HBV5-6認識配列は、遺伝子型A、B、C、D
、E、及びGを含む複数のHBV遺伝子型(例えば、それぞれ配列番号3~7及び9)の
ゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
は、本明細書において集合的に「HBV5-6メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的な
HBV5-6メガヌクレアーゼは、配列番号22~28に提供されている。
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、HBV7-8認識配列
(配列番号14)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV7-8認識配列
は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質のORFの中に位置している。HBV7-8認
識配列は、遺伝子型A、B、C、D、F、及びGを含む複数のHBV遺伝子型(例えば、
それぞれ配列番号3~6、8、及び9)のゲノムに少なくとも見出すことができる。その
ような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「HBV7-8
メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なHBV7-8メガヌクレアーゼは、配列番号2
9~32に提供されている。
(配列番号14)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV7-8認識配列
は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質のORFの中に位置している。HBV7-8認
識配列は、遺伝子型A、B、C、D、F、及びGを含む複数のHBV遺伝子型(例えば、
それぞれ配列番号3~6、8、及び9)のゲノムに少なくとも見出すことができる。その
ような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「HBV7-8
メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なHBV7-8メガヌクレアーゼは、配列番号2
9~32に提供されている。
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、HBV11-12認識
配列(配列番号16)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV11-12
認識配列は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質ORFの中に位置している。HBV1
1-12認識配列は、遺伝子型A、B、C、D、E、F、及びGを含む複数のHBV遺伝
子型(例えば、それぞれ配列番号3~9)のゲノムに少なくとも見出すことができる。そ
のような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「HBV11
-12メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なHBV11~12メガヌクレアーゼは、
配列番号34~40に提供されている。
配列(配列番号16)を認識し切断するように遺伝子操作されている。HBV11-12
認識配列は、複数のHBV遺伝子型のPタンパク質ORFの中に位置している。HBV1
1-12認識配列は、遺伝子型A、B、C、D、E、F、及びGを含む複数のHBV遺伝
子型(例えば、それぞれ配列番号3~9)のゲノムに少なくとも見出すことができる。そ
のような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「HBV11
-12メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なHBV11~12メガヌクレアーゼは、
配列番号34~40に提供されている。
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第1の超可変(HVR1)領域を含む
第1のサブユニット及び第2の超可変(HVR2)領域を含む第2のサブユニットを含む
。更に、第1のサブユニットは認識配列の第1の認識した半分の部位(例えば、HBV1
、HBV5、HBV7、又はHBV11の半分の部位)に結合し、第2のサブユニットは
認識配列の第2の認識した半分の部位(例えば、HBV2、HBV6、HBV8、又はH
BV12の半分の部位)に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌ
クレアーゼである実施形態では、第1及び第2のサブユニットは、HVR1領域を含み第
1の半分の部位と結合する第1のサブユニットが、N末端サブユニットとして位置し、H
VR2領域を含み第2の半分の部位と結合する第2のサブユニットが、C末端サブユニッ
トとして位置するように配向できる。別の実施形態では、第1及び第2のサブユニットは
、HVR1領域を含み第1の半分の部位と結合する第1のサブユニットが、C末端サブユ
ニットとして位置し、HVR2領域を含み第2の半分の部位と結合する第2のサブユニッ
トが、N末端サブユニットとして位置するように配向できる。本発明の例示的なHBV1
-2メガヌクレアーゼを表1に提示する。本発明の例示的なHBV5-6メガヌクレアー
ゼを表2に提示する。本発明の例示的なHBV7-8メガヌクレアーゼを表3に提示する
。本発明の例示的なHBV11-12メガヌクレアーゼを表4に提示する。
第1のサブユニット及び第2の超可変(HVR2)領域を含む第2のサブユニットを含む
。更に、第1のサブユニットは認識配列の第1の認識した半分の部位(例えば、HBV1
、HBV5、HBV7、又はHBV11の半分の部位)に結合し、第2のサブユニットは
認識配列の第2の認識した半分の部位(例えば、HBV2、HBV6、HBV8、又はH
BV12の半分の部位)に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌ
クレアーゼである実施形態では、第1及び第2のサブユニットは、HVR1領域を含み第
1の半分の部位と結合する第1のサブユニットが、N末端サブユニットとして位置し、H
VR2領域を含み第2の半分の部位と結合する第2のサブユニットが、C末端サブユニッ
トとして位置するように配向できる。別の実施形態では、第1及び第2のサブユニットは
、HVR1領域を含み第1の半分の部位と結合する第1のサブユニットが、C末端サブユ
ニットとして位置し、HVR2領域を含み第2の半分の部位と結合する第2のサブユニッ
トが、N末端サブユニットとして位置するように配向できる。本発明の例示的なHBV1
-2メガヌクレアーゼを表1に提示する。本発明の例示的なHBV5-6メガヌクレアー
ゼを表2に提示する。本発明の例示的なHBV7-8メガヌクレアーゼを表3に提示する
。本発明の例示的なHBV11-12メガヌクレアーゼを表4に提示する。
*「HBV1サブユニット(%)」及び「HBV2サブユニット(%)」は、各メガヌク
レアーゼのHBV1結合及びHBV2結合サブユニット領域と、HBV1-2×.2メガ
ヌクレアーゼの各HBV1結合及びHBV2結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配
列の同一性を表す。
レアーゼのHBV1結合及びHBV2結合サブユニット領域と、HBV1-2×.2メガ
ヌクレアーゼの各HBV1結合及びHBV2結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配
列の同一性を表す。
*「HBV5サブユニット(%)」及び「HBV6サブユニット(%)」は、各メガヌク
レアーゼのHBV5結合及びHBV6結合サブユニット領域と、HBV5-6×.33メ
ガヌクレアーゼの各HBV5結合及びHBV6結合サブユニット領域との間のアミノ酸の
配列の同一性を表す。
レアーゼのHBV5結合及びHBV6結合サブユニット領域と、HBV5-6×.33メ
ガヌクレアーゼの各HBV5結合及びHBV6結合サブユニット領域との間のアミノ酸の
配列の同一性を表す。
*「HBV7サブユニット(%)」及び「HBV8サブユニット(%)」は、各メガヌク
レアーゼのHBV7結合及びHBV8結合サブユニット領域と、HBV7-8×.2メガ
ヌクレアーゼの各HBV7結合及びHBV8結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配
列の同一性を表す。
レアーゼのHBV7結合及びHBV8結合サブユニット領域と、HBV7-8×.2メガ
ヌクレアーゼの各HBV7結合及びHBV8結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配
列の同一性を表す。
*「HBV11サブユニット(%)」及び「HBV12サブユニット(%)」は、各メガ
ヌクレアーゼのHBV11結合及びHBV12結合サブユニット領域と、HBV11-1
2×.26メガヌクレアーゼの各HBV11結合及びHBV12結合サブユニット領域と
の間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
ヌクレアーゼのHBV11結合及びHBV12結合サブユニット領域と、HBV11-1
2×.26メガヌクレアーゼの各HBV11結合及びHBV12結合サブユニット領域と
の間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
2.3 エンドヌクレアーゼの送達及び発現方法
本明細書に開示されているのは、対象のHBV感染又はHCCを治療するための方法で
ある。同様に、対象におけるHBV感染の症状の軽減及びHBVの量の減少、HBVの増
殖速度の低下又はHCCの治療の方法が提供されており、医薬的に許容される担体及び本
明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又は遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸)を含む医薬組成物を投与することを含む。本発明の方法にお
いて、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをHBVゲノムに与えることができる標的細胞のDNA/RNAに送
達され、及び/又はそれから発現され得る。
ある。同様に、対象におけるHBV感染の症状の軽減及びHBVの量の減少、HBVの増
殖速度の低下又はHCCの治療の方法が提供されており、医薬的に許容される担体及び本
明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ(又は遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸)を含む医薬組成物を投与することを含む。本発明の方法にお
いて、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをHBVゲノムに与えることができる標的細胞のDNA/RNAに送
達され、及び/又はそれから発現され得る。
本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又
は好ましくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞内に送達
され得る。そのような核酸は、DNA(例えば、環状又は線状化プラスミドDNA又はP
CR産物)又はRNA(例えばmRNA)であり得る。遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼコード配列がDNAの形態で送達される実施形態について、それはヌクレアーゼ遺伝子
の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結させるべきである。本発明に適した
哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期(CMV)プロモータ(Thoms
en et al.(1984),Proc Natl Acad Sci USA.8
1(3):659-63)、又はSV40初期プロモータ(Benoist and C
hambon(1981),Nature.290(5804):304-10)、並び
に誘導性プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ(Dingermann
et al.(1992),Mol Cell Biol.12(9):4038-4
5)等の構成的プロモータが含まれる。また、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼは、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータは、限定することなく
、JeTプロモータを挙げることができる(国際公開第2002/012514号パンフ
レット)。特定の実施形態では、本明細書に開示される場合の遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸配列は、肝特異的プロモータに作動可能に連結され得る。肝特
異的プロモータの例としては、限定することなく、ヒトα-1アンチトリプシンプロモー
タ及びアポリポタンパク質A-IIプロモータが挙げられる。
は好ましくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞内に送達
され得る。そのような核酸は、DNA(例えば、環状又は線状化プラスミドDNA又はP
CR産物)又はRNA(例えばmRNA)であり得る。遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼコード配列がDNAの形態で送達される実施形態について、それはヌクレアーゼ遺伝子
の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結させるべきである。本発明に適した
哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期(CMV)プロモータ(Thoms
en et al.(1984),Proc Natl Acad Sci USA.8
1(3):659-63)、又はSV40初期プロモータ(Benoist and C
hambon(1981),Nature.290(5804):304-10)、並び
に誘導性プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ(Dingermann
et al.(1992),Mol Cell Biol.12(9):4038-4
5)等の構成的プロモータが含まれる。また、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼは、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータは、限定することなく
、JeTプロモータを挙げることができる(国際公開第2002/012514号パンフ
レット)。特定の実施形態では、本明細書に開示される場合の遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸配列は、肝特異的プロモータに作動可能に連結され得る。肝特
異的プロモータの例としては、限定することなく、ヒトα-1アンチトリプシンプロモー
タ及びアポリポタンパク質A-IIプロモータが挙げられる。
特定の実施形態では、少なくとも1つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸配列が、組換えDNA構築物又は発現カセットに送達される。例えば、組換えDN
A構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸配列とを含む発現カセット(即ち、「カセット」)を含むことができる。他の
実施形態では、組換えDNA構築物は、2以上のカセットを含み、各カセットがプロモー
タと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み
、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対
する特異性を有する。特定の実施形態において、組換えDNA構築物は、2つのカセット
、3つのカセット、4つのカセット、又はそれ以上を含み得る。例えば、カセット又はカ
セットの組み合わせは、HBV1-2メガヌクレアーゼ、HBV5-6メガヌクレアーゼ
、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11-12メガヌクレアーゼの任意の数又
は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形態において、単一のカセット
は、HBV1-2メガヌクレアーゼ、HBV5-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガ
ヌクレアーゼ、及びHBV11-12メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施
形態では、カセット又はカセットの組み合わせは、HBV5-6メガヌクレアーゼ及びH
BV11-12メガヌクレアーゼをコードし得る。
る核酸配列が、組換えDNA構築物又は発現カセットに送達される。例えば、組換えDN
A構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸配列とを含む発現カセット(即ち、「カセット」)を含むことができる。他の
実施形態では、組換えDNA構築物は、2以上のカセットを含み、各カセットがプロモー
タと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み
、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対
する特異性を有する。特定の実施形態において、組換えDNA構築物は、2つのカセット
、3つのカセット、4つのカセット、又はそれ以上を含み得る。例えば、カセット又はカ
セットの組み合わせは、HBV1-2メガヌクレアーゼ、HBV5-6メガヌクレアーゼ
、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11-12メガヌクレアーゼの任意の数又
は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形態において、単一のカセット
は、HBV1-2メガヌクレアーゼ、HBV5-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガ
ヌクレアーゼ、及びHBV11-12メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施
形態では、カセット又はカセットの組み合わせは、HBV5-6メガヌクレアーゼ及びH
BV11-12メガヌクレアーゼをコードし得る。
他の実施形態において、組換えDNA構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核
酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNAを生成する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするmRNAが
細胞に送達されるが、その理由は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝
子が、細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低下させるためである。遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードするそのようなmRNAは、インビトロでの転写といった、当技
術分野において公知の方法を利用して産生され得る。いくつかの実施形態において、mR
NAは7-メチル-グアノシンを用いてキャップされている。いくつかの態様において、
mRNAはポリアデニル化されていてもよい。
細胞に送達されるが、その理由は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝
子が、細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低下させるためである。遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードするそのようなmRNAは、インビトロでの転写といった、当技
術分野において公知の方法を利用して産生され得る。いくつかの実施形態において、mR
NAは7-メチル-グアノシンを用いてキャップされている。いくつかの態様において、
mRNAはポリアデニル化されていてもよい。
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードするmRNAは
、細胞内で同時に発現される2以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmR
NAであってよい。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、HB
Vゲノムが複数の部位で切断されるように、HBVゲノムの異なる認識配列を標的とする
、本明細書に記載の2以上のメガヌクレアーゼをコードし得る。いくつかの実施形態にお
いて、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載されている2以上のメガヌクレア
ーゼ、及び細胞において治療上有益な効果を誘導する少なくとも1つの更なるタンパク質
をコードし得る。本発明のポリシストロニックmRNAは、IRES要素、T2A要素、
P2A要素、E2A要素、及びF2A要素を含むがこれらに限定されない、同じmRNA
分子に由来する2以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要
素を含み得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記
載の2つのメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンmRNA、本明細書に記載の3
つのメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンmRNA、又は本明細書に記載の4つ
のメガヌクレアーゼをコードするクアドシストロンmRNAであり、この場合、各mRN
Aによってコードされるヌクレアーゼは、HBVゲノムの異なる認識配列に対して特異性
を有する。例えば、ポリシストロニックmRNAは、HBV1-2メガヌクレアーゼ、H
BV5-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11-12メ
ガヌクレアーゼの任意の数又は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形
態において、ポリシストロニックmRNAは、HBV1-2メガヌクレアーゼ、HBV5
-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11-12メガヌク
レアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、H
BV5-6メガヌクレアーゼ及びHBV11-12メガヌクレアーゼをコードするバイシ
ストロンmRNAであり得る。
、細胞内で同時に発現される2以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmR
NAであってよい。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、HB
Vゲノムが複数の部位で切断されるように、HBVゲノムの異なる認識配列を標的とする
、本明細書に記載の2以上のメガヌクレアーゼをコードし得る。いくつかの実施形態にお
いて、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記載されている2以上のメガヌクレア
ーゼ、及び細胞において治療上有益な効果を誘導する少なくとも1つの更なるタンパク質
をコードし得る。本発明のポリシストロニックmRNAは、IRES要素、T2A要素、
P2A要素、E2A要素、及びF2A要素を含むがこれらに限定されない、同じmRNA
分子に由来する2以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要
素を含み得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックmRNAは、本明細書に記
載の2つのメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンmRNA、本明細書に記載の3
つのメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンmRNA、又は本明細書に記載の4つ
のメガヌクレアーゼをコードするクアドシストロンmRNAであり、この場合、各mRN
Aによってコードされるヌクレアーゼは、HBVゲノムの異なる認識配列に対して特異性
を有する。例えば、ポリシストロニックmRNAは、HBV1-2メガヌクレアーゼ、H
BV5-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11-12メ
ガヌクレアーゼの任意の数又は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形
態において、ポリシストロニックmRNAは、HBV1-2メガヌクレアーゼ、HBV5
-6メガヌクレアーゼ、HBV7-8メガヌクレアーゼ、及びHBV11-12メガヌク
レアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニックmRNAは、H
BV5-6メガヌクレアーゼ及びHBV11-12メガヌクレアーゼをコードするバイシ
ストロンmRNAであり得る。
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖D
NAの鋳型を用いて細胞に導入することができる。一本鎖DNAは、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び/又は下流に5’及び/又は3’AAV逆方
向末端反復(ITR)を更に含み得る。他の実施形態では、一本鎖DNAは、遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び/又は下流に5’及び/又は3’相
同性アームを更に含み得る。
NAの鋳型を用いて細胞に導入することができる。一本鎖DNAは、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び/又は下流に5’及び/又は3’AAV逆方
向末端反復(ITR)を更に含み得る。他の実施形態では、一本鎖DNAは、遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び/又は下流に5’及び/又は3’相
同性アームを更に含み得る。
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化
DNAの鋳型を用いて細胞に導入することができる。いくつかの例では、エンドヌクレア
ーゼをコードするプラスミドDNAは、1以上の制限酵素により消化させることができ、
環状プラスミドDNAが細胞に導入される前に線状化されるようにする。
DNAの鋳型を用いて細胞に導入することができる。いくつかの例では、エンドヌクレア
ーゼをコードするプラスミドDNAは、1以上の制限酵素により消化させることができ、
環状プラスミドDNAが細胞に導入される前に線状化されるようにする。
精製されたヌクレアーゼタンパク質は、本明細書において以下に更に詳述されるものを
含む、当技術分野において公知の様々な異なるメカニズムによってゲノムDNAを切断す
るために、細胞内に送達し得る。
含む、当技術分野において公知の様々な異なるメカニズムによってゲノムDNAを切断す
るために、細胞内に送達し得る。
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを送達するための標的組織は、限定するこ
となく肝臓の細胞、例えば肝細胞、又は好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細
胞又はヒト初代肝細胞、HepG2.2.15又はHepG2-hNTCP細胞を含む。
論じたように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレア
ーゼをコードするRNA若しくはDNAとして送達することができる。一実施形態では、
メガヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、又はDN
Aベクターは、標的組織への直接的な注入によって、標的細胞(例えば、肝臓の細胞)に
供給される。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質、mRNA、又はDNAを、循環
系を介して全身的に送達することができる。
となく肝臓の細胞、例えば肝細胞、又は好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細
胞又はヒト初代肝細胞、HepG2.2.15又はHepG2-hNTCP細胞を含む。
論じたように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレア
ーゼをコードするRNA若しくはDNAとして送達することができる。一実施形態では、
メガヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするmRNA、又はDN
Aベクターは、標的組織への直接的な注入によって、標的細胞(例えば、肝臓の細胞)に
供給される。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質、mRNA、又はDNAを、循環
系を介して全身的に送達することができる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするDNA/mRNAは、全身投与、又は標的組織への投与のために、公知の
技術に従って、医薬的に許容される担体用に処方される。例えば、Remington,
The Science And Practice of Pharmacy(21s
ted.2005)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質
/RNA/mRNAは、典型的には医薬的に許容される担体と混合される。担体は当然、
製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、また患
者にとって有害であってはならない。担体は、固体又は液体、あるいはその両方であり得
、単位用量の製剤として化合物と共に製剤化できる。
ゼをコードするDNA/mRNAは、全身投与、又は標的組織への投与のために、公知の
技術に従って、医薬的に許容される担体用に処方される。例えば、Remington,
The Science And Practice of Pharmacy(21s
ted.2005)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質
/RNA/mRNAは、典型的には医薬的に許容される担体と混合される。担体は当然、
製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、また患
者にとって有害であってはならない。担体は、固体又は液体、あるいはその両方であり得
、単位用量の製剤として化合物と共に製剤化できる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするDNA/mRNAは、細胞の取り込みを容易にするために細胞透過性ペプ
チド又は標的化リガンドに結合する。当技術分野において公知の細胞透過性ペプチドの例
には、ポリアルギニン(Jearawiriyapaisarn,et al.(200
8)Mol Ther.16:1624-9)、HIVウイルス由来のTATペプチド(
Hudecz et al.(2005),Med.Res.Rev.25:679-7
36)、MPG(Simeoni,et al.(2003)Nucleic Acid
s Res.31:2717-2724)、Pep-1(Deshayes et al
.(2004)Biochemistry 43:7698-7706、及びHSV-1
VP-22(Deshayes et al.(2005)Cell Mol Lif
e Sci.62:1839-49)が含まれる。別の実施形態において、エンドヌクレ
アーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするDNA/mRNAは、標的細胞
にて発現される特定の細胞表面の受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合で結合
させて、エンドヌクレアーゼタンパク質/DNA/mRNAが標的細胞に結合し、標的細
胞によって内在化されるようにする。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質/DNA
/mRNAを、そのような細胞表面の受容体の天然のリガンド(又は天然のリガンドの一
部)に共有結合又は非共有結合で結合させることができる(McCall,et al.
(2014)Tissue Barriers.2(4):e944449;Dinda
, et al.(2013)Curr Pharm Biotechnol.14:1
264-74;Kang,et al.(2014)Curr Pharm Biote
chnol.15(3):220-30;Qian et al.(2014)Expe
rt Opin Drug Metab Toxicol.10(11):1491-5
08)。
ゼをコードするDNA/mRNAは、細胞の取り込みを容易にするために細胞透過性ペプ
チド又は標的化リガンドに結合する。当技術分野において公知の細胞透過性ペプチドの例
には、ポリアルギニン(Jearawiriyapaisarn,et al.(200
8)Mol Ther.16:1624-9)、HIVウイルス由来のTATペプチド(
Hudecz et al.(2005),Med.Res.Rev.25:679-7
36)、MPG(Simeoni,et al.(2003)Nucleic Acid
s Res.31:2717-2724)、Pep-1(Deshayes et al
.(2004)Biochemistry 43:7698-7706、及びHSV-1
VP-22(Deshayes et al.(2005)Cell Mol Lif
e Sci.62:1839-49)が含まれる。別の実施形態において、エンドヌクレ
アーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするDNA/mRNAは、標的細胞
にて発現される特定の細胞表面の受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合で結合
させて、エンドヌクレアーゼタンパク質/DNA/mRNAが標的細胞に結合し、標的細
胞によって内在化されるようにする。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質/DNA
/mRNAを、そのような細胞表面の受容体の天然のリガンド(又は天然のリガンドの一
部)に共有結合又は非共有結合で結合させることができる(McCall,et al.
(2014)Tissue Barriers.2(4):e944449;Dinda
, et al.(2013)Curr Pharm Biotechnol.14:1
264-74;Kang,et al.(2014)Curr Pharm Biote
chnol.15(3):220-30;Qian et al.(2014)Expe
rt Opin Drug Metab Toxicol.10(11):1491-5
08)。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするDNA/mRNAは、(例えば、肝類洞壁内皮細胞又は造血内皮細胞、あるい
はそれに分化する前駆細胞の近傍において)肝臓の所望の領域内への注射又は移植のため
に生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注入を必要とせずに標的組
織の所望の領域へ治療用ペイロードの持続する調整可能な放出をもたらすことができ、刺
激応答材料(例えば温度応答性及びpH応答性ヒドロゲル)は、環境的又は外部から適用
された合図に反応してペイロードを放出するように設計され得る(Kang Derwe
nt et al.(2008)Trans Am Ophthalmol Soc.1
06:206-214)。
コードするDNA/mRNAは、(例えば、肝類洞壁内皮細胞又は造血内皮細胞、あるい
はそれに分化する前駆細胞の近傍において)肝臓の所望の領域内への注射又は移植のため
に生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注入を必要とせずに標的組
織の所望の領域へ治療用ペイロードの持続する調整可能な放出をもたらすことができ、刺
激応答材料(例えば温度応答性及びpH応答性ヒドロゲル)は、環境的又は外部から適用
された合図に反応してペイロードを放出するように設計され得る(Kang Derwe
nt et al.(2008)Trans Am Ophthalmol Soc.1
06:206-214)。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするDNA/mRNAは、ナノ粒子に共有結合で、又は好ましくは非共有結合
で結合されるか、当技術分野で公知の方法を用いてそのようなナノ粒子内に封入される(
Sharma,et al.(2014)Biomed Res Int.2014)。
ナノ粒子は、その長さスケールが<1μm、好ましくは<100nmであるナノスケール
送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子か
ら構成されるコアを用いて設計することができ、エンドヌクレアーゼタンパク質、mRN
A、又はDNAの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これに
より、各細胞に送達されるタンパク質/mRNA/DNAのコピー数が増加し、従って、
各エンドヌクレアーゼの細胞内での発現が増加して標的認識配列が切断される可能性が最
大になる。そのようなナノ粒子の表面をポリマー又は脂質(例えば、キトサン、カチオン
性ポリマー、又はカチオン性脂質)で更に改変して、その表面が細胞の送達及びペイロー
ドの取り込みを増強する追加の機能性を付与するコア-シェルナノ粒子を形成し得る(J
ian et al.(2012)Biomaterials.33(30):7621
-30)。ナノ粒子を適切な細胞型に向かわせるために、及び/又は細胞の取り込みの可
能性を高めるために、有利にもナノ粒子を更に標的化分子に結合させることができる。そ
のような標的化分子の例には、細胞表面の受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に天
然のリガンド(又は天然のリガンドの一部)が含まれる。
ゼをコードするDNA/mRNAは、ナノ粒子に共有結合で、又は好ましくは非共有結合
で結合されるか、当技術分野で公知の方法を用いてそのようなナノ粒子内に封入される(
Sharma,et al.(2014)Biomed Res Int.2014)。
ナノ粒子は、その長さスケールが<1μm、好ましくは<100nmであるナノスケール
送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子か
ら構成されるコアを用いて設計することができ、エンドヌクレアーゼタンパク質、mRN
A、又はDNAの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これに
より、各細胞に送達されるタンパク質/mRNA/DNAのコピー数が増加し、従って、
各エンドヌクレアーゼの細胞内での発現が増加して標的認識配列が切断される可能性が最
大になる。そのようなナノ粒子の表面をポリマー又は脂質(例えば、キトサン、カチオン
性ポリマー、又はカチオン性脂質)で更に改変して、その表面が細胞の送達及びペイロー
ドの取り込みを増強する追加の機能性を付与するコア-シェルナノ粒子を形成し得る(J
ian et al.(2012)Biomaterials.33(30):7621
-30)。ナノ粒子を適切な細胞型に向かわせるために、及び/又は細胞の取り込みの可
能性を高めるために、有利にもナノ粒子を更に標的化分子に結合させることができる。そ
のような標的化分子の例には、細胞表面の受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に天
然のリガンド(又は天然のリガンドの一部)が含まれる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするDNA/mRNAは、リポソーム内に封入されるか、カチオン性脂質を用
いて複合体化される(例えば、LIPOFECTAMINE transfection
reagent,Life Technologies Corp.,Carlsba
d,CA;Zuris et al.(2015)Nat Biotechnol.33
:73-80;Mishra et al.(2011)J Drug Deliv.2
011:863734を参照)。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分
解しないよう保護し、標的部位での蓄積及び保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合及
び/又は細胞膜の破壊を介して、細胞の取り込み及び送達の効率を高めることができる。
ゼをコードするDNA/mRNAは、リポソーム内に封入されるか、カチオン性脂質を用
いて複合体化される(例えば、LIPOFECTAMINE transfection
reagent,Life Technologies Corp.,Carlsba
d,CA;Zuris et al.(2015)Nat Biotechnol.33
:73-80;Mishra et al.(2011)J Drug Deliv.2
011:863734を参照)。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分
解しないよう保護し、標的部位での蓄積及び保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合及
び/又は細胞膜の破壊を介して、細胞の取り込み及び送達の効率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするDNA/mRNAは、ポリマー足場(例えばPLGA)内に封入されるか
、カチオンポリマー(例えばPEI、PLL)を用いて複合体化される(Tamboli
et al.(2011)Ther Deliv.2(4):523-536)。ポリ
マー担体は、ポリマーの侵食及び薬物の拡散の制御を通じて調整可能な薬物放出速度をも
たらすように設計することができ、また高い薬物封入効率により、所望の標的細胞集団へ
細胞内の送達をするまで、治療ペイロードの保護を提供することができる。
ゼをコードするDNA/mRNAは、ポリマー足場(例えばPLGA)内に封入されるか
、カチオンポリマー(例えばPEI、PLL)を用いて複合体化される(Tamboli
et al.(2011)Ther Deliv.2(4):523-536)。ポリ
マー担体は、ポリマーの侵食及び薬物の拡散の制御を通じて調整可能な薬物放出速度をも
たらすように設計することができ、また高い薬物封入効率により、所望の標的細胞集団へ
細胞内の送達をするまで、治療ペイロードの保護を提供することができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又は遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードするDNA/mRNAは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組
み合わされる(Tong et al.(2007)J Gene Med.9(11)
:956-66)。ポリマーのミセルは、凝集を防ぎ、電荷の相互作用をマスクし、非特
異的な相互作用を減少させることができる親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコ
ール)で形成されたミセルのシェルを含み得る。
ヌクレアーゼをコードするDNA/mRNAは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組
み合わされる(Tong et al.(2007)J Gene Med.9(11)
:956-66)。ポリマーのミセルは、凝集を防ぎ、電荷の相互作用をマスクし、非特
異的な相互作用を減少させることができる親水性ポリマー(例えば、ポリエチレングリコ
ール)で形成されたミセルのシェルを含み得る。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするDNA/mRNAは、標的細胞への投与及び/又は送達のために、エマルジョ
ン又はナノエマルジョン(即ち、<1nmの平均粒径を有する)に処方される。「エマル
ション」の用語は、限定することなく、水不混和性の相を水相と混合させたときに、無極
性残基(例えば炭化水素の長鎖)を水及び極性の頭部の基から水に向けて遠ざける疎水性
の力の結果として形成することができる脂質の構造を含んだ、任意の水中油型、油中水型
、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を示す。これらの他の脂質構造とし
ては、単層、小層、及び多層脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに
限定されない。エマルジョンは、水相と親油性相(典型的には油と有機溶媒を含有する)
で構成される。また、エマルジョンは、1以上の界面活性剤を頻繁に含有する。ナノエマ
ルション配合物は、例えば、米国特許出願公開第2002/0045667号及び第20
04/0043041号、並びに米国特許第6,015,832号、第6,506,80
3号、第6,635,676号、及び第6,559,189号に記載されているように周
知であり、その各々は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
コードするDNA/mRNAは、標的細胞への投与及び/又は送達のために、エマルジョ
ン又はナノエマルジョン(即ち、<1nmの平均粒径を有する)に処方される。「エマル
ション」の用語は、限定することなく、水不混和性の相を水相と混合させたときに、無極
性残基(例えば炭化水素の長鎖)を水及び極性の頭部の基から水に向けて遠ざける疎水性
の力の結果として形成することができる脂質の構造を含んだ、任意の水中油型、油中水型
、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を示す。これらの他の脂質構造とし
ては、単層、小層、及び多層脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに
限定されない。エマルジョンは、水相と親油性相(典型的には油と有機溶媒を含有する)
で構成される。また、エマルジョンは、1以上の界面活性剤を頻繁に含有する。ナノエマ
ルション配合物は、例えば、米国特許出願公開第2002/0045667号及び第20
04/0043041号、並びに米国特許第6,015,832号、第6,506,80
3号、第6,635,676号、及び第6,559,189号に記載されているように周
知であり、その各々は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするDNA/mRNAは、多機能ポリマーコンジュゲート、DNAデンドリマ
ー、及びポリマーデンドリマーに共有結合で接着するか、非共有結合で関連させられる(
Mastorakos et al.(2015)Nanoscale.7(9):38
45-56;Cheng et al.(2008)J Pharm Sci.97(1
):123-43)。デンドリマーの発生は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、
また高い薬物ペイロード容量をもたらすことができる。更に、複数の表面の基の表示を利
用して、安定性を向上させ、非特異的な相互作用を低減し、細胞特異的な標的化及び薬物
放出を増強することができる。
ゼをコードするDNA/mRNAは、多機能ポリマーコンジュゲート、DNAデンドリマ
ー、及びポリマーデンドリマーに共有結合で接着するか、非共有結合で関連させられる(
Mastorakos et al.(2015)Nanoscale.7(9):38
45-56;Cheng et al.(2008)J Pharm Sci.97(1
):123-43)。デンドリマーの発生は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、
また高い薬物ペイロード容量をもたらすことができる。更に、複数の表面の基の表示を利
用して、安定性を向上させ、非特異的な相互作用を低減し、細胞特異的な標的化及び薬物
放出を増強することができる。
いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子はウイルスベクター
を用いて送達される。そのようなベクターは当技術分野において公知であり、レトロウイ
ルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイ
ルス(AAV)ベクターが含まれる(Vannucci,et al.(2013)Ne
w Microbiol.36:1-22に概説)。いくつかの実施形態では、ウイルス
ベクターは標的組織(例えば、肝組織)に直接注射される。別の実施形態において、ウイ
ルスベクターは循環系を介して全身的に送達される。異なるAAVベクターが異なる組織
に位置付けられる傾向があることは、当技術分野において公知である。肝臓標的組織にお
いて、肝細胞の効果的な形質導入は、例えば、AAV血清型2、8、及び9で示されてい
る(Sands(2011)Methods Mol.Biol.807:141-15
7)。また、AAVベクターは、それらが宿主細胞で第二鎖のDNAの合成を必要としな
いように、自己相補的であり得る(McCarty,et al.(2001)Gene
Ther.8:1248-54)。
を用いて送達される。そのようなベクターは当技術分野において公知であり、レトロウイ
ルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイ
ルス(AAV)ベクターが含まれる(Vannucci,et al.(2013)Ne
w Microbiol.36:1-22に概説)。いくつかの実施形態では、ウイルス
ベクターは標的組織(例えば、肝組織)に直接注射される。別の実施形態において、ウイ
ルスベクターは循環系を介して全身的に送達される。異なるAAVベクターが異なる組織
に位置付けられる傾向があることは、当技術分野において公知である。肝臓標的組織にお
いて、肝細胞の効果的な形質導入は、例えば、AAV血清型2、8、及び9で示されてい
る(Sands(2011)Methods Mol.Biol.807:141-15
7)。また、AAVベクターは、それらが宿主細胞で第二鎖のDNAの合成を必要としな
いように、自己相補的であり得る(McCarty,et al.(2001)Gene
Ther.8:1248-54)。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼ遺伝子送達に使用されるウイルスベクターは、自
己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、ベクター内の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼについての認識配列の存在に起因して、細胞又は生物において限
られた持続時間を有し得る。従って、自己制限ウイルスベクターは、プロモータ、本明細
書に記載のエンドヌクレアーゼ、及びITR内のエンドヌクレアーゼ認識部位をコードす
るように遺伝子操作することができる。自己制限ウイルスベクターは、エンドヌクレアー
ゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように
、エンドヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生物に送達する。送達されたエンドヌク
レアーゼはまた、自己制限ウイルスベクター自体の中で標的部位を見つけて、その標的部
位でベクターを切断する。一旦切断されると、ウイルスゲノムの5’及び3’末端が露出
されてエキソヌクレアーゼによって分解され、そのためウイルスを死滅させて、エンドヌ
クレアーゼの産生を止める。
己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、ベクター内の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼについての認識配列の存在に起因して、細胞又は生物において限
られた持続時間を有し得る。従って、自己制限ウイルスベクターは、プロモータ、本明細
書に記載のエンドヌクレアーゼ、及びITR内のエンドヌクレアーゼ認識部位をコードす
るように遺伝子操作することができる。自己制限ウイルスベクターは、エンドヌクレアー
ゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように
、エンドヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生物に送達する。送達されたエンドヌク
レアーゼはまた、自己制限ウイルスベクター自体の中で標的部位を見つけて、その標的部
位でベクターを切断する。一旦切断されると、ウイルスゲノムの5’及び3’末端が露出
されてエキソヌクレアーゼによって分解され、そのためウイルスを死滅させて、エンドヌ
クレアーゼの産生を止める。
エンドヌクレアーゼ遺伝子が、DNAの形態(例えばプラスミド)で、及び/又はウイ
ルスベクター(例えばAAV)を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能
に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクター
由来の内因性プロモータ(例えば、レンチウイルスベクターのLTR)又は周知のサイト
メガロウイルス若しくはSV40ウイルス初期プロモータ等のウイルスプロモータであり
得る。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において優先的
に遺伝子発現を駆動するプロモータに作動可能に連結されている。肝特異的プロモータの
例としては、限定することなく、ヒトα-1アンチトリプシンプロモータ及びアポリポタ
ンパク質A-IIプロモータが挙げられる。
ルスベクター(例えばAAV)を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能
に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクター
由来の内因性プロモータ(例えば、レンチウイルスベクターのLTR)又は周知のサイト
メガロウイルス若しくはSV40ウイルス初期プロモータ等のウイルスプロモータであり
得る。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において優先的
に遺伝子発現を駆動するプロモータに作動可能に連結されている。肝特異的プロモータの
例としては、限定することなく、ヒトα-1アンチトリプシンプロモータ及びアポリポタ
ンパク質A-IIプロモータが挙げられる。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。また、ウイル
スベクターは、2以上のカセットを含み得、各カセットがプロモータと、本明細書に記載
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作された
メガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸
配列を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を
駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNA、例えば遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmRNAを生成する。
作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。また、ウイル
スベクターは、2以上のカセットを含み得、各カセットがプロモータと、本明細書に記載
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作された
メガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるHBV認識配列に対する特異性を有する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸
配列を含む1つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を
駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックmRNA、例えば遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックmRNAを生成する。
本明細書に開示のメガヌクレアーゼをHBVに感染した対象の肝臓に送達するための方
法及び組成物が提供される。一実施形態では、哺乳動物から取り出された生来の肝細胞は
、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターで形質導入することができる
。あるいは、HBV感染対象の生来の肝細胞は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び
/又は肝の再生を刺激する分子、例えば肝毒素をコードするアデノウイルスベクターで、
エクスビボで形質導入され得る。好ましくは、肝毒素はuPAであり、ウイルスベクター
によって発現されると、肝細胞からのその分泌を阻害するように改変されている。別の実
施形態では、ベクターはtPAをコードし、これは肝細胞の再生をデノボで刺激すること
ができる。哺乳動物から取り出した形質導入された肝細胞は、次いで哺乳動物に戻すこと
ができ、その場合、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現に資する条件が付与される
。典型的には、形質導入された肝細胞は、脾臓又は門脈脈管構造を通して注入することに
よって患者に戻すことができ、投与は、1~5日以上の期間にわたって、単回又は複数回
であり得る。
法及び組成物が提供される。一実施形態では、哺乳動物から取り出された生来の肝細胞は
、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターで形質導入することができる
。あるいは、HBV感染対象の生来の肝細胞は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び
/又は肝の再生を刺激する分子、例えば肝毒素をコードするアデノウイルスベクターで、
エクスビボで形質導入され得る。好ましくは、肝毒素はuPAであり、ウイルスベクター
によって発現されると、肝細胞からのその分泌を阻害するように改変されている。別の実
施形態では、ベクターはtPAをコードし、これは肝細胞の再生をデノボで刺激すること
ができる。哺乳動物から取り出した形質導入された肝細胞は、次いで哺乳動物に戻すこと
ができ、その場合、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現に資する条件が付与される
。典型的には、形質導入された肝細胞は、脾臓又は門脈脈管構造を通して注入することに
よって患者に戻すことができ、投与は、1~5日以上の期間にわたって、単回又は複数回
であり得る。
本発明の方法のインビボの態様では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし、
対象に投与されるレトロウイルス、シュードタイプ又はアデノウイルス関連ベクターが構
築されている。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターの投与は、分泌
障害の肝毒素をコードする、又はtPAをコードするアデノウイルスベクターの投与と共
に起こり得、それは肝毒素として作用することなく肝細胞の再生を刺激する。
対象に投与されるレトロウイルス、シュードタイプ又はアデノウイルス関連ベクターが構
築されている。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターの投与は、分泌
障害の肝毒素をコードする、又はtPAをコードするアデノウイルスベクターの投与と共
に起こり得、それは肝毒素として作用することなく肝細胞の再生を刺激する。
適切な用量は、他の要因の中でも、選択された任意のAAVベクターの詳細(例えば、
血清型等)、投与経路、治療される対象(即ち、年齢、体重、性別、及び対象の全身状態
)、及び投与の様式に依存する。従って、適切な投与量は患者ごとに異なり得る。適切な
有効量は、当業者が容易に判断することができる。投薬治療は、単回投与計画又は複数回
投与計画であり得る。更に、対象は、極力適切な多さの用量を投与され得る。当業者は適
切な用量数を容易に判断することができる。投与量は、別の投与経路を考慮に入れるか、
治療の利益と任意の副作用とのバランスをとるために調整する必要があり得る。
血清型等)、投与経路、治療される対象(即ち、年齢、体重、性別、及び対象の全身状態
)、及び投与の様式に依存する。従って、適切な投与量は患者ごとに異なり得る。適切な
有効量は、当業者が容易に判断することができる。投薬治療は、単回投与計画又は複数回
投与計画であり得る。更に、対象は、極力適切な多さの用量を投与され得る。当業者は適
切な用量数を容易に判断することができる。投与量は、別の投与経路を考慮に入れるか、
治療の利益と任意の副作用とのバランスをとるために調整する必要があり得る。
2.4 医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼ、又は医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含む医薬組成
物を提供する。他の実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体と、本明細書
に開示されるような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを細胞が発現する標的組織に送達
することができる本発明の細胞とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、
HBVを有する対象を治療すること、HBVのレベル若しくは増殖を低減させること、H
BVの少なくとも1つの症状を減少させること、又はHCCを治療することに有用であり
得る。
操作されたメガヌクレアーゼ、又は医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含む医薬組成
物を提供する。他の実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体と、本明細書
に開示されるような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを細胞が発現する標的組織に送達
することができる本発明の細胞とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、
HBVを有する対象を治療すること、HBVのレベル若しくは増殖を低減させること、H
BVの少なくとも1つの症状を減少させること、又はHCCを治療することに有用であり
得る。
医薬組成物は、標的HBV株の遺伝子型に従って、設計又は選択することができる。本
明細書に詳細に記載されるように、本発明のメガヌクレアーゼは、HBVの特定の遺伝子
型における認識配列を認識して切断するように遺伝子操作されている。例えば、HBV1
-2メガヌクレアーゼ(例えば、配列番号18~21)は、少なくともHBV遺伝子型A
、B、C、E、F、及びG(例えば、それぞれ配列番号3~5及び7~9)のゲノムに見
出されるHBV1-2認識配列を認識し切断する。更に、本明細書に開示される遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼの認識配列は、配列番号3~9において提供される各遺伝子型
の例に対して100%の配列同一性を共有してはいないHBV遺伝子型A、B、C、D、
E、F、及びGの単離体にて見出すことができる。本明細書で使用しているとき、HBV
の「単離体」は、配列番号3~9のいずれかにおいて提供される、対応する遺伝子型の例
と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なく
とも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98
%、少なくとも99%、又はそれより多くの配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形
態において、本明細書に開示される医薬組成物は、配列番号10、12、14、又は16
に定められる認識配列を含むHBVの任意の遺伝子型を有する対象に投与することができ
る。
明細書に詳細に記載されるように、本発明のメガヌクレアーゼは、HBVの特定の遺伝子
型における認識配列を認識して切断するように遺伝子操作されている。例えば、HBV1
-2メガヌクレアーゼ(例えば、配列番号18~21)は、少なくともHBV遺伝子型A
、B、C、E、F、及びG(例えば、それぞれ配列番号3~5及び7~9)のゲノムに見
出されるHBV1-2認識配列を認識し切断する。更に、本明細書に開示される遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼの認識配列は、配列番号3~9において提供される各遺伝子型
の例に対して100%の配列同一性を共有してはいないHBV遺伝子型A、B、C、D、
E、F、及びGの単離体にて見出すことができる。本明細書で使用しているとき、HBV
の「単離体」は、配列番号3~9のいずれかにおいて提供される、対応する遺伝子型の例
と少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なく
とも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98
%、少なくとも99%、又はそれより多くの配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形
態において、本明細書に開示される医薬組成物は、配列番号10、12、14、又は16
に定められる認識配列を含むHBVの任意の遺伝子型を有する対象に投与することができ
る。
そのような医薬組成物は公知の技術に従って調製することができる。例えば、Remi
ngton,The Science And Practice of Pharma
cy(21sted.2005)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において
、エンドヌクレアーゼポリペプチド(又はそれをコードするDNA/RNA)は、典型的
には、医薬上許容される担体と混合され、得られる組成物は対象に投与される。担体は当
然、製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、ま
た対象にとって有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物
は、対象における疾患の治療に有用な1又は複数の追加の薬剤又は生体分子を更に含むこ
とができる。同様に、追加の薬剤及び/又は生体分子を別々の組成物として同時投与する
ことができる。
ngton,The Science And Practice of Pharma
cy(21sted.2005)を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において
、エンドヌクレアーゼポリペプチド(又はそれをコードするDNA/RNA)は、典型的
には、医薬上許容される担体と混合され、得られる組成物は対象に投与される。担体は当
然、製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、ま
た対象にとって有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物
は、対象における疾患の治療に有用な1又は複数の追加の薬剤又は生体分子を更に含むこ
とができる。同様に、追加の薬剤及び/又は生体分子を別々の組成物として同時投与する
ことができる。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼ(又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸)の組み合わせ
を含むことができ、この場合それぞれの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるH
BV認識配列に対する特異性を有し、その結果、単一の医薬組成物が、対象における広範
なアレイのHBV遺伝子型及び/又は遺伝子型単離体の治療に広範囲に有用となる。同様
に、他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、異なるHBV認識配列に対する特異性を
有する本明細書に記載の複数の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシス
トロニックmRNA(又は発現時にポリシストロニックmRNAを産生するカセットを有
する組換えDNA構築物又はウイルスベクター)を含み得る。そのような医薬組成物はま
た、対象における広範なアレイのHBV遺伝子型及び/又は遺伝子型単離体の治療に広範
囲に有用となる。いずれの場合も、そのような医薬組成物は、特定のHBV遺伝子型又は
単離体が対象において既知であるか未知であるときの単一の治療として有用であり得る。
ヌクレアーゼ(又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸)の組み合わせ
を含むことができ、この場合それぞれの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるH
BV認識配列に対する特異性を有し、その結果、単一の医薬組成物が、対象における広範
なアレイのHBV遺伝子型及び/又は遺伝子型単離体の治療に広範囲に有用となる。同様
に、他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、異なるHBV認識配列に対する特異性を
有する本明細書に記載の複数の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシス
トロニックmRNA(又は発現時にポリシストロニックmRNAを産生するカセットを有
する組換えDNA構築物又はウイルスベクター)を含み得る。そのような医薬組成物はま
た、対象における広範なアレイのHBV遺伝子型及び/又は遺伝子型単離体の治療に広範
囲に有用となる。いずれの場合も、そのような医薬組成物は、特定のHBV遺伝子型又は
単離体が対象において既知であるか未知であるときの単一の治療として有用であり得る。
例えば、本明細書に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む、又は本明細書
に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含む医薬組成物は
、HBVの複数の遺伝子型に感染した、又はHBVの未知の遺伝子型に感染した患者に投
与できる。従って、複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む医薬組成物を準備するこ
と、又は複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含むことで、資源
によりHBVの正確な遺伝子型判定ができず、また迅速で広い治療の解決が望まれるHB
V感染の治療及び制御に対する柔軟な選択肢が得られる。
に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含む医薬組成物は
、HBVの複数の遺伝子型に感染した、又はHBVの未知の遺伝子型に感染した患者に投
与できる。従って、複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む医薬組成物を準備するこ
と、又は複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含むことで、資源
によりHBVの正確な遺伝子型判定ができず、また迅速で広い治療の解決が望まれるHB
V感染の治療及び制御に対する柔軟な選択肢が得られる。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に
記載の1以上のmRNAを含むことができ、それは本明細書の他の箇所に記載されている
。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に
対する特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする
、本明細書に記載の2以上のmRNAを含み得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は
、それぞれが異なるHBV認識配列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする、本明細書に記載の2、3、又は4つのmRNAを含み得る
。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する
特異性を有する本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードす
る、本明細書に記載の1以上のポリシストロニックmRNAを含み得る。特定の実施形態
では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の2、3、又は4つの遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードするポリシストロニックmRNAを含むことができる。他の特定の実施
形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の2以上のポリシストロニックmRNAを含
むことができ、各々本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。
記載の1以上のmRNAを含むことができ、それは本明細書の他の箇所に記載されている
。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に
対する特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする
、本明細書に記載の2以上のmRNAを含み得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は
、それぞれが異なるHBV認識配列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする、本明細書に記載の2、3、又は4つのmRNAを含み得る
。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるHBV認識配列に対する
特異性を有する本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードす
る、本明細書に記載の1以上のポリシストロニックmRNAを含み得る。特定の実施形態
では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の2、3、又は4つの遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードするポリシストロニックmRNAを含むことができる。他の特定の実施
形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の2以上のポリシストロニックmRNAを含
むことができ、各々本発明の2以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。
本発明での使用が企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも1つのカチオン性
脂質、少なくとも1つの非カチオン性脂質、及び少なくとも1つの複合脂質を含む。より
特定の例では、脂質ナノ粒子は、約50モル%~約85モル%のカチオン性脂質、約13
モル%~約49.5モル%の非カチオン性脂質、及び約0.5モル%~約10モル%の脂
質コンジュゲートを含み得、非ラメラ(即ち、非二層)の形態を有するような方法で製造
される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約40モル%~約85モル%のカチオン性
脂質、約13モル%~約49.5モル%の非カチオン性脂質、及び約0.5モル%~約1
0モル%の脂質コンジュゲートを含み得、非ラメラ(即ち、非二層)の形態を有するよう
な方法で製造される。
脂質、少なくとも1つの非カチオン性脂質、及び少なくとも1つの複合脂質を含む。より
特定の例では、脂質ナノ粒子は、約50モル%~約85モル%のカチオン性脂質、約13
モル%~約49.5モル%の非カチオン性脂質、及び約0.5モル%~約10モル%の脂
質コンジュゲートを含み得、非ラメラ(即ち、非二層)の形態を有するような方法で製造
される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約40モル%~約85モル%のカチオン性
脂質、約13モル%~約49.5モル%の非カチオン性脂質、及び約0.5モル%~約1
0モル%の脂質コンジュゲートを含み得、非ラメラ(即ち、非二層)の形態を有するよう
な方法で製造される。
カチオン性脂質は、例えば、以下の1以上を含み得る:パルミトイル-オレオイル-ノ
ル-アルギニン(PONA)、MPDACA、GUADACA、((6Z、9Z、28Z
、31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(
ジメチルアミノ)ブタン酸)(MC3);LenMC3、CP-LenMC3、γ-Le
nMC3、CP-γーLenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3エーテル、MC4
エーテル、MC3アミド、Pan-MC3、Pan-MC4、及びPanMC5、1,2
-ジリノレイルオキシ-N,Nジメチルアミノプロパン(DLinDMA)1,2-ジリ
ノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、2,2-ジリノ
レイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K
-C2-DMA;「XTC2」)、2,2-ジリノレイル-4-(3-ジメチルアミノプ
ロピル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-C3-DMA)、2,2-ジリノ
レイル-4-(4-ジメチルアミノブチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K
-C4-DMA)、2,2-ジリノレイル-5-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジ
オキサン(DLin-K6-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-N-メチルペジアジ
ノ-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-MPZ)、2,2-ジリノレイル-4-
ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、1,2-
ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-C-DAP
)、1,2-ジリノレイオキシ-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin
-DAC)、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン(DLin-MA)、
1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2-ジ
リノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-S-DMA)、1-リノレオ
イル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-2-DMAP)
、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin-
TMA.Cl)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(
DLin-TAP.Cl)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N-メチルピペラジノ
)プロパン(DLin-MPZ)、3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-1,2-プロ
パンジオール(DLinAP)、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-1,2-プロパン
ジオ(DOAP)、1,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ)
エトキシプロパン(DLin-EG-DMA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチル
アンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジオレオイルオキシ-N,N-ジメチル
アミノプロパン(DODMA)、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチルアミノ
プロパン(DSDMA)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N
,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N-ジステアリル-N,N
-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキ
シ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、3-(
N-(N´,N´-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(DC-C
hol)、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-
N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、2,3-ジオレオイルオキ
シ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパ
ンアミニウムトリフルオロ酢酸塩(DOSPA)、ジオクタデシルアミドグリシルスペル
ミン(DOGS)、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-ベータ-オキ
シブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエノキシ)プ
ロパン(CLinDMA)、2-[5´-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)
-3´-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9’,1-2´-
オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、N,N-ジメチル-3,4-ジ
オレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、1,2-N,N’-ジオレイルカルバミ
ル-3-ジメチルアミノプロパン(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-ジリノレ
イルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン(DLincarbDAP)、又はそれら
の混合物。カチオン性脂質はまた、DLinDMA、DLin-K-C2-DMA(「X
TC2」)、MC3、LenMC3、CP-LenMC3、γ-LenMC3、CP-γ
-LenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3エーテル、MC4エーテル、MC3ア
ミド、Pan-MC3、Pan-MC4、PanMC5、又はそれらの混合物であってよ
い。
ル-アルギニン(PONA)、MPDACA、GUADACA、((6Z、9Z、28Z
、31Z)-ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-イル4-(
ジメチルアミノ)ブタン酸)(MC3);LenMC3、CP-LenMC3、γ-Le
nMC3、CP-γーLenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3エーテル、MC4
エーテル、MC3アミド、Pan-MC3、Pan-MC4、及びPanMC5、1,2
-ジリノレイルオキシ-N,Nジメチルアミノプロパン(DLinDMA)1,2-ジリ
ノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、2,2-ジリノ
レイル-4-(2-ジメチルアミノエチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K
-C2-DMA;「XTC2」)、2,2-ジリノレイル-4-(3-ジメチルアミノプ
ロピル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-C3-DMA)、2,2-ジリノ
レイル-4-(4-ジメチルアミノブチル)-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K
-C4-DMA)、2,2-ジリノレイル-5-ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジ
オキサン(DLin-K6-DMA)、2,2-ジリノレイル-4-N-メチルペジアジ
ノ-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-MPZ)、2,2-ジリノレイル-4-
ジメチルアミノメチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-K-DMA)、1,2-
ジリノレイルカルバモイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-C-DAP
)、1,2-ジリノレイオキシ-3-(ジメチルアミノ)アセトキシプロパン(DLin
-DAC)、1,2-ジリノレイオキシ-3-モルホリノプロパン(DLin-MA)、
1,2-ジリノレオイル-3-ジメチルアミノプロパン(DLinDAP)、1,2-ジ
リノレイルチオ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-S-DMA)、1-リノレオ
イル-2-リノレイルオキシ-3-ジメチルアミノプロパン(DLin-2-DMAP)
、1,2-ジリノレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(DLin-
TMA.Cl)、1,2-ジリノレオイル-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(
DLin-TAP.Cl)、1,2-ジリノレイルオキシ-3-(N-メチルピペラジノ
)プロパン(DLin-MPZ)、3-(N,N-ジリノレイルアミノ)-1,2-プロ
パンジオール(DLinAP)、3-(N,N-ジオレイルアミノ)-1,2-プロパン
ジオ(DOAP)、1,2-ジリノレイルオキソ-3-(2-N,N-ジメチルアミノ)
エトキシプロパン(DLin-EG-DMA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチル
アンモニウムクロリド(DODAC)、1,2-ジオレオイルオキシ-N,N-ジメチル
アミノプロパン(DODMA)、1,2-ジステアリルオキシ-N,N-ジメチルアミノ
プロパン(DSDMA)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N
,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N-ジステアリル-N,N
-ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N-(1-(2,3-ジオレオイルオキ
シ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、3-(
N-(N´,N´-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(DC-C
hol)、N-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-
N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、2,3-ジオレオイルオキ
シ-N-[2(スペルミン-カルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパ
ンアミニウムトリフルオロ酢酸塩(DOSPA)、ジオクタデシルアミドグリシルスペル
ミン(DOGS)、3-ジメチルアミノ-2-(コレスト-5-エン-3-ベータ-オキ
シブタン-4-オキシ)-1-(cis,cis-9,12-オクタデカジエノキシ)プ
ロパン(CLinDMA)、2-[5´-(コレスタ-5-エン-3-ベータ-オキシ)
-3´-オキサペントキシ)-3-ジメチル-1-(cis,cis-9’,1-2´-
オクタデカジエノキシ)プロパン(CpLinDMA)、N,N-ジメチル-3,4-ジ
オレイルオキシベンジルアミン(DMOBA)、1,2-N,N’-ジオレイルカルバミ
ル-3-ジメチルアミノプロパン(DOcarbDAP)、1,2-N,N’-ジリノレ
イルカルバミル-3-ジメチルアミノプロパン(DLincarbDAP)、又はそれら
の混合物。カチオン性脂質はまた、DLinDMA、DLin-K-C2-DMA(「X
TC2」)、MC3、LenMC3、CP-LenMC3、γ-LenMC3、CP-γ
-LenMC3、MC3MC、MC2MC、MC3エーテル、MC4エーテル、MC3ア
ミド、Pan-MC3、Pan-MC4、PanMC5、又はそれらの混合物であってよ
い。
様々な実施形態において、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約50mol%
~約90mol%、約50mol%~約85mol%、約50mol%~約80mol%
、約50mol%~約75mol%、約50mol%~約70mol%、約50mol%
~約65mol%、又は約50mol%~約60mol%を含み得る。
~約90mol%、約50mol%~約85mol%、約50mol%~約80mol%
、約50mol%~約75mol%、約50mol%~約70mol%、約50mol%
~約65mol%、又は約50mol%~約60mol%を含み得る。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約40mol%~約9
0mol%、約40mol%~約85mol%、約40mol%~約80mol%、約4
0mol%~約75mol%、約40mol%~約70mol%、約40mol%~約6
5mol%、又は約40mol%~約60mol%を含み得る。
0mol%、約40mol%~約85mol%、約40mol%~約80mol%、約4
0mol%~約75mol%、約40mol%~約70mol%、約40mol%~約6
5mol%、又は約40mol%~約60mol%を含み得る。
非カチオン性脂質は、例えば、1以上のアニオン性脂質及び/又は中性脂質を含み得る
。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質の成分のうちの1つを含
む:(1)コレステロール若しくはその誘導体;(2)リン脂質;又は(3)リン脂質と
コレステロール若しくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例には、コレス
タノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2’-ヒド
ロキシエチルエーテル、コレステリル-4’-ヒドロキシブチルエーテル、及びそれらの
混合物が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質は、中性脂質、例えば非限定的に
、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコ
リン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミ
トイルオレオイル-ホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホス
ファチジルエタノールアミン(POPE)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルグ
リセロール(POPG)、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン(DPPE
)、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-
ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、モノメチル-ホスファチジルエタノール
アミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジル
エタノールアミン(DEPE)、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールア
ミン(SOPE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、及びそれらの混合物であってよ
い。ある好ましい態様において、リン脂質は、DPPC、DSPC、又はそれらの混合物
である。
。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質の成分のうちの1つを含
む:(1)コレステロール若しくはその誘導体;(2)リン脂質;又は(3)リン脂質と
コレステロール若しくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例には、コレス
タノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル-2’-ヒド
ロキシエチルエーテル、コレステリル-4’-ヒドロキシブチルエーテル、及びそれらの
混合物が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質は、中性脂質、例えば非限定的に
、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコ
リン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミ
トイルオレオイル-ホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホス
ファチジルエタノールアミン(POPE)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルグ
リセロール(POPG)、ジパルミトイル-ホスファチジルエタノールアミン(DPPE
)、ジミリストイル-ホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-
ホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、モノメチル-ホスファチジルエタノール
アミン、ジメチル-ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル-ホスファチジル
エタノールアミン(DEPE)、ステアロイルオレオイル-ホスファチジルエタノールア
ミン(SOPE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、及びそれらの混合物であってよ
い。ある好ましい態様において、リン脂質は、DPPC、DSPC、又はそれらの混合物
である。
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質(例えば、1以上のリン脂質及び/又
はコレステロール)は、粒子に存在する総脂質の約10mol%~約60mol%、約1
5mol%~約60mol%、約20mol%~約60mol%、約25mol%~約6
0mol%、約30mol%~約60mol%、約10mol%~約55mol%、約1
5mol%~約55mol%、約20mol%~約55mol%、約25mol%~約5
5mol%、約30mol%~約55mol%、約13mol%~約50mol%、約1
5mol%~約50mol%、又は約20mol%~約50mol%を含み得る。非カチ
オン性脂質がリン脂質とコレステロール又はコレステロール誘導体との混合物である場合
、混合物は粒子に存在する総脂質の最大約40、50、又は60モル%を含んでもよい。
はコレステロール)は、粒子に存在する総脂質の約10mol%~約60mol%、約1
5mol%~約60mol%、約20mol%~約60mol%、約25mol%~約6
0mol%、約30mol%~約60mol%、約10mol%~約55mol%、約1
5mol%~約55mol%、約20mol%~約55mol%、約25mol%~約5
5mol%、約30mol%~約55mol%、約13mol%~約50mol%、約1
5mol%~約50mol%、又は約20mol%~約50mol%を含み得る。非カチ
オン性脂質がリン脂質とコレステロール又はコレステロール誘導体との混合物である場合
、混合物は粒子に存在する総脂質の最大約40、50、又は60モル%を含んでもよい。
粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)-脂質
コンジュゲート、ポリアミド(ATTA)-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-
脂質コンジュゲート(CPL)、又はそれら混合物の1以上を含み得る。1つの好ましい
態様において、核酸-脂質粒子は、PEG-脂質コンジュゲート又はATTA-脂質コン
ジュゲートのいずれかを含む。特定の実施形態では、PEG-脂質コンジュゲート又はA
TTA-脂質コンジュゲートはCPLと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂
質は、例えば、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)、PEGジアルキルオキシプロ
ピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、又はそれらの混合物
を含むPEG-脂質を含み得る。PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリル
オキシプロピル(C12)、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(C14)、PEG-
ジパルミチルオキシプロピル(C16)、PEG-ジステアリルオキシプロピル(C18
)、又はそれらの混合物であり得る。
コンジュゲート、ポリアミド(ATTA)-脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー-
脂質コンジュゲート(CPL)、又はそれら混合物の1以上を含み得る。1つの好ましい
態様において、核酸-脂質粒子は、PEG-脂質コンジュゲート又はATTA-脂質コン
ジュゲートのいずれかを含む。特定の実施形態では、PEG-脂質コンジュゲート又はA
TTA-脂質コンジュゲートはCPLと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂
質は、例えば、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)、PEGジアルキルオキシプロ
ピル(DAA)、PEG-リン脂質、PEG-セラミド(Cer)、又はそれらの混合物
を含むPEG-脂質を含み得る。PEG-DAAコンジュゲートは、PEG-ジラウリル
オキシプロピル(C12)、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(C14)、PEG-
ジパルミチルオキシプロピル(C16)、PEG-ジステアリルオキシプロピル(C18
)、又はそれらの混合物であり得る。
本発明における使用に適した更なるPEG-脂質コンジュゲートとしては、mPEG2
000-1,2-ジ-O-アルキル-sn3-カルボモイルグリセリド(PEG-C-D
OMG)が挙げられるが、これらに限定されない。PEG-C-DOMGの合成は、PC
T出願第PCT/US08/88676号に記載されている。本発明での使用に適した更
に追加のPEG-脂質コンジュゲートとしては、限定されないが、1-[8’-(1,2
-ジミリストイル-3-プロパノキシ)-カルボキサミド-3’,6’-ジオキサオクタ
ニル]カルバモイル-ω-メチル-ポリ(エチレングリコール)(2KPEG-DMG)
が挙げられる。2KPEG-DMGの合成は、米国特許第7,404,969号に記載さ
れている。
000-1,2-ジ-O-アルキル-sn3-カルボモイルグリセリド(PEG-C-D
OMG)が挙げられるが、これらに限定されない。PEG-C-DOMGの合成は、PC
T出願第PCT/US08/88676号に記載されている。本発明での使用に適した更
に追加のPEG-脂質コンジュゲートとしては、限定されないが、1-[8’-(1,2
-ジミリストイル-3-プロパノキシ)-カルボキサミド-3’,6’-ジオキサオクタ
ニル]カルバモイル-ω-メチル-ポリ(エチレングリコール)(2KPEG-DMG)
が挙げられる。2KPEG-DMGの合成は、米国特許第7,404,969号に記載さ
れている。
場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲー
ト)は、粒子に存在する総脂質の約0.1mol%~約2mol%、約0.5mol%~
約2mol%、約1mol%~約2mol%、約0.6mol%~約1.9mol%、約
0.7mol%~約1.8mol%、約0.8mol%~約1.7mol%、約1mol
%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1
.7mol%、約1.3mol%~約1.6mol%、約1.4mol%~約1.5mo
l%、又は約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、又は2mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。
典型的には、そのような場合、PEG部分は約2,000ダルトンの平均分子量を有する
。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲ
ート)は、粒子に存在する総脂質の約5.0mol%~約10mol%、約5mol%~
約9mol%、約5mol%~約8mol%、約6mol%~約9mol%、約6mol
%~約8mol%、約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%、
10mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。典型的には
、そのような場合、PEG部分は約750ダルトンの平均分子量を有する。
ト)は、粒子に存在する総脂質の約0.1mol%~約2mol%、約0.5mol%~
約2mol%、約1mol%~約2mol%、約0.6mol%~約1.9mol%、約
0.7mol%~約1.8mol%、約0.8mol%~約1.7mol%、約1mol
%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1
.7mol%、約1.3mol%~約1.6mol%、約1.4mol%~約1.5mo
l%、又は約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、又は2mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。
典型的には、そのような場合、PEG部分は約2,000ダルトンの平均分子量を有する
。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲ
ート)は、粒子に存在する総脂質の約5.0mol%~約10mol%、約5mol%~
約9mol%、約5mol%~約8mol%、約6mol%~約9mol%、約6mol
%~約8mol%、約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%、
10mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。典型的には
、そのような場合、PEG部分は約750ダルトンの平均分子量を有する。
他の実施形態では、組成物は、正電荷とは異なる、少なくとも1つの正電荷担体と少な
くとも1つの負電荷担体とを含む両性リポソームを含むことができ、リポソームの等電点
は4~8である。この目的は、リポソームをpH依存性の変化する電荷で準備するという
事実により達成される。
くとも1つの負電荷担体とを含む両性リポソームを含むことができ、リポソームの等電点
は4~8である。この目的は、リポソームをpH依存性の変化する電荷で準備するという
事実により達成される。
所望の特性を有するリポソームの構造は、例えば、膜形成又は膜ベースのカチオン電荷
担体の量が、低いpHではアニオン電荷担体の量を超え、その比がより高いpHでは逆転
するときに形成される。これは、イオン性成分のpKa値が4~9の場合に常に当てはま
る。媒体のpHが低下すると、全てのカチオン電荷担体がより荷電し、全てのアニオン電
荷担体はその電荷を失う。
担体の量が、低いpHではアニオン電荷担体の量を超え、その比がより高いpHでは逆転
するときに形成される。これは、イオン性成分のpKa値が4~9の場合に常に当てはま
る。媒体のpHが低下すると、全てのカチオン電荷担体がより荷電し、全てのアニオン電
荷担体はその電荷を失う。
両性リポソームに有用なカチオン性化合物には、本明細書において既に上記したカチオ
ン性化合物が含まれる。限定するものではないが、カチオン性の強い化合物には、例えば
、DC-Chol 3-β-[N-(N’,N’-ジメチルメタン)カルバモイル]コレ
ステロール、TC-Chol 3-β-[N-(N’,N’,N’-トリメチルアミノエ
タン)カルバモイルコレステロール、BGSCビスグアニジニウム-スペルミジン-コレ
ステロール、BGTCビス-グアジニウム-トレン-コレステロール、DOTAP(1,
2-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、D
OSPER(1,3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシ-スペルミル)-プロ
ピルアミド)、DOTMA(1,2-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N,N-トリ
メチルアンモニウムクロリド)(リポフェクチン(登録商標))、DORIE1,2-ジ
オレオイルオキシプロピル)-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、D
OSC(1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセリルコリンエステル)、
DOGSDSO(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-スクシニル-2-ヒドロ
キシエチルジスルフィドオルニチン(omithine))、DDABジメチルジオクタ
デシルアンモニウムブロミド、DOGS((C18)2GlySper3+)N,N-ジ
オクタデシルアミド-グリコール-スペルミン(トランスフェクタム(登録商標))(C
18)2Gly+N,N-ジオクタデシルアミド-グリシン、CTABセチルトリメチル
アンモニウムブロミド、CpyCセチルピリジニウムクロリド、DOEPC1,2-ジオ
レオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン又は他のO-アルキル-ホスファチ
ジルコリン又はエタノールアミン、リジンからのアミド、アルギニン又はオルニチン(o
mithine)、及びホスファチジルエタノールアミンを含むことができる。
ン性化合物が含まれる。限定するものではないが、カチオン性の強い化合物には、例えば
、DC-Chol 3-β-[N-(N’,N’-ジメチルメタン)カルバモイル]コレ
ステロール、TC-Chol 3-β-[N-(N’,N’,N’-トリメチルアミノエ
タン)カルバモイルコレステロール、BGSCビスグアニジニウム-スペルミジン-コレ
ステロール、BGTCビス-グアジニウム-トレン-コレステロール、DOTAP(1,
2-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド、D
OSPER(1,3-ジオレオイルオキシ-2-(6-カルボキシ-スペルミル)-プロ
ピルアミド)、DOTMA(1,2-ジオレオイルオキシプロピル)-N,N,N-トリ
メチルアンモニウムクロリド)(リポフェクチン(登録商標))、DORIE1,2-ジ
オレオイルオキシプロピル)-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、D
OSC(1,2-ジオレオイル-3-スクシニル-sn-グリセリルコリンエステル)、
DOGSDSO(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-スクシニル-2-ヒドロ
キシエチルジスルフィドオルニチン(omithine))、DDABジメチルジオクタ
デシルアンモニウムブロミド、DOGS((C18)2GlySper3+)N,N-ジ
オクタデシルアミド-グリコール-スペルミン(トランスフェクタム(登録商標))(C
18)2Gly+N,N-ジオクタデシルアミド-グリシン、CTABセチルトリメチル
アンモニウムブロミド、CpyCセチルピリジニウムクロリド、DOEPC1,2-ジオ
レオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン又は他のO-アルキル-ホスファチ
ジルコリン又はエタノールアミン、リジンからのアミド、アルギニン又はオルニチン(o
mithine)、及びホスファチジルエタノールアミンを含むことができる。
カチオン性の弱い化合物の例としては、限定するものではないが、His-Chol(
ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシネート)、Mo-Chol(モルホリン-N-
エチルアミノ-コレステロールヘミスクシネート)、又はヒスチジニル-PEが挙げられ
る。
ヒスタミニル-コレステロールヘミスクシネート)、Mo-Chol(モルホリン-N-
エチルアミノ-コレステロールヘミスクシネート)、又はヒスチジニル-PEが挙げられ
る。
中性化合物の例としては、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、又はジアシルグリセロールが挙げられ
るが、これらに限定されない。
ァチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、又はジアシルグリセロールが挙げられ
るが、これらに限定されない。
両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書において既に記載した非カチ
オン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例には、CHEMS(
コレステロールヘミスクシネート)、8~25個の炭素原子を有するアルキルカルボン酸
、又はジアシルグリセロールヘミスクシネートが含まれ得る。追加の弱アニオン性化合物
には、アスパラギン酸、又はグルタミン酸とPE及びPSのアミド、並びにグリシン、ア
ラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グル
タミン酸、アスパラギン酸若しくは他のアミノ酸、又はアミノジカルボン酸とのそのアミ
ドが含まれ得る。同じ原理に従うと、ヒドロキシカルボン酸又はヒドロキシジカルボン酸
とPSとのエステルも弱アニオン性化合物である。
オン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例には、CHEMS(
コレステロールヘミスクシネート)、8~25個の炭素原子を有するアルキルカルボン酸
、又はジアシルグリセロールヘミスクシネートが含まれ得る。追加の弱アニオン性化合物
には、アスパラギン酸、又はグルタミン酸とPE及びPSのアミド、並びにグリシン、ア
ラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グル
タミン酸、アスパラギン酸若しくは他のアミノ酸、又はアミノジカルボン酸とのそのアミ
ドが含まれ得る。同じ原理に従うと、ヒドロキシカルボン酸又はヒドロキシジカルボン酸
とPSとのエステルも弱アニオン性化合物である。
いくつかの実施形態では、両性リポソームは、本明細書の上記に記したものなどの複合
脂質を含み得る。有用な複合脂質の特定の例には、PEG改変ホスファチジルエタノール
アミン及びホスファチジン酸、PEG-セラミドコンジュゲート(例えば、PEG-Ce
rC14又はPEG-CerC20)、PEG改変ジアルキルアミン及びPEG改変1,
2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが含まれるが、これらに限定されない。特に好
ましいのは、PEG改変ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールである。
脂質を含み得る。有用な複合脂質の特定の例には、PEG改変ホスファチジルエタノール
アミン及びホスファチジン酸、PEG-セラミドコンジュゲート(例えば、PEG-Ce
rC14又はPEG-CerC20)、PEG改変ジアルキルアミン及びPEG改変1,
2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが含まれるが、これらに限定されない。特に好
ましいのは、PEG改変ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールである。
いくつかの実施形態において、中性脂質は、粒子に存在する総脂質の約10mol%~
約60mol%、約15mol%~約60mol%、約20mol%~約60mol%、
約25mol%~約60mol%、約30mol%~約60mol%、約10mol%~
約55mol%、約15mol%~約55mol%、約20mol%~約55mol%、
約25mol%~約55mol%、約30mol%~約55mol%、約13mol%~
約50mol%、約15mol%~約50mol%、又は約20mol%~約50mol
%を含み得る。
約60mol%、約15mol%~約60mol%、約20mol%~約60mol%、
約25mol%~約60mol%、約30mol%~約60mol%、約10mol%~
約55mol%、約15mol%~約55mol%、約20mol%~約55mol%、
約25mol%~約55mol%、約30mol%~約55mol%、約13mol%~
約50mol%、約15mol%~約50mol%、又は約20mol%~約50mol
%を含み得る。
場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲー
ト)は、粒子に存在する総脂質の約0.1mol%~約2mol%、約0.5mol%~
約2mol%、約1mol%~約2mol%、約0.6mol%~約1.9mol%、約
0.7mol%~約1.8mol%、約0.8mol%~約1.7mol%、約1mol
%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1
.7mol%、約1.3mol%~約1.6mol%、約1.4mol%~約1.5mo
l%、又は約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、又は2mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。
典型的には、そのような場合、PEG部分は約2,000ダルトンの平均分子量を有する
。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲ
ート)は、粒子に存在する総脂質の約5.0mol%~約10mol%、約5mol%~
約9mol%、約5mol%~約8mol%、約6mol%~約9mol%、約6mol
%~約8mol%、約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%、
10mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。典型的には
、そのような場合、PEG部分は約750ダルトンの平均分子量を有する。
ト)は、粒子に存在する総脂質の約0.1mol%~約2mol%、約0.5mol%~
約2mol%、約1mol%~約2mol%、約0.6mol%~約1.9mol%、約
0.7mol%~約1.8mol%、約0.8mol%~約1.7mol%、約1mol
%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1.8mol%、約1.2mol%~約1
.7mol%、約1.3mol%~約1.6mol%、約1.4mol%~約1.5mo
l%、又は約1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、
1.9、又は2mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。
典型的には、そのような場合、PEG部分は約2,000ダルトンの平均分子量を有する
。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質(例えば、PEG-脂質コンジュゲ
ート)は、粒子に存在する総脂質の約5.0mol%~約10mol%、約5mol%~
約9mol%、約5mol%~約8mol%、約6mol%~約9mol%、約6mol
%~約8mol%、約5mol%、6mol%、7mol%、8mol%、9mol%、
10mol%(又はその任意の画分もしくはその範囲)を含むことができる。典型的には
、そのような場合、PEG部分は約750ダルトンの平均分子量を有する。
中性及び複合脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残余は、様々な比率で
処方されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含み得る。カチオン性脂質と
アニオン性脂質の比率は、核酸封入の所望の特性、ゼータ電位、pKa、又は荷電脂質成
分の存在に少なくとも部分的に依拠する他の物理化学的特性を成し遂げるために選択され
得る。
処方されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含み得る。カチオン性脂質と
アニオン性脂質の比率は、核酸封入の所望の特性、ゼータ電位、pKa、又は荷電脂質成
分の存在に少なくとも部分的に依拠する他の物理化学的特性を成し遂げるために選択され
得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込み
を特異的に増強する組成を有する。
を特異的に増強する組成を有する。
2.5組換えAAVベクターの作製方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するための組換えAAVベク
ターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK-293等の哺乳動物細
胞株において産生される。ウイルスのcap及びrep遺伝子は、ベクターから除去され
て治療遺伝子(例えばエンドヌクレアーゼ遺伝子)を送達するための空間を設けるために
自己複製を防止するので、これらをパッケージングする細胞株にイントランス(in t
rans)で供給する必要がある。更に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」(例え
ばアデノウイルス)成分を供給することが必要である(Cots D,Bosch A,
Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370-
81)。多くの場合、組換えAAVベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第1のプ
ラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケー
ジングされる介在するDNA配列を含むウイルスITRを含む第3のプラスミドで、細胞
株を形質移入する、トリプル形質移入を用いて産生される。次いで、カプシドに包まれた
ゲノム(ITR及び対象の介在する遺伝子)を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、
超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。
次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを
使用して精製し、続いて細胞、組織、又はヒトである患者等の生物に対して、目的の遺伝
子に送達する。
ターを提供する。組換えAAVベクターは、典型的には、HEK-293等の哺乳動物細
胞株において産生される。ウイルスのcap及びrep遺伝子は、ベクターから除去され
て治療遺伝子(例えばエンドヌクレアーゼ遺伝子)を送達するための空間を設けるために
自己複製を防止するので、これらをパッケージングする細胞株にイントランス(in t
rans)で供給する必要がある。更に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」(例え
ばアデノウイルス)成分を供給することが必要である(Cots D,Bosch A,
Chillon M(2013)Curr.Gene Ther.13(5):370-
81)。多くの場合、組換えAAVベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第1のプ
ラスミド、cap及びrep遺伝子を含む第2のプラスミド、並びにウイルスにパッケー
ジングされる介在するDNA配列を含むウイルスITRを含む第3のプラスミドで、細胞
株を形質移入する、トリプル形質移入を用いて産生される。次いで、カプシドに包まれた
ゲノム(ITR及び対象の介在する遺伝子)を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、
超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。
次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを
使用して精製し、続いて細胞、組織、又はヒトである患者等の生物に対して、目的の遺伝
子に送達する。
組換えAAV粒子は典型的には細胞で産生(作製)されるので、部位特異的エンドヌク
レアーゼがパッケージング細胞にて発現されないことを確実にするために、本発明を実施
する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムはエンドヌクレアーゼの
認識配列を含むので、パッケージング細胞株で発現される任意のエンドヌクレアーゼは、
ウイルス粒子にパッケージングされ得る前に、ウイルスゲノムを切断することができる。
これはパッケージング効率の低下及び/又は断片化したゲノムのパッケージングをもたら
す。パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼの発現を防ぐために、以下のような
いくつかのアプローチを用いることができる。
レアーゼがパッケージング細胞にて発現されないことを確実にするために、本発明を実施
する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムはエンドヌクレアーゼの
認識配列を含むので、パッケージング細胞株で発現される任意のエンドヌクレアーゼは、
ウイルス粒子にパッケージングされ得る前に、ウイルスゲノムを切断することができる。
これはパッケージング効率の低下及び/又は断片化したゲノムのパッケージングをもたら
す。パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼの発現を防ぐために、以下のような
いくつかのアプローチを用いることができる。
エンドヌクレアーゼは、パッケージング細胞で活性ではない組織特異的プロモータの制
御下に置くことができる。例えば、ウイルスベクターがエンドヌクレアーゼ遺伝子を筋肉
組織に送達するように開発されている場合、筋肉特異的プロモータを使用することができ
る。筋肉特異的プロモータの例は、C5-12(Liu,et al.(2004)Hu
m Gene Ther.15:783-92)、筋肉特異的クレアチンキナーゼ(MC
K)プロモータ(Yuasa,et al.(2002)Gene Ther.9:15
76-88)、又は平滑筋22(SM22)プロモータ(Haase,et al.(2
013)BMC Biotechnol.13:49-54)を含む。CNS(ニューロ
ン)特異的プロモータの例には、NSE、シナプシン、及びMeCP2プロモータが含ま
れる(Lentz,et al.(2012)Neurobiol Dis.48:17
9-88)。肝臓特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ(Palb等)、ヒ
トα1-アンチトリプシン(Pa1AT等)、及びヘモペキシン(Phpx等)が含まれ
る(Kramer,MG et al.,(2003)Mol.Therapy 7:3
75-85)。眼特異的プロモータの例には、オプシン、及び角膜上皮特異的K12プロ
モータが含まれる(Martin KRG,Klein RL,and Quigley
HA(2002)Methods(28):267-75)(Tong Y,et a
l.,(2007)J Gene Med,9:956-66)。これらのプロモータ又
は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、HEK-293細胞において高度に
活性であるわけではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッ
ケージング細胞において顕著なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じないと予想
される。同様に、本発明のウイルスベクターは、不適合な組織特異的プロモータ(即ち、
周知のHeLa細胞系(ヒト上皮細胞)の使用、及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータ
の使用)を用いる他の細胞系の使用を企図する。組織特異的プロモータの他の例には、滑
膜肉腫PDZD4(小脳)、C6(肝臓)、ASB5(筋肉)、PPP1R12B(心臓
)、SLC5A12(腎臓)、コレステロール調節APOM(肝臓)、及びADPRHL
1(心臓)、及び単一遺伝子奇形症候群TP73L(筋肉)が含まれる。(Jacox
E,et al.,(2010)PLoS One v.5(8):e12274)。
御下に置くことができる。例えば、ウイルスベクターがエンドヌクレアーゼ遺伝子を筋肉
組織に送達するように開発されている場合、筋肉特異的プロモータを使用することができ
る。筋肉特異的プロモータの例は、C5-12(Liu,et al.(2004)Hu
m Gene Ther.15:783-92)、筋肉特異的クレアチンキナーゼ(MC
K)プロモータ(Yuasa,et al.(2002)Gene Ther.9:15
76-88)、又は平滑筋22(SM22)プロモータ(Haase,et al.(2
013)BMC Biotechnol.13:49-54)を含む。CNS(ニューロ
ン)特異的プロモータの例には、NSE、シナプシン、及びMeCP2プロモータが含ま
れる(Lentz,et al.(2012)Neurobiol Dis.48:17
9-88)。肝臓特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ(Palb等)、ヒ
トα1-アンチトリプシン(Pa1AT等)、及びヘモペキシン(Phpx等)が含まれ
る(Kramer,MG et al.,(2003)Mol.Therapy 7:3
75-85)。眼特異的プロモータの例には、オプシン、及び角膜上皮特異的K12プロ
モータが含まれる(Martin KRG,Klein RL,and Quigley
HA(2002)Methods(28):267-75)(Tong Y,et a
l.,(2007)J Gene Med,9:956-66)。これらのプロモータ又
は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、HEK-293細胞において高度に
活性であるわけではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッ
ケージング細胞において顕著なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じないと予想
される。同様に、本発明のウイルスベクターは、不適合な組織特異的プロモータ(即ち、
周知のHeLa細胞系(ヒト上皮細胞)の使用、及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータ
の使用)を用いる他の細胞系の使用を企図する。組織特異的プロモータの他の例には、滑
膜肉腫PDZD4(小脳)、C6(肝臓)、ASB5(筋肉)、PPP1R12B(心臓
)、SLC5A12(腎臓)、コレステロール調節APOM(肝臓)、及びADPRHL
1(心臓)、及び単一遺伝子奇形症候群TP73L(筋肉)が含まれる。(Jacox
E,et al.,(2010)PLoS One v.5(8):e12274)。
あるいは、ベクターは、エンドヌクレアーゼが発現される見込みのない、異なる種由来
の細胞にパッケージングされ得る。例えば、ウイルス粒子は、哺乳動物以外のパッケージ
ング細胞では活性ではない、周知のサイトメガロウイルス又はSV40ウイルス初期プロ
モータ等の哺乳動物のプロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞にて産生するこ
とができる。好ましい態様において、ウイルス粒子は、Gaoら(Gao,H.,et
al.(2007)J.Biotechnol.131(2):138-43)によって
記載されているように、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞にて産生される。哺乳動物
のプロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞において発現される可
能性は低いAirenne,KJ,et al.(2013)Mol.Ther.21(
4):739-49)。更に、昆虫細胞は哺乳動物細胞とは異なるmRNAスプライシン
グモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン(HGH)のイントロン又はSV40
ラージT抗原のイントロン等の哺乳動物のイントロンを、エンドヌクレアーゼのコード配
列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレmRNA転写物か
ら効率的にはスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的なエンドヌクレアーゼを発
現せず、ゲノム全長をパッケージングする。対照的に、得られた組換えAAV粒子が送達
される哺乳動物の細胞は、プレmRNAを適切にスプライスし、機能的なエンドヌクレア
ーゼタンパク質を発現する。Haifeng Chenは、昆虫パッケージング細胞にお
ける毒性のタンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素フラグメントAの発現を減弱するた
めに、HGH及びSV40ラージT抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素
遺伝子を運ぶ組換えAAVベクターの産生を可能にする(Chen,H(2012)Mo
l Ther Nucleic Acids.1(11):e57)。
の細胞にパッケージングされ得る。例えば、ウイルス粒子は、哺乳動物以外のパッケージ
ング細胞では活性ではない、周知のサイトメガロウイルス又はSV40ウイルス初期プロ
モータ等の哺乳動物のプロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞にて産生するこ
とができる。好ましい態様において、ウイルス粒子は、Gaoら(Gao,H.,et
al.(2007)J.Biotechnol.131(2):138-43)によって
記載されているように、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞にて産生される。哺乳動物
のプロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞において発現される可
能性は低いAirenne,KJ,et al.(2013)Mol.Ther.21(
4):739-49)。更に、昆虫細胞は哺乳動物細胞とは異なるmRNAスプライシン
グモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン(HGH)のイントロン又はSV40
ラージT抗原のイントロン等の哺乳動物のイントロンを、エンドヌクレアーゼのコード配
列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレmRNA転写物か
ら効率的にはスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的なエンドヌクレアーゼを発
現せず、ゲノム全長をパッケージングする。対照的に、得られた組換えAAV粒子が送達
される哺乳動物の細胞は、プレmRNAを適切にスプライスし、機能的なエンドヌクレア
ーゼタンパク質を発現する。Haifeng Chenは、昆虫パッケージング細胞にお
ける毒性のタンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素フラグメントAの発現を減弱するた
めに、HGH及びSV40ラージT抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素
遺伝子を運ぶ組換えAAVベクターの産生を可能にする(Chen,H(2012)Mo
l Ther Nucleic Acids.1(11):e57)。
エンドヌクレアーゼ遺伝子は、小分子インデューサーがエンドヌクレアーゼの発現に必
要とされるように誘導性プロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例に
は、Tet-Onシステム(Clontech;Chen H.,et al.,(20
15)BMC Biotechnol.15(1):4))、及びRheoSwitch
システム(Intrexon;Sowa G.,et al.,(2011)Spine
, 36(10):E623-8)が含まれる。両方のシステム及び当技術分野で公知の
類似のシステムは、小分子アクチベータ(それぞれ、ドキシサイクリン又はエクジソン)
に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子(それぞれ、Tetレプレッサー及
びエクジソン受容体の変異体)に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を
用いて本発明を実施することは、1)対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を配置し、エンドヌクレアーゼ遺伝子は転写因子に対する結合
部位を有すること、及び2)パッケージされたウイルスゲノムに転写因子をコードする遺
伝子を含むことを含む。転写アクチベータが同様に同じ細胞に提供されない場合、エンド
ヌクレアーゼは組換えAAV送達後に標的細胞又は組織において発現されないため、後者
の工程が必要である。次いで転写アクチベータは、同族の小分子アクチベータで処理され
た細胞又は組織においてのみ、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を誘導する。このアプ
ローチは、いつ、どの組織に小分子インデューサーを送達するかを選択することによって
、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を時空間的様式で調節することを可能にするため、
有利である。しかし、ウイルスゲノムにインデューサーを含める必要性は、運搬能力を著
しく制限するものであり、このアプローチに対する欠点を生み出している。
要とされるように誘導性プロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例に
は、Tet-Onシステム(Clontech;Chen H.,et al.,(20
15)BMC Biotechnol.15(1):4))、及びRheoSwitch
システム(Intrexon;Sowa G.,et al.,(2011)Spine
, 36(10):E623-8)が含まれる。両方のシステム及び当技術分野で公知の
類似のシステムは、小分子アクチベータ(それぞれ、ドキシサイクリン又はエクジソン)
に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子(それぞれ、Tetレプレッサー及
びエクジソン受容体の変異体)に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を
用いて本発明を実施することは、1)対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を配置し、エンドヌクレアーゼ遺伝子は転写因子に対する結合
部位を有すること、及び2)パッケージされたウイルスゲノムに転写因子をコードする遺
伝子を含むことを含む。転写アクチベータが同様に同じ細胞に提供されない場合、エンド
ヌクレアーゼは組換えAAV送達後に標的細胞又は組織において発現されないため、後者
の工程が必要である。次いで転写アクチベータは、同族の小分子アクチベータで処理され
た細胞又は組織においてのみ、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を誘導する。このアプ
ローチは、いつ、どの組織に小分子インデューサーを送達するかを選択することによって
、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を時空間的様式で調節することを可能にするため、
有利である。しかし、ウイルスゲノムにインデューサーを含める必要性は、運搬能力を著
しく制限するものであり、このアプローチに対する欠点を生み出している。
別の好ましい実施形態では、エンドヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサを発現
する哺乳動物細胞株において、組換えAAV粒子が産生される。転写リプレッサは当技術
分野において公知であり、Tetリプレッサ、Lacリプレッサ、Croリプレッサ、及
びλリプレッサが含まれる。エクジソン受容体等の多くの核ホルモン受容体はまた、それ
らの同族ホルモンリガンドの非存在下で、転写リプレッサとしても作用する。本発明を実
施するために、パッケージングする細胞を、転写リプレッサをコードするベクターで形質
移入/形質導入し、ウイルスゲノムのエンドヌクレアーゼ遺伝子(パッケージングベクタ
ー)を、リプレッサに対する結合部位を含むように改変したプロモータに作動可能に連結
させ、リプレッサはプロモータをサイレンシングするようにする。転写リプレッサをコー
ドする遺伝子は様々な位置に配置することができる。それは、別のベクトルにコードする
ことができる。それはITR配列の外部でパッケージングベクターに組み込むことができ
る。それはcap/repベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むこと
ができる。あるいは、最も好ましくは、それは構成的に発現されるように、パッケージン
グする細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。転写リプレッサ部位を組み込むた
めに一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野において公知である。例
えば、Chang及びRoninsonは、強力で構成的なCMV及びRSVプロモータ
を、Lacリプレッサ用のオペレータを含むように改変し、改変したプロモータによる遺
伝子発現が、リプレッサを発現する細胞で非常に減弱されることを示した(Chang
BD,and Roninson IB(1996)Gene183:137-42)。
非ヒト転写リプレッサを使用することで、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッ
サを発現するパッケージングする細胞においてのみ抑制され、得られた組換えAAVベク
ターで形質導入された標的細胞又は組織においては抑制されないことが確実になる。
する哺乳動物細胞株において、組換えAAV粒子が産生される。転写リプレッサは当技術
分野において公知であり、Tetリプレッサ、Lacリプレッサ、Croリプレッサ、及
びλリプレッサが含まれる。エクジソン受容体等の多くの核ホルモン受容体はまた、それ
らの同族ホルモンリガンドの非存在下で、転写リプレッサとしても作用する。本発明を実
施するために、パッケージングする細胞を、転写リプレッサをコードするベクターで形質
移入/形質導入し、ウイルスゲノムのエンドヌクレアーゼ遺伝子(パッケージングベクタ
ー)を、リプレッサに対する結合部位を含むように改変したプロモータに作動可能に連結
させ、リプレッサはプロモータをサイレンシングするようにする。転写リプレッサをコー
ドする遺伝子は様々な位置に配置することができる。それは、別のベクトルにコードする
ことができる。それはITR配列の外部でパッケージングベクターに組み込むことができ
る。それはcap/repベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むこと
ができる。あるいは、最も好ましくは、それは構成的に発現されるように、パッケージン
グする細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。転写リプレッサ部位を組み込むた
めに一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野において公知である。例
えば、Chang及びRoninsonは、強力で構成的なCMV及びRSVプロモータ
を、Lacリプレッサ用のオペレータを含むように改変し、改変したプロモータによる遺
伝子発現が、リプレッサを発現する細胞で非常に減弱されることを示した(Chang
BD,and Roninson IB(1996)Gene183:137-42)。
非ヒト転写リプレッサを使用することで、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッ
サを発現するパッケージングする細胞においてのみ抑制され、得られた組換えAAVベク
ターで形質導入された標的細胞又は組織においては抑制されないことが確実になる。
2.6 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びその変
異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドの
変異体を包含する。
異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドの
変異体を包含する。
本明細書で使用しているとき、「変異体」は実質的に類似の配列を意味することを意図
している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の1以上の内部の部位における1
以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び/又は天然ポリペプチドの1以上の部位におけ
る1以上のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリペプチド
を意味することを意図している。本明細書で使用しているとき、「天然の」ポリヌクレオ
チド又はポリペプチドは、変異体が由来する親の配列を含む。実施形態に包含される変異
体ポリペプチドは、生物学的に活性である。即ち、それらは天然のタンパク質の所望の生
物学的活性を保有し続けている。即ち、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型の
ゲノムのORF内の認識配列、例えばHBV1-2認識配列(配列番号10)、HBV5
-6認識配列(配列番号12)、HBV7-8認識配列(配列番号14)、又はHBV1
1-12認識配列(配列番号16)を認識して切断する能力を保有し続けている。そのよ
うな変異体は、例えば、人間の操作から生じ得る。実施形態の天然のポリペプチドの生物
学的に活性な変異体(例えば、配列番号18~39)、又は本明細書に記載の認識した半
分の部位の結合サブユニットの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載さ
れている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって判定されるように、天然
のポリペプチド又は天然のサブユニットのアミノ酸配列に対して、少なくとも約40%、
約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、
約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、
約97%、約98%、又は約99%の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又は
サブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと約1~
40程度のアミノ酸残基、約1~20程度、約1~10程度、約5程度、4、3、2、又
は1アミノ酸残基程度少なくて、異なることがあり得る。
している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の1以上の内部の部位における1
以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び/又は天然ポリペプチドの1以上の部位におけ
る1以上のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリペプチド
を意味することを意図している。本明細書で使用しているとき、「天然の」ポリヌクレオ
チド又はポリペプチドは、変異体が由来する親の配列を含む。実施形態に包含される変異
体ポリペプチドは、生物学的に活性である。即ち、それらは天然のタンパク質の所望の生
物学的活性を保有し続けている。即ち、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型の
ゲノムのORF内の認識配列、例えばHBV1-2認識配列(配列番号10)、HBV5
-6認識配列(配列番号12)、HBV7-8認識配列(配列番号14)、又はHBV1
1-12認識配列(配列番号16)を認識して切断する能力を保有し続けている。そのよ
うな変異体は、例えば、人間の操作から生じ得る。実施形態の天然のポリペプチドの生物
学的に活性な変異体(例えば、配列番号18~39)、又は本明細書に記載の認識した半
分の部位の結合サブユニットの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載さ
れている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって判定されるように、天然
のポリペプチド又は天然のサブユニットのアミノ酸配列に対して、少なくとも約40%、
約45%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、
約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、
約97%、約98%、又は約99%の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又は
サブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと約1~
40程度のアミノ酸残基、約1~20程度、約1~10程度、約5程度、4、3、2、又
は1アミノ酸残基程度少なくて、異なることがあり得る。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法
で改変することができる。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られ
ている。例えば、アミノ酸配列変異体は、DNAの突然変異によって作製することができ
る。突然変異誘発及びポリヌクレオチドの改変のための方法は、当技術分野において周知
である。例えば、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA82:488-492;Kunkel et al.(1987)Methods
in Enzymol.154:367-382;米国特許第4,873,192号;W
alker and Gaastra,eds.(1983)Techniques i
n Molecular Biology(MacMillan Publishing
Company,ニューヨーク州)及びそれに引用されている参考文献を参照されたい
。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸の置換に関する指
針は、参照により本明細書に組み入れられる、Dayhoff et al.(1978
)Atlas of Protein Sequence and Structure
(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)
のモデルに見出すことができる。1つのアミノ酸を類似した特性を有する他のものと交換
するといった保存的な置換が最適であり得る。
で改変することができる。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られ
ている。例えば、アミノ酸配列変異体は、DNAの突然変異によって作製することができ
る。突然変異誘発及びポリヌクレオチドの改変のための方法は、当技術分野において周知
である。例えば、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA82:488-492;Kunkel et al.(1987)Methods
in Enzymol.154:367-382;米国特許第4,873,192号;W
alker and Gaastra,eds.(1983)Techniques i
n Molecular Biology(MacMillan Publishing
Company,ニューヨーク州)及びそれに引用されている参考文献を参照されたい
。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸の置換に関する指
針は、参照により本明細書に組み入れられる、Dayhoff et al.(1978
)Atlas of Protein Sequence and Structure
(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)
のモデルに見出すことができる。1つのアミノ酸を類似した特性を有する他のものと交換
するといった保存的な置換が最適であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に
開示されているHVR1及びHVR2領域の変異体を含み得る。親HVR領域は、例えば
、例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基24~79又は残基215~270を
含み得る。従って、変異体HVRは、本明細書に例示の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼの残基24~79又は残基215~270に対応するアミノ酸配列と少なくとも80%
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むことができ、その結果変異体HVR領域が、遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼの生物学的活性(即ち、認識配列への結合及び切断)を維持するよう
になる。更に、本発明のいくつかの実施形態では、変異型HVR1領域又は変異型HVR
2領域は、親HVR内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含み得る。
これに関連して、「に対応する」とは、変異体HVRのアミノ酸残基が、同じ対応する位
置で(即ち、親配列の残りのアミノ酸に関連して)親HVR配列に存在する同じアミノ酸
残基(即ち、別の同一の残基)であることを意味する。例として、親HVR配列が26位
にセリン残基を含む場合、残基26に「対応する残基を含む」変異型HVRはまた、親の
26位に対応する位置にセリンを含む。
開示されているHVR1及びHVR2領域の変異体を含み得る。親HVR領域は、例えば
、例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基24~79又は残基215~270を
含み得る。従って、変異体HVRは、本明細書に例示の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼの残基24~79又は残基215~270に対応するアミノ酸配列と少なくとも80%
、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又はそれ以上の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むことができ、その結果変異体HVR領域が、遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼの生物学的活性(即ち、認識配列への結合及び切断)を維持するよう
になる。更に、本発明のいくつかの実施形態では、変異型HVR1領域又は変異型HVR
2領域は、親HVR内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含み得る。
これに関連して、「に対応する」とは、変異体HVRのアミノ酸残基が、同じ対応する位
置で(即ち、親配列の残りのアミノ酸に関連して)親HVR配列に存在する同じアミノ酸
残基(即ち、別の同一の残基)であることを意味する。例として、親HVR配列が26位
にセリン残基を含む場合、残基26に「対応する残基を含む」変異型HVRはまた、親の
26位に対応する位置にセリンを含む。
野生型I-CreIメガヌクレアーゼのDNA認識ドメインに対するかなりの数のアミ
ノ酸の改変が、以前に同定されており(例えば、米国特許第8,021,867号)、そ
れは単独で又は組み合わせて、DNAの認識配列の半分の部位の中の個々の塩基において
特異性が改変された、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを生じ、得られた合理的に設計
されたメガヌクレアーゼが、野生型酵素とは異なる半分の部位の特異性を有するようにす
る。表5は、認識した半分の部位の各々の半分の部位の位置(-1~-9)に存在する塩
基に基づいて特異性を増強するために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ単量体又はサブ
ユニットにおいてなされ得る潜在的な置換を提供する。
ノ酸の改変が、以前に同定されており(例えば、米国特許第8,021,867号)、そ
れは単独で又は組み合わせて、DNAの認識配列の半分の部位の中の個々の塩基において
特異性が改変された、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを生じ、得られた合理的に設計
されたメガヌクレアーゼが、野生型酵素とは異なる半分の部位の特異性を有するようにす
る。表5は、認識した半分の部位の各々の半分の部位の位置(-1~-9)に存在する塩
基に基づいて特異性を増強するために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ単量体又はサブ
ユニットにおいてなされ得る潜在的な置換を提供する。
太字のエントリは野生型の接触残基であり、本明細書で使用している「改変」を構成し
てはいない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖の塩基と接触していることを示す。
てはいない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖の塩基と接触していることを示す。
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然のポリヌクレオチド内の1以上の部位に
おける1以上のヌクレオチドの欠失及び/又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の
変異体が、オープンリーディングフレームを維持するように構築されることを認識する。
ポリヌクレオチドに関して、保存的な変異体は、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポ
リペプチドのうちの1つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。変異体のポリ
ヌクレオチドには、例えば部位志向的な突然変異誘発を用いることによって生成されるが
、それでも実施形態の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするもの等の、合成由
来のポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体
は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータ
によって定まる特定の当該のポリヌクレオチドに少なくとも約40%、約45%、約50
%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90
%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98
%、約99%、又はそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド
(即ち、参照ポリヌクレオチド)の変異体はまた、変異体のポリヌクレオチドによってコ
ードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと
の間のパーセントの配列同一性の比較によって評価することができる。
おける1以上のヌクレオチドの欠失及び/又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の
変異体が、オープンリーディングフレームを維持するように構築されることを認識する。
ポリヌクレオチドに関して、保存的な変異体は、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポ
リペプチドのうちの1つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。変異体のポリ
ヌクレオチドには、例えば部位志向的な突然変異誘発を用いることによって生成されるが
、それでも実施形態の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするもの等の、合成由
来のポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体
は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータ
によって定まる特定の当該のポリヌクレオチドに少なくとも約40%、約45%、約50
%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90
%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98
%、約99%、又はそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド
(即ち、参照ポリヌクレオチド)の変異体はまた、変異体のポリヌクレオチドによってコ
ードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと
の間のパーセントの配列同一性の比較によって評価することができる。
本明細書に包含されるタンパク質の配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特
徴に根本的な変化を生じさせるとは予想されない。しかし、置換、欠失、又は挿入の正確
な効果を実行する前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果が、B型肝炎
ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのORF内の認識配列を優先的に認識して
切断する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって評価されるという
ことを認識する。
徴に根本的な変化を生じさせるとは予想されない。しかし、置換、欠失、又は挿入の正確
な効果を実行する前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果が、B型肝炎
ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのORF内の認識配列を優先的に認識して
切断する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって評価されるという
ことを認識する。
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらは限定するものとして解釈され
るべきではない。当業者は、日常的な実験のみを利用して、本明細書に記載の特定の物質
や手順に対する多数の等価物を認識する、又は確認することができる。そのような均等物
は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることを意図している。
るべきではない。当業者は、日常的な実験のみを利用して、本明細書に記載の特定の物質
や手順に対する多数の等価物を認識する、又は確認することができる。そのような均等物
は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることを意図している。
実施例1;HBV認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼの特性決定
HBV1-2認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「HBV1-2メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ(配列番号18~21)は、HBV1-2認識配列(配列番号1
0)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、E、F、及びG(
例えば、それぞれ配列番号3~5及び7~9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタンパク
質、S、preS2/S、及びpreS1/preS2 ORF内に位置付けられる。各
HBV1-2遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ
局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガ
ヌクレアーゼサブユニットを含む。各HBV1-2メガヌクレアーゼの第1のサブユニッ
トは、配列番号10のHBV1の認識した半分の部位に結合し、一方第2のサブユニット
は、HBV2の認識した半分の部位に結合する(図2参照)。
されたメガヌクレアーゼ(配列番号18~21)は、HBV1-2認識配列(配列番号1
0)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、E、F、及びG(
例えば、それぞれ配列番号3~5及び7~9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタンパク
質、S、preS2/S、及びpreS1/preS2 ORF内に位置付けられる。各
HBV1-2遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ
局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガ
ヌクレアーゼサブユニットを含む。各HBV1-2メガヌクレアーゼの第1のサブユニッ
トは、配列番号10のHBV1の認識した半分の部位に結合し、一方第2のサブユニット
は、HBV2の認識した半分の部位に結合する(図2参照)。
HBV1結合サブユニット及びHBV2結合サブユニットはそれぞれ、HVR1及びH
VR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBV1結合サブユニットは
HVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV2結合サブユニットもまた、H
VR2領域外で高度に保存されている。配列番号18~21のHBV1結合領域は、それ
ぞれ配列番号40~43として提供される。配列番号40~43のそれぞれは、メガヌク
レアーゼHBV1~2×.2(配列番号18)のHBV1結合領域である配列番号40と
少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号18~21のHBV2結合領域は、
それぞれ配列番号44~47として提供されている。配列番号44~47のそれぞれは、
メガヌクレアーゼHBV1~2×.2(配列番号18)のHBV2結合領域である配列番
号44と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
VR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBV1結合サブユニットは
HVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV2結合サブユニットもまた、H
VR2領域外で高度に保存されている。配列番号18~21のHBV1結合領域は、それ
ぞれ配列番号40~43として提供される。配列番号40~43のそれぞれは、メガヌク
レアーゼHBV1~2×.2(配列番号18)のHBV1結合領域である配列番号40と
少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号18~21のHBV2結合領域は、
それぞれ配列番号44~47として提供されている。配列番号44~47のそれぞれは、
メガヌクレアーゼHBV1~2×.2(配列番号18)のHBV2結合領域である配列番
号44と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
HBV 5-6認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「HBV5-6メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ(配列番号22~28)は、HBV5-6認識配列(配列番号1
2)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、D、E、及びG(
例えば、それぞれ配列番号3~7及び9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタンパク質、
S、preS2/S、及びpreS1/preS2 ORF内に位置付けられる。各HB
V5-6遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在
化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌク
レアーゼサブユニットを含む。各HBV5-6メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは
、配列番号12のHBV5の認識した半分の部位に結合し、一方第2のサブユニットは、
HBV6の認識した半分の部位に結合する(図2参照)。
されたメガヌクレアーゼ(配列番号22~28)は、HBV5-6認識配列(配列番号1
2)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、D、E、及びG(
例えば、それぞれ配列番号3~7及び9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタンパク質、
S、preS2/S、及びpreS1/preS2 ORF内に位置付けられる。各HB
V5-6遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在
化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌク
レアーゼサブユニットを含む。各HBV5-6メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは
、配列番号12のHBV5の認識した半分の部位に結合し、一方第2のサブユニットは、
HBV6の認識した半分の部位に結合する(図2参照)。
HBV5結合サブユニット及びHBV6結合サブユニットはそれぞれ、HVR1及びH
VR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBV5結合サブユニットは
HVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV6結合サブユニットもまた、H
VR2領域外で高度に保存されている。配列番号22~28のHBV5結合領域は、それ
ぞれ配列番号48~54として提供される。配列番号48~54のそれぞれは、メガヌク
レアーゼHBV5~6×.33(配列番号22)のHBV5結合領域である配列番号49
と少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号22~28のHBV6結合領域は
、それぞれ配列番号55~61として提供されている。配列番号55~61のそれぞれは
、メガヌクレアーゼHBV5~6×.33(配列番号22)のHBV5結合領域である配
列番号55と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
VR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBV5結合サブユニットは
HVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV6結合サブユニットもまた、H
VR2領域外で高度に保存されている。配列番号22~28のHBV5結合領域は、それ
ぞれ配列番号48~54として提供される。配列番号48~54のそれぞれは、メガヌク
レアーゼHBV5~6×.33(配列番号22)のHBV5結合領域である配列番号49
と少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号22~28のHBV6結合領域は
、それぞれ配列番号55~61として提供されている。配列番号55~61のそれぞれは
、メガヌクレアーゼHBV5~6×.33(配列番号22)のHBV5結合領域である配
列番号55と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
HBV 7-8認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「HBV7-8メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ(配列番号29~32)は、HBV7-8認識配列(配列番号1
4)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、D、F、及びG(
例えば、それぞれ配列番号3~6、8、及び9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタンパ
ク質ORF内に位置付けられる。各HBV7-8遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、
SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニッ
ト、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各HBV7-8メ
ガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号14のHBV7の認識した半分の部位
に結合し、一方第2のサブユニットは、HBV8の認識した半分の部位に結合する(図2
参照)。
されたメガヌクレアーゼ(配列番号29~32)は、HBV7-8認識配列(配列番号1
4)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、D、F、及びG(
例えば、それぞれ配列番号3~6、8、及び9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタンパ
ク質ORF内に位置付けられる。各HBV7-8遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、
SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブユニッ
ト、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各HBV7-8メ
ガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号14のHBV7の認識した半分の部位
に結合し、一方第2のサブユニットは、HBV8の認識した半分の部位に結合する(図2
参照)。
HBV7結合サブユニット及びHBV8結合サブユニットはそれぞれ、HVR1及びH
VR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBV7結合サブユニットは
HVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV8結合サブユニットもまた、H
VR2領域外で高度に保存されている。配列番号29~32のHBV7結合領域は、それ
ぞれ配列番号62~65として提供される。配列番号62~65のそれぞれは、メガヌク
レアーゼHBV7~8×.2(配列番号29)のHBV7結合領域である配列番号62と
少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号29~32のHBV8結合領域は、
それぞれ配列番号66~69として提供されている。配列番号66~69のそれぞれは、
メガヌクレアーゼHBV7~8×.2(配列番号29)のHBV8結合領域である配列番
号66と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
VR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBV7結合サブユニットは
HVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV8結合サブユニットもまた、H
VR2領域外で高度に保存されている。配列番号29~32のHBV7結合領域は、それ
ぞれ配列番号62~65として提供される。配列番号62~65のそれぞれは、メガヌク
レアーゼHBV7~8×.2(配列番号29)のHBV7結合領域である配列番号62と
少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号29~32のHBV8結合領域は、
それぞれ配列番号66~69として提供されている。配列番号66~69のそれぞれは、
メガヌクレアーゼHBV7~8×.2(配列番号29)のHBV8結合領域である配列番
号66と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
HBV 11-12認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「HBV11-12メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼ(配列番号33~39)は、HBV 11-12認識配列(
配列番号16)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、D、E
、F、及びG(例えば、それぞれ配列番号3~9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタン
パク質ORF内に位置付けられる。各HBV11-12遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブ
ユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各HBV
11-12メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号16のHBV11の認識
した半分の部位に結合し、一方第2のサブユニットは、HBV12の認識した半分の部位
に結合する(図2参照)。
操作されたメガヌクレアーゼ(配列番号33~39)は、HBV 11-12認識配列(
配列番号16)を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型A、B、C、D、E
、F、及びG(例えば、それぞれ配列番号3~9)を含む複数のHBV遺伝子型のPタン
パク質ORF内に位置付けられる。各HBV11-12遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼは、SV40由来のN末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第1のメガヌクレアーゼサブ
ユニット、リンカー配列、及び第2のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各HBV
11-12メガヌクレアーゼの第1のサブユニットは、配列番号16のHBV11の認識
した半分の部位に結合し、一方第2のサブユニットは、HBV12の認識した半分の部位
に結合する(図2参照)。
HBV11結合サブユニット及びHBV12結合サブユニットはそれぞれ、HVR1及
びHVR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBVs11結合サブユ
ニットはHVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV12結合サブユニット
もまた、HVR2領域外で高度に保存されている。配列番号33~39のHBV11結合
領域は、それぞれ配列番号70~76として提供される。配列番号70~76のそれぞれ
は、メガヌクレアーゼHBV11-12x.26(配列番号33)のHBV11結合領域
である配列番号70と少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号33~39の
HBV12結合領域は、それぞれ配列番号77~83として提供されている。配列番号7
7~83のそれぞれは、メガヌクレアーゼHBV11-12x.26(配列番号33)の
HBV12結合領域である配列番号77と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
びHVR2とそれぞれ呼ばれる56塩基対の超可変領域を含む。HBVs11結合サブユ
ニットはHVR1領域外で高度に保存されている。同様に、HBV12結合サブユニット
もまた、HVR2領域外で高度に保存されている。配列番号33~39のHBV11結合
領域は、それぞれ配列番号70~76として提供される。配列番号70~76のそれぞれ
は、メガヌクレアーゼHBV11-12x.26(配列番号33)のHBV11結合領域
である配列番号70と少なくとも90%の配列同一性を共有する。配列番号33~39の
HBV12結合領域は、それぞれ配列番号77~83として提供されている。配列番号7
7~83のそれぞれは、メガヌクレアーゼHBV11-12x.26(配列番号33)の
HBV12結合領域である配列番号77と少なくとも90%の配列同一性を共有する。
CHO細胞レポーターアッセイにおけるHBV認識配列の切断
HBV1-2、HBV5-6、HBV7-8、及びHBV11-12メガヌクレアーゼ
がそれらのそれぞれの認識配列(それぞれ配列番号10、12、14、及び16)を認識
し切断することができるかどうかを判断するために、それぞれ遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼを、以前に記載したCHO細胞レポーターアッセイを使用して評価した(国際公
開第2012/167192号パンフレット、図6を参照)。アッセイを実施するために
、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセッ
トを保有するCHO細胞レポーター株を作製した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認
識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能的なGFP遺伝子を生じるように、
各細胞株のGFP遺伝子を一対の認識配列によって中断した。
がそれらのそれぞれの認識配列(それぞれ配列番号10、12、14、及び16)を認識
し切断することができるかどうかを判断するために、それぞれ遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼを、以前に記載したCHO細胞レポーターアッセイを使用して評価した(国際公
開第2012/167192号パンフレット、図6を参照)。アッセイを実施するために
、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子発現カセッ
トを保有するCHO細胞レポーター株を作製した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認
識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能的なGFP遺伝子を生じるように、
各細胞株のGFP遺伝子を一対の認識配列によって中断した。
この研究のために発現させたCHOレポーター細胞株において、GFP遺伝子に挿入さ
れた1つの認識配列は、HBV1-2認識配列(配列番号10)、HBV5-6認識配列
(配列番号12)、HBV7-8認識配列(配列番号12)、及びHBV11-12認識
配列(配列番号16)であった。GFP遺伝子に挿入された第2の認識配列は、CHO-
23/24認識配列であったが、これは「CHO-23/24」と呼ばれる対照メガヌク
レアーゼによって認識され切断されるものである。HBV1-2認識配列及びCHO-2
3/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、「HBV1-2細胞」と呼ばれる。H
BV5-6認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、「
HBV5-6細胞」と呼ばれる。HBV7-8認識配列及びCHO-23/24認識配列
を含むCHOレポーター細胞は、「HBV7-8細胞」と呼ばれる。HBV11-12認
識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、「HBV11-
12細胞」と呼ばれる。
れた1つの認識配列は、HBV1-2認識配列(配列番号10)、HBV5-6認識配列
(配列番号12)、HBV7-8認識配列(配列番号12)、及びHBV11-12認識
配列(配列番号16)であった。GFP遺伝子に挿入された第2の認識配列は、CHO-
23/24認識配列であったが、これは「CHO-23/24」と呼ばれる対照メガヌク
レアーゼによって認識され切断されるものである。HBV1-2認識配列及びCHO-2
3/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、「HBV1-2細胞」と呼ばれる。H
BV5-6認識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、「
HBV5-6細胞」と呼ばれる。HBV7-8認識配列及びCHO-23/24認識配列
を含むCHOレポーター細胞は、「HBV7-8細胞」と呼ばれる。HBV11-12認
識配列及びCHO-23/24認識配列を含むCHOレポーター細胞は、「HBV11-
12細胞」と呼ばれる。
CHOレポーター細胞を、それらの対応する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドするプラスミドDNA(例えば、HBV1-2細胞を、HBV1-2メガヌクレアーゼ
をコードするプラスミドDNAで形質移入した)、又はCHO-23/34メガヌクレア
ーゼをコードするプラスミドDNAで、形質移入した。各アッセイにおいて、4e5のC
HOレポーター細胞を、製造元の説明書に従ってLipofectamine2000(
ThermoFisher)を用いて、96ウェルプレートにおける50ngのプラスミ
ドDNAで形質移入した。形質移入の48時間後に、細胞をフローサイトメトリーにより
評価して、形質移入されていない陰性の対照(HBV bs)と比較し、GFP陽性細胞
の割合を判定した。図7A~図7Dに示しているように、全てのHBVメガヌクレアーゼ
は、陰性の対照を有意に超える頻度で、それらの対応する認識配列を含む細胞株において
GFP陽性細胞を産生することが見出された。
ドするプラスミドDNA(例えば、HBV1-2細胞を、HBV1-2メガヌクレアーゼ
をコードするプラスミドDNAで形質移入した)、又はCHO-23/34メガヌクレア
ーゼをコードするプラスミドDNAで、形質移入した。各アッセイにおいて、4e5のC
HOレポーター細胞を、製造元の説明書に従ってLipofectamine2000(
ThermoFisher)を用いて、96ウェルプレートにおける50ngのプラスミ
ドDNAで形質移入した。形質移入の48時間後に、細胞をフローサイトメトリーにより
評価して、形質移入されていない陰性の対照(HBV bs)と比較し、GFP陽性細胞
の割合を判定した。図7A~図7Dに示しているように、全てのHBVメガヌクレアーゼ
は、陰性の対照を有意に超える頻度で、それらの対応する認識配列を含む細胞株において
GFP陽性細胞を産生することが見出された。
また、HBV1-2、HBV5-6、HBV7-8、及びHBV11-12メガヌクレ
アーゼの有効性は、メガヌクレアーゼをCHOレポーター細胞に導入した後2、5、7、
9、及び12日後に時間依存的に判定した。この研究では、製造元の説明書に従ってBi
oRad Gene Pulser Xcellを使用して、HBV1-2、HBV5-
6、HBV7-8、又はHB11-12細胞(1.0×106)に1細胞あたり1×10
6コピーのメガヌクレアーゼmRNAをエレクトロポレーションした。形質移入後の指定
の時点で、細胞をフローサイトメトリーによって評価して、GFP陽性細胞の割合を判定
した。CHO-23/24メガヌクレアーゼもまた、各時点で陽性対照として含めた。
アーゼの有効性は、メガヌクレアーゼをCHOレポーター細胞に導入した後2、5、7、
9、及び12日後に時間依存的に判定した。この研究では、製造元の説明書に従ってBi
oRad Gene Pulser Xcellを使用して、HBV1-2、HBV5-
6、HBV7-8、又はHB11-12細胞(1.0×106)に1細胞あたり1×10
6コピーのメガヌクレアーゼmRNAをエレクトロポレーションした。形質移入後の指定
の時点で、細胞をフローサイトメトリーによって評価して、GFP陽性細胞の割合を判定
した。CHO-23/24メガヌクレアーゼもまた、各時点で陽性対照として含めた。
図8A~図8Dに示すように、異なるHBVメガヌクレアーゼによって産生された%G
FPは、経時的に変化した。HBV5-6及びHBV11-12メガヌクレアーゼが、分
析した12日間にわたって実質的に一致していた(図8B及び図8D)のに対し、HBV
1-2及びHBV7-8メガヌクレアーゼは、実験の過程で減少した初期の時点にて、高
レベルのGFP陽性細胞を産生した。
FPは、経時的に変化した。HBV5-6及びHBV11-12メガヌクレアーゼが、分
析した12日間にわたって実質的に一致していた(図8B及び図8D)のに対し、HBV
1-2及びHBV7-8メガヌクレアーゼは、実験の過程で減少した初期の時点にて、高
レベルのGFP陽性細胞を産生した。
結論
これらの研究は、本発明に包含されているHBVメガヌクレアーゼが細胞内のそれぞれ
の認識配列を効率的に標的化して切断することができ、その効果が経時的に一定であるか
、一過性であり得ることを示した。
の認識配列を効率的に標的化して切断することができ、その効果が経時的に一定であるか
、一過性であり得ることを示した。
実施例2;HBV特異的ヌクレアーゼは大腸菌のプラスミドDNAを除去する
エピソームDNAを利用した細菌レポーターシステム
本実験の目的は、本発明のHBVメガヌクレアーゼを、大腸菌レポーターシステムにお
いてエピソームDNAプラスミド内の認識配列を認識して切断する能力について評価する
ことであった。
いてエピソームDNAプラスミド内の認識配列を認識して切断する能力について評価する
ことであった。
「pARCUS」と呼ばれるプラスミドを、ARCUSヌクレアーゼの誘導性発現を駆
動するために作製した(図9A)。pARCUSでは、ARCUSヌクレアーゼ(ここで
は、HBV5-6×.33又はHBV11-12×のいずれか)をIPTG誘導性プロモ
ータの制御下に置く。更に、形質転換した細菌の選択を可能にするために、pARCUS
はアンピシリン耐性遺伝子をコードする。pARCUSは、低コピーのプラスミドである
ので、ARCUSヌクレアーゼの誘導した発現は、過剰な発現を引き起こさない。
動するために作製した(図9A)。pARCUSでは、ARCUSヌクレアーゼ(ここで
は、HBV5-6×.33又はHBV11-12×のいずれか)をIPTG誘導性プロモ
ータの制御下に置く。更に、形質転換した細菌の選択を可能にするために、pARCUS
はアンピシリン耐性遺伝子をコードする。pARCUSは、低コピーのプラスミドである
ので、ARCUSヌクレアーゼの誘導した発現は、過剰な発現を引き起こさない。
「pHBVa」と呼ばれる追加のプラスミドが生成された(図9A)。pHBVaは、
HBV5-6及びHBV11-12の認識配列を含む、HBVゲノムの大きな断片を保有
している。このプラスミドはまた、カナマイシン耐性遺伝子及びSacB遺伝子をコード
する。カナマイシン耐性遺伝子は、形質転換させた細菌の選択を可能にするものであり、
SacB遺伝子はスクロースの存在下で活性である毒素である。従って、pHBVaで形
質転換された細菌は、培地のカナマイシンの存在下では生存するが、カナマイシン及びス
クロースの存在下では生存しない。pHBVaは、HBVゲノムの多くのコピーがあり得
るHBV感染細胞を複製する試みにおいて、高コピーのプラスミドであるように設計した
。重要なことに、pHBVaは、pARCUSとは異なる複製の起点を利用しており、細
菌と両方のプラスミドとの同時の形質転換が可能になる。
HBV5-6及びHBV11-12の認識配列を含む、HBVゲノムの大きな断片を保有
している。このプラスミドはまた、カナマイシン耐性遺伝子及びSacB遺伝子をコード
する。カナマイシン耐性遺伝子は、形質転換させた細菌の選択を可能にするものであり、
SacB遺伝子はスクロースの存在下で活性である毒素である。従って、pHBVaで形
質転換された細菌は、培地のカナマイシンの存在下では生存するが、カナマイシン及びス
クロースの存在下では生存しない。pHBVaは、HBVゲノムの多くのコピーがあり得
るHBV感染細胞を複製する試みにおいて、高コピーのプラスミドであるように設計した
。重要なことに、pHBVaは、pARCUSとは異なる複製の起点を利用しており、細
菌と両方のプラスミドとの同時の形質転換が可能になる。
細菌をこれらのプラスミドで同時に形質転換し、選択的な圧力の様々な組み合わせを含
有する培地において増殖させた(アンピシリン、カナマイシン、又はスクロース)場合、
複数の可能な結果が存在している。pARCUSで形質転換され、アンピシリンの存在下
で増殖される細菌は、pARCUSプラスミドを保有するであろうが、増殖培地がIPT
Gを補充されないと、コードされたヌクレアーゼを発現しない。IPTGで誘導すると、
コードされたヌクレアーゼが発現される。pHBVaで形質転換された細菌はカナマイシ
ンの存在下で増殖するが、カナマイシン及びスクロースの場合は増殖しない。アンピシリ
ン及び/又はカナマイシンの存在下にてpARCUS及びpHBVaで同時に形質転換さ
れた細菌は、スクロースに対して感受性がある。pARCUS及びpHBVで同時に形質
転換された細菌において、IPTGを用いたARCUSヌクレアーゼの誘導は、ヌクレア
ーゼの発現をもたらし、それが次にpHBVaにてコードされた標的部位を切断し得るこ
とが予測された。当該の部位での切断がpHBVaプラスミドの線状化をもたらすと予想
したが、それは細菌のヌクレアーゼによって急速に分解されるはずである。pHBVプラ
スミドの分解は、細菌がカナマイシンに対する耐性を失うこと、その一方でスクロースの
存在下で生き残ることができること、という2つの結果をもたらすであろう。
有する培地において増殖させた(アンピシリン、カナマイシン、又はスクロース)場合、
複数の可能な結果が存在している。pARCUSで形質転換され、アンピシリンの存在下
で増殖される細菌は、pARCUSプラスミドを保有するであろうが、増殖培地がIPT
Gを補充されないと、コードされたヌクレアーゼを発現しない。IPTGで誘導すると、
コードされたヌクレアーゼが発現される。pHBVaで形質転換された細菌はカナマイシ
ンの存在下で増殖するが、カナマイシン及びスクロースの場合は増殖しない。アンピシリ
ン及び/又はカナマイシンの存在下にてpARCUS及びpHBVaで同時に形質転換さ
れた細菌は、スクロースに対して感受性がある。pARCUS及びpHBVで同時に形質
転換された細菌において、IPTGを用いたARCUSヌクレアーゼの誘導は、ヌクレア
ーゼの発現をもたらし、それが次にpHBVaにてコードされた標的部位を切断し得るこ
とが予測された。当該の部位での切断がpHBVaプラスミドの線状化をもたらすと予想
したが、それは細菌のヌクレアーゼによって急速に分解されるはずである。pHBVプラ
スミドの分解は、細菌がカナマイシンに対する耐性を失うこと、その一方でスクロースの
存在下で生き残ることができること、という2つの結果をもたらすであろう。
同時の形質転換の結果を検証するために、細菌をpARCUS及びpHBVaで(エレ
クトロポレーションにより)同時に形質転換し、播種前に3時間アンピシリンの存在下で
培養した。並行する培養において、同時に形質転換させた細胞をIPTGで処理し(3時
間)、ヌクレアーゼの発現を誘導し、pHBVaの切断を可能にした。次いで、細胞を、
アンピシリン、アンピシリン及びスクロース、又はアンピシリン及びカナマイシンの存在
下で、寒天プレートに蒔いた。プレートを一晩インキュベートし、コロニーを数えて細菌
の生存を評価した。
クトロポレーションにより)同時に形質転換し、播種前に3時間アンピシリンの存在下で
培養した。並行する培養において、同時に形質転換させた細胞をIPTGで処理し(3時
間)、ヌクレアーゼの発現を誘導し、pHBVaの切断を可能にした。次いで、細胞を、
アンピシリン、アンピシリン及びスクロース、又はアンピシリン及びカナマイシンの存在
下で、寒天プレートに蒔いた。プレートを一晩インキュベートし、コロニーを数えて細菌
の生存を評価した。
結果
各選択プレートに存在するコロニーの数により、ARCUSヌクレアーゼがpHBVa
プラスミドを切断し得ることの劇的な証拠が得られた。対照のアンピシリンプレートでは
、非誘導培養物又はIPTG誘導培養物のいずれかからのコロニー数は、pHBVa及び
いずれかのpARCUSプラスミドで同時に形質転換された細胞について、同等であった
(図9B)。HBV5-6×.33をコードするpARCUSで同時に形質転換した細菌
と、HBV11-12×.26をコードするpARCUSで同時に形質転換した細菌との
間にコロニー数の差があったが、これは形質転換の効率を反映していると思われる。
プラスミドを切断し得ることの劇的な証拠が得られた。対照のアンピシリンプレートでは
、非誘導培養物又はIPTG誘導培養物のいずれかからのコロニー数は、pHBVa及び
いずれかのpARCUSプラスミドで同時に形質転換された細胞について、同等であった
(図9B)。HBV5-6×.33をコードするpARCUSで同時に形質転換した細菌
と、HBV11-12×.26をコードするpARCUSで同時に形質転換した細菌との
間にコロニー数の差があったが、これは形質転換の効率を反映していると思われる。
著しく対照的に、アンピシリンとスクロースの両方を含むプレートでの非IPTG誘導
培養物からのコロニー数は劇的に少なくなっており、これはスクロースが利用可能である
場合にSacB遺伝子が細胞殺傷に有効であることを示している(図9B)。しかし、I
PTGで誘導された培養物は、アンピシリンとスクロースの両方を含有するプレートで非
常によく成長しており、このことは、SacB遺伝子を除去したことを示している。pH
BVa、及びHBV11-12x.26をコードするpARCUSで同時に形質転換され
た(しかしIPTGで誘導されていない)細菌のコロニー数は、アンピシリン対照プレー
トのものと同じであり、pARCUS5-6x.33で同時に形質転換された細菌は、対
照プレートと比較して、ほんのわずかに減少した。
培養物からのコロニー数は劇的に少なくなっており、これはスクロースが利用可能である
場合にSacB遺伝子が細胞殺傷に有効であることを示している(図9B)。しかし、I
PTGで誘導された培養物は、アンピシリンとスクロースの両方を含有するプレートで非
常によく成長しており、このことは、SacB遺伝子を除去したことを示している。pH
BVa、及びHBV11-12x.26をコードするpARCUSで同時に形質転換され
た(しかしIPTGで誘導されていない)細菌のコロニー数は、アンピシリン対照プレー
トのものと同じであり、pARCUS5-6x.33で同時に形質転換された細菌は、対
照プレートと比較して、ほんのわずかに減少した。
非IPTG誘導培養物は、アンピシリンとカナマイシンの両方を含有するプレートで増
殖することができた(図9B)。HBV 11-12×.26をコードするpARCUS
で同時に形質転換した細菌からのコロニー数は、対照のアンピシリンのみのプレートとほ
ぼ等しく、pARCUS HBV5-6×.33で同時に形質転換した細胞は、対照と比
較して、ほんのわずかに減少した。しかし、アンピシリン及びカナマイシンを含有するプ
レートでIPTG誘導細胞を増殖させた場合、コロニー数はゼロに近く、これはカナマイ
シン耐性遺伝子を保有するプラスミドの排除を示していた(図9B)。
殖することができた(図9B)。HBV 11-12×.26をコードするpARCUS
で同時に形質転換した細菌からのコロニー数は、対照のアンピシリンのみのプレートとほ
ぼ等しく、pARCUS HBV5-6×.33で同時に形質転換した細胞は、対照と比
較して、ほんのわずかに減少した。しかし、アンピシリン及びカナマイシンを含有するプ
レートでIPTG誘導細胞を増殖させた場合、コロニー数はゼロに近く、これはカナマイ
シン耐性遺伝子を保有するプラスミドの排除を示していた(図9B)。
結論
これらのデータは、HBVゲノムの部位を認識する本発明のHBVメガヌクレアーゼが
pHBVaプラスミドを切断することができ、その結果pHBVaプラスミドが排除され
ることを明白に実証している。IPTG誘導培養物では、細胞はスクロースの存在下で増
殖しており、これはSacB含有プラスミドを効率的に除去したことを示している。同様
に、IPTG誘導培養物において、細胞はカナマイシンの存在下で死滅し、これはまた、
pHBVaプラスミドを破壊したことを強く示唆している。HBV cccDNAを切断
するために本発明のHBVメガヌクレアーゼを使用して、HBV感染哺乳動物細胞におい
て同様の結果が起こり得る可能性がある。細菌では、直鎖状DNAはすぐに除去される。
哺乳動物細胞での線状化cccDNAも、細胞のヌクレアーゼによって消化されると考え
られる。切断がcccDNAの線状化及び排除につながらないとしても、HBV ARC
USヌクレアーゼによって引き起こされるインデルの突然変異は、コードする領域を破壊
し、cccDNAが機能的HBVタンパク質を産生することを不可能にする見込みがある
。従って、HBVゲノムの部位を標的とする本発明のメガヌクレアーゼは、HBV cc
cDNAを排除又は不活性化するための有効な方法であるはずである。
pHBVaプラスミドを切断することができ、その結果pHBVaプラスミドが排除され
ることを明白に実証している。IPTG誘導培養物では、細胞はスクロースの存在下で増
殖しており、これはSacB含有プラスミドを効率的に除去したことを示している。同様
に、IPTG誘導培養物において、細胞はカナマイシンの存在下で死滅し、これはまた、
pHBVaプラスミドを破壊したことを強く示唆している。HBV cccDNAを切断
するために本発明のHBVメガヌクレアーゼを使用して、HBV感染哺乳動物細胞におい
て同様の結果が起こり得る可能性がある。細菌では、直鎖状DNAはすぐに除去される。
哺乳動物細胞での線状化cccDNAも、細胞のヌクレアーゼによって消化されると考え
られる。切断がcccDNAの線状化及び排除につながらないとしても、HBV ARC
USヌクレアーゼによって引き起こされるインデルの突然変異は、コードする領域を破壊
し、cccDNAが機能的HBVタンパク質を産生することを不可能にする見込みがある
。従って、HBVゲノムの部位を標的とする本発明のメガヌクレアーゼは、HBV cc
cDNAを排除又は不活性化するための有効な方法であるはずである。
実施例3;細胞でのHBVウイルスゲノムの標的化
HBVゲノムを発現するAD38細胞の治療
これらの実施例の主な目的は、本発明のメガヌクレアーゼがHBV感染哺乳動物細胞の
HBVゲノムを不活性化及び/又は排除することができるかどうかを評価することであっ
た。
HBVゲノムを不活性化及び/又は排除することができるかどうかを評価することであっ
た。
第1の研究では、メガヌクレアーゼの有効性は、Tetプロモータ下でHBVゲノムを
安定的に発現するAD38細胞系において評価された。このAD38細胞系は活性ウイル
ス粒子を生成しないが、細胞培地で検出可能であるHBV S抗原(HBsAg)を生成
する。本研究では、細胞にHBV5-6×.33又はHBV11-12×.26をコード
するDNAプラスミドで形質移入した。これらの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは両
方とも、重複するS(HBsAg遺伝子)及びP(ポリメラーゼ遺伝子)リーディングフ
レーム内の配列を標的とするHBV5-6×.33、及びP遺伝子を標的とするHBV1
1-12×.26を用い、HBVゲノムに特異的な配列を標的とする。対照として、AD
38細胞を、赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子をコードするプラスミドで形質移入し
た。細胞を播種し、24時間後にリポソームベースの形質移入プロトコルを用いてプラス
ミドで形質移入した。形質移入の24時間後、AD38細胞を洗浄して、残っているリポ
ソーム複合体を除去した。形質移入後3日目及び7日目に、細胞の上清を回収し、ELI
SAによってHBsAgの存在についてアッセイした。
安定的に発現するAD38細胞系において評価された。このAD38細胞系は活性ウイル
ス粒子を生成しないが、細胞培地で検出可能であるHBV S抗原(HBsAg)を生成
する。本研究では、細胞にHBV5-6×.33又はHBV11-12×.26をコード
するDNAプラスミドで形質移入した。これらの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは両
方とも、重複するS(HBsAg遺伝子)及びP(ポリメラーゼ遺伝子)リーディングフ
レーム内の配列を標的とするHBV5-6×.33、及びP遺伝子を標的とするHBV1
1-12×.26を用い、HBVゲノムに特異的な配列を標的とする。対照として、AD
38細胞を、赤色蛍光タンパク質(RFP)遺伝子をコードするプラスミドで形質移入し
た。細胞を播種し、24時間後にリポソームベースの形質移入プロトコルを用いてプラス
ミドで形質移入した。形質移入の24時間後、AD38細胞を洗浄して、残っているリポ
ソーム複合体を除去した。形質移入後3日目及び7日目に、細胞の上清を回収し、ELI
SAによってHBsAgの存在についてアッセイした。
結果
ELISAのデータを、形質移入後3日目及び7日目に、RFP形質移入のAD38細
胞の上清に存在するHBsAgの量に対して正規化した。形質移入後3日目に、HBV1
1-12x.26をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、RFP形質移入の細胞
と比較して、上清に約25%少ないHBsAgを示した(図10)。同じ時点で、HBV
5-6×.33をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、RFP形質移入の細胞
と比較して、上清に約50%少ないHBsAgを示した(図10)。非形質移入の対照細
胞は、RFP形質移入の細胞と本質的に同じであった。HBsAgの減少は形質移入後7
日目で更に明白であった。HBV11-12x.26で形質移入したAD38細胞は、R
FPで形質移入した細胞よりも約50%低いHBsAgのレベルを示し、HBV5-6x
.33で形質移入した細胞は、RFP対照より約75%低いレベルを示した(図10)。
形質移入後7日目に、RFPで形質移入した細胞は、非形質移入細胞と比較して上清のH
BsAgが有意に少なく、これは形質移入のプロセスが細胞のHBsAg産生能に悪影響
を及ぼしたことを示唆している。それにもかかわらず、その影響は、HBVメガヌクレア
ーゼをコードするプラスミドで形質移入された細胞において、はるかに顕著であり、上清
のHBsAgレベルの減少がメガヌクレアーゼの活性によるものであることを強く示唆し
ている。
胞の上清に存在するHBsAgの量に対して正規化した。形質移入後3日目に、HBV1
1-12x.26をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、RFP形質移入の細胞
と比較して、上清に約25%少ないHBsAgを示した(図10)。同じ時点で、HBV
5-6×.33をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、RFP形質移入の細胞
と比較して、上清に約50%少ないHBsAgを示した(図10)。非形質移入の対照細
胞は、RFP形質移入の細胞と本質的に同じであった。HBsAgの減少は形質移入後7
日目で更に明白であった。HBV11-12x.26で形質移入したAD38細胞は、R
FPで形質移入した細胞よりも約50%低いHBsAgのレベルを示し、HBV5-6x
.33で形質移入した細胞は、RFP対照より約75%低いレベルを示した(図10)。
形質移入後7日目に、RFPで形質移入した細胞は、非形質移入細胞と比較して上清のH
BsAgが有意に少なく、これは形質移入のプロセスが細胞のHBsAg産生能に悪影響
を及ぼしたことを示唆している。それにもかかわらず、その影響は、HBVメガヌクレア
ーゼをコードするプラスミドで形質移入された細胞において、はるかに顕著であり、上清
のHBsAgレベルの減少がメガヌクレアーゼの活性によるものであることを強く示唆し
ている。
結論
これらのデータは、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26のいずれかを
コードするプラスミドで形質移入されたAD38細胞が、非形質移入細胞又はRFPレポ
ーター遺伝子で形質移入された細胞と比較して、上清のHBsAgが劇的に減少したこと
を示している。HBVメガヌクレアーゼのいずれかで形質移入した細胞における上清のH
BsAgレベルの減少は、その減少がAD38細胞のHBVゲノムに対するメガヌクレア
ーゼ活性に起因することを強く示唆している。
コードするプラスミドで形質移入されたAD38細胞が、非形質移入細胞又はRFPレポ
ーター遺伝子で形質移入された細胞と比較して、上清のHBsAgが劇的に減少したこと
を示している。HBVメガヌクレアーゼのいずれかで形質移入した細胞における上清のH
BsAgレベルの減少は、その減少がAD38細胞のHBVゲノムに対するメガヌクレア
ーゼ活性に起因することを強く示唆している。
実施例4;細胞でのHBVウイルスゲノムの標的化
HBVゲノムを発現するAD38細胞の治療
上記の実施例3の研究は、HBVゲノム発現AD38細胞系からのHBsAgの分泌を
減少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証している。HBsAgの分泌の
更に大きな減少が、プラスミドの形質移入の代わりにレンチウイルスの送達を用いて達成
され得るかどうかを判断するために、HBV11-12x.26及びHBV5-6x.3
3メガヌクレアーゼを個々に又は組み合わせて用いるレンチウイルスの送達で、この研究
を繰り返した。
減少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証している。HBsAgの分泌の
更に大きな減少が、プラスミドの形質移入の代わりにレンチウイルスの送達を用いて達成
され得るかどうかを判断するために、HBV11-12x.26及びHBV5-6x.3
3メガヌクレアーゼを個々に又は組み合わせて用いるレンチウイルスの送達で、この研究
を繰り返した。
RFP、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26のいずれかを発現するレ
ンチウイルスを作製し、AD38細胞を形質導入して、HBsAgの産生に対するメガヌ
クレアーゼの影響を判定した。AD38細胞を播種し、24時間後に、RFP、HBV5
-6×.33、HBV11-12×.26をコードするレンチウイルス、又はHBVメガ
ヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合物のいずれかで形質導入した。
細胞に、1、2、又は4のMOIで単一のレンチウイルスで形質導入した。HBVメガヌ
クレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合物で形質導入された細胞は、2及
び4の総MOIで形質導入された。形質導入細胞の培地は、形質導入後1日目及び3日目
に交換した。形質導入後7日目に細胞の上清を回収し、ELISAによりHBsAgの存
在についてアッセイした。
ンチウイルスを作製し、AD38細胞を形質導入して、HBsAgの産生に対するメガヌ
クレアーゼの影響を判定した。AD38細胞を播種し、24時間後に、RFP、HBV5
-6×.33、HBV11-12×.26をコードするレンチウイルス、又はHBVメガ
ヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合物のいずれかで形質導入した。
細胞に、1、2、又は4のMOIで単一のレンチウイルスで形質導入した。HBVメガヌ
クレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合物で形質導入された細胞は、2及
び4の総MOIで形質導入された。形質導入細胞の培地は、形質導入後1日目及び3日目
に交換した。形質導入後7日目に細胞の上清を回収し、ELISAによりHBsAgの存
在についてアッセイした。
結果
ELISAのデータを、形質移入後7日目に、RFP形質導入のAD38細胞の上清に
存在するHBsAgの量に対して正規化した。MOIが1の場合、HBV5-6×.33
で形質導入されたAD38細胞は、RFP発現レンチウイルスで形質導入されたAD38
細胞よりも上清に約60%少ないHBsAgを示した(図11)。また、MOIが1の場
合、HBV11-12x.26はRFPよりも約40%少ないHBsAgを示した。より
高いMOIでは、HBVメガヌクレアーゼの影響はより顕著であった。MOIが2の場合
、HBV5-6×.33をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、RFPで
形質導入された細胞と比較して約80%のHBsAgの減少を示し、MOIが4の場合、
減少は比較すると約90%であった。同様に、MOIが2の場合、HBV11-12×.
26をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、RFPで形質導入された細胞
よりも約70%少ないHBsAgを示し、MOIが4の場合、HBsAgは約80%低か
った。また最後に、HBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合
物で形質導入された細胞は、RFP形質導入の対照の細胞と比較して、上清のHBsAg
のレベルが劇的に減少したことを示した(図11)。総MOIが2の場合、HBV発現レ
ンチウイルスは、HBsAgの発現を約80%減少させ、総MOIが4の場合、発現は約
90%減少した。
存在するHBsAgの量に対して正規化した。MOIが1の場合、HBV5-6×.33
で形質導入されたAD38細胞は、RFP発現レンチウイルスで形質導入されたAD38
細胞よりも上清に約60%少ないHBsAgを示した(図11)。また、MOIが1の場
合、HBV11-12x.26はRFPよりも約40%少ないHBsAgを示した。より
高いMOIでは、HBVメガヌクレアーゼの影響はより顕著であった。MOIが2の場合
、HBV5-6×.33をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、RFPで
形質導入された細胞と比較して約80%のHBsAgの減少を示し、MOIが4の場合、
減少は比較すると約90%であった。同様に、MOIが2の場合、HBV11-12×.
26をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、RFPで形質導入された細胞
よりも約70%少ないHBsAgを示し、MOIが4の場合、HBsAgは約80%低か
った。また最後に、HBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合
物で形質導入された細胞は、RFP形質導入の対照の細胞と比較して、上清のHBsAg
のレベルが劇的に減少したことを示した(図11)。総MOIが2の場合、HBV発現レ
ンチウイルスは、HBsAgの発現を約80%減少させ、総MOIが4の場合、発現は約
90%減少した。
結論
これらのデータは、RFP発現レンチウイルスで形質導入された細胞と比較して、HB
V 5-6×.33若しくはHBV11-12×.26、又は両方の組み合わせをコード
するレンチウイルスで形質導入されたAD38細胞が、上清のHBsAgの劇的な減少を
示すことを実証する。HBVメガヌクレアーゼのいずれか又は両方を発現するレンチウイ
ルスで形質導入された細胞における上清のHBsAgのレベルの減少は、その減少がAD
38細胞のHBVゲノムに対するメガヌクレアーゼの活性に起因することを強く示唆して
いる。更に、これらのデータは、HBVメガヌクレアーゼの共発現がHBsAgの発現を
効果的に減少させることを実証し、このことは共発現されたメガヌクレアーゼがHBVゲ
ノムを効果的にすることができることを強く示唆している。
V 5-6×.33若しくはHBV11-12×.26、又は両方の組み合わせをコード
するレンチウイルスで形質導入されたAD38細胞が、上清のHBsAgの劇的な減少を
示すことを実証する。HBVメガヌクレアーゼのいずれか又は両方を発現するレンチウイ
ルスで形質導入された細胞における上清のHBsAgのレベルの減少は、その減少がAD
38細胞のHBVゲノムに対するメガヌクレアーゼの活性に起因することを強く示唆して
いる。更に、これらのデータは、HBVメガヌクレアーゼの共発現がHBsAgの発現を
効果的に減少させることを実証し、このことは共発現されたメガヌクレアーゼがHBVゲ
ノムを効果的にすることができることを強く示唆している。
実施例5;細胞でのHBVウイルスゲノムの標的化
HBVゲノムを発現するAD38細胞の治療
更なる研究において、HBsAgの分泌に対するメガヌクレアーゼの処理の効果、細胞
培養培地に存在するHBV DNAコピー、及び細胞内のHBV cccDNAコピーを
観察するために、AD38細胞を、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26
メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスで形質導入した。
培養培地に存在するHBV DNAコピー、及び細胞内のHBV cccDNAコピーを
観察するために、AD38細胞を、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26
メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスで形質導入した。
上記の実施例4と同様に、RFP(LV212)、HBV5-6×.33(LV224
)、又はHBV11-12×.26(LV225)のいずれかを発現するレンチウイルス
を生成し、AD38細胞を形質導入して、メガヌクレアーゼの各実験結果に与える影響を
判定した。AD38細胞をテトラサイクリンの存在下で播種し、24時間後に、4のMO
Iで、RFP、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26をコードするレンチ
ウイルスで形質導入した。形質導入細胞の培地を形質導入24時間後に交換した。形質導
入後7日目に、細胞の上清を回収し、ELISAによりHBsAgの存在についてアッセ
イした。細胞培養液5μL当たりの細胞外HBV DNAのコピーを定量的PCRにより
判断した。細胞溶解物を得て、5μLの細胞溶解物当たりのHBV cccDNAの細胞
内のコピーを、定量的PCRによって判定した。
)、又はHBV11-12×.26(LV225)のいずれかを発現するレンチウイルス
を生成し、AD38細胞を形質導入して、メガヌクレアーゼの各実験結果に与える影響を
判定した。AD38細胞をテトラサイクリンの存在下で播種し、24時間後に、4のMO
Iで、RFP、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26をコードするレンチ
ウイルスで形質導入した。形質導入細胞の培地を形質導入24時間後に交換した。形質導
入後7日目に、細胞の上清を回収し、ELISAによりHBsAgの存在についてアッセ
イした。細胞培養液5μL当たりの細胞外HBV DNAのコピーを定量的PCRにより
判断した。細胞溶解物を得て、5μLの細胞溶解物当たりのHBV cccDNAの細胞
内のコピーを、定量的PCRによって判定した。
結果
4のMOIにおいて、HBV5-6×.33及びHBV11-12×.26で形質導入
されたAD38細胞は、形質導入後7日で、RFP発現レンチウイルスで形質導入された
AD38細胞よりも、細胞培養培地においてそれぞれ約58%及び25%少ないHBsA
gを示した(図12A)。細胞外のHBV DNAのコピー数もまた、RFP発現レンチ
ウイルスによる形質導入と比較した場合、HBV5-6×.33及びHBV11-12×
.26メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約28%及び50%減少した
(図12B)。最終的に、細胞内のHBV cccDNAのコピー数もまた、RFP発現
レンチウイルスによる形質導入と比較した場合、HBV5-6×.33及びHBV11-
12×.26メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約71%及び60%減
少した(図12C)。
されたAD38細胞は、形質導入後7日で、RFP発現レンチウイルスで形質導入された
AD38細胞よりも、細胞培養培地においてそれぞれ約58%及び25%少ないHBsA
gを示した(図12A)。細胞外のHBV DNAのコピー数もまた、RFP発現レンチ
ウイルスによる形質導入と比較した場合、HBV5-6×.33及びHBV11-12×
.26メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約28%及び50%減少した
(図12B)。最終的に、細胞内のHBV cccDNAのコピー数もまた、RFP発現
レンチウイルスによる形質導入と比較した場合、HBV5-6×.33及びHBV11-
12×.26メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約71%及び60%減
少した(図12C)。
結論
これらのデータは更に、HBV5-6x.33又はHBV11-12x.26メガヌク
レアーゼのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入したAD38細胞が、RFP
発現レンチウイルスで形質導入した細胞と比較して、上清のHBsAgの劇的な減少を示
すことを実証している。更に、これらのデータは、本発明のHBVメガヌクレアーゼがま
た細胞外のHBV DNAのコピー数を減少させ、重要なことに、HBV cccDNA
の細胞内のコピー数を有意に減少させることを実証している。
レアーゼのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入したAD38細胞が、RFP
発現レンチウイルスで形質導入した細胞と比較して、上清のHBsAgの劇的な減少を示
すことを実証している。更に、これらのデータは、本発明のHBVメガヌクレアーゼがま
た細胞外のHBV DNAのコピー数を減少させ、重要なことに、HBV cccDNA
の細胞内のコピー数を有意に減少させることを実証している。
実施例6;HBV感染初代ヒト肝細胞の治療
HBV感染初代ヒト肝細胞の治療
上記の実施例の研究は、HBVゲノム発現AD38細胞系からのHBsAgの分泌を減
少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証する。本実施例の研究は、HBV
感染初代ヒト肝細胞における本発明のHBVメガヌクレアーゼの有効性を判定するために
行われた。
少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証する。本実施例の研究は、HBV
感染初代ヒト肝細胞における本発明のHBVメガヌクレアーゼの有効性を判定するために
行われた。
RFP、HBV5-6×.33又はHBV11-12×.26を発現するレンチウイル
スを作製し、HBV感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、HBsAg及びHBeAgの産
生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。簡潔には、初代ヒト肝細胞を播種し、2
4時間後にHBVに感染させた。感染後1日目に細胞を洗浄し、24時間後(感染後2日
目)に、RFP、HBV5-6×.33、HBV11-12×.26をコードするレンチ
ウイルス、又はHBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合物の
いずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をDMSOで処理した。細
胞の上清を回収し、形質導入後4日目、8日目、11日目、及び13日目に培地を交換し
た。各時点で、HBsAg及びHBeAgをELISAにより細胞の上清で測定した。ま
た、上清の中の細胞外DNAを感染後13日目に測定した。
スを作製し、HBV感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、HBsAg及びHBeAgの産
生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。簡潔には、初代ヒト肝細胞を播種し、2
4時間後にHBVに感染させた。感染後1日目に細胞を洗浄し、24時間後(感染後2日
目)に、RFP、HBV5-6×.33、HBV11-12×.26をコードするレンチ
ウイルス、又はHBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1の混合物の
いずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をDMSOで処理した。細
胞の上清を回収し、形質導入後4日目、8日目、11日目、及び13日目に培地を交換し
た。各時点で、HBsAg及びHBeAgをELISAにより細胞の上清で測定した。ま
た、上清の中の細胞外DNAを感染後13日目に測定した。
結果
一般に、レンチウイルス形質導入がHBsAg又はHBeAgのいずれかの分泌に影響
を及ぼすかどうかを判断するために、RFPをコードするレンチウイルスで形質導入した
細胞から得た細胞の上清を、DMSOで処理した細胞と比較した(図13)。RFPをコ
ードするレンチウイルスを用いたHBV感染初代ヒト肝細胞の形質導入は、HBsAg又
はHBeAgの分泌に対する影響があったとしてもわずかであった(図13A及び図13
B)。5又は2.5のMOIでは、HBsAgのレベルはDMSOで処理した細胞と同一
であり、1.25のMOIではわずかな減少しかない(図13A)。同様に、RFP-レ
ンチウイルス形質導入細胞の上清のHBeAgのレベルは、DMSOで処理した細胞と比
較した場合に、1.25、2.5、又は5のMOIでほんのわずかな減少を示している(
図13B)。更に、HBV感染初代ヒト肝細胞の上清にて検出された細胞外のHBVの量
は、DMSOで処理した細胞と、RFPをコードするレンチウイルスで形質導入された細
胞との間にほとんど差異を示していない(図13C)。
を及ぼすかどうかを判断するために、RFPをコードするレンチウイルスで形質導入した
細胞から得た細胞の上清を、DMSOで処理した細胞と比較した(図13)。RFPをコ
ードするレンチウイルスを用いたHBV感染初代ヒト肝細胞の形質導入は、HBsAg又
はHBeAgの分泌に対する影響があったとしてもわずかであった(図13A及び図13
B)。5又は2.5のMOIでは、HBsAgのレベルはDMSOで処理した細胞と同一
であり、1.25のMOIではわずかな減少しかない(図13A)。同様に、RFP-レ
ンチウイルス形質導入細胞の上清のHBeAgのレベルは、DMSOで処理した細胞と比
較した場合に、1.25、2.5、又は5のMOIでほんのわずかな減少を示している(
図13B)。更に、HBV感染初代ヒト肝細胞の上清にて検出された細胞外のHBVの量
は、DMSOで処理した細胞と、RFPをコードするレンチウイルスで形質導入された細
胞との間にほとんど差異を示していない(図13C)。
レンチウイルス形質導入は、一般に、感染した初代ヒト肝細胞におけるHBV機能に影
響を及ぼさないことを示したので、HBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルス
をRFPレンチウイルスと比較した。HBsAgのELISAのデータを、形質導入後3
日目、8日目、11日目、及び13日目に、RFP形質導入HBV感染初代ヒト肝細胞の
上清に存在するHBsAgの量に対して正規化した(図14)。2.5及び1.25のM
OIの両方で、HBV5-6×.33をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は
、実験の経過にわたってHBsAgの着実な減少を示し、RFP対照と比較したときに、
3日目にわずかにレベルの減少、8日目までに約50~60%の減少、並びに11日目及
び13日目までに約90%の減少を示した(図14A及び14B)。HBV11-12x
.26で形質導入した感染細胞は、MOIが2.5と1.25の両方で同様のパターンを
示し、3日目の時点でより顕著な減少(約50%の減少)を示し、それでも依然、形質導
入後11日目及び13日目までに約90%の減少を達成した(図14A及び図14B)。
感染細胞を、HBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1混合物で形質
導入した場合、HBsAgの同様の減少が経時的に観察された。2.5のMOIでは、レ
ベルは形質導入後3日目に約50%減少し、減少は継続して、形質導入後11日目及び1
3日目までに90%に達した(図14A及び図14B)。
響を及ぼさないことを示したので、HBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルス
をRFPレンチウイルスと比較した。HBsAgのELISAのデータを、形質導入後3
日目、8日目、11日目、及び13日目に、RFP形質導入HBV感染初代ヒト肝細胞の
上清に存在するHBsAgの量に対して正規化した(図14)。2.5及び1.25のM
OIの両方で、HBV5-6×.33をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は
、実験の経過にわたってHBsAgの着実な減少を示し、RFP対照と比較したときに、
3日目にわずかにレベルの減少、8日目までに約50~60%の減少、並びに11日目及
び13日目までに約90%の減少を示した(図14A及び14B)。HBV11-12x
.26で形質導入した感染細胞は、MOIが2.5と1.25の両方で同様のパターンを
示し、3日目の時点でより顕著な減少(約50%の減少)を示し、それでも依然、形質導
入後11日目及び13日目までに約90%の減少を達成した(図14A及び図14B)。
感染細胞を、HBVメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1混合物で形質
導入した場合、HBsAgの同様の減少が経時的に観察された。2.5のMOIでは、レ
ベルは形質導入後3日目に約50%減少し、減少は継続して、形質導入後11日目及び1
3日目までに90%に達した(図14A及び図14B)。
また、HBeAgのELISAのデータを、形質導入後3日目、8日目、11日目、及
び13日目に、RFP形質導入HBV感染初代ヒト肝細胞の上清に存在するHBeAgの
量に対して正規化した(図14)。2.5及び1.25のMOIの両方で、HBV5-6
×.33をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、実験の経過にわたってHB
eAgの着実な減少を示し、RFP対照と比較したときに、3日目に約25%のレベルの
減少、8日目までに約50%の減少、並びに11日目及び13日目までに約90%の減少
を示した(図14C及び図14D)。HBV11-12x.26で形質導入した感染細胞
は、MOIが2.5と1.25の両方で同様のパターンを示し、3日目の時点で類似した
減少(約30%の減少)を示し、それでも依然、形質導入後11日目及び13日目までに
HBeAgの約90%の減少を達成した(図14C及び図14D)。感染細胞を、HBV
メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1混合物で形質導入した場合、HB
eAgの同様の減少が経時的に観察された。2.5及び1.25のMOIでは、レベルは
形質導入後3日目に約50%減少し、減少は継続して、形質導入後11日目及び13日目
までに90%に達した(図14C及び図14D)。
び13日目に、RFP形質導入HBV感染初代ヒト肝細胞の上清に存在するHBeAgの
量に対して正規化した(図14)。2.5及び1.25のMOIの両方で、HBV5-6
×.33をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、実験の経過にわたってHB
eAgの着実な減少を示し、RFP対照と比較したときに、3日目に約25%のレベルの
減少、8日目までに約50%の減少、並びに11日目及び13日目までに約90%の減少
を示した(図14C及び図14D)。HBV11-12x.26で形質導入した感染細胞
は、MOIが2.5と1.25の両方で同様のパターンを示し、3日目の時点で類似した
減少(約30%の減少)を示し、それでも依然、形質導入後11日目及び13日目までに
HBeAgの約90%の減少を達成した(図14C及び図14D)。感染細胞を、HBV
メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの1:1混合物で形質導入した場合、HB
eAgの同様の減少が経時的に観察された。2.5及び1.25のMOIでは、レベルは
形質導入後3日目に約50%減少し、減少は継続して、形質導入後11日目及び13日目
までに90%に達した(図14C及び図14D)。
結論
これらのデータは、RFP発現レンチウイルスで形質導入された細胞と比較して、HB
V 5-6×.33若しくはHBV11-12×.26、又はその2つの組み合わせをコ
ードするレンチウイルスで形質導入されたHBV感染初代ヒト肝細胞が、上清のHBsA
g及びHBeAgの劇的な減少を示すことを実証する。感染させた細胞の上清のHBsA
g及びHBeAgのレベルにおける減少は、HBVメガヌクレアーゼのいずれか又は両方
を発現するレンチウイルスで形質導入され、その減少が感染性ウイルスに対するメガヌク
レアーゼの活性に起因することを強く示唆している。
V 5-6×.33若しくはHBV11-12×.26、又はその2つの組み合わせをコ
ードするレンチウイルスで形質導入されたHBV感染初代ヒト肝細胞が、上清のHBsA
g及びHBeAgの劇的な減少を示すことを実証する。感染させた細胞の上清のHBsA
g及びHBeAgのレベルにおける減少は、HBVメガヌクレアーゼのいずれか又は両方
を発現するレンチウイルスで形質導入され、その減少が感染性ウイルスに対するメガヌク
レアーゼの活性に起因することを強く示唆している。
実施例7;LNP封入ヌクレアーゼmRNAの肝臓への送達
脂質ナノ粒子でのmRNAの封入とマウスへの送達
この研究の目的は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする脂質ナノ粒子(L
NP)封入mRNAを作製してインビボで投与でき、肝臓における遺伝子編集が起こり、
観察され得ることを実証することである。
NP)封入mRNAを作製してインビボで投与でき、肝臓における遺伝子編集が起こり、
観察され得ることを実証することである。
マウスの肝臓で発現されるマウスCMP-NeuAcヒドロラーゼ(Cmah)遺伝子
の認識配列に対して特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させた。C
mahメガヌクレアーゼをコードするARCAキャップmRNAをTriLink Bi
oTechnologies LLC(カリフォルニア州サンディエゴ)が作製し、3つ
の異なる市販のLNP製剤に封入しており、各々は様々な比率のイオン性カチオン性脂質
、PEG脂質、及びコレステロールを含む。LNP封入mRNAを、1.0mg/kgの
用量で、IV注射によりCD-1マウスに投与した。投与の6日後に肝臓を採取した。臓
器採取の前に、動物を食塩水で灌流した。全肝臓ゲノムDNA(gDNA)を単離し、C
mah遺伝子における挿入/欠失(インデル)突然変異の頻度を、T7エンドヌクレアー
ゼI(T7E)アッセイ及びディープシーケンシングを用いて判定した。T7Eのアッセ
イでは、Cmah認識配列を含むゲノムの領域をPCR増幅し、その結果、野生型と突然
変異の増幅対立遺伝子の異種混合物が得られた。PCR産物を変性させ、ゆっくりと再ア
ニーリングさせ、野生型と突然変異の対立遺伝子の間のヘテロ二本鎖の形成を可能にした
。そのようなヘテロ二本鎖は、ミスマッチで切断するT7エンドヌクレアーゼIによる切
断を受けやすい。T7E切断産物をゲルで可視化すると、ヘテロ二本鎖のT7E切断に起
因して複数のバンドが存在するが、野生型のサンプルには単一のバンドが存在する。切断
されていない産物に対する切断された産物の比率は、ヌクレアーゼ切断活性のレベルの尺
度を提供する。
の認識配列に対して特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させた。C
mahメガヌクレアーゼをコードするARCAキャップmRNAをTriLink Bi
oTechnologies LLC(カリフォルニア州サンディエゴ)が作製し、3つ
の異なる市販のLNP製剤に封入しており、各々は様々な比率のイオン性カチオン性脂質
、PEG脂質、及びコレステロールを含む。LNP封入mRNAを、1.0mg/kgの
用量で、IV注射によりCD-1マウスに投与した。投与の6日後に肝臓を採取した。臓
器採取の前に、動物を食塩水で灌流した。全肝臓ゲノムDNA(gDNA)を単離し、C
mah遺伝子における挿入/欠失(インデル)突然変異の頻度を、T7エンドヌクレアー
ゼI(T7E)アッセイ及びディープシーケンシングを用いて判定した。T7Eのアッセ
イでは、Cmah認識配列を含むゲノムの領域をPCR増幅し、その結果、野生型と突然
変異の増幅対立遺伝子の異種混合物が得られた。PCR産物を変性させ、ゆっくりと再ア
ニーリングさせ、野生型と突然変異の対立遺伝子の間のヘテロ二本鎖の形成を可能にした
。そのようなヘテロ二本鎖は、ミスマッチで切断するT7エンドヌクレアーゼIによる切
断を受けやすい。T7E切断産物をゲルで可視化すると、ヘテロ二本鎖のT7E切断に起
因して複数のバンドが存在するが、野生型のサンプルには単一のバンドが存在する。切断
されていない産物に対する切断された産物の比率は、ヌクレアーゼ切断活性のレベルの尺
度を提供する。
結果
本研究の結果を図15に示す。レーン1及び2に示されるように、ルシフェラーゼをコ
ードするLNP封入mRNAを投与された対照マウスから得られたgDNAは、Cmah
認識配列での切断の証拠を示さなかった。ルシフェラーゼmRNA処置動物において観察
された切断と非切断の比は、mRNAを投与されていない動物において観察された比に匹
敵した(レーン8)。対照的に、レーン3~7及び9~18はそれぞれ、各レーンに複数
のバンドが存在することによって示されるように、動物に、Cmahメガヌクレアーゼを
コードするLNP封入mRNAを投与した場合のCmah認識配列での改変を示す。Cm
ah認識配列における遺伝子改変の割合を確認及び定量化するために、各肝臓から得られ
たgDNAについてディープシーケンシングも行った。ディープシーケンシングによって
得られた割合は、%KOとして各レーンの下に、図15に示されている。レーン3~7は
、LNP製剤#1を投与した複製動物における3.41%~21.49%の範囲の改変を
示す。レーン9~13は、LNP製剤#2を投与した複製動物における18.4%から2
3.2%の範囲の改変を示す。レーン14~18は、LNP製剤#3を投与した複製動物
における51.1%~64.8%の範囲の改変を示す。
ードするLNP封入mRNAを投与された対照マウスから得られたgDNAは、Cmah
認識配列での切断の証拠を示さなかった。ルシフェラーゼmRNA処置動物において観察
された切断と非切断の比は、mRNAを投与されていない動物において観察された比に匹
敵した(レーン8)。対照的に、レーン3~7及び9~18はそれぞれ、各レーンに複数
のバンドが存在することによって示されるように、動物に、Cmahメガヌクレアーゼを
コードするLNP封入mRNAを投与した場合のCmah認識配列での改変を示す。Cm
ah認識配列における遺伝子改変の割合を確認及び定量化するために、各肝臓から得られ
たgDNAについてディープシーケンシングも行った。ディープシーケンシングによって
得られた割合は、%KOとして各レーンの下に、図15に示されている。レーン3~7は
、LNP製剤#1を投与した複製動物における3.41%~21.49%の範囲の改変を
示す。レーン9~13は、LNP製剤#2を投与した複製動物における18.4%から2
3.2%の範囲の改変を示す。レーン14~18は、LNP製剤#3を投与した複製動物
における51.1%~64.8%の範囲の改変を示す。
結論
この研究は、本発明のHBV特異的メガヌクレアーゼのような遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼをコードするmRNAが、LNPにて封入され、インビボで標的肝細胞(即ち
、肝細胞)に送達され得、ゲノムの標的化された認識配列で遺伝子編集を誘導し得ること
を明白に示している。
クレアーゼをコードするmRNAが、LNPにて封入され、インビボで標的肝細胞(即ち
、肝細胞)に送達され得、ゲノムの標的化された認識配列で遺伝子編集を誘導し得ること
を明白に示している。
Claims (65)
- B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレー
ム(ORF)内の認識配列を認識して切断する、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであ
って、
第1のサブユニット及び第2のサブユニットを含み、
前記第1のサブユニットが前記認識配列の第1の認識した半分の部位に結合し、第1の
超可変(HVR1)領域を含み、
前記第2のサブユニットは、前記認識配列の第2の認識した半分の部位に結合し、第2
の超可変(HVR2)領域を含む、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記認識配列が、遺伝子型A(配列番号3)並びに遺伝子型B(配列番号4)、遺伝子
型C(配列番号5)、遺伝子型D(配列番号6)、遺伝子型E(配列番号7)、遺伝子型
F(配列番号8)、及び遺伝子型G(配列番号9)の1以上のORF内にある、請求項1
に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記認識配列が、ポリメラーゼ(P)タンパク質、大表面(preS1/preS2/
S)タンパク質、中表面(preS2/S)タンパク質、及び小表面(S)タンパク質か
らなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも1つのORF内にある、請
求項1又は2に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記認識配列が配列番号12を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR1領域が、配列番号22~24のいずれか1つの残基215~270又は配
列番号25~28のいずれか1つの残基24~79に対応するアミノ酸配列に対して少な
くとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4に記載の遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR1領域が、配列番号22~24のいずれか1つの残基215、217、21
9、221、223、224、229、231、233、235、237、259、26
1、266、及び268に対応する残基、又は配列番号25~28のいずれか1つの残基
24、26、28、30、32、33、38、40、42、44、46、68、70、7
5、及び77に対応する残基を含む、請求項4又は5に記載の遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼ。 - 前記HVR1領域が、配列番号22~24のいずれか1つの残基215~270又は配
列番号25~28のいずれか1つの残基24~79を含む、請求項4~6のいずれか1項
に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号22~24のいずれか1つの残基24~79又は配列番
号25~28のいずれか1つの残基215~270に対応するアミノ酸配列に対して少な
くとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4~7のいずれか1項に
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号22~24のいずれか1つの残基24、26、28、3
0、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応す
る残基、又は配列番号25~28のいずれか1つの残基215、217、219、221
、223、224、229、231、233、235、237、259、261、266
、及び268に対応する残基を含む、請求項4~8のいずれか1項に記載の遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号22~24のいずれか1つの残基24~79、または配
列番号25~28のいずれか1つの残基215~270を含む、請求項4~9のいずれか
1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号22~24のいずれか1つの残基198~344
又は配列番号25~28のいずれか1つの残基7~153に対して少なくとも80%の配
列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユニットが、配列番号22~24
のいずれか1つの残基7~153又は配列番号25~28のいずれか1つの残基198~
344に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項4~
10のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号22~24のいずれか1つの残基198~344
又は配列番号25~28のいずれか1つの残基7~153を含む、請求項4~11のいず
れか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第2のサブユニットが、配列番号22~24のいずれか1つの残基7~153又は
配列番号25~28のいずれか1つの残基198~344を含む、請求項4~12のいず
れか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - リンカーを含み、前記リンカーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットと
を共有結合で結合させる、請求項4~13のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼ。 - 配列番号22~28のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項4~14のいずれか
1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記認識配列が配列番号16を含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR1領域が、配列番号33~39のいずれか1つの残基215~270に対し
て少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項16に記載の遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR1領域が、配列番号33~39のいずれか1つの残基215、217、21
9、221、223、224、229、231、233、235、237、259、26
1、266、及び268に対応する残基を含む、請求項16又は17に記載の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR1領域が、配列番号33~39のいずれか1つの残基215~270を含む
、請求項16~18のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号33~39のいずれか1つの残基24~79に対して少
なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項16~19のいずれか
1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号33~39のいずれか1つの残基24、26、28、3
0、32、33、38、40、42、44、46、68、70、75、及び77に対応す
る残基を含む、請求項16~20のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼ。 - 前記HVR2領域が、配列番号33~39のいずれか1つの残基24~79を含む、請
求項16~21のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号33~39のいずれか1つの残基198~344
に対して少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第2のサブユ
ニットが、配列番号33~39のいずれか1つの残基7~153に対して少なくとも80
%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項16~22のいずれか1項に記載の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第1のサブユニットが、配列番号33~39のいずれか1つの残基198~344
を含む、請求項16~23のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 前記第2のサブユニットが、配列番号33~39のいずれか1つの残基7~153を含
む、請求項16~24のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - リンカーを含み、前記リンカーが前記第1のサブユニットと前記第2のサブユニットと
を共有結合で結合させる、請求項16~25のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ。 - 配列番号33~39のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項16~26のいずれ
か1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドがmRNAである、請求項28に記載のポリヌクレオチド。
- 前記mRNAが、請求項1~27に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの1以上
をコードするポリシストロニックmRNAである、請求項29に記載のポリヌクレオチド
。 - 前記ポリシストロニックmRNAが、
(a)配列番号12を含む認識配列を認識し切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
;及び
(b)配列番号16を含む認識配列を認識し切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
をコードする、請求項30に記載のポリヌクレオチド。 - 前記ポリシストロニックmRNAが、
(a)請求項4~15のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ;及び
(b)請求項16~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
をコードする、請求項30又は31に記載のポリヌクレオチド。 - 前記ポリシストロニックmRNAが、配列番号22のアミノ酸配列を含む遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードし、且つ配列番号33のアミノ酸配列を含む遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼをコードする、請求項30~32のいずれか1項に記載のポリヌク
レオチド。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸配列を含む、組換えDNA構築物。 - プロモータと請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む、請求項34に記載の組換えDNA構築
物。 - 2以上のカセットを含み、前記カセットの各々が、プロモータと、請求項1~27のい
ずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み、
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの各々が、異なるHBV認識配列に対して特異性
を有する、請求項34に記載の組換えDNA構築物。 - プロモータと、請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼの1以上をコードするポリシストロニック核酸配列と、を含むカセットを含み、前記
プロモータが、前記ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞においてポ
リシストロニックmRNAを生成する、請求項34に記載の組換えDNA構築物。 - 前記ポリシストロニックmRNAが、請求項30~33のいずれか1項に記載のポリシ
ストロニックmRNAである、請求項36に記載の組換えDNA構築物。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る前記核酸配列を含むウイルスベクターをコードする、請求項34に記載の組換えDNA
構築物。 - 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項39に記載の組換えDN
A構築物。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸配列を含む、ウイルスベクター。 - 前記ウイルスベクターが組換えAAVベクターである、請求項41に記載のウイルスベ
クター。 - 前記ウイルスベクターが、プロモータと請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む、請求項41
に記載のウイルスベクター。 - 2以上のカセットを含み、前記カセットの各々が、プロモータと、請求項1~27のい
ずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列と、を含み
、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの各々が、異なるHBV認識配列に対して特異
性を有する、請求項41に記載のウイルスベクター。 - プロモータと、請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼの1以上をコードするポリシストロニック核酸配列と、を含むカセットを含み、前記
プロモータが、前記ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞においてポ
リシストロニックmRNAを生成する、請求項41に記載のウイルスベクター。 - 前記ポリシストロニックmRNAが、請求項30~33のいずれか1項に記載の前記ポ
リシストロニックmRNAである、請求項45に記載のウイルスベクター。 - B型肝炎ウイルス(HBV)又はHBVに起因する肝細胞がんを有する対象を治療する
ための医薬組成物であって、医薬的に許容される担体、及び
(a)請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸;又は
(b)請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ;
を含む、医薬組成物。 - 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸が、請求項29~33の
いずれか1項に記載の前記mRNAである、請求項47に記載の医薬組成物。 - 請求項34~40のいずれか1項に記載の組換えDNA構築物を含む、請求項47に記
載の医薬組成物。 - 請求項41~46のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含む、請求項47に記載
の医薬組成物。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを含む、請
求項47に記載の医薬組成物。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの2以上を
含み、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、異なるHBV認識配列に対して特異性
を有する、請求項47に記載の医薬組成物。 - 請求項1~27のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの2以上を
コードする2以上の核酸を含み、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、異なるHB
V認識配列に対して特異性を有する、請求項47に記載の医薬組成物。 - 脂質ナノ粒子内に封入されている請求項29~33のいずれか1項に記載の前記mRN
Aの1以上を含む、請求項47に記載の医薬組成物。 - HBVを有する対象を治療する方法であって、前記対象の標的細胞に、
(a)遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし、前記標的細胞においてインビボで
発現される核酸;又は
(b)遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ;
を送達することを含み、
前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、B型肝炎ウイルスの少なくとも2つの遺伝
子型のゲノムのORF中の認識配列に対する特異性を有し、前記遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、前記標的細胞中の前記認識配列を認識し切断し、前記対象におけるHBV
の感染及び/又は増殖が減少又は排除される方法。 - 前記認識配列が、遺伝子型A、並びに遺伝子型B(配列番号4)、遺伝子型C(配列番
号5)、遺伝子型D(配列番号6)、遺伝子型E(配列番号7)、遺伝子型F(配列番号
8)、及び遺伝子型G(配列番号9)の1以上のORF内にある、請求項55に記載の方
法。 - 前記認識配列が、B型肝炎ウイルスの少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5
つ、又は少なくとも6つの遺伝子型のORF内に見出される、請求項55又は56に記載
の方法。 - 前記認識配列が、ポリメラーゼ(P)タンパク質、大表面(preS1/preS2/
S)タンパク質、中表面(preS2/S)タンパク質、及び小表面(S)タンパク質か
らなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも1つのORF内にある、請
求項55~57のいずれか1項に記載の方法。 - 前記認識配列が配列番号12、配列番号16、配列番号10、又は配列番号14を含む
、請求項55~58のいずれか1項に記載の方法。 - 前記認識配列が配列番号12を含む、請求項55~59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、請求項4~15のいずれか1項に記載の遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼである、請求項55~59のいずれか1項に記載の方法
。 - 前記認識配列が配列番号16を含む、請求項55~59のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、請求項16~27のいずれか1項に記載の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである、請求項62に記載の方法。 - 前記対象に請求項47~54のいずれか1項に記載の医薬組成物を投与することを含む
、請求項55~63のいずれか1項に記載の方法。 - 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを
コードする前記核酸が、標的肝細胞に送達される、請求項55~64のいずれか1項に記
載の方法。
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WO2009001159A1 (en) | 2007-06-25 | 2008-12-31 | Cellectis | Method for enhancing the cleavage activity of i-crei derived meganucleases |
US8748373B2 (en) * | 2007-02-21 | 2014-06-10 | Fox Chase Cancer Center | Hepatitis B virus compositions and methods of use |
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AU2008318430A1 (en) | 2007-10-31 | 2009-05-07 | Precision Biosciences, Inc. | Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences |
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CN103732238A (zh) | 2011-06-08 | 2014-04-16 | 奥瑞基尼探索技术有限公司 | 用于免疫调节的治疗性化合物 |
JP6165723B2 (ja) * | 2011-06-30 | 2017-07-19 | アローヘッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | B型肝炎ウイルスの遺伝子発現を阻害するための組成物および方法 |
US20140120106A1 (en) * | 2011-07-06 | 2014-05-01 | Yale University | Stimulation of Arterial Collateral Growth and Lymphogenesis |
MX353548B (es) | 2011-11-29 | 2018-01-18 | Ono Pharmaceutical Co | Clorhidrato derivado de purinona. |
EA037918B1 (ru) | 2011-12-21 | 2021-06-07 | Новира Терапьютикс, Инк. | Противовирусные агенты против гепатита в |
EA039373B1 (ru) | 2012-02-08 | 2022-01-19 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Юси | Производные пиперидино-пиримидина для лечения вирусных инфекций |
WO2013132317A1 (en) | 2012-03-07 | 2013-09-12 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Peptidomimetic compounds as immunomodulators |
CN104245726A (zh) | 2012-03-29 | 2014-12-24 | 奥瑞基尼探索技术有限公司 | 来自人pd1的bc环的免疫调节环状化合物 |
US20130267517A1 (en) | 2012-03-31 | 2013-10-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel 4-methyl-dihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
WO2013144129A1 (en) | 2012-03-31 | 2013-10-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel 4-methyl-dihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
WO2013159109A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression |
SG11201407190TA (en) | 2012-05-15 | 2014-12-30 | Bristol Myers Squibb Co | Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling |
AR091279A1 (es) | 2012-06-08 | 2015-01-21 | Gilead Sciences Inc | Inhibidores macrociclicos de virus flaviviridae |
MX2014014766A (es) | 2012-06-08 | 2015-05-11 | Gilead Sciences Inc | Inhibidores macrociclicos de virus flaviviridae. |
PL2859009T3 (pl) | 2012-06-08 | 2018-03-30 | Gilead Sciences, Inc. | Makrocykliczne inhibitory wirusów flaviviridae |
CN109232439A (zh) | 2012-08-10 | 2019-01-18 | 爱尔兰詹森科学公司 | 用于治疗病毒感染和另外的疾病的烷基嘧啶衍生物 |
UA123256C2 (uk) | 2012-08-28 | 2021-03-10 | ЯНССЕН САЙЄНСІЗ АЙРЛЕНД ЮСі | Сульфамоїлариламіди та їх застосування як лікарських препаратів для лікування гепатиту b |
PL2890683T3 (pl) | 2012-08-28 | 2017-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Pochodne skondensowanego bicyklicznego sulfamylu i ich zastosowanie jako leki do leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu B |
MA37942B1 (fr) | 2012-09-10 | 2020-01-31 | Hoffmann La Roche | Hétéroaryldihydropyrimidines d'acide 6-aminé pour le traitement et la prophylaxie d'une infection par le virus de l'hépatite b |
PL2903968T3 (pl) | 2012-10-02 | 2017-05-31 | Gilead Sciences, Inc. | Inhibitory demetylaz histonowych |
NZ705589A (en) | 2012-10-10 | 2019-05-31 | Janssen Sciences Ireland Uc | Pyrrolo[3,2-d]pyrimidine derivatives for the treatment of viral infections and other diseases |
US9663474B2 (en) | 2012-11-16 | 2017-05-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Heterocyclic substituted 2-amino quinazoline derivatives for the treatment of viral infections |
WO2014089364A1 (en) | 2012-12-06 | 2014-06-12 | Quanticel Pharmaceuticals, Inc | Histone demethylase inhibitors |
RS56821B1 (sr) | 2012-12-19 | 2018-04-30 | Celgene Quanticel Research Inc | Inhibitori histon demetilaze |
SG11201504946VA (en) | 2012-12-21 | 2015-07-30 | Quanticel Pharmaceuticals Inc | Histone demethylase inhibitors |
US9598378B2 (en) | 2013-02-21 | 2017-03-21 | Janssen Sciences Ireland Uc | 2-aminopyrimidine derivatives for the treatment of viral infections |
JP6514117B2 (ja) | 2013-02-27 | 2019-05-15 | エピセラピューティクス アーペーエス | ヒストン脱メチル化酵素の阻害剤 |
HUE034820T2 (en) | 2013-02-28 | 2018-02-28 | Janssen Sciences Ireland Uc | Sulphamoyl arylamides and their use as medicaments for the treatment of hepatitis B |
WO2014164708A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Quanticel Pharmaceuticals, Inc. | Histone dementhylase inhibitors |
WO2014165128A2 (en) | 2013-03-12 | 2014-10-09 | Novira Therapeutics, Inc. | Hepatitis b antiviral agents |
JP6660182B2 (ja) | 2013-03-13 | 2020-03-11 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ピラゾロ化合物及びその使用 |
AU2014236711A1 (en) | 2013-03-14 | 2015-09-17 | Celgene Quanticel Research, Inc. | Histone demethylase inhibitors |
US9308236B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-04-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions |
JP6332654B2 (ja) | 2013-03-15 | 2018-05-30 | セルジーン クオンティセル リサーチ,インク. | ヒストンデメチラーゼ阻害剤 |
ES2640063T3 (es) | 2013-04-03 | 2017-10-31 | Janssen Sciences Ireland Uc | Derivados de n-fenil-carboxamida y su uso como medicamentos para el tratamiento de la hepatitis B |
JP2016518140A (ja) | 2013-05-03 | 2016-06-23 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | I型インターフェロンの環状ジヌクレオチド誘導法 |
AU2014267235B2 (en) | 2013-05-17 | 2017-10-05 | Janssen Sciences Ireland Uc | Sulphamoylthiophenamide derivatives and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis B |
JO3603B1 (ar) | 2013-05-17 | 2020-07-05 | Janssen Sciences Ireland Uc | مشتقات سلفامويل بيرولاميد واستخدامها كادوية لمعالجة التهاب الكبد نوع بي |
US9266904B2 (en) | 2013-05-17 | 2016-02-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | 6-bridged heteroaryldihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis B virus infection |
JP6348978B2 (ja) | 2013-07-25 | 2018-06-27 | ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー | グリオキサミド置換ピロールアミド誘導体およびb型肝炎を処置するための医薬品としてのその使用 |
JP6401788B2 (ja) | 2013-07-30 | 2018-10-10 | ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー | ウイルス感染治療用チエノ[3,2−d]ピリミジン誘導体 |
JP2016527303A (ja) | 2013-08-05 | 2016-09-08 | ケンブリッジ エンタープライズ リミテッド | がん免疫療法におけるcxcr4シグナル伝達の阻害 |
WO2015023958A1 (en) | 2013-08-15 | 2015-02-19 | The University Of Kansas | Toll-like receptor agonists |
BR112016004194A8 (pt) | 2013-09-04 | 2020-02-11 | Bristol Myers Squibb Co | compostos úteis como imunomoduladores |
KR20160081898A (ko) | 2013-09-06 | 2016-07-08 | 오리진 디스커버리 테크놀로지스 리미티드 | 면역조절제로서 1,3,4-옥사디아졸 및 1,3,4-티아디아졸 유도체 |
HUE038169T2 (hu) | 2013-09-06 | 2018-09-28 | Aurigene Discovery Tech Ltd | 1,2,4-Oxadiazol származékok mint immunomodulátorok |
PT3041468T (pt) | 2013-09-06 | 2018-09-28 | Aurigene Discovery Tech Ltd | Compostos peptidomiméticos cíclicos como imunomoduladores |
WO2015036927A1 (en) | 2013-09-10 | 2015-03-19 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Immunomodulating peptidomimetic derivatives |
EP3711762A1 (en) | 2013-09-11 | 2020-09-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | A farnesoid x receptor agonsits foruse and pharmaceutical compositions for the treatment of chronic hepatitis b virus infection |
WO2015044900A1 (en) | 2013-09-27 | 2015-04-02 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Therapeutic immunomodulating compounds |
KR102365952B1 (ko) | 2013-10-14 | 2022-02-22 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 선택적으로 치환된 퀴놀린 화합물 |
KR102103256B1 (ko) | 2013-10-14 | 2020-04-23 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 선택적으로 치환된 퀴놀린 화합물 |
ES2655518T3 (es) | 2013-10-23 | 2018-02-20 | Janssen Sciences Ireland Uc | Derivados de carboxamida y su uso como medicamentos para el tratamiento de la hepatitis B |
ES2777248T3 (es) | 2013-11-14 | 2020-08-04 | Novira Therapeutics Inc | Derivados de azepano y métodos de tratar infecciones por hepatitis B |
AU2014361784A1 (en) * | 2013-12-12 | 2016-06-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR-Cas systems and compositions for HBV and viral diseases and disorders |
CA2933466A1 (en) | 2013-12-13 | 2015-06-18 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Pyrrolo[3,2-c]pyridine derivatives as tlr inhibitors |
US10654807B2 (en) | 2013-12-20 | 2020-05-19 | The University Of Kansas | Toll-like receptor 8 agonists |
US9169212B2 (en) | 2014-01-16 | 2015-10-27 | Novira Therapeutics, Inc. | Azepane derivatives and methods of treating hepatitis B infections |
US9181288B2 (en) | 2014-01-16 | 2015-11-10 | Novira Therapeutics, Inc. | Azepane derivatives and methods of treating hepatitis B infections |
SG11201605970QA (en) | 2014-01-30 | 2016-08-30 | Hoffmann La Roche | Novel dihydroquinolizinones for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
AU2015214404B2 (en) | 2014-02-04 | 2020-10-01 | Incyte Corporation | Combination of a PD-1 antagonist and an IDO1 inhibitor for treating cancer |
CN110483484A (zh) | 2014-02-06 | 2019-11-22 | 爱尔兰詹森科学公司 | 氨磺酰基吡咯酰胺衍生物及其作为药物用于治疗乙型肝炎的用途 |
US20170088626A1 (en) | 2014-03-05 | 2017-03-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Treatment of renal cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and another anti-cancer agent |
DK3114128T3 (en) | 2014-03-07 | 2019-03-25 | Hoffmann La Roche | New 6-fused heteroaryld dihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis B virus infection |
US9400280B2 (en) | 2014-03-27 | 2016-07-26 | Novira Therapeutics, Inc. | Piperidine derivatives and methods of treating hepatitis B infections |
US9850225B2 (en) | 2014-04-14 | 2017-12-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Compounds useful as immunomodulators |
PT3134402T (pt) | 2014-04-22 | 2020-07-02 | Hoffmann La Roche | Compostos de 4-amino-imidazoquinolina |
NZ724878A (en) | 2014-05-01 | 2019-03-29 | Novartis Ag | Compounds and compositions as toll-like receptor 7 agonists |
CR20160512A (es) | 2014-05-01 | 2016-12-21 | Novartis Ag | Compuestos y composiciones como agonistas del receptor tipo toll 7 |
WO2015173164A1 (en) | 2014-05-13 | 2015-11-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel dihydroquinolizinones for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
CN106572993B (zh) | 2014-05-23 | 2019-07-16 | 卫材R&D管理有限公司 | Ep4拮抗剂在制备治疗癌症的药物中的应用 |
JP2017518372A (ja) | 2014-05-30 | 2017-07-06 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 潜伏性ウイルス感染用の処置剤を送達するための組成物および方法 |
US10987322B2 (en) | 2014-06-06 | 2021-04-27 | Flexus Biosciences, Inc. | Immunoregulatory agents |
WO2016012470A1 (en) | 2014-07-25 | 2016-01-28 | F. Hoffmann-La Roche Ag | New amorphous and crystalline forms of (3s)-4-[[(4r)-4-(2-chloro-4-fluoro-phenyl)-5-methoxycarbonyl-2-thiazol-2-yl-1, 4-dihydropyrimidin-6-yl]methyl]morpholine-3-carboxylic acid |
WO2016019232A1 (en) | 2014-08-01 | 2016-02-04 | John Vasilakos | Methods and therapeutic combinations for treating tumors |
EP3180319B1 (en) | 2014-08-14 | 2018-10-03 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Novel pyridazones and triazinones for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
EA032824B1 (ru) | 2014-08-15 | 2019-07-31 | Чиа Тай Тяньцин Фармасьютикал Груп Ко., Лтд. | Пирролопиримидиновые соединения, используемые в качестве агониста tlr7 |
EP3398948A3 (en) | 2014-08-22 | 2018-12-05 | Janus Biotherapeutics, Inc. | 2,4,6,7-tetrasubstituted pteridine compounds and methods of synthesis and use thereof |
EA201790154A1 (ru) | 2014-08-27 | 2017-08-31 | Джилид Сайэнс, Инк. | Соединения и способы для ингибирования гистоновых деметилаз |
US9884866B2 (en) | 2014-09-08 | 2018-02-06 | Regents Of The University Of Minnesota | Immunomodulators and immunomodulator conjugates |
CA2960778C (en) | 2014-09-11 | 2023-03-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions |
US9732119B2 (en) | 2014-10-10 | 2017-08-15 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
JP6783230B2 (ja) | 2014-10-10 | 2020-11-11 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | ヒストンデメチラーゼのインヒビターとしてのピロリドンアミド化合物 |
CN107001386A (zh) | 2014-10-11 | 2017-08-01 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于治疗感染性疾病的化合物 |
US9637485B2 (en) | 2014-11-03 | 2017-05-02 | Hoffmann-La Roche Inc. | 6,7-dihydrobenzo[a]quinolizin-2-one derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis B virus infection |
UY36390A (es) | 2014-11-05 | 2016-06-01 | Flexus Biosciences Inc | Compuestos moduladores de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (ido), sus métodos de síntesis y composiciones farmacéuticas que los contienen |
CN107205970A (zh) | 2014-11-05 | 2017-09-26 | 弗莱塞斯生物科学公司 | 免疫调节剂 |
CA2967248A1 (en) | 2014-11-13 | 2016-05-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adenine derivatives which are useful in the treatment of allergic diseases or other inflammatory conditions |
US9856292B2 (en) | 2014-11-14 | 2018-01-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
RS61612B1 (sr) | 2014-12-08 | 2021-04-29 | Hoffmann La Roche | 3-supstituisana 5-amino-6h-tiazolo[4,5-d]pirimidin-2,7-dion jedinjenja za lečenje i profilaksu virusne infekcije |
US9861680B2 (en) | 2014-12-18 | 2018-01-09 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
WO2016096778A1 (en) | 2014-12-18 | 2016-06-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Benzazepine sulfonamide compounds |
US9944678B2 (en) | 2014-12-19 | 2018-04-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
WO2016102438A1 (en) | 2014-12-23 | 2016-06-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for the preparation of 4-phenyl-5-alkoxycarbonyl-2-thiazol-2-yl-1,4-dihydropyrimidine analogues |
US9676793B2 (en) | 2014-12-23 | 2017-06-13 | Hoffmann-Laroche Inc. | Co-crystals of 5-amino-2-oxothiazolo[4,5-d]pyrimidin-3(2H)-yl-5-hydroxymethyl tetrahydrofuran-3-yl acetate and methods for preparing and using the same |
CN105732635A (zh) | 2014-12-29 | 2016-07-06 | 南京明德新药研发股份有限公司 | 一类Toll样受体7激动剂 |
CN107108610B (zh) | 2014-12-30 | 2019-06-04 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于治疗和预防肝炎b病毒感染的新的四氢吡啶并嘧啶和四氢吡啶并吡啶化合物 |
US9518057B2 (en) | 2014-12-30 | 2016-12-13 | Novira Therapeutics, Inc. | Derivatives and methods of treating hepatitis B infections |
EP3240913A1 (en) | 2014-12-31 | 2017-11-08 | F. Hoffmann-La Roche AG | A novel high-throughput method for quantification of hbv cccdna from cell lysate by real-time pcr |
MA41338B1 (fr) | 2015-01-16 | 2019-07-31 | Hoffmann La Roche | Composés de pyrazine pour le traitement de maladies infectieuses |
WO2016120186A1 (en) | 2015-01-27 | 2016-08-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant hbv cccdna, the method to generate thereof and the use thereof |
US20160222060A1 (en) | 2015-02-04 | 2016-08-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
CN107207505B (zh) | 2015-02-11 | 2018-12-14 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 治疗和预防乙型肝炎病毒感染的 2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸衍生物 |
CA2978188C (en) | 2015-03-04 | 2020-05-12 | Gilead Sciences, Inc. | Toll-like receptor modulating 4,6-diamino-pyrido[3,2-d]pyrimidine compounds |
MY191185A (en) | 2015-03-06 | 2022-06-04 | Hoffmann La Roche | Benzazepine dicarboxamide compounds |
JP2018513118A (ja) | 2015-03-10 | 2018-05-24 | オーリジーン ディスカバリー テクノロジーズ リミテッドAurigene Discovery Technologies Limited | 免疫調節剤としての治療性環式化合物 |
CA2979161A1 (en) | 2015-03-10 | 2016-09-15 | Aurigene Discovery Technologies Limited | 3-substituted-1,2,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators |
CN107427497A (zh) | 2015-03-10 | 2017-12-01 | 奥瑞基尼探索技术有限公司 | 作为免疫调节剂的3‑取代的1,3,4‑噁二唑和噻二唑化合物 |
BR112017019306A2 (pt) | 2015-03-10 | 2018-05-08 | Aurigene Discovery Technologies Limited | compostos de 1,3,4-oxadiazol e tiadiazol como imunomoduladores |
MY196130A (en) | 2015-03-10 | 2023-03-16 | Aurigene Discovery Tech Ltd | 1,2,4-Oxadiazole and Thiadiazole Compounds as Immunomodulators |
US9809625B2 (en) | 2015-03-18 | 2017-11-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
WO2016161268A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Enanta Pharmaceuticals, Inc. | Hepatitis b antviral agents |
EP3283472B1 (en) | 2015-04-17 | 2021-04-14 | Indiana University Research & Technology Corporation | Hepatitis b viral assembly effectors |
JP6462155B2 (ja) | 2015-05-04 | 2019-01-30 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft | B型肝炎ウイルス感染症の治療用のHBsAg(HBV表面抗原)及びHBV DNA産生の阻害剤としてのテトラヒドロピリドピリミジン類及びテトラヒドロピリドピリジン類 |
CN107592864B (zh) | 2015-05-12 | 2021-04-16 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于治疗和预防病毒感染的新的取代的氨基噻唑并嘧啶二酮 |
WO2016195982A2 (en) | 2015-06-01 | 2016-12-08 | The Penn State Research Foundation | Hepatitis b virus capsid assembly |
GB201511477D0 (en) | 2015-06-30 | 2015-08-12 | Redx Pharma Plc | Antiviral compounds |
WO2017001307A1 (en) | 2015-06-30 | 2017-01-05 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel substituted aminothiazolopyrimidinedione for the treatment and prophylaxis of virus infection |
US10875876B2 (en) | 2015-07-02 | 2020-12-29 | Janssen Sciences Ireland Uc | Cyclized sulfamoylarylamide derivatives and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis B |
WO2017007701A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-12 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Antiviral phosphodiamide compounds |
WO2017013046A1 (en) | 2015-07-21 | 2017-01-26 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel tricyclic 4-pyridone-3-carboxylic acid derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
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EP3433249B1 (en) | 2016-03-21 | 2022-11-09 | Council Of Scientific & Industrial Research | Blocking toll-like receptor 9 signaling with small molecule antagonist |
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US10533007B2 (en) | 2016-04-19 | 2020-01-14 | Innate Tumor Immunity, Inc. | NLRP3 modulators |
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WO2017186711A1 (en) | 2016-04-25 | 2017-11-02 | Invivogen | Novel complexes of immunostimulatory compounds, and uses thereof |
WO2017192741A1 (en) * | 2016-05-03 | 2017-11-09 | Precision Biosciences, Inc. | Engineered nucleases useful for treatment of hemophilia a |
AR108396A1 (es) | 2016-05-06 | 2018-08-15 | Incyte Corp | Compuestos heterocíclicos como inmunomoduladores |
PT3453707T (pt) | 2016-05-06 | 2022-03-15 | Shanghai De Novo Pharmatech Co Ltd | Derivado de benzazepina, método de preparação, composição farmacêutica e a sua utilização |
EP3458455B1 (en) | 2016-05-20 | 2021-06-16 | F. Hoffmann-La Roche AG | Novel pyrazine compounds with oxygen, sulfur and nitrogen linker for the treatment of infectious diseases |
JP6918838B2 (ja) | 2016-05-23 | 2021-08-11 | エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 第三級アミド基を有するベンズアゼピンジカルボキサミド化合物 |
JP7022702B2 (ja) | 2016-05-23 | 2022-02-18 | エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト | 第二級アミド基を有するベンズアゼピンジカルボキサミド化合物 |
EP3464279B1 (en) | 2016-05-26 | 2021-11-24 | Incyte Corporation | Heterocyclic compounds as immunomodulators |
WO2017202798A1 (en) | 2016-05-26 | 2017-11-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Xanthone derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus disease |
WO2017211791A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Combination therapy of an hbsag inhibitor and a tlr7 agonist |
SG11201810834WA (en) | 2016-06-10 | 2018-12-28 | Enanta Pharm Inc | Hepatitis b antiviral agents |
WO2017216054A1 (en) | 2016-06-12 | 2017-12-21 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dihydropyrimidinyl benzazepine carboxamide compounds |
WO2017216686A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Novartis Ag | 8,9-fused 2-oxo-6,7-dihydropyrido-isoquinoline compounds as antivirals |
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TWI771305B (zh) | 2016-06-20 | 2022-07-21 | 美商英塞特公司 | 作為免疫調節劑之雜環化合物 |
WO2017219931A1 (zh) | 2016-06-22 | 2017-12-28 | 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 | 二氢蝶啶酮类衍生物、其制备方法及其用途 |
US10071079B2 (en) | 2016-06-29 | 2018-09-11 | Bristol-Myers Squibb Company | [1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridinyl substituted indole compounds |
WO2018001944A1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel dihydropyrrolopyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection |
AU2017290755B2 (en) | 2016-06-29 | 2021-07-01 | Novira Therapeutics, Inc. | Diazepinone derivatives and their use in the treatment of hepatitis B infections |
WO2018001952A1 (en) | 2016-06-29 | 2018-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel tetrahydropyridopyrimidines for the treatment and prophylaxis of hbv infection |
JP6935434B2 (ja) | 2016-06-29 | 2021-09-15 | ノヴィラ・セラピューティクス・インコーポレイテッド | オキサジアゼピノン誘導体及びb型肝炎感染症の治療におけるその使用 |
KR102468272B1 (ko) | 2016-06-30 | 2022-11-18 | 삼성전자주식회사 | 음향 출력 장치 및 그 제어 방법 |
CA3027471A1 (en) | 2016-07-01 | 2018-01-04 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Dihydropyranopyrimidines for the treatment of viral infections |
WO2018009466A1 (en) | 2016-07-05 | 2018-01-11 | Aduro Biotech, Inc. | Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof |
US10590105B2 (en) | 2016-07-08 | 2020-03-17 | Bristol-Meyers Squibb Company | 1,3-dihydroxy-phenyl derivatives useful as immunomodulators |
WO2018011100A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel tetrahydropyrazolopyridine compounds for the treatment of infectious diseases |
JP7034133B2 (ja) | 2016-07-14 | 2022-03-11 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | 感染性疾患の処置のためのカルボキシ 6,7-ジヒドロ-4H-ピラゾロ[1,5-a]ピラジン化合物 |
WO2018011163A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | 6,7-dihydro-4h-pyrazolo[1,5-a]pyrazine and 6,7-dihydro-4h-triazolo[1,5-a]pyrazine compounds for the treatment of infectious diseases |
WO2018013789A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-18 | Incyte Corporation | Heterocyclic compounds as immunomodulators |
WO2018011160A1 (en) | 2016-07-14 | 2018-01-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | 6,7-dihydro-4h-pyrazolo[1,5-a]pyrazine compounds for the treatment of infectious diseases |
WO2018019297A1 (zh) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 银杏树药业(苏州)有限公司 | 异喹啉酮类化合物及其制备抗病毒药物的应用 |
WO2018022282A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Newave Pharmaceutical Inc. | Novel therapeutic agents for the treatment of hbv infection |
AU2017307208B2 (en) | 2016-07-30 | 2021-01-21 | Bristol-Myers Squibb Company | Dimethoxyphenyl substituted indole compounds as TLR7, TLR8 or TLR9 inhibitors |
EP3493804A1 (en) | 2016-08-03 | 2019-06-12 | Arising International, Inc. | Symmetric or semi-symmetric compounds useful as immunomodulators |
DK3497094T3 (da) | 2016-08-08 | 2023-05-15 | Merck Patent Gmbh | Tlr7/8-antagonister og anvendelser deraf |
CN109689059A (zh) | 2016-08-24 | 2019-04-26 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | Hbv衣壳组装抑制剂和核苷或核苷酸类似物的组合疗法 |
EP3504215B1 (en) | 2016-08-26 | 2022-04-06 | 3M Innovative Properties Company | Fused [1,2]imidazo[4,5-c]ring compounds substituted with guanidino groups |
US20180057486A1 (en) | 2016-08-29 | 2018-03-01 | Incyte Corporation | Heterocyclic compounds as immunomodulators |
US10144706B2 (en) | 2016-09-01 | 2018-12-04 | Bristol-Myers Squibb Company | Compounds useful as immunomodulators |
US10640499B2 (en) | 2016-09-02 | 2020-05-05 | Gilead Sciences, Inc. | Toll like receptor modulator compounds |
WO2018045144A1 (en) | 2016-09-02 | 2018-03-08 | Gilead Sciences, Inc. | Toll like receptor modulator compounds |
WO2018043747A1 (ja) | 2016-09-05 | 2018-03-08 | 国立大学法人京都大学 | 抗b型肝炎ウイルス剤 |
EP3510036B1 (en) | 2016-09-07 | 2021-07-21 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Imidazoquinoline derivatives and their use in therapy |
TWI670266B (zh) | 2016-09-09 | 2019-09-01 | 大陸商浙江海正藥業股份有限公司 | 二氫嘧啶類化合物及其製備方法和用途 |
CA3031585A1 (en) | 2016-09-09 | 2018-03-15 | Novartis Ag | Compounds and compositions as inhibitors of endosomal toll-like receptors |
EP3510024B1 (en) | 2016-09-09 | 2021-11-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Pyridyl substituted indole compounds |
WO2018051254A1 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Cyclic substituted-1,2,4-oxadiazole compounds as immunomodulators |
WO2018051255A1 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Aurigene Discovery Technologies Limited | Cyclic substituted-1,3,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators |
US10537590B2 (en) | 2016-09-30 | 2020-01-21 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Cyclic dinucleotide compounds |
HUE056502T2 (hu) | 2016-10-04 | 2022-02-28 | Merck Sharp & Dohme | Benzo[b]tiofén vegyületek mint STING agonisták |
US11001605B2 (en) | 2016-10-07 | 2021-05-11 | Biolog Life Science Institute Gmbh & Co. Kg | Cyclic dinucleotides containing benzimidazole, method for the production of same, and use of same to activate stimulator of interferon genes (sting)-dependent signaling pathways |
CR20190181A (es) | 2016-10-14 | 2019-08-21 | Prec Biosciences Inc | Meganucleasas diseñadas específicamente para el reconocimiento de secuencias en el genoma del virus de la hepatitis b. |
EA201990997A1 (ru) | 2016-10-20 | 2019-08-30 | Ориджин Дискавери Текнолоджиз Лимитед | Двойные ингибиторы vista и путей pd-1 |
EP3532069A4 (en) | 2016-10-26 | 2020-05-13 | Merck Sharp & Dohme Corp. | ARYL-AMIDE PHOSPHODIAMIDE COMPOUNDS ANTIVIRALS |
WO2018078149A1 (en) | 2016-10-31 | 2018-05-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Novel cyclicsulfonimidoylpurinone compounds and derivatives for the treatment and prophylaxis of virus infection |
WO2018085750A2 (en) | 2016-11-07 | 2018-05-11 | Bristol-Myers Squibb Company | Immunomodulators |
WO2018089695A1 (en) | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Dynavax Technologies Corporation | Toll-like receptor antagonist compounds and methods of use |
US11084818B2 (en) | 2016-11-11 | 2021-08-10 | Hepo Pharmaceutical Co., Ltd. | Nitrogen-containing heterocyclic compound, preparation method, intermediate, pharmaceutical composition and use |
JOP20170188A1 (ar) | 2016-11-25 | 2019-01-30 | Janssen Biotech Inc | ثنائي النوكليوتيدات الحلقية كمنبهات ستينغ (sting) |
PT3546457T (pt) | 2016-11-28 | 2021-08-06 | Jiangsu Hengrui Medicine Co | Derivado de pirazolo-heteroarílico, método de preparação e a utilização médica do mesmo |
JOP20170192A1 (ar) | 2016-12-01 | 2019-01-30 | Takeda Pharmaceuticals Co | داي نوكليوتيد حلقي |
AU2017378783A1 (en) | 2016-12-20 | 2019-07-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Cyclic dinucleotide sting agonists for cancer treatment |
RU2019122602A (ru) | 2016-12-20 | 2021-01-22 | Мерк Шарп И Доум Корп. | Комбинации антагонистов pd-1 и циклических динуклеотидных агонистов sting для лечения рака |
EP3558970B1 (en) | 2016-12-20 | 2021-09-01 | Bristol-Myers Squibb Company | Compounds useful as immunomodulators |
US10519159B2 (en) | 2016-12-22 | 2019-12-31 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Antiviral aliphatic ester prodrugs of tenofovir |
WO2018119263A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Incyte Corporation | Heterocyclic compounds derivatives as pd-l1 internalization inducers |
WO2018119286A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Incyte Corporation | Bicyclic heteroaromatic compounds as immunomodulators |
CA3046029A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Antiviral benzyl-amine phosphodiamide compounds |
WO2018119221A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Incyte Corporation | Pyridine derivatives as immunomodulators |
WO2018119266A1 (en) | 2016-12-22 | 2018-06-28 | Incyte Corporation | Benzooxazole derivatives as immunomodulators |
ES2874756T3 (es) | 2016-12-22 | 2021-11-05 | Incyte Corp | Derivados de triazolo[1,5-A]piridina como inmunomoduladores |
WO2018199338A1 (ja) | 2017-04-27 | 2018-11-01 | 国立大学法人広島大学 | B型肝炎治療用核酸分子 |
US11142750B2 (en) | 2018-04-12 | 2021-10-12 | Precision Biosciences, Inc. | Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the Hepatitis B virus genome |
-
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