JP2023153824A - Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの認識配列に特異的な遺伝子操作メガヌクレアーゼ - Google Patents

Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの認識配列に特異的な遺伝子操作メガヌクレアーゼ Download PDF

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Abstract

【課題】Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの認識配列に特異的な遺伝子操作メガヌクレアーゼを提供する。【解決手段】Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認識配列を認識して切断する、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであって、第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、前記第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識した半分の部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識した半分の部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、腫瘍学、分子生物学、及び組換え核酸技術の分野に関する。特に、本発明は
、Ｂ型肝炎ウイルスゲノムの少なくとも２つの遺伝子型の中の認識配列に対する特異性を
有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼに関する。そのような遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの感染及びＢ型肝炎ウイルスによって引き起こされる肝
細胞がんを治療するための方法において有用である。
ＥＦＳ－ＷＥＢを介したテキストファイルとして提出された配列表への言及
本願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩのフォーマットで提出された配列表を含み
、その全体は参照により本明細書に組み入れられる。２０１７年１０月１３日に作成され
た上記のＡＳＣＩＩのコピーは、Ｐ１０９０７００１８ＷＯ００－ＳＥＱ－ＭＪＴ．ｔｘ
ｔという名前で、サイズは１６９，０１１バイトである。
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は世界的に大きな健康問題であり、３億５千万人を超える
人々が慢性的なキャリアである。ＨＢＶ感染症は、肝臓の深刻且つ一般的な感染症である
。慢性感染症は、肝硬変及びヒトのがんの最も一般的な形態の１つである肝細胞がん（Ｈ
ＣＣ）を含む、重篤な肝疾患を発症するリスクの増大と関連している。慢性ＨＢＶキャリ
アにおけるＨＣＣの推定のリスクは、感染していない個人におけるよりも約１００倍大き
い。世界の人口の約３分の１が、生きている一時点で感染しており、それは２億４千万人
から３億５千万人の慢性感染症を含んでいる。毎年７５万人を超える人々がＢ型肝炎で死
亡している。これらのうち約３０万人が肝がんによる。現在入手可能な抗ＨＢＶ薬には限
界がある。例えば、インターフェロンアルファの投与は重篤な有害反応と関連している。
ヌクレオシド類似体は、静ウイルス性であり、長期の投与が必要となる。
ＨＢＶゲノムは、１つの部位あたり１年につき１．４～３．２×１０－５ヌクレオチド
置換という推定速度での遺伝的多様性を示す。ウイルスのポリメラーゼによるいずれかの
プルーフリーディング能力の不在下でヌクレオチドを誤った取り込んだ結果として、複製
している間、多数のウイルス変異体が生じる。その多様性により、ウイルスのよく認識さ
れている亜型が生じた。ＨＢＶは、完全なゲノムの配列における８％以上の群間の相違に
基づいた明確な遺伝子型に分類されており、それぞれ異なる地理的分布を有する。例えば
、遺伝子型Ａは、サハラ以南のアフリカ、北ヨーロッパ、及び西アフリカで広く見られる
。遺伝子型ＢとＣはアジアで一般的である。遺伝子型Ｃは主に東南アジアで観察される。
遺伝子型Ｄは、アフリカ、ヨーロッパ、地中海諸国、及びインドで優勢である。遺伝子型
Ｇはフランス、ドイツ、アメリカ合衆国で報告されている。また、遺伝子型Ｈは中南米で
よく見られる。遺伝子型Ｉは最近ベトナムとラオスで報告されている。最新のＨＢＶ遺伝
子型、遺伝子型Ｊは、日本の琉球諸島で確認されている。
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科に属するエンベロープＤＮＡウイルスである。それは、
ＲＮＡ中間体、プレゲノムＲＮＡ（ｐｇＲＮＡ）の逆転写によって複製する、小さい、部
分的に二本鎖（ＤＳ）の、弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）ゲノムを含む。ＨＢＶの環状
ＤＮＡゲノムは珍しい。ＤＮＡが完全に二本鎖であるわけではないからである。全長の鎖
の一端が、ウイルスＤＮＡポリメラーゼに結合している。ゲノムは約３０２０～３３２０
ヌクレオチド長（全長の鎖）、１７００～２８００ヌクレオチド長（長さの短い鎖）であ
る。ネガティブセンス（非コード）は、ウイルスｍＲＮＡに相補的である。
Ｃ、Ｘ、Ｐ、及びＳと呼ばれる、ゲノムによってコードされる４つの既知の遺伝子があ
る。コアタンパク質は遺伝子Ｃ（ＨＢｃＡｇ）によってコードされ、その開始コドンは上
流のフレーム内ＡＵＧ開始コドンが先行し、そこからプレコアタンパク質が産生される。
ＨＢｅＡｇはプレコアタンパク質のタンパク質分解処理によって産生される。ＤＮＡポリ
メラーゼは、表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に対する遺伝子Ｐ．Ｇｅｎｅ Ｓコードによりコー
ドされる。ＨＢｓＡｇ遺伝子は１つの長いオープンリーディングフレームであるが、遺伝
子を３つの部分、即ちｐｒｅ－Ｓ１、ｐｒｅ－Ｓ２、及びＳに分割する３つのインフレー
ムの「開始」（ＡＴＧ）コドンを含む。複数の開始コドンにより、大（表面から内側への
順序で、ｐｒｅ－Ｓ１／ｐｒｅ－Ｓ２／Ｓ）、中（ｐｒｅ－Ｓ２／Ｓ）、及び小（Ｓ）と
呼ばれる３つの異なる大きさのポリペプチドが生成される。遺伝子Ｘによってコードされ
るタンパク質の機能は完全には理解されていないが、それは肝がんの発症と関連している
。それは細胞の増殖を促進する遺伝子を刺激して、増殖調節分子を不活化する。
ウイルスのＤＮＡは、細胞の感染直後、核にて見出される。部分的に二本鎖のＤＮＡは
、（＋）センスの鎖の完成及び（－）のセンスの鎖からのタンパク質分子の除去、並びに
（＋）センスの鎖からの短いＲＮＡ配列の除去によって完全に二本鎖にされる。非コード
の塩基が（－）センスの鎖の末端から除去され、末端は再結合される。
ＨＢＶのライフサイクルは、ウイルスが宿主細胞に付着して、内在化すると始まる。最
近の研究は、タウロコール酸ナトリウム共輸送ポリペプチド（ＮＴＣＰ）がＨＢＶの感染
における機能的受容体であることを証明している。ビリオン弛緩型環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮ
Ａ）は核に送達され、そこでそれは修復されて共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）を
形成する。エピソームｃｃｃＤＮＡは、宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるプレゲノムＲ
ＮＡ（ｐｇＲＮＡ）及び他のウイルスｍＲＮＡの転写のための鋳型として機能する。転写
物は次に細胞質に輸送され、そこでウイルスタンパク質の翻訳が起こる。逆転写酵素（Ｒ
Ｔ）はｐｇＲＮＡに結合し、コアタンパク質の未成熟なＲＮＡ含有ヌクレオカプシドへの
集合を引き起こす。未成熟なヌクレオカプシドは次に成熟の過程を経る。それによってｐ
ｇＲＮＡがＲＴによって逆転写されて、成熟ｒｃＤＮＡが作られる。ヘパドナウイルス逆
転写の独特の特徴は、マイナス鎖ＤＮＡ合成のＲＴにプライミングされた開始であり、こ
れはマイナス鎖ＤＮＡの５’末端へのＲＴの共有結合をもたらす。
次いで、成熟したｒｃＤＮＡ含有ヌクレオカプシドは、ウイルス表面タンパク質によっ
てエンベロープされ、ビリオンとして分泌される（分泌経路）か、別法として、ｃｃｃＤ
ＮＡのプールを更に増幅するために核に再循環される（再循環経路）。肝細胞におけるｃ
ｃｃＤＮＡの持続性は、ウイルスの持続性、抗ウイルス療法の中止後のウイルス複製の再
活性化、及び治療に対する抵抗性において、重要な役割を果たす。
ホーミングエンドヌクレアーゼは、植物及び真菌のゲノムに一般的に見られる１５～４
０塩基対の切断部位を認識する一群の天然のヌクレアーゼである。それらは、グループ１
自己スプライシングイントロンやインテイン等の寄生のＤＮＡの要素と関連していること
が多い。それらは、染色体にて二本鎖の切断を生じさせることによって宿主ゲノムの特定
の位置で相同組換え又は遺伝子挿入を自然に促進し、これは細胞のＤＮＡ修復機構を動員
する（非特許文献１）。ホーミングエンドヌクレアーゼは一般に４つのファミリーに分類
される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリー、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリー、Ｈ
ｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリーである。これらのファミリーは、
触媒の活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフによって特徴付けられる。例えば、
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡ
ＤＧ（配列番号２）モチーフの１つ又は２つのコピーを有することを特徴とする（非特許
文献２を参照）。単一コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフを有するＬＡ
ＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼはホモ二量体を形成し、一
方、２コピーのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）モチーフを有するメンバーは単量体と
して見出される。ホーミングエンドヌクレアーゼを産生する方法は、当技術分野において
公知である。
Ｉ－ＣｒｅＩ（配列番号１）は、緑藻クラミドモナスの葉緑体染色体にある２２塩基対
の認識配列を認識し切断する、ホーミングエンドヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配
列番号２）ファミリーのメンバーである。遺伝的選択技術を用いて、野生型Ｉ－ＣｒｅＩ
切断部位選択性を改変した（非特許文献３～６）。哺乳動物、酵母、植物、細菌、及びウ
イルスゲノムの部位を含む、広範囲に異なるＤＮＡの部位を標的とするためにＩ－Ｃｒｅ
Ｉ及び他のホーミングエンドヌクレアーゼを包括的に再設計することができる、モノ－Ｌ
ＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２）ホーミングエンドヌクレアーゼを合理的に設計する方法
が記載された（特許文献１）。
特許文献２に最初に記載されているように、Ｉ－ＣｒｅＩ及びその遺伝子操作された誘
導体は、通常二量体であるが、第１のサブユニットのＣ末端を第２のサブユニットのＮ末
端に結合する短いペプチドリンカーを用いて、単一ポリペプチドに融合できる（非特許文
献７、非特許文献８）。従って、機能的な「一本鎖」メガヌクレアーゼは、単一の転写物
から発現させることができる。
ＨＢＶ感染の治療のために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを使用することが、示さ
れている。例えば、特許文献３は、非ゲノム組み込み型ウイルスのゲノムを切断するため
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの使用を示唆している。そのようなメガヌクレアー
ゼは、Ｉ－ＣｒｅＩの変異体を含む。特許文献３は、１つのＨＢＶ株のゲノムに存在する
多数の２２塩基対メガヌクレアーゼ認識配列を開示している。しかし、特許文献３は、Ｈ
ＢＶゲノムの複数の遺伝子型の中に存在するいずれの認識配列も同定しない。
国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット 国際公開第２００９／０５９１９５号パンフレット 国際公開第２０１０／１３６８４１号パンフレット
Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６），Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５ Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９（１８）：３７５７－３７７４ Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１ Ｃｈａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８ Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９ Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５５：４４３－５８ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：１６５０－６２ Ｇｒｉｚｏｔ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：５４０５－１９
本発明は、部分的には、ＨＢＶゲノムの少なくとも１つのオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）内及びＨＢＶのゲノムの少なくとも２つの異なる遺伝子型内のＤＮＡ配列を
認識するように遺伝子操作される部位特異的な希少切断エンドヌクレアーゼの開発に依存
する。本発明者らは、ウイルスの複数の遺伝子型を不活化するために、組換えメガヌクレ
アーゼによって標的とされ得る遺伝子型にわたって保存されている特定の認識配列を同定
した。
本発明はいくつかの態様で従来技術を改良する。本発明者らは驚くべきことに、認識配
列がＨＢＶゲノムのいくつかの遺伝子型のＯＲＦ内で同定され得ることを見出した。ウイ
ルスのいくつかの遺伝子型を標的とすることによって、世界の局所的な領域に存在する異
なる遺伝子型に対して使用することができる単一の医薬組成物を調製することができる。
従って、本明細書に開示されている方法及び組成物は、世界中の感染した個人におけるＨ
ＢＶの増殖を治療又は低減するのに有用である。肝臓におけるＨＢＶの複製の抑制又は根
絶は、肝病理の改善、及び肝硬変や肝細胞がんへの進行の減少をもたらす。従って、本発
明は、ＨＢＶ感染に対する更なる遺伝子治療アプローチに対する当技術分野における必要
性を満たすものである。更に、本発明は、ＨＣＣ細胞のＨＢＶゲノムへの「自殺遺伝子」
の相同組換えによる挿入を標的とする手段を提供することによって肝細胞がんを治療する
方法を提供する。自殺遺伝子は、がん細胞を直接死滅させる毒素若しくはアポトーシス促
進タンパク質、又はがん細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する細胞表面抗
原若しくはＭＨＣクラスＩ抗原ポリペプチドをコードすることができる。
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染の治療に有用な遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼを提供する。本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、少なくとも２つの
Ｂ型肝炎ウイルスの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認
識配列を認識して切断する。本明細書において開示される遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼによるそのような認識配列での切断は、切断部位での非相同末端結合（ＮＨＥＪ）に
起因して、１以上のウイルスタンパク質の発現を乱し得る。ＮＨＥＪは、挿入、欠失を引
き起こす可能性がある、又は遺伝子の発現を妨げる可能性のあるフレームシフト突然変異
を引き起こす可能性がある。従って、正常な遺伝子発現を妨害することによって、ＨＢＶ
の感染及び増殖は、本明細書に開示されている方法に従って、減少又は排除することがで
きる。本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ内
に位置する認識配列に対する特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用す
るＨＢＶの治療のための医薬組成物及び方法を提供する。本発明は更に、ＨＢＶのレベル
を低下させる、及び／又はＨＢＶの感染に関連する症状を低下させるために、本明細書に
開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをＨＢＶに感染した対象に送達する方法を
提供する。
従って、一態様において、本発明は、少なくとも２つのＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型の
ゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認識配列を認識して切断する、遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼを提供する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第
１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、第１のサブユニットが認識配列の第１
の認識した半分の部位に結合し、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、第２のサブユニ
ットは、認識配列の第２の認識した半分の部位に結合し、第２の超可変（ＨＶＲ２）領域
を含む。
いくつかの実施形態では、認識配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも３つ、少なくと
も４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＯＲＦ内に見出される。その
ような一実施形態では、認識配列はＢ型肝炎ウイルスの遺伝子型Ａ（配列番号３）のＯＲ
Ｆ内にある。そのような実施形態は、配列番号３と異なるが本明細書に記載の１又は複数
のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型ＡのＢ型肝炎ウイルス単離体を含む
。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型ＡのＯＲＦ並びに遺伝子型Ｂ、Ｃ
、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（それぞれ配列番号４～９）の１又は複数のＯＲＦ内にある。その
ような実施形態は、配列番号３～９と異なるが本明細書に記載の１又は複数のＨＢＶメガ
ヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧのＢ型肝炎ウイ
ルス単離体を含む。
いくつかの実施形態では、認識配列は、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒ
ｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表
面（Ｓ）タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも１つ
のＯＲＦ内にある。いくつかの実施形態において、認識配列は、配列番号１０（即ち、Ｈ
ＢＶ１－２認識配列）、配列番号１２（即ち、ＨＢＶ５－６認識配列）、配列番号１４（
即ち、ＨＢＶ７－８認識配列）、又は配列番号１６（即ち、ＨＢＶ１１－１２認識配列）
を含み得る。
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号
１８若しくは１９の残基２４～７９、又は配列番号２０若しくは２１の残基２１５～２７
０に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号１８若しくは１９の
残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０
、７５、及び７７に対応する残基、又は配列番号２０若しくは２１の残基２１５、２１７
、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９
、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、Ｈ
ＶＲ１領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２４～７９、又は配列番号２０若しくは
２１の残基２１５～２７０を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、ＨＶＲ２領域は
、配列番号１８若しくは１９の残基２１５～２７０、又は配列番号２０若しくは２１の残
基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号１８若し
くは１９の残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２
３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基、又は配列
番号２０若しくは２１の残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、
４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。特定の実施形態に
おいて、ＨＶＲ２領域は、配列番号１８若しくは１９の残基２１５～２７０、又は配列番
号２０若しくは２１の残基２４～７９を含み得る。
このような実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、第１のサブユニットは、配
列番号１８若しくは１９の残基７～１５３、又は配列番号２０若しくは２１の残基１９８
～３４４に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも
９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニット
は、配列番号１８若しくは１９の残基１９８～３４４、又は配列番号２０若しくは２１の
残基７～１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少な
くとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの
実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号１８若しくは１９の残基７～１５３
、又は配列番号２０若しくは２１の残基１９８～３４４を含み得る。同様に、いくつかの
実施形態において、第２のサブユニットは、配列番号１８若しくは１９の残基１９８～３
４４、又は配列番号２０若しくは２１の残基７～１５３を含み得る。
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号１０を含み、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサ
ブユニットを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレ
アーゼは、配列番号１８～２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
他の実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号２２～
２４のいずれか１つの残基２１５～２７０、又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残
基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を
含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２２～２
４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２９、２
３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する残基、
又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３
８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。
特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２
１５～２７０、又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基２４～７９を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、ＨＶＲ２領域は
、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２４～７９、又は配列番号２５～２８のいず
れか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対する少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、
配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、
４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基、又は配列番号２
５～２８のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、２２
９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応する
残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２２～２４のいず
れか１つの残基２４～７９、又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基２１５～２７
０を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、第１のサブユニ
ットは、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号２５～２
８のいずれか１つの残基７～１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含
み得、第２のサブユニットは、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基７～１５３又は
配列番号２５～２８のいずれか１つの残基１９８～３４４に対する少なくとも８０％、少
なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有
するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配
列番号２２～２４のいずれか１つの残基１９８～３４４又は配列番号２５～２８のいずれ
か１つの残基７～１５３を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第２のサブ
ユニットは、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基７～１５３又は配列番号２５～２
８のいずれか１つの残基１９８～３４４を含み得る。
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号１２を含み、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサ
ブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号２２～２８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号
２９～３２のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対する少なく
とも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の
配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、
ＨＶＲ１領域は、配列番号２９～３２のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２
２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２
６６、及び２６８に対応する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は
、配列番号２９～３２のいずれか１つの残基２１５～２７０を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、ＨＶＲ２領域は
、配列番号２９～３２のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対する
少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ
以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態にお
いて、ＨＶＲ２領域は、配列番号２９～３２のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
る残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号２９～３２のい
ずれか１つの残基２４～７９を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、第１のサブユニ
ットは、配列番号２９～３２のいずれか１つの残基１９８～３４４に対する少なくとも８
０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同
一性を有するアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニットは、配列番号２９～３２のいず
れか１つの残基７～１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号２９～３２のいずれか１
つの残基１９８～３４４を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第２のサブ
ユニットは、配列番号２９～３２のいずれか１つの残基７～１５３を含み得る。
このような特定の実施形態では、認識配列が配列番号１４を含み、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ、リンカーは第１のサブユニットと第２のサ
ブユニットとを共有結合で結合させる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼは、配列番号２９～３２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
いくつかの実施形態では、認識配列が配列番号１６を含み、ＨＶＲ１領域は、配列番号
３３～３９のいずれか１つの残基２１５～２７０に対する少なくとも８０％、少なくとも
８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミ
ノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番
号３３～３９のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２４、
２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６、及び２６８に対応
する残基を含み得る。特定の実施形態において、ＨＶＲ１領域は、配列番号３３～３９の
いずれか１つの残基２１５～２７０を含み得る。
いくつかのこのような実施形態では、認識配列が配列番号１６を含み、ＨＶＲ２領域は
、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２４～７９に対する少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得る。いくつかのこのような実施形態において、ＨＶＲ２領域は、
配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、
４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応する残基を含み得る。特定
の実施形態において、ＨＶＲ２領域は、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２４～
７９を含み得る。
このような実施形態では、認識配列が配列番号１６を含み、第１のサブユニットは、配
列番号３３～３９のいずれか１つの残基１９８～３４４に対する少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有す
るアミノ酸配列を含み得、第２のサブユニットは、配列番号３３～３９のいずれか１つの
残基７～１５３に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少な
くとも９５％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。いくつかの
実施形態において、第１のサブユニットは、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基１
９８～３４４を含み得る。同様に、いくつかの実施形態において、第２のサブユニットは
、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基７～１５３を含み得る。
特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼはリンカーを含むことができ
、リンカーは第１のサブユニットと第２のサブユニットとを共有結合で結合させる。特定
の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３３～３９のいずれか
１つのアミノ酸配列を含み得る。
別の態様において、本発明は、本明細書に開示されている任意の遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定
の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドはｍＲＮＡであり得る。
更なる実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載の１又は複数の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡであり得る。特定の実施形態に
おいて、本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、限定するものではなく、本明細書に記
載の２つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンｍＲＮＡ、本
明細書に記載の３つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンｍ
ＲＮＡ、又は本明細書に記載の４つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするク
アドシストロンｍＲＮＡであり得る。そのような実施形態において、２以上の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼがポリシストロニックｍＲＮＡによってコードされ、それぞれの
コードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるＨＢＶ認識配列に対する特異
性を有する。更に、そのような実施形態では、本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの任意の組み合わせをコードし得る
。特定の実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ１－２メガヌクレア
ーゼ、ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１
－１２メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニック
ｍＲＮＡは、ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼをコ
ードするバイシストロンｍＲＮＡであり得る。
更なる実施形態において、本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載の
１以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、並びにＨＢＶ感染細胞及び／又はＨＢＶ感
染対象において治療上有益な効果を誘導する１以上の更なるタンパク質をコードし得る。
別の態様において、本発明は、本発明の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、組換
えＤＮＡ構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
をコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物
は、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形
態において、組換えＤＮＡ構築物は、２つのカセット、３つのカセット、４つのカセット
、又はそれ以上を含み得る。
他の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核
酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
特定の実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、本明細書に開示されている任意の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターをコードする
。そのような実施形態では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデ
ノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態で
は、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットとを含む。他の実
施形態では、ウイルスベクターは、２つ以上のカセットを含み、各カセットがプロモータ
と、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み
、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対
する特異性を有する。
他の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸配列
を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
別の態様において、本発明は、本発明の任意の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含むウイルスベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ウイル
スベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイル
ス（ＡＡＶ）ベクターであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡ
Ｖベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、
本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセ
ットを含む。他の実施形態では、ウイルスベクターは、２以上のカセットを含み、各カセ
ットがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする
核酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨ
ＢＶ認識配列に対する特異性を有する。
更なる実施形態においてウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸
配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を
駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
別の態様では、本発明は、ＨＢＶによって引き起こされるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
又は肝細胞がんを有する対象を治療するための医薬組成物であって、医薬的に許容される
担体と、（ａ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸、
又は（ｂ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質とを含む医薬
組成物を提供し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも
２つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内の認識配列に対す
る特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識配列は、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくと
も３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＯＲＦ内に
ある。そのような一実施形態では、認識配列は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ（配列番号３）のＯＲ
Ｆ内にあるか、認識配列、及びＨＢＶの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３
つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの他の遺伝子型を含むその単
離体である。様々な実施形態において、更なるＨＢＶ遺伝子型は、遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、及び／若しくはＧ（それぞれ配列番号４～９）、又は本明細書に記載の１以上の
ＨＢＶ認識配列を含むその単離体を含み得る。
いくつかの実施形態において、医薬組成物の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は医
薬組成物の核酸配列によってコードされるものは、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表
面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、
及び小表面（Ｓ）タンパク質からなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なく
とも１つのＯＲＦ内の認識配列に対する特異性を有する。いくつかの実施形態では、認識
配列は配列番号１０、１２、１４、又は１６を含み得る。
一実施形態において、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを
コードする医薬組成物の核酸配列は、本明細書に記載されているｍＲＮＡであり得る。い
くつかのそのような実施形態において、ｍＲＮＡは、本明細書に記載のポリシストロニッ
クｍＲＮＡであり得、その結果、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレ
アーゼが、インビボで標的細胞において発現される。
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼをコードする核酸配列を含む本明細書に記載される組換えＤＮＡ構築物を含む
。いくつかのそのような実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータと、本発明の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。他の
実施形態では、医薬組成物の組換えＤＮＡ構築物は、２以上のカセットを含み、各カセッ
トがプロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核
酸配列とを含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢ
Ｖ認識配列に対する特異性を有する。特定の実施形態において、医薬組成物の組換えＤＮ
Ａ構築物は、２つのカセット、３つのカセット、４つのカセット、又はそれ以上を含み得
る。
他の実施形態では、医薬組成物の組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及びポリシストロ
ニック核酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発
現を駆動して、標的細胞においてインビボで本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮ
Ａを生成し、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞に
おいて発現されるようにする。
別の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを含む。そのような一実施形態
では、ウイルスベクターはレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はＡＡ
Ｖであり得る。特定の実施形態では、ウイルスベクターは組換えＡＡＶベクターであり得
る。
いくつかのそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む
。他の実施形態では、ウイルスベクターは、２以上のカセットを含み、各カセットがプロ
モータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列と
を含み、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配
列に対する特異性を有する。
他のそのような実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニッ
ク核酸配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の
発現を駆動して、標的細胞においてインビボで、本明細書に記載のポリシストロニックｍ
ＲＮＡを生成し、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細
胞において発現されるようにする。
そのような一実施形態では、医薬組成物は、配列番号１０を認識して切断する、本明細
書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むこと
ができる。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１８～
２１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１２を認識して切断する、本明細書に開示
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２２～２８のう
ちのいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１４を認識して切断する、本明細書に開示
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２９～３２のい
ずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
別の実施形態では、医薬組成物は、配列番号１６を認識して切断する、本明細書に開示
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又はそれをコードする核酸）を含むことができる
。特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３３～３９のい
ずれか１つのアミノ酸配列を含み得る。
様々な実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の２以上の遺伝子操作された
メガヌクレアーゼタンパク質を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、
本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。他の実施形態では、医
薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする２以上の
核酸を含むことができ、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載の異なる
ＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。そのような実施形態では、２以上の核酸は、本
明細書に記載のｍＲＮＡ、本明細書に記載の組換えＤＮＡ構築物、及び／又は本明細書に
記載のウイルスベクターに含まれ得る。他の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記
載の１以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質、及び本明細書に記載の遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードする１以上の核酸（即ち、ｍＲＮＡ、組換えＤＮ
Ａ構築物、又はウイルスベクター）を含み得、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びコ
ードされる遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に記載された異なるＨＢＶ認
識配列に対して特異性を有する。
更なる実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼタンパク質の組み合わせ、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードする核酸の組み合わせ（即ち、ｍＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物、ウイルスベクター）
、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパク質と遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼタンパク質をコードする核酸の組み合わせを含み得、医薬組成物の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ及び／又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの組み合わせ
は、ＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（配列番号３～９）のそれぞれにお
ける認識配列、並びに本明細書に記載のＨＢＶ認識配列を含む各遺伝子型の単離体を認識
して切断することができる。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に記載
の１又は複数のｍＲＮＡを含むことができる。特定の実施形態において、医薬組成物の脂
質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する本発明の
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に記載の２以上のｍ
ＲＮＡを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒子は、それぞれが異なるＨＢＶ認識配
列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする、本
明細書に記載の２つ、３つ、又は４つのｍＲＮＡを含み得る。他の実施形態では、医薬組
成物の脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する
本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする、本明細書に
記載の１以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態で、脂質ナノ粒
子は、本明細書に記載の２つ、３つ、又は４つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコ
ードするポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができる。他の特定の実施形態で、脂質
ナノ粒子は、本明細書に記載の２以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができ、
各々本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。いくつかの実施
形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込みを増強する組成を
有する。
別の態様において、本発明は、ＨＢＶを有する対象を治療するための方法を提供する。
同様に、本明細書で提供されるのは、ＨＢＶのレベル及び／又は増殖を減少させるため、
あるいはＨＢＶに関連する症状を減少させるための方法である。方法は、対象の標的細胞
に、（ａ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作さ
れたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで発現される核酸、又は（ｂ）遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼタンパク質を送達することを含み、遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ中の認識
配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識配列を認識して
切断し、そのため標的細胞のＨＢＶゲノムを切断する。この方法は、対象におけるＨＢＶ
の感染及び／又は増殖を減少又は排除することができる。
別の態様において、本発明は、ＨＢＶによって引き起こされたＨＣＣを有する対象を治
療するための方法を提供する。方法は、対象の標的細胞に、（１）（ａ）遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標
的細胞においてインビボで発現される核酸、又は（ｂ）遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼタンパク質、及び（２）自殺遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列及びメガヌクレ
アーゼ切断部位に隣接する配列と相同な配列を含む核酸を送達することを含み、遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムの
ＯＲＦ中の認識配列に対する特異性を有し、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、認識
配列を認識して切断し、そのため標的細胞のＨＢＶゲノムを切断し、自殺遺伝子は、相同
組換えによって切断されたＨＢＶゲノムに挿入され、自殺遺伝子の発現は標的細胞を死滅
させる。
いくつかの実施形態では、自殺遺伝子は標的細胞に対して直接致死性である。いくつか
のそのような態様において、直接致死性な自殺遺伝子は、毒性ポリペプチド又はアポトー
シス促進タンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は標的細胞
に対して間接致死性であり、標的細胞を死滅させるように対象自身の免疫系に指示する。
いくつかのそのような態様において、間接致死性な自殺遺伝子は、対象の免疫系によって
異物であると認識され、体液性又は細胞性免疫応答によって標的化される細胞表面タンパ
ク質をコードする。他のそのような実施形態において、間接致死性な自殺遺伝子は、ＭＨ
ＣクラスＩ分子によって提示され、対象の免疫系によって異物であると認識され、細胞傷
害性免疫応答によって標的化されるポリペプチドをコードする。
ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法のいくつかの実施形態では、認識配列は少なくとも３
つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＢ型肝炎ウイル
スのＯＲＦ内に見られる。そのような一実施形態では、認識配列はＢ型肝炎ウイルスの遺
伝子型Ａ（配列番号３）のＯＲＦ内にある。そのような実施形態は、配列番号３と異なる
が本明細書に記載の１又は複数のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Ａの
Ｂ型肝炎ウイルス単離体を含む。更なるそのような態様において、認識配列は遺伝子型Ａ
のＯＲＦ並びに遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（それぞれ配列番号４～９）の１又
は複数のＯＲＦ内にある。そのような実施形態は、配列番号３～９と異なるが本明細書に
記載の１又は複数のＨＢＶメガヌクレアーゼ認識配列を含む、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、及びＧのＢ型肝炎ウイルス単離体を含む。
ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法のそのような実施形態において、認識配列は、ポリメ
ラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、中表面（
ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表面（Ｓ）タンパク質からなる群から選択されるタ
ンパク質をコードする、少なくとも１つのＯＲＦ内にあってよい。いくつかの実施形態に
おいて、認識配列は、配列番号１０（即ち、ＨＢＶ１－２認識配列）、配列番号１２（即
ち、ＨＢＶ５－６認識配列）、配列番号１４（即ち、ＨＢＶ７－８認識配列）、又は配列
番号１６（即ち、ＨＢＶ１１－１２認識配列）を含み得る。
ＨＢＶ感染症又はＨＣＣの治療方法の特定の実施形態では、遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼタンパク質又はコードされた遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に
記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである。
更なる実施形態において、ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法は、少なくとも、医薬的に
許容される担体、及び（ａ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸であって、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが標的細胞においてインビボで
発現される核酸、又は（ｂ）本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼタンパ
ク質を含む本明細書に記載の本発明の任意の医薬組成物を対象に投与することを含む。
ＨＢＶ感染又はＨＣＣの治療方法のいくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を標的肝細胞の細胞
に送達することができる。特定の実施形態では、有効量の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、標的肝細胞の細胞に送
達することができる。
特定の実施形態では、肝細胞の細胞への送達はエクスビボで生じ、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸が送達された有
効量の肝細胞の細胞が、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、肝毒性タンパク質、又は肝毒性タンパク質をコードする核酸
若しくはＡＡＶが、本明細書に開示されている医薬組成物と共に投与される。
本方法の特定の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１０を含み得る。いくつかの
そのような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１０を認
識し切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の
実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１８～２１のうちのいず
れか１つのアミノ酸配列を含み得る。
方法の別の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１２を含み得る。いくつかのその
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１２を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２２～２８のうちのいずれか
１つのアミノ酸配列を含み得る。
方法の他の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１４を含み得る。いくつかのその
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１４を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号２９～３２のいずれか１つの
アミノ酸配列を含み得る。
方法の他の実施形態では、第１の認識配列は配列番号１６を含み得る。いくつかのその
ような実施形態において、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号１６を認識し
切断する本発明のいずれかの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであり得る。特定の実施
形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、配列番号３３～３９のいずれか１つの
アミノ酸配列を含み得る。
本方法の特定の実施形態では、対象はヒト等の哺乳動物であり得る。
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための本明細書に記載の遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼを提供する。本発明は更に、ＨＢＶを治療するため、ＨＢＶのレベル
若しくは増殖を減少させるため、ＨＢＶに関連する症状を減少させるため、又はＨＣＣを
治療するための医薬品の製造において、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
ーゼを使用することを提供する。
別の態様では、本発明は医薬品として使用するための単離されたポリヌクレオチドを提
供し、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。本発明は更に、ＨＢＶを治療するため、ＨＢ
Ｖのレベル若しくは増殖を減少させるため、ＨＢＶに関連する症状を減少させるため、又
はＨＣＣを治療するための医薬品の製造において、単離されたポリヌクレオチドを使用す
ることを提供する。
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するための組換えＡＡＶベクターを提供し
、組換えＡＡＶベクターは単離されたポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオ
チドは本明細書に開示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む
。本発明は更に、ＨＢＶを治療するため、ＨＢＶのレベル若しくは増殖を減少させるため
、ＨＢＶに関連する症状を軽減するため、又はＨＣＣを治療するための医薬品の製造にお
いて組換えＡＡＶベクターを使用することを提供し、組換えＡＡＶベクターは、単離され
たポリヌクレオチドを含み、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に開示されている
遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む。
本発明の前述及び他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲を参
照することによって、より十分に理解することができる。明確にするために別々の実施形
態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて
提供することもできる。実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含さ
れ、あたかもそれぞれの、また全ての組み合わせが個別に且つ明示的に開示されているか
のように、本明細書に開示されている。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈
で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に又は任意の適切なサブコンビネーション
で提供することもできる。実施形態に列挙された特徴の全てのサブコンビネーションはま
た、本発明によって具体的に包含され、あたかもそれぞれの、また全てのそのようなサブ
コンビネーションが本明細書に個々にそして明示的に開示されたかのように、本明細書に
開示される。本明細書に開示された本発明の各態様の実施形態は、必要な変更を加えて本
発明の他の各々の態様に適用される。
ＨＢＶゲノムのゲノム地図を示し、全てのＯＲＦを同定する。ウイルス粒子は、各鎖の５’領域にまたがって、直接反復配列（ＤＲ１及びＤＲ２）が隣接している凝集性の重複を有する、部分的に二本鎖のゲノム（破線で示す）を有する。遺伝子Ｓは、ウイルスエンベロープ内の膜貫通タンパク質である主要Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質及びそのグリコシル化パートナーをコードする。Ｓ遺伝子の上流のインフレーム配列はｐｒｅ－Ｓドメインをコードし、これはＳ配列と共に翻訳されて、肝細胞感染のためのウイルス受容体を含むｐｒｅ－Ｓ及びＳポリペプチド（中型及び大型タンパク質）を作る。遺伝子Ｃはウイルスのヌクレオカプシドを形成するＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）をコードする。Ｐ領域は、ウイルスの複製に必要なＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮａｓｅ Ｈ活性も有するウイルス逆転写酵素をコードする。ＨＢＶはＤＮＡウイルスであるが、プレゲノムＲＮＡ中間体を介して複製する。最後に、Ｘ遺伝子はウイルスの小さな調節タンパク質、Ｂ型肝炎ｘ（ＨＢｘ）抗原をコードする。ＨＢｘは、ウイルス遺伝子の発現及び複製を刺激し、ウイルス感染細胞を免疫介在性の破壊から保護し、肝細胞がんの発症に寄与するトランス活性化タンパク質である。 ＨＢＶゲノムの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ認識配列。Ａ）本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼによって標的化された各認識配列は、２つの認識した半分の部位を含む。各々の認識した半分の部位は、４塩基対の中央配列によって分離された９塩基対を含む。ＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１０）は、ＨＢＶ１及びＨＢＶ２と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。ＨＢＶ５－６認識配列（配列番号１２）は、ＨＢＶ５及びＨＢＶ６と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１４）は、ＨＢＶ７及びＨＢＶ８と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。ＨＢＶ１１－１２認識配列（配列番号１６）は、ＨＢＶ１１及びＨＢＶ１２と呼ばれる２つの認識した半分の部位を含む。 ＨＢＶ遺伝子型Ａのゲノム並びにゲノム内のＨＢＶ１－２、ＨＢＶ５－６、ＨＢＶ７－８、及びＨＢＶ１１－１２の認識配列の位置の図解。ＨＢＶ１－２及びＨＢＶ５－６認識配列は両方とも、ＨＢＶゲノムの４つのＯＲＦ内、Ｐ、ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びＳに位置している。ＨＢＶ７－８及びＨＢＶ１１－１２認識配列はそれぞれ、ポリメラーゼをコードするＯＲＦ内に位置する。 ＨＢＶ遺伝子型Ａ～ＧにおけるＨＢＶ認識配列のアラインメント。本発明の標的となる認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型にわたって保存されている。ＨＢＶ１－２認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基１８５～２０６にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧにおいて完全に保存されている。遺伝子型Ｄは、第１の半分の部位の－４位におけるＧとＴの単一ヌクレオチドの相違を含む。ＨＢＶ５－６認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基７４２～７６３にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧにおいて完全に保存されている。遺伝子型Ｆは、第１の半分の部位の－３位におけるＧとＣの単一ヌクレオチドの相違を含む。ＨＢＶ７－８認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基１１８３～１２０４にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧにおいて完全に保存されている。遺伝子型Ｅは、第１の半分の部位の－１位におけるＧとＣの単一ヌクレオチドの相違を含む。ＨＢＶ１１－１２認識配列は、配列番号３に示されるＨＢＶ遺伝子型Ａの残基１２５９～１２８０にわたり、この認識配列は遺伝子型Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧにおいて完全に保存されている。 本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは２つのサブユニットを含み、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは第１の認識した半分の部位（例えばＨＢＶ１、ＨＢＶ５、ＨＢＶ７、又はＨＢＶ１１）に結合し、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは第２の認識した半分の部位（例えば、ＨＢＶ２、ＨＢＶ６、ＨＢＶ８、又はＨＢＶ１２）に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌクレアーゼである実施形態では、ＨＶＲ１領域を含む第１のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置付けることができる。同様に、ＨＶＲ２領域を含む第２のサブユニットは、Ｎ末端又はＣ末端サブユニットのいずれかとして位置付けることができる。 Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦを標的とする遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを評価するためのＣＨＯ細胞におけるレポーターアッセイの概略図。本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼについて、レポーターカセットが細胞のゲノムに安定的に組み込まれているＣＨＯ細胞株が産生された。レポーターカセットは、５’から３’への順序で、ＳＶ４０早期プロモータ；ＧＦＰ遺伝子の５’２／３；本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの認識配列（例えば、ＨＢＶ１－２認識配列）；ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼの認識配列（国際公開第２０１２／１６７１９２号パンフレット）；及びＧＦＰ遺伝子の３’２／３を含んだ。このカセットで安定に形質移入された細胞は、ＤＮＡ切断誘導剤の非存在下ではＧＦＰを発現しなかった。メガヌクレアーゼは、各メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡ又はｍＲＮＡの形質導入によって導入された。メガヌクレアーゼ認識配列のいずれかにおいてＤＮＡの切断が誘導された場合、ＧＦＰ遺伝子の重複領域は互いに組換えられて機能的ＧＦＰ遺伝子を生成した。次に、メガヌクレアーゼによるゲノム切断の頻度の間接的な尺度として、ＧＦＰ発現細胞の割合をフローサイトメトリーによって判定することができた。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける遺伝子、少なくとも２つの遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスのゲノムのＯＲＦ中の認識配列を認識して切断するための遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの効率。配列番号１８～３９に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５－６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１４）又はＨＢＶ１１－１２認識配列（配列番号１６）を標的とするように遺伝子操作され、ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示された結果は、各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞の割合を提供し、これは標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す。陰性対照（ｂｓ）を各アッセイに更に含めた。図７Ａ；ＨＢＶ１－２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図７Ｂ；ＨＢＶ５－６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図７Ｃ；ＨＢＶ７－８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図７Ｄ；ＨＢＶ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける遺伝子、少なくとも２つの遺伝子型のＢ型肝炎ウイルスのゲノムのＯＲＦ中の認識配列を認識して切断するための遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの効率。配列番号１８～３９に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５－６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１４）又はＨＢＶ１１－１２認識配列（配列番号１６）を標的とするように遺伝子操作され、ヌクレオフェクション後１２日にわたる複数の時点でＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおける有効性についてスクリーニングした。示された結果は、１２日間の分析期間にわたって各アッセイにおいて観察されたＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを提供し、これは時間の関数として標的認識配列又はＣＨＯ－２３／２４認識配列を切断するための各メガヌクレアーゼの有効性を示す。図８Ａ；ＨＢＶ１－２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図８Ｂ；ＨＢＶ５－６認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図８Ｃ；ＨＢＶ７－８認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。図８Ｄ；ＨＢＶ１１－１２認識配列を標的とするメガヌクレアーゼを示す。 ＨＢＶメガヌクレアーゼの、大腸菌レポーターシステムにおいてエピソームＤＮＡプラスミド内の認識配列を認識して切断する能力についての評価。図９Ａ；プラスミドｐＡＲＣＵＳ及びプラスミドｐＨＢＶａを示す。図９Ｂ；各選択プレートに存在するコロニーの数を示しており、ＨＢＶメガヌクレアーゼがｐＨＢＶａプラスミドを切断し得る証拠が得られた。 ＡＤ３８細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＨＢＶゲノムを発現し、ＨＢｓＡｇを分泌するＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６メガヌクレアーゼをコードするプラスミドＤＮＡで形質移入した。この実験では、対照として、赤色蛍光タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを使用した。形質移入後３日目及び７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。 ＡＤ３８細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＨＢＶゲノムを発現し、ＨＢｓＡｇを分泌するＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５－６×．３３メガヌクレアーゼ又はＨＢＶ１１－１２×．２６メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスで形質導入するか、その２つの組み合わせで形質導入した。この実験では、対照として、赤色蛍光タンパク質をコードするレンチウイルスを使用した。１、２、及び４のＭＯＩを調べた。形質導入後７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。 ＡＤ３８細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＨＢＶゲノムを発現し、ＨＢｓＡｇを分泌するＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５－６×．３３メガヌクレアーゼ（ＬＶ２２４）、ＨＢＶ１１－１２×．２６メガヌクレアーゼ（ＬＶ２２５）、又は赤色蛍光タンパク質（ＬＶ２１２）をコードするレンチウイルスで形質導入した。４のＭＯＩを調べ、形質導入後７日目に細胞上清を回収し、ＨＢｓＡｇの存在及び細胞外ＨＢＶ ＤＮＡのコピー数についてアッセイした。更に、細胞溶解物を形質導入後７日目に得て、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの細胞内のコピー数について分析した。図１２Ａ；細胞培養培地中のＨＢｓＡｇ濃度を示す。図１２Ｂ；細胞培養培地中の細胞外ＨＢＶ ＤＮＡのコピー数を示す。図１２Ｃ；細胞溶解物中の細胞内ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡコピー数を示す。 ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６を発現するレンチウイルスを作製し、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。初代ヒト肝細胞を播種し、２４時間後にＨＢＶに感染させた。感染後１日目に細胞を洗浄し、２４時間後（感染後２日目）に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３、ＨＢＶ１１－１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をＤＭＳＯで処理した。細胞の上清を回収し、形質導入後４日目、８日目、１１日目、及び１３日目に培地を交換した。各時点で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇをＥＬＩＳＡにより細胞の上清で測定した。また、上清の中の細胞外ＤＮＡを感染後１３日目に測定した。一般に、レンチウイルス形質導入がＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇのいずれかの分泌に影響を及ぼすかどうかを判断するために、ＲＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入した細胞から得た細胞の上清を、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較した。図１３Ａ；ＲＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入が、ＭＯＩ又は１．２５、２．５、若しくは５でＨＢｓＡｇの発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。図１３Ｂ；ＲＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入が、ＭＯＩ又は１．２５、２．５、若しくは５でＨＢｅＡｇの発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。図１３Ｃ；ＲＦＰをコードするレンチウイルスによる形質導入が、ＭＯＩ又は１．２５、２．５、若しくは５でＨＢＶ ＤＮＡの発現にほとんど影響を及ぼさなかったことを示す。 ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶメガヌクレアーゼの評価。ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６を発現するレンチウイルスを作製し、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。初代ヒト肝細胞を播種し、２４時間後にＨＢＶに感染させた。感染後１日目に細胞を洗浄し、２４時間後（感染後２日目）に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３、ＨＢＶ１１－１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をＤＭＳＯで処理した。細胞の上清を回収し、形質導入後４日目、８日目、１１日目、及び１３日目に培地を交換した。各時点で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇをＥＬＩＳＡにより細胞の上清で測定した。図１４Ａ；２．５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｓＡｇを示す。図１４Ｂ；１．２５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｓＡｇを示す。図１４Ｃ；２．５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｅＡｇを示す。図１４Ｄ；１．２５のＭＯＩでの形質導入後の細胞培養培地におけるＨＢｅＡｇを示す。 脂質ナノ粒子封入ｍＲＮＡの肝臓への送達。マウスの肝臓で発現されるマウスＣＭＰ－ＮｅｕＡｃヒドロラーゼ（Ｃｍａｈ）遺伝子の認識配列に対して特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させた。ＣｍａｈメガヌクレアーゼをコードするＡＲＣＡでキャップされたｍＲＮＡを、３つの異なる市販のＬＮＰ製剤に封入した。ＬＮＰ封入ｍＲＮＡを、ＩＶ注射によりＣＤ－１マウスに投与し、６日後に肝臓を採取した。全肝臓ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｃｍａｈ遺伝子における挿入／欠失（インデル）突然変異の頻度を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイ及びディープシーケンシングを用いて判定した。
配列の簡単な説明
配列番号１は、緑藻クラミドモナスからの野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのアミ
ノ酸配列を示す。
配列番号２は、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ＨＢＶ遺伝子型Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ＨＢＶ遺伝子型Ｃのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、ＨＢＶ遺伝子型Ｄのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ＨＢＶ遺伝子型Ｅのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ＨＢＶ遺伝子型Ｆのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、ＨＢＶ遺伝子型Ｇのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、ＨＢＶ１－２認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、ＨＢＶ１－２認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、ＨＢＶ５－６認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、ＨＢＶ５－６認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、ＨＢＶ７－８認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、ＨＢＶ７－８認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、ＨＢＶ１１－１２認識配列（センス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１７は、ＨＢＶ１１－１２認識配列（アンチセンス）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、ＨＢＶ１－２×．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ＨＢＶ１－２×．１４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、ＨＢＶ１－２×．６８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ＨＢＶ１－２×．９３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、ＨＢＶ５－６×．３３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ＨＢＶ５－６×．８４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、ＨＢＶ５－６×．９０メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ＨＢＶ５－６×．４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、ＨＢＶ５－６×．５メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、ＨＢＶ５－６×．６８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２８は、ＨＢＶ５－６×．７９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、ＨＢＶ７－８×．２メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、ＨＢＶ７－８×．９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ＨＢＶ７－８×．１７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、ＨＢＶ７－８×．４４メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ＨＢＶ１１－１２×．２６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、ＨＢＶ１１－１２×．９メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＨＢＶ１１－１２×．１３メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、ＨＢＶ１１－１２×．１６メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、ＨＢＶ１１－１２×．２７メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、ＨＢＶ１１－１２×．４１メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、ＨＢＶ１１－１２×．４８メガヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、ＨＢＶ１－２×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、ＨＢＶ１－２×．１４メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、ＨＢＶ１－２×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、ＨＢＶ１－２×．９３メガヌクレアーゼＨＢＶ１結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、ＨＢＶ１－２×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ２結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号４５は、ＨＢＶ１－２×．１４メガヌクレアーゼＨＢＶ２－結合サブユニット
のアミノ酸配列を示す。
配列番号４６は、ＨＢＶ１－２×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ２結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４７は、ＨＢＶ１－２×．９３メガヌクレアーゼＨＢＶ２結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４８は、ＨＢＶ５－６×．３３メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号４９は、ＨＢＶ５－６×．８４メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、ＨＢＶ５－６×．９０メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、ＨＢＶ５－６×．４メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、ＨＢＶ５－６×．５メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、ＨＢＶ５－６×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、ＨＢＶ５－６×．７９メガヌクレアーゼＨＢＶ５結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、ＨＢＶ５－６×．３３メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、ＨＢＶ５－６×．８４メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、ＨＢＶ５－６×．９０メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、ＨＢＶ５－６×．４メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、ＨＢＶ５－６×．５メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、ＨＢＶ５－６×．６８メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、ＨＢＶ５－６×．７９メガヌクレアーゼＨＢＶ６結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号６２は、ＨＢＶ７－８×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、ＨＢＶ７－８×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号６４は、ＨＢＶ７－８×．１７メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号６５は、ＨＢＶ７－８×．４４メガヌクレアーゼＨＢＶ７結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、ＨＢＶ７－８×．２メガヌクレアーゼＨＢＶ８結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、ＨＢＶ７－８×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ８結合サブユニットのア
ミノ酸配列を示す。
配列番号６８は、ＨＢＶ７－８×．１７メガヌクレアーゼＨＢＶ８－結合サブユニット
のアミノ酸配列を示す。
配列番号６９は、ＨＢＶ７－８×．４４メガヌクレアーゼＨＢＶ８結合サブユニットの
アミノ酸配列を示す。
配列番号７０は、ＨＢＶ１１－１２×．２６メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７１は、ＨＢＶ１１－１２×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
配列番号７２は、ＨＢＶ１１－１２×．１３メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、ＨＢＶ１１－１２×．１６メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７４は、ＨＢＶ１１－１２×．２７メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、ＨＢＶ１１－１２×．４１メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、ＨＢＶ１１－１２×．４８メガヌクレアーゼＨＢＶ１１結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、ＨＢＶ１１－１２×．２６メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号７８は、ＨＢＶ１１－１２×．９メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニッ
トのアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、ＨＢＶ１１－１２×．１３メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８０は、ＨＢＶ１１－１２×．１６メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、ＨＢＶ１１－１２×．２７メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８２は、ＨＢＶ１１－１２×．４１メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８３は、ＨＢＶ１１－１２×．４８メガヌクレアーゼＨＢＶ１２結合サブユニ
ットのアミノ酸配列を示す。
配列番号８４は、第１の半分の部位の－４位でのＧからＣへの置換を伴うＨＢＶ遺伝子
型ＡのＨＢＶ１－２認識配列に対応する、ＨＢＶ遺伝子型Ｄに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
配列番号８５は、第１の半分の部位の－３位にてＧからＣへの置換を伴うＨＢＶ遺伝子
型ＡのＨＢＶ５－６認識配列に対応する、ＨＢＶ遺伝子型Ｆに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
配列番号８６は、第１の半分の部位の－１位にてＣからＴへの置換を伴うＨＢＶ遺伝子
型ＡのＨＢＶ７－８認識配列に対応する、ＨＢＶ遺伝子型Ｅに存在する認識配列の核酸配
列を示す。
１．１ 基準及び定義
本明細書で言及している特許及び科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本
明細書に引用されている、発行された米国特許、許可出願、公開された外国出願、及びＧ
ｅｎＢａｎｋデータベースの配列を含む参考文献は、あたかも各々が具体的且つ個別に参
照により組み込まれることが示されているような程度で、参照により本明細書に組み込ま
れる。
本発明は様々な形で具現化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されるも
のと解釈されるべきではない。むしろ、本開示が徹底的且つ完全なものであり、本発明の
範囲を当業者に十分に伝えるようにするために、これらの実施形態が提供されている。例
えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の実
施形態に関して例示した特徴を、当該の実施形態から削除することができる。更に、本明
細書で示唆している実施形態に対する多数の変形及び追加は、本開示からみて当業者には
明らかであり、それらは本発明から逸脱しない。
他に定義されない限り、本明細書で使用している全ての専門用語及び科学的用語は、本
発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書の本発
明の説明で使用している専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としてお
り、本発明を限定することを意図してはいない。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参
照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で使用しているとき、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」は、１又は複数を意
味し得る。例えば、「ａ ｃｅｌｌ（細胞）」は、単一の細胞又は多数の細胞を意味し得
る。
本明細書で使用しているとき、他に具体的に示されない限り、「又は」という語は、「
及び／又は」の包括的な意味で使用しており、「いずれか／又は」の排他的な意味では使
用していない。
本明細書で使用しているとき、「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」の用語は
、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する天然に存在する又は遺伝子操
作された酵素について言及するために、互換的に使用されている。
本明細書で使用しているとき、「メガヌクレアーゼ」の用語は、１２塩基対より大きい
認識配列で二本鎖ＤＮＡに結合するエンドヌクレアーゼのことを示す。好ましくは、本発
明のメガヌクレアーゼの認識配列は２２塩基対である。メガヌクレアーゼは、Ｉ－Ｃｒｅ
Ｉに由来するエンドヌクレアーゼであり得、例えば、ＤＮＡの結合特異性、ＤＮＡの切断
活性、ＤＮＡの結合親和性、又は二量体化の特性に関して、天然のＩ－ＣｒｅＩに対して
改変されているＩ－ＣｒｅＩの遺伝子操作された変異体を示すことができる。そのような
改変されたＩ－ＣｒｅＩの変異体を産生するための方法は、当技術分野において公知であ
る（例えば、国際公開第２００７／０４７８５９号パンフレット）。本明細書で使用して
いるとき、メガヌクレアーゼは、ヘテロ二量体として二本鎖ＤＮＡに結合する。メガヌク
レアーゼはまた、ペプチドリンカーを用いて一対のＤＮＡ結合ドメインが単一のポリペプ
チドに結合されている「一本鎖メガヌクレアーゼ」であってもよい。「ホーミングエンド
ヌクレアーゼ」の用語は、「メガヌクレアーゼ」という用語と同義である。本発明のメガ
ヌクレアーゼは、細胞内で発現したとき細胞の生存率に対する有害な影響を観察せずに実
質的に無毒であるか、本明細書に記載の方法を用いて測定したときにメガヌクレアーゼ切
断活性の顕著な低下がある。
本明細書で使用しているとき、「一本鎖メガヌクレアーゼ」の用語は、リンカーによっ
て結合された一対のヌクレアーゼサブユニットを含むポリペプチドをいう。一本鎖メガヌ
クレアーゼは、Ｎ末端サブユニット－リンカー－Ｃ末端サブユニットという構成を有する
。２つのメガヌクレアーゼサブユニットは一般にアミノ酸配列において同一ではなく、非
同一ＤＮＡ配列を認識する。従って、一本鎖メガヌクレアーゼは、典型的には、擬似パリ
ンドローム認識配列又は非パリンドローム認識配列を切断する。一本鎖メガヌクレアーゼ
は実際には二量体ではないが、「一本鎖ヘテロ二量体」又は「一本鎖ヘテロ二量体メガヌ
クレアーゼ」と呼ばれることがある。明確にするために、特に明記しない限り、「メガヌ
クレアーゼ」の用語は、二量体又は一本鎖メガヌクレアーゼを示すことができる。
本明細書で使用しているとき、「リンカー」の用語は、２つのメガヌクレアーゼサブユ
ニットを単一のポリペプチドに結合するために使用する外因性ペプチド配列をいう。リン
カーは、天然タンパク質に見られる配列を有しても、いかなる天然タンパク質にも見られ
ない人工的な配列であってもよい。リンカーは柔軟で二次構造を欠いていることがあり、
又は生理学的条件下で特定の三次元構造を形成する傾向を有していることがある。リンカ
ーとしては、米国特許第８，４４５，２５１号及び米国特許第９，４３４，９３１号に包
含されるものを挙げることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態にお
いて、リンカーは、配列番号１８～３９のいずれか１つの残基１５４～１９５を含むアミ
ノ酸配列を有し得る。
本明細書で使用しているとき、タンパク質に関する、「組換え」又は「遺伝子操作され
た」の用語は、タンパク質をコードする核酸、及びタンパク質を発現する細胞又は生物へ
遺伝子工学技術を適用した結果として、改変させたアミノ酸配列を有することを意味する
。核酸に関する、「組換え」又は「遺伝子操作された」の用語は、遺伝子工学技術を適用
した結果として、改変させた核酸配列を有することを意味する。遺伝子工学技術としては
、ＰＣＲ及びＤＮＡクローニング技術；形質移入、形質転換、及び他の遺伝子導入技術；
相同組換え；部位特異的変異誘発；並びに遺伝子融合が挙げられるが、これらに限定され
ない。この定義によれば、天然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するが、
異種の宿主におけるクローニング及び発現によって産生されるタンパク質は、組換えとは
見なされない。
本明細書で使用しているとき、「野生型」の用語は、同じ型の遺伝子の対立遺伝子集団
において最も一般的な、天然に存在する対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド配列）をい
い、この場合野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチドは、その本来の機能を
有する。「野生型」の用語はまた、野生型対立遺伝子によってコードされるポリペプチド
も示す。野生型対立遺伝子（即ち、ポリヌクレオチド）及びポリペプチドは、野生型配列
に対して１又は複数の突然変異及び／又は置換を含む突然変異型又は変異型の対立遺伝子
及びポリペプチドと、区別可能である。野生型対立遺伝子又はポリペプチドは生物に正常
な表現型を付与することができるが、突然変異型又は変異型の対立遺伝子又はポリペプチ
ドは、場合によっては、変化した表現型を付与することができる。野生型ヌクレアーゼは
、組換えヌクレアーゼ又は天然に存在しないヌクレアーゼと区別可能である。「野生型」
の用語はまた、特定の遺伝子の野生型対立遺伝子を有する細胞、生物、及び／又は対象、
あるいは比較する目的のために使用する細胞、生物、及び／又は対象を示すことができる
。
本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、細胞又は生物において、ある
いはその先祖において、ゲノムＤＮＡ配列が組換え技術によって意図的に改変されている
細胞又は生物をいう。本明細書で使用しているとき、「遺伝子改変」の用語は、「トラン
スジェニック」という用語を包含する。
組換えタンパク質に関して本明細書で使用しているとき、「改変」の用語は、参照配列
（例えば、野生型又は天然の配列）に対する組換え配列のアミノ酸残基の任意の挿入、欠
失、又は置換を意味する。
本明細書で使用しているとき、「認識配列」の用語は、エンドヌクレアーゼによって結
合及び切断されるＤＮＡ配列をいう。メガヌクレアーゼの場合、認識配列は、４塩基対に
よって分離されている一対の反転した９塩基対の「半分の部位」を含む。一本鎖メガヌク
レアーゼの場合、タンパク質のＮ末端ドメインが第１の半分の部位と接触し、タンパク質
のＣ末端ドメインが第２の半分の部位と接触する。メガヌクレアーゼによる切断は、４塩
基対の３’の「オーバーハング」を生じる。「オーバーハング」又は「粘着性の末端」は
、二本鎖ＤＮＡ配列のエンドヌクレアーゼの切断によって産生され得る短い一本鎖ＤＮＡ
セグメントである。Ｉ－ＣｒｅＩ由来のメガヌクレアーゼ及び一本鎖メガヌクレアーゼの
場合、オーバーハングは２２塩基対認識配列の１０～１３塩基を含む。
本明細書で使用しているとき、「標的部位」又は「標的配列」の用語は、ヌクレアーゼ
の認識配列を含む細胞の染色体ＤＮＡの領域をいう。
本明細書で使用しているとき、「ＤＮＡ結合親和性」又は「結合親和性」の用語は、メ
ガヌクレアーゼが参照ＤＮＡ分子と非共有結合で会合する傾向（例えば、認識配列又は任
意の配列）を意味する。結合親和性は解離定数Ｋｄによって測定される。本明細書で使用
しているとき、参照認識配列に対するヌクレアーゼのＫｄが、参照ヌクレアーゼに対して
統計的に有意な（ｐ＜０．０５）量だけ増加又は減少する場合、ヌクレアーゼは「変化し
た」結合親和性を有する。
本明細書で使用しているとき、「特異性」の用語は、認識配列と呼ばれる特定の塩基対
の配列においてのみ、又は特定の認識配列の組においてのみ、メガヌクレアーゼが二本鎖
ＤＮＡ分子を認識して切断できることを意味する。認識配列の組は、特定の保存された位
置又は配列のモチーフを共有するが、１以上の位置で変性している場合もある。非常に特
異的なメガヌクレアーゼは、１つのみ又はごく少数の認識配列を切断することができる。
特異性は当技術分野において公知の任意の方法により判断することができる。本明細書で
使用しているとき、メガヌクレアーゼが、生理学的条件下で参照メガヌクレアーゼ（例え
ば野生型）に結合せずまた切断されない認識配列に、結合及び切断する場合、又は認識配
列の切断の速さが、参照メガヌクレアーゼと比較して生物学的に顕著な量（例えば、少な
くとも２倍、又は２倍～１０倍）増加又は減少する場合、メガヌクレアーゼは「改変した
」特異性を有する。
本明細書で使用しているとき、「相同組換え」又は「ＨＲ」の用語は、修復テンプレー
トとして相同ＤＮＡ配列を使用して二本鎖ＤＮＡの切断が修復される自然の細胞のプロセ
スをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃ
ｉ．１１：１９５８－１９７６を参照）。相同ＤＮＡ配列は、内因性染色体配列又は細胞
に送達された外因性核酸であり得る。
本明細書で使用しているとき、「非相同末端結合」又は「ＮＨＥＪ」の用語は、二本鎖
ＤＮＡの切断が２つの非相同ＤＮＡセグメントの直接的な結合によって修復される自然の
細胞のプロセスをいう（例えば、Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．（２００６），Ｆｒｏｎｔ
．Ｂｉｏｓｃｉ．１１：１９５８－１９７６を参照）。非相同末端結合によるＤＮＡの修
復には誤りがありがちで、修復部位でのＤＮＡ配列の非鋳型化（ｕｎｔｅｍｐｌａｔｅｄ
）付加又は欠失が頻繁にもたらされる。いくつかの例において、標的認識配列での切断が
、標的認識部位でのＮＨＥＪを生じている。遺伝子のコード配列中の標的部位のヌクレア
ーゼ誘導性の切断、続くＮＨＥＪによるＤＮＡの修復は、遺伝子の機能を破壊するフレー
ムシフトの突然変異などの突然変異を、コード配列に導入することができる。従って、遺
伝子操作されたメガヌクレアーゼは、細胞集団の遺伝子を効果的にノックアウトするため
に使用できる。
アミノ酸の配列と核酸の配列の両方に関して本明細書で使用しているとき、「パーセン
トの同一性」、「配列同一性」、「パーセントの類似性」、「配列の類似性」等の用語は
、整列したアミノ酸の残基又はヌクレオチド間の類似性を最大限にする配列の整列、同一
又は類似している残基又はヌクレオチドの数、全体の残基又はヌクレオチドの数、並びに
配列の整列における空隙の存在及び長さの関数である配列の整列に基づいた、２つの配列
の類似性の程度の尺度を示す。標準的なパラメータを使用して配列の類似性を判断するた
めの様々なアルゴリズム及びコンピュータプログラムが利用可能である。本明細書で使用
しているとき、配列の類似性は、アミノ酸の配列についてのＢＬＡＳＴｐプログラム、及
び核酸の配列についてのＢＬＡＳＴｎプログラムを使用して測定され、これらは両方とも
、国立生物工学情報センター（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して
利用でき、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ （１９９３），Ｎａｔ
ｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６），
Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．
（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３ ８９－３４０２）；
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．７（１－２）：
２０３－１４に記載されている。本明細書で使用しているとき、２つのアミノ酸配列のパ
ーセントの類似性は、ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムについての、ワードサイズ＝３、ギャッ
プオープニングペナルティ＝－１１、ギャップエクステンションペナルティ＝－１、スコ
アリングのマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２というパラメータに基づくスコアである。本
明細書で使用しているとき、２つの核酸配列のパーセントの類似性は、ＢＬＡＳＴｎアル
ゴリズムについての、ワードサイズ＝１１、ギャップオープニングペナルティ＝－５、ギ
ャップエクステンションペナルティ＝－２、マッチした報酬＝１、及びミスマッチのペナ
ルティ＝－３というパラメータに基づくスコアである。
２つのタンパク質又はアミノ酸の配列の改変に関して本明細書で使用している場合、「
対応する」の用語は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタンパク質における改変のアミノ
酸の位置が、２つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき（例えば、ＢＬＡＳ
Ｔｐプログラムを使用したとき）に、第２のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応し
ているか整列していることを示すために使用される。従って、残基Ｘ及びＹが配列の整列
において互いに対応している場合、ＸとＹが異なる数であり得るという事実にもかかわら
ず、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク
質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の改変に対応している。
本明細書で使用しているとき、「認識した半分の部位」、「認識配列の半分の部位」又
は単に「半分の部位」の用語は、ホモ二量体又はヘテロ二量体のメガヌクレアーゼの単量
体によって、あるいは一本鎖メガヌクレアーゼの１つのサブユニットによって認識される
二本鎖ＤＮＡ分子の核酸の配列を意味する。
本明細書で使用しているとき、「超可変領域」の用語は、比較的高い可変性を有するア
ミノ酸を含む、メガヌクレアーゼの単量体又はサブユニット内の局在化された配列をいう
。超可変領域は、約５０～６０の隣接残基、約５３～５７の隣接残基、又は好ましくは約
５６の残基を含み得る。いくつかの実施形態では、超可変領域の残基は、配列番号１８～
３９のいずれか１つの２４～７９位又は２１５～２７０位に対応し得る。超可変領域は、
認識配列におけるＤＮＡ塩基と接触する１以上の残基を含むことができ、単量体又はサブ
ユニットの塩基の選択性を変えるために改変することができる。超可変領域はまた、メガ
ヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ認識配列と会合するときに、ＤＮＡ骨格に結合する１以上の
残基を含み得る。そのような残基は、ＤＮＡ骨格及び標的認識配列に対するメガヌクレア
ーゼの結合親和性を変えるために改変することができる。本発明の異なる実施形態では、
超可変領域は、１～２０個の残基を含むことができ、それは可変性を示し、塩基の選択性
及び／又はＤＮＡ結合親和性に影響を及ぼすように改変することができる。いくつかの実
施形態において、超可変領域内の可変残基は、配列番号１８～３９のいずれか１つの２４
位、２６位、２８位、３０位、３２位、３３位、３８位、４０位、４２位、４４位、４６
位、４９位、５０位、５４位、６４位、６８位、７０位、７５位、及び７７位の１以上に
対応する。他の実施形態では、超可変領域内の可変残基は、配列番号１８～３９のいずれ
か１つの２１５位、２１７位、２１９位、２２１位、２２３位、２２４位、２２９位、２
３１位、２３３位、２３５位、２３７位、２４０位、２４１位、２４５位、２５５位、２
５９位、２６１位、２６６位、及び２６８位の１以上に対応する。
「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現カセット」、「発現構築物」、「
キメラ構築物」、「構築物」、及び「組換えＤＮＡ断片」の用語は、本明細書で互換的に
用いられ、核酸の断片である。組換え構築物は、天然には一緒に見出さない調節及びコー
ド配列を含むがこれらに限定されない、核酸断片の人工的な組み合わせを含む。例えば、
組換えＤＮＡ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給
源に由来して天然に見出せる様式とは異なる様式で配置されている調節配列及びコード配
列を含み得る。そのような構築物はそれ自体で使用しても、ベクターと共に使用してもよ
い。
本明細書で使用しているとき、「ベクター」又は「組換えＤＮＡベクター」は、複製の
システム、及び所与の宿主細胞におけるポリペプチドコード化配列の転写及び翻訳が可能
である配列を含む構築物であり得る。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当
業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために使用する方法に依拠する。ベクター
は、制限なく、プラスミドベクター及び組換えＡＡＶベクター、又は本発明のメガヌクレ
アーゼをコードする遺伝子を標的細胞に送達するのに適した、当技術分野で公知の他の任
意のベクターを含み得る。当業者は、本発明の単離されたヌクレオチド又は核酸配列のい
ずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換、選択及び増殖させるために、ベクターに存在
していなければならない遺伝的な要素を十分に知っている。
本明細書で使用しているとき、「ベクター」はまた、ウイルスベクターを示すことがで
きる。ウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ
ウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を含み得るが、これらに
限定されない。
本明細書で使用しているとき、「ポリシストロニック」ｍＲＮＡとは、２つ以上のコー
ド配列（即ち、シストロン）を含み、２以上のタンパク質をコードする単一のメッセンジ
ャーＲＮＡをいう。ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、Ｐ２Ａ
要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含むがこれらに限定されない、同じｍＲＮＡ分子に
由来する２つ以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要素を
含み得る。
本明細書で使用しているとき、「対照」又は「対照細胞」とは、遺伝子改変細胞の遺伝
子型又は表現型の変化を測定するための基準点を提供する細胞をいう。対照細胞は、例え
ば、（ａ）野生型細胞、即ち、遺伝子変化細胞をもたらした遺伝子改変用の出発材料と同
じ遺伝子型のもの；（ｂ）遺伝子改変細胞と同じ遺伝子型であるが、ヌルの構築物（即ち
、対象となる形質に既知の効果を及ぼさない構築物）で形質転換された細胞；又は（ｃ）
遺伝子改変細胞と遺伝的に同一であるが、改変した遺伝子型又は表現型の発現を誘導する
条件又は刺激又は更なる遺伝子改変に曝されない細胞を含み得る。
２つのタンパク質又はアミノ酸の配列の改変に関して本明細書で使用している場合、「
対応する」の用語は、第１のタンパク質における特定の改変が第２のタンパク質における
改変と同じアミノ酸残基の置換であること、及び第１のタンパク質における改変のアミノ
酸の位置が、２つのタンパク質が標準的な配列の整列に曝されたとき（例えば、ＢＬＡＳ
Ｔｐプログラムを使用したとき）に、第２のタンパク質の改変のアミノ酸の位置と対応し
ているか整列していることを示すために使用される。従って、残基Ｘ及びＹが配列の整列
において互いに対応している場合、ＸとＹが異なる数であり得るという事実にもかかわら
ず、第１のタンパク質における残基「Ｘ」のアミノ酸「Ａ」への改変は、第２のタンパク
質におけるアミノ酸「Ａ」への残基「Ｙ」の改変に対応している。
本明細書で使用しているとき、「治療」又は「対象を治療する」の用語は、少なくとも
１つのＨＢＶ粒子のゲノムを切断することによってウイルスのＨＢＶ増殖速度を緩徐化又
は停止させる目的で、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、又は本発明の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を、ＨＢＶに感染した対象へ投与すること
をいう。そのような治療は、対象におけるＨＢＶの形質移入及び複製を低減又は防止し、
対象におけるＨＢＶの１又は複数の症状を部分的又は完全に取り除く。ＨＢＶ感染の症状
の軽減を評価するための手段は、酵素アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレ
ベルを判定すること、又は血清の転換、即ちＨｂｅＡｇの消失を測定することによる、肝
機能の測定を含み得る。更に、ＨＢＶの症状の軽減又は低減は、肝生検で検査し、当技術
分野で周知の方法で組織線維症のレベルを測定することによって判断できる。循環ウイル
ス粒子の数は、例えば、ＰＣＲを用いてＨＢＶ ＤＮＡのレベルを測定することによって
、又は血中のＨＢｓＡｇレベルを検出することによって、判断することができる。「治療
」又は「対象を治療する」の用語は更に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸を含む細胞（例えば肝細胞）の投与を示すことができ、この場合細胞は標的組織（
例えば肝臓）に送達され、対象においてＨＢＶの感染を治療するのに十分な量で遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼを産生し、それによりＨＢＶの１以上の症状の部分的又は完全
な軽減をもたらす。いくつかの態様では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ、
それをコードする核酸、又は本発明の遺伝子改変細胞は、本発明の医薬組成物の形態で、
治療中に投与される。
「Ｂ型肝炎ウイルス感染」の用語は、慢性肝疾患／障害、炎症、線維症の状態、及び肝
がんをはじめとした増殖性障害等の、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染に関連する、又は感染
に起因するいずれかの状態を示す。持続性の慢性ＨＢＶ感染は、疲労、肝障害、肝硬変、
及び原発性肝がんである肝細胞がんを引き起こし得る。
本明細書で使用しているとき、「増殖する」及び「増殖」の用語は、活発に分裂してヒ
ト細胞に感染するＨＢＶ細胞を示す。従って、増殖の減少は、本明細書に開示の遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼ、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を
投与していない適切な対照と比較したとき少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１
０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９
０％、９５％、又は１００％の減少を含む、ＨＢＶの増殖の任意の減少を示す。本願を通
して、「増殖性障害」の用語は、組織の望まれない又は異常な増殖によって特徴付けられ
るいずれかの疾患／障害を示す。また、本明細書で使用しているとき、「増殖性障害」の
用語は、細胞の調節されていない及び／又は異常な増殖が、がん性又は非がん性であり得
る望まれない状態又は疾患の発症をもたらし得る状態をいう。
「有効量」又は「治療有効量」の用語は、有益な又は望ましい生物学的及び／又は臨床
的な結果をもたらすのに十分な量を示す。治療有効量は、メガヌクレアーゼ製剤又は組成
物、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重、健康状態、及び反応性に
応じて変わる。特定の実施形態では、本明細書に開示される有効量の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼ又は医薬的組成物は、ＨＢＶに感染している対象におけるＨＢＶのレベル
又は増殖を減少させるか、ＨＢＶの少なくとも１つの症状を低減させる。
「脂質ナノ粒子」の用語は、平均直径が１０～１０００ナノメートルの典型的には球形
の構造を有する脂質組成物を示す。いくつかの製剤において、脂質ナノ粒子は、少なくと
も１つのカチオン性脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つの複
合脂質を含み得る。ｍＲＮＡ等の核酸を封入するのに適している、当技術分野において公
知の脂質ナノ粒子が、本発明にて使用するために企図される。
本明細書で使用するとき、変数に対する数値範囲の記載は、その範囲内の任意の値に等
しい変数で本発明を実施できることを伝えることを意図している。従って、本質的に離散
的な変数については、その変数は、範囲の端点を含んだ数値範囲内の任意の整数の値に等
しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数については、その変数は、範囲の端点を含
んだ数値範囲内の任意の実数の値に等しくなり得る。限定するものではなく例として、０
～２の値を有すると記載された変数は、その変数が本質的に離散的である場合には０、１
又は２の値を取り得、変数が本質的に連続的である場合には、０．０、０．１、０．０１
、０．００１の値、又は０以上２以下の他のいずれかの実数の値を取り得る。
２．１ 発明の原理
本発明は、部分的に、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、ＨＢＶゲノム内のＯＲＦ
を切断することによってＨＢＶのレベルを低下させる、又はＨＢＶの増殖を遅くするため
に使用され得るという仮説に基づく。より具体的には、メガヌクレアーゼは、複数のＨＢ
Ｖ遺伝子型のゲノム内に存在する認識配列を認識して切断するように遺伝子操作すること
ができる。従って、単一の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを利用して、ＨＢＶのレベ
ル又は増殖を減少させたり、Ｂ型肝炎ウイルスの複数の遺伝子型のＨＢＶ感染の症状を低
減させたりすることができる。
従って、本発明は、ＨＢＶゲノムの少なくとも２つの遺伝子型のＯＲＦ内の認識配列を
認識して切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを包含する。また、本発明は、その
ような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを、医薬組成物中で、及びＨＢＶ感染を治療す
るための方法において使用する方法を包含する。更に、本発明は、遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼのタンパク質、又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸を
含む医薬組成物、及びＨＢＶの感染を治療するためのそのような組成物を使用することを
包含する。
２．２ ＨＢＶのゲノム内の認識配列を認識して切断するためのメガヌクレアーゼ
部位特異的ヌクレアーゼを使用してウイルスのゲノムにてＤＮＡを切断することは可能
であるという点、及びそのようなＤＮＡの切断がＮＨＥＪを介したゲノムの永続的な改変
をもたらすことができて、その結果ＨＢＶビリオンがヒトの細胞を分裂させたり感染させ
ることはもはやできなくなるという点は、当技術分野において公知である。従って、一実
施形態では、本発明は、遺伝子操作された組換えメガヌクレアーゼを使用して実施するこ
とができる。
好ましい実施形態では、本発明を実施するために使用されるヌクレアーゼは一本鎖メガ
ヌクレアーゼである。一本鎖メガヌクレアーゼは、リンカーペプチドによって結合された
Ｎ末端サブユニット及びＣ末端サブユニットを含む。２つのドメインのそれぞれは、認識
配列の半分（即ち、認識した半分の部位）を認識し、ＤＮＡ切断の部位は、２つのサブユ
ニットの界面付近の認識配列の中にある。ＤＮＡ鎖の切断は、４塩基対によって相殺させ
て、メガヌクレアーゼによるＤＮＡの切断が一対の４塩基対、３’一本鎖オーバーハング
を生成するようにする。
いくつかの例において、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１－２
認識配列（配列番号１０）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ１－２
認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ
１／ｐｒｅＳ２のＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ１－２認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ
、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、それぞれ配列番号３～５及
び７～９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ」と呼ばれ
る。例示的なＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼは、配列番号１８～２１に提供されている。
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ５－６認識配列
（配列番号１２）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ５－６認識配列
は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒ
ｅＳ２のＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ５－６認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ
、Ｅ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、それぞれ配列番号３～７及び９）の
ゲノムに少なくとも見出すことができる。そのような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
は、本明細書において集合的に「ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的な
ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼは、配列番号２２～２８に提供されている。
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ７－８認識配列
（配列番号１４）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ７－８認識配列
は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質のＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ７－８認
識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝子型（例えば、
それぞれ配列番号３～６、８、及び９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。その
ような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ７－８
メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼは、配列番号２
９～３２に提供されている。
更なる例では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ１１－１２認識
配列（配列番号１６）を認識し切断するように遺伝子操作されている。ＨＢＶ１１－１２
認識配列は、複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質ＯＲＦの中に位置している。ＨＢＶ１
１－１２認識配列は、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧを含む複数のＨＢＶ遺伝
子型（例えば、それぞれ配列番号３～９）のゲノムに少なくとも見出すことができる。そ
のような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書において集合的に「ＨＢＶ１１
－１２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる。例示的なＨＢＶ１１～１２メガヌクレアーゼは、
配列番号３４～４０に提供されている。
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、第１の超可変（ＨＶＲ１）領域を含む
第１のサブユニット及び第２の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む第２のサブユニットを含む
。更に、第１のサブユニットは認識配列の第１の認識した半分の部位（例えば、ＨＢＶ１
、ＨＢＶ５、ＨＢＶ７、又はＨＢＶ１１の半分の部位）に結合し、第２のサブユニットは
認識配列の第２の認識した半分の部位（例えば、ＨＢＶ２、ＨＢＶ６、ＨＢＶ８、又はＨ
ＢＶ１２の半分の部位）に結合する。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが一本鎖メガヌ
クレアーゼである実施形態では、第１及び第２のサブユニットは、ＨＶＲ１領域を含み第
１の半分の部位と結合する第１のサブユニットが、Ｎ末端サブユニットとして位置し、Ｈ
ＶＲ２領域を含み第２の半分の部位と結合する第２のサブユニットが、Ｃ末端サブユニッ
トとして位置するように配向できる。別の実施形態では、第１及び第２のサブユニットは
、ＨＶＲ１領域を含み第１の半分の部位と結合する第１のサブユニットが、Ｃ末端サブユ
ニットとして位置し、ＨＶＲ２領域を含み第２の半分の部位と結合する第２のサブユニッ
トが、Ｎ末端サブユニットとして位置するように配向できる。本発明の例示的なＨＢＶ１
－２メガヌクレアーゼを表１に提示する。本発明の例示的なＨＢＶ５－６メガヌクレアー
ゼを表２に提示する。本発明の例示的なＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼを表３に提示する
。本発明の例示的なＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼを表４に提示する。
表１；ＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１０）を認識し切断するように遺伝子操作された
例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
Figure 2023153824000001
＊「ＨＢＶ１サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ２サブユニット（％）」は、各メガヌク
レアーゼのＨＢＶ１結合及びＨＢＶ２結合サブユニット領域と、ＨＢＶ１－２×．２メガ
ヌクレアーゼの各ＨＢＶ１結合及びＨＢＶ２結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配
列の同一性を表す。
表２；ＨＢＶ５－６認識配列（配列番号１２）を認識し切断するように遺伝子操作された
例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
Figure 2023153824000002
＊「ＨＢＶ５サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ６サブユニット（％）」は、各メガヌク
レアーゼのＨＢＶ５結合及びＨＢＶ６結合サブユニット領域と、ＨＢＶ５－６×．３３メ
ガヌクレアーゼの各ＨＢＶ５結合及びＨＢＶ６結合サブユニット領域との間のアミノ酸の
配列の同一性を表す。
表３；ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１４）を認識し切断するように遺伝子操作された
例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
Figure 2023153824000003
＊「ＨＢＶ７サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ８サブユニット（％）」は、各メガヌク
レアーゼのＨＢＶ７結合及びＨＢＶ８結合サブユニット領域と、ＨＢＶ７－８×．２メガ
ヌクレアーゼの各ＨＢＶ７結合及びＨＢＶ８結合サブユニット領域との間のアミノ酸の配
列の同一性を表す。
表４；ＨＢＶ１１－１２認識配列（配列番号１６）を認識し切断するように遺伝子操作さ
れた例示的な遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
Figure 2023153824000004
＊「ＨＢＶ１１サブユニット（％）」及び「ＨＢＶ１２サブユニット（％）」は、各メガ
ヌクレアーゼのＨＢＶ１１結合及びＨＢＶ１２結合サブユニット領域と、ＨＢＶ１１－１
２×．２６メガヌクレアーゼの各ＨＢＶ１１結合及びＨＢＶ１２結合サブユニット領域と
の間のアミノ酸の配列の同一性を表す。
２．３ エンドヌクレアーゼの送達及び発現方法
本明細書に開示されているのは、対象のＨＢＶ感染又はＨＣＣを治療するための方法で
ある。同様に、対象におけるＨＢＶ感染の症状の軽減及びＨＢＶの量の減少、ＨＢＶの増
殖速度の低下又はＨＣＣの治療の方法が提供されており、医薬的に許容される担体及び本
明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ（又は遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸）を含む医薬組成物を投与することを含む。本発明の方法にお
いて、本明細書に開示されている遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをＨＢＶゲノムに与えることができる標的細胞のＤＮＡ／ＲＮＡに送
達され、及び／又はそれから発現され得る。
本明細書に開示される遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、タンパク質の形態で、又
は好ましくは遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸として、細胞内に送達
され得る。そのような核酸は、ＤＮＡ（例えば、環状又は線状化プラスミドＤＮＡ又はＰ
ＣＲ産物）又はＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）であり得る。遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼコード配列がＤＮＡの形態で送達される実施形態について、それはヌクレアーゼ遺伝子
の転写を促進するためにプロモータに作動可能に連結させるべきである。本発明に適した
哺乳動物プロモータには、サイトメガロウイルス初期（ＣＭＶ）プロモータ（Ｔｈｏｍｓ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８
１（３）：６５９－６３）、又はＳＶ４０初期プロモータ（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃ
ｈａｍｂｏｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ．２９０（５８０４）：３０４－１０）、並び
に誘導性プロモータ、例えばテトラサイクリン誘導性プロモータ（Ｄｉｎｇｅｒｍａｎｎ
ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２（９）：４０３８－４
５）等の構成的プロモータが含まれる。また、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼは、合成プロモータに作動可能に連結され得る。合成プロモータは、限定することなく
、ＪｅＴプロモータを挙げることができる（国際公開第２００２／０１２５１４号パンフ
レット）。特定の実施形態では、本明細書に開示される場合の遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードする核酸配列は、肝特異的プロモータに作動可能に連結され得る。肝特
異的プロモータの例としては、限定することなく、ヒトα－１アンチトリプシンプロモー
タ及びアポリポタンパク質Ａ－ＩＩプロモータが挙げられる。
特定の実施形態では、少なくとも１つの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
る核酸配列が、組換えＤＮＡ構築物又は発現カセットに送達される。例えば、組換えＤＮ
Ａ構築物は、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドする核酸配列とを含む発現カセット（即ち、「カセット」）を含むことができる。他の
実施形態では、組換えＤＮＡ構築物は、２以上のカセットを含み、各カセットがプロモー
タと、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み
、各遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対
する特異性を有する。特定の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、２つのカセット
、３つのカセット、４つのカセット、又はそれ以上を含み得る。例えば、カセット又はカ
セットの組み合わせは、ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ
、ＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼの任意の数又
は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形態において、単一のカセット
は、ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７－８メガ
ヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼをコードし得る。別の特定の実施
形態では、カセット又はカセットの組み合わせは、ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ及びＨ
ＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼをコードし得る。
他の実施形態において、組換えＤＮＡ構築物は、プロモータ及びポリシストロニック核
酸配列を含むカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動
して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが
細胞に送達されるが、その理由は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする遺伝
子が、細胞のゲノムに組み込まれる可能性を低下させるためである。遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードするそのようなｍＲＮＡは、インビトロでの転写といった、当技
術分野において公知の方法を利用して産生され得る。いくつかの実施形態において、ｍＲ
ＮＡは７－メチル－グアノシンを用いてキャップされている。いくつかの態様において、
ｍＲＮＡはポリアデニル化されていてもよい。
特定の実施形態では、本発明の遺伝子操作されたヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡは
、細胞内で同時に発現される２以上のヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲ
ＮＡであってよい。いくつかの実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢ
Ｖゲノムが複数の部位で切断されるように、ＨＢＶゲノムの異なる認識配列を標的とする
、本明細書に記載の２以上のメガヌクレアーゼをコードし得る。いくつかの実施形態にお
いて、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記載されている２以上のメガヌクレア
ーゼ、及び細胞において治療上有益な効果を誘導する少なくとも１つの更なるタンパク質
をコードし得る。本発明のポリシストロニックｍＲＮＡは、ＩＲＥＳ要素、Ｔ２Ａ要素、
Ｐ２Ａ要素、Ｅ２Ａ要素、及びＦ２Ａ要素を含むがこれらに限定されない、同じｍＲＮＡ
分子に由来する２以上の遺伝子の翻訳を可能にする、当技術分野において公知の任意の要
素を含み得る。特定の実施形態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、本明細書に記
載の２つのメガヌクレアーゼをコードするバイシストロンｍＲＮＡ、本明細書に記載の３
つのメガヌクレアーゼをコードするトリシストロンｍＲＮＡ、又は本明細書に記載の４つ
のメガヌクレアーゼをコードするクアドシストロンｍＲＮＡであり、この場合、各ｍＲＮ
Ａによってコードされるヌクレアーゼは、ＨＢＶゲノムの異なる認識配列に対して特異性
を有する。例えば、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ、Ｈ
ＢＶ５－６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１－１２メ
ガヌクレアーゼの任意の数又は組み合わせをコードすることができる。いくつかの実施形
態において、ポリシストロニックｍＲＮＡは、ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ５
－６メガヌクレアーゼ、ＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼ、及びＨＢＶ１１－１２メガヌク
レアーゼをコードし得る。別の特定の実施形態では、ポリシストロニックｍＲＮＡは、Ｈ
ＢＶ５－６メガヌクレアーゼ及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼをコードするバイシ
ストロンｍＲＮＡであり得る。
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする核酸は、一本鎖Ｄ
ＮＡの鋳型を用いて細胞に導入することができる。一本鎖ＤＮＡは、遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’ＡＡＶ逆方
向末端反復（ＩＴＲ）を更に含み得る。他の実施形態では、一本鎖ＤＮＡは、遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼをコードする配列の上流及び／又は下流に５’及び／又は３’相
同性アームを更に含み得る。
別の特定の実施形態では、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子は、線状化
ＤＮＡの鋳型を用いて細胞に導入することができる。いくつかの例では、エンドヌクレア
ーゼをコードするプラスミドＤＮＡは、１以上の制限酵素により消化させることができ、
環状プラスミドＤＮＡが細胞に導入される前に線状化されるようにする。
精製されたヌクレアーゼタンパク質は、本明細書において以下に更に詳述されるものを
含む、当技術分野において公知の様々な異なるメカニズムによってゲノムＤＮＡを切断す
るために、細胞内に送達し得る。
本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを送達するための標的組織は、限定するこ
となく肝臓の細胞、例えば肝細胞、又は好ましくは初代肝細胞、より好ましくはヒト肝細
胞又はヒト初代肝細胞、ＨｅｐＧ２．２．１５又はＨｅｐＧ２－ｈＮＴＣＰ細胞を含む。
論じたように、本発明のメガヌクレアーゼは、精製タンパク質として、又はメガヌクレア
ーゼをコードするＲＮＡ若しくはＤＮＡとして送達することができる。一実施形態では、
メガヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、又はＤＮ
Ａベクターは、標的組織への直接的な注入によって、標的細胞（例えば、肝臓の細胞）に
供給される。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮＡ、又はＤＮＡを、循環
系を介して全身的に送達することができる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、全身投与、又は標的組織への投与のために、公知の
技術に従って、医薬的に許容される担体用に処方される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，
Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２１ｓ
ｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において、タンパク質
／ＲＮＡ／ｍＲＮＡは、典型的には医薬的に許容される担体と混合される。担体は当然、
製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、また患
者にとって有害であってはならない。担体は、固体又は液体、あるいはその両方であり得
、単位用量の製剤として化合物と共に製剤化できる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、細胞の取り込みを容易にするために細胞透過性ペプ
チド又は標的化リガンドに結合する。当技術分野において公知の細胞透過性ペプチドの例
には、ポリアルギニン（Ｊｅａｒａｗｉｒｉｙａｐａｉｓａｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２００
８）Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．１６：１６２４－９）、ＨＩＶウイルス由来のＴＡＴペプチド（
Ｈｕｄｅｃｚ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．２５：６７９－７
３６）、ＭＰＧ（Ｓｉｍｅｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４）、Ｐｅｐ－１（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ
．（２００４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：７６９８－７７０６、及びＨＳＶ－１
ＶＰ－２２（Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆ
ｅ Ｓｃｉ．６２：１８３９－４９）が含まれる。別の実施形態において、エンドヌクレ
アーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞
にて発現される特定の細胞表面の受容体を認識する抗体に共有結合又は非共有結合で結合
させて、エンドヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ／ｍＲＮＡが標的細胞に結合し、標的細
胞によって内在化されるようにする。あるいは、エンドヌクレアーゼタンパク質／ＤＮＡ
／ｍＲＮＡを、そのような細胞表面の受容体の天然のリガンド（又は天然のリガンドの一
部）に共有結合又は非共有結合で結合させることができる（ＭｃＣａｌｌ，ｅｔ ａｌ．
（２０１４）Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｒｒｉｅｒｓ．２（４）：ｅ９４４４４９；Ｄｉｎｄａ
， ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１
２６４－７４；Ｋａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．１５（３）：２２０－３０；Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｅｘｐｅ
ｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１０（１１）：１４９１－５
０８）。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、（例えば、肝類洞壁内皮細胞又は造血内皮細胞、あるい
はそれに分化する前駆細胞の近傍において）肝臓の所望の領域内への注射又は移植のため
に生分解性ヒドロゲル内に封入される。ヒドロゲルは、頻繁な注入を必要とせずに標的組
織の所望の領域へ治療用ペイロードの持続する調整可能な放出をもたらすことができ、刺
激応答材料（例えば温度応答性及びｐＨ応答性ヒドロゲル）は、環境的又は外部から適用
された合図に反応してペイロードを放出するように設計され得る（Ｋａｎｇ Ｄｅｒｗｅ
ｎｔ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｔｒａｎｓ Ａｍ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ．１
０６：２０６－２１４）。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ナノ粒子に共有結合で、又は好ましくは非共有結合
で結合されるか、当技術分野で公知の方法を用いてそのようなナノ粒子内に封入される（
Ｓｈａｒｍａ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１４）。
ナノ粒子は、その長さスケールが＜１μｍ、好ましくは＜１００ｎｍであるナノスケール
送達システムである。そのようなナノ粒子は、金属、脂質、ポリマー、又は生体高分子か
ら構成されるコアを用いて設計することができ、エンドヌクレアーゼタンパク質、ｍＲＮ
Ａ、又はＤＮＡの複数のコピーをナノ粒子コアに付着又は封入することができる。これに
より、各細胞に送達されるタンパク質／ｍＲＮＡ／ＤＮＡのコピー数が増加し、従って、
各エンドヌクレアーゼの細胞内での発現が増加して標的認識配列が切断される可能性が最
大になる。そのようなナノ粒子の表面をポリマー又は脂質（例えば、キトサン、カチオン
性ポリマー、又はカチオン性脂質）で更に改変して、その表面が細胞の送達及びペイロー
ドの取り込みを増強する追加の機能性を付与するコア－シェルナノ粒子を形成し得る（Ｊ
ｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．３３（３０）：７６２１
－３０）。ナノ粒子を適切な細胞型に向かわせるために、及び／又は細胞の取り込みの可
能性を高めるために、有利にもナノ粒子を更に標的化分子に結合させることができる。そ
のような標的化分子の例には、細胞表面の受容体に特異的な抗体及び細胞表面受容体に天
然のリガンド（又は天然のリガンドの一部）が含まれる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、リポソーム内に封入されるか、カチオン性脂質を用
いて複合体化される（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ
ｒｅａｇｅｎｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａ
ｄ，ＣＡ；Ｚｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３
：７３－８０；Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２
０１１：８６３７３４を参照）。リポソーム及びリポプレックス製剤は、ペイロードを分
解しないよう保護し、標的部位での蓄積及び保持を増強し、標的細胞の細胞膜との融合及
び／又は細胞膜の破壊を介して、細胞の取り込み及び送達の効率を高めることができる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ポリマー足場（例えばＰＬＧＡ）内に封入されるか
、カチオンポリマー（例えばＰＥＩ、ＰＬＬ）を用いて複合体化される（Ｔａｍｂｏｌｉ
ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ．２（４）：５２３－５３６）。ポリ
マー担体は、ポリマーの侵食及び薬物の拡散の制御を通じて調整可能な薬物放出速度をも
たらすように設計することができ、また高い薬物封入効率により、所望の標的細胞集団へ
細胞内の送達をするまで、治療ペイロードの保護を提供することができる。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又は遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、ミセルに自己集合する両親媒性分子と組
み合わされる（Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９（１１）
：９５６－６６）。ポリマーのミセルは、凝集を防ぎ、電荷の相互作用をマスクし、非特
異的な相互作用を減少させることができる親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコ
ール）で形成されたミセルのシェルを含み得る。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、標的細胞への投与及び／又は送達のために、エマルジョ
ン又はナノエマルジョン（即ち、＜１ｎｍの平均粒径を有する）に処方される。「エマル
ション」の用語は、限定することなく、水不混和性の相を水相と混合させたときに、無極
性残基（例えば炭化水素の長鎖）を水及び極性の頭部の基から水に向けて遠ざける疎水性
の力の結果として形成することができる脂質の構造を含んだ、任意の水中油型、油中水型
、水中油中水型、又は油中水中油型の分散液又は液滴を示す。これらの他の脂質構造とし
ては、単層、小層、及び多層脂質小胞、ミセル、及びラメラ相が挙げられるが、これらに
限定されない。エマルジョンは、水相と親油性相（典型的には油と有機溶媒を含有する）
で構成される。また、エマルジョンは、１以上の界面活性剤を頻繁に含有する。ナノエマ
ルション配合物は、例えば、米国特許出願公開第２００２／００４５６６７号及び第２０
０４／００４３０４１号、並びに米国特許第６，０１５，８３２号、第６，５０６，８０
３号、第６，６３５，６７６号、及び第６，５５９，１８９号に記載されているように周
知であり、その各々は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
いくつかの実施形態において、エンドヌクレアーゼタンパク質、又はエンドヌクレアー
ゼをコードするＤＮＡ／ｍＲＮＡは、多機能ポリマーコンジュゲート、ＤＮＡデンドリマ
ー、及びポリマーデンドリマーに共有結合で接着するか、非共有結合で関連させられる（
Ｍａｓｔｏｒａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｎｏｓｃａｌｅ．７（９）：３８
４５－５６；Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．９７（１
）：１２３－４３）。デンドリマーの発生は、ペイロードの容量及びサイズを制御でき、
また高い薬物ペイロード容量をもたらすことができる。更に、複数の表面の基の表示を利
用して、安定性を向上させ、非特異的な相互作用を低減し、細胞特異的な標的化及び薬物
放出を増強することができる。
いくつかの態様において、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子はウイルスベクター
を用いて送達される。そのようなベクターは当技術分野において公知であり、レトロウイ
ルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイ
ルス（ＡＡＶ）ベクターが含まれる（Ｖａｎｎｕｃｃｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎｅ
ｗ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１－２２に概説）。いくつかの実施形態では、ウイルス
ベクターは標的組織（例えば、肝組織）に直接注射される。別の実施形態において、ウイ
ルスベクターは循環系を介して全身的に送達される。異なるＡＡＶベクターが異なる組織
に位置付けられる傾向があることは、当技術分野において公知である。肝臓標的組織にお
いて、肝細胞の効果的な形質導入は、例えば、ＡＡＶ血清型２、８、及び９で示されてい
る（Ｓａｎｄｓ（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０７：１４１－１５
７）。また、ＡＡＶベクターは、それらが宿主細胞で第二鎖のＤＮＡの合成を必要としな
いように、自己相補的であり得る（ＭｃＣａｒｔｙ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．８：１２４８－５４）。
一実施形態では、エンドヌクレアーゼ遺伝子送達に使用されるウイルスベクターは、自
己制限ウイルスベクターである。自己制限ウイルスベクターは、ベクター内の遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼについての認識配列の存在に起因して、細胞又は生物において限
られた持続時間を有し得る。従って、自己制限ウイルスベクターは、プロモータ、本明細
書に記載のエンドヌクレアーゼ、及びＩＴＲ内のエンドヌクレアーゼ認識部位をコードす
るように遺伝子操作することができる。自己制限ウイルスベクターは、エンドヌクレアー
ゼが発現され、ゲノム内の内因性認識配列で細胞のゲノムを切断することができるように
、エンドヌクレアーゼ遺伝子を細胞、組織、又は生物に送達する。送達されたエンドヌク
レアーゼはまた、自己制限ウイルスベクター自体の中で標的部位を見つけて、その標的部
位でベクターを切断する。一旦切断されると、ウイルスゲノムの５’及び３’末端が露出
されてエキソヌクレアーゼによって分解され、そのためウイルスを死滅させて、エンドヌ
クレアーゼの産生を止める。
エンドヌクレアーゼ遺伝子が、ＤＮＡの形態（例えばプラスミド）で、及び／又はウイ
ルスベクター（例えばＡＡＶ）を介して送達される場合、それらはプロモータに作動可能
に連結されなければならない。いくつかの実施形態において、これは、ウイルスベクター
由来の内因性プロモータ（例えば、レンチウイルスベクターのＬＴＲ）又は周知のサイト
メガロウイルス若しくはＳＶ４０ウイルス初期プロモータ等のウイルスプロモータであり
得る。好ましい実施形態において、メガヌクレアーゼ遺伝子は、標的細胞において優先的
に遺伝子発現を駆動するプロモータに作動可能に連結されている。肝特異的プロモータの
例としては、限定することなく、ヒトα－１アンチトリプシンプロモータ及びアポリポタ
ンパク質Ａ－ＩＩプロモータが挙げられる。
特定の実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータと、本明細書に記載の遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む。また、ウイル
スベクターは、２以上のカセットを含み得、各カセットがプロモータと、本明細書に記載
の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列を含み、各遺伝子操作された
メガヌクレアーゼが、本明細書に開示の異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を有する。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、プロモータ及びポリシストロニック核酸
配列を含む１つのカセットを含み、プロモータが、ポリシストロニック核酸配列の発現を
駆動して、標的細胞において本明細書に記載のポリシストロニックｍＲＮＡ、例えば遺伝
子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡを生成する。
本明細書に開示のメガヌクレアーゼをＨＢＶに感染した対象の肝臓に送達するための方
法及び組成物が提供される。一実施形態では、哺乳動物から取り出された生来の肝細胞は
、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターで形質導入することができる
。あるいは、ＨＢＶ感染対象の生来の肝細胞は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及び
／又は肝の再生を刺激する分子、例えば肝毒素をコードするアデノウイルスベクターで、
エクスビボで形質導入され得る。好ましくは、肝毒素はｕＰＡであり、ウイルスベクター
によって発現されると、肝細胞からのその分泌を阻害するように改変されている。別の実
施形態では、ベクターはｔＰＡをコードし、これは肝細胞の再生をデノボで刺激すること
ができる。哺乳動物から取り出した形質導入された肝細胞は、次いで哺乳動物に戻すこと
ができ、その場合、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの発現に資する条件が付与される
。典型的には、形質導入された肝細胞は、脾臓又は門脈脈管構造を通して注入することに
よって患者に戻すことができ、投与は、１～５日以上の期間にわたって、単回又は複数回
であり得る。
本発明の方法のインビボの態様では、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし、
対象に投与されるレトロウイルス、シュードタイプ又はアデノウイルス関連ベクターが構
築されている。遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするベクターの投与は、分泌
障害の肝毒素をコードする、又はｔＰＡをコードするアデノウイルスベクターの投与と共
に起こり得、それは肝毒素として作用することなく肝細胞の再生を刺激する。
適切な用量は、他の要因の中でも、選択された任意のＡＡＶベクターの詳細（例えば、
血清型等）、投与経路、治療される対象（即ち、年齢、体重、性別、及び対象の全身状態
）、及び投与の様式に依存する。従って、適切な投与量は患者ごとに異なり得る。適切な
有効量は、当業者が容易に判断することができる。投薬治療は、単回投与計画又は複数回
投与計画であり得る。更に、対象は、極力適切な多さの用量を投与され得る。当業者は適
切な用量数を容易に判断することができる。投与量は、別の投与経路を考慮に入れるか、
治療の利益と任意の副作用とのバランスをとるために調整する必要があり得る。
２．４ 医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼ、又は医薬的に許容される担体及び本発明の遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含む医薬組成
物を提供する。他の実施形態において、本発明は、医薬的に許容される担体と、本明細書
に開示されるような遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを細胞が発現する標的組織に送達
することができる本発明の細胞とを含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、
ＨＢＶを有する対象を治療すること、ＨＢＶのレベル若しくは増殖を低減させること、Ｈ
ＢＶの少なくとも１つの症状を減少させること、又はＨＣＣを治療することに有用であり
得る。
医薬組成物は、標的ＨＢＶ株の遺伝子型に従って、設計又は選択することができる。本
明細書に詳細に記載されるように、本発明のメガヌクレアーゼは、ＨＢＶの特定の遺伝子
型における認識配列を認識して切断するように遺伝子操作されている。例えば、ＨＢＶ１
－２メガヌクレアーゼ（例えば、配列番号１８～２１）は、少なくともＨＢＶ遺伝子型Ａ
、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３～５及び７～９）のゲノムに見
出されるＨＢＶ１－２認識配列を認識し切断する。更に、本明細書に開示される遺伝子操
作されたメガヌクレアーゼの認識配列は、配列番号３～９において提供される各遺伝子型
の例に対して１００％の配列同一性を共有してはいないＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、
Ｅ、Ｆ、及びＧの単離体にて見出すことができる。本明細書で使用しているとき、ＨＢＶ
の「単離体」は、配列番号３～９のいずれかにおいて提供される、対応する遺伝子型の例
と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なく
とも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８
％、少なくとも９９％、又はそれより多くの配列同一性を共有し得る。いくつかの実施形
態において、本明細書に開示される医薬組成物は、配列番号１０、１２、１４、又は１６
に定められる認識配列を含むＨＢＶの任意の遺伝子型を有する対象に投与することができ
る。
そのような医薬組成物は公知の技術に従って調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａ
ｃｙ（２１ｓｔｅｄ．２００５）を参照されたい。本発明による医薬製剤の製造において
、エンドヌクレアーゼポリペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ／ＲＮＡ）は、典型的
には、医薬上許容される担体と混合され、得られる組成物は対象に投与される。担体は当
然、製剤の他のいずれかの成分と相溶性であるという意味で許容されなければならず、ま
た対象にとって有害であってはならない。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物
は、対象における疾患の治療に有用な１又は複数の追加の薬剤又は生体分子を更に含むこ
とができる。同様に、追加の薬剤及び／又は生体分子を別々の組成物として同時投与する
ことができる。
特定の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガ
ヌクレアーゼ（又は遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸）の組み合わせ
を含むことができ、この場合それぞれの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、異なるＨ
ＢＶ認識配列に対する特異性を有し、その結果、単一の医薬組成物が、対象における広範
なアレイのＨＢＶ遺伝子型及び／又は遺伝子型単離体の治療に広範囲に有用となる。同様
に、他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、異なるＨＢＶ認識配列に対する特異性を
有する本明細書に記載の複数の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするポリシス
トロニックｍＲＮＡ（又は発現時にポリシストロニックｍＲＮＡを産生するカセットを有
する組換えＤＮＡ構築物又はウイルスベクター）を含み得る。そのような医薬組成物はま
た、対象における広範なアレイのＨＢＶ遺伝子型及び／又は遺伝子型単離体の治療に広範
囲に有用となる。いずれの場合も、そのような医薬組成物は、特定のＨＢＶ遺伝子型又は
単離体が対象において既知であるか未知であるときの単一の治療として有用であり得る。
例えば、本明細書に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む、又は本明細書
に開示の複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含む医薬組成物は
、ＨＢＶの複数の遺伝子型に感染した、又はＨＢＶの未知の遺伝子型に感染した患者に投
与できる。従って、複数の異なる組換えメガヌクレアーゼを含む医薬組成物を準備するこ
と、又は複数の異なる組換えメガヌクレアーゼをコードする核酸分子を含むことで、資源
によりＨＢＶの正確な遺伝子型判定ができず、また迅速で広い治療の解決が望まれるＨＢ
Ｖ感染の治療及び制御に対する柔軟な選択肢が得られる。
本発明の特定の実施形態では、医薬組成物は、脂質ナノ粒子内に封入された本明細書に
記載の１以上のｍＲＮＡを含むことができ、それは本明細書の他の箇所に記載されている
。特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に
対する特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードする
、本明細書に記載の２以上のｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は
、それぞれが異なるＨＢＶ認識配列に対して特異性を有する本発明の遺伝子操作されたメ
ガヌクレアーゼをコードする、本明細書に記載の２、３、又は４つのｍＲＮＡを含み得る
。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の異なるＨＢＶ認識配列に対する
特異性を有する本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをそれぞれコードす
る、本明細書に記載の１以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含み得る。特定の実施形態
では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２、３、又は４つの遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼをコードするポリシストロニックｍＲＮＡを含むことができる。他の特定の実施
形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書に記載の２以上のポリシストロニックｍＲＮＡを含
むことができ、各々本発明の２以上の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする。
本発明での使用が企図されるいくつかの脂質ナノ粒子は、少なくとも１つのカチオン性
脂質、少なくとも１つの非カチオン性脂質、及び少なくとも１つの複合脂質を含む。より
特定の例では、脂質ナノ粒子は、約５０モル％～約８５モル％のカチオン性脂質、約１３
モル％～約４９．５モル％の非カチオン性脂質、及び約０．５モル％～約１０モル％の脂
質コンジュゲートを含み得、非ラメラ（即ち、非二層）の形態を有するような方法で製造
される。他の特定の例では、脂質ナノ粒子は、約４０モル％～約８５モル％のカチオン性
脂質、約１３モル％～約４９．５モル％の非カチオン性脂質、及び約０．５モル％～約１
０モル％の脂質コンジュゲートを含み得、非ラメラ（即ち、非二層）の形態を有するよう
な方法で製造される。
カチオン性脂質は、例えば、以下の１以上を含み得る：パルミトイル－オレオイル－ノ
ル－アルギニン（ＰＯＮＡ）、ＭＰＤＡＣＡ、ＧＵＡＤＡＣＡ、（（６Ｚ、９Ｚ、２８Ｚ
、３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（
ジメチルアミノ）ブタン酸）（ＭＣ３）；ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－Ｌｅ
ｎＭＣ３、ＣＰ－γーＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４
エーテル、ＭＣ３アミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、及びＰａｎＭＣ５、１，２
－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）１，２－ジリ
ノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノ
レイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ
－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプ
ロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノ
レイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ
－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジ
オキサン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペジアジ
ノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－
ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－
ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ
）、１，２－ジリノレイオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ
－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、
１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジ
リノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオ
イル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）
、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－
ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（
ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ
）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロ
パンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパン
ジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）
エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチル
アンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル
アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ
プロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ
，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ
－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキ
シ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（
Ｎ－（Ｎ´，Ｎ´－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃ
ｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－
Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレオイルオキ
シ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパ
ンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペル
ミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキ
シブタン－４－オキシ）－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プ
ロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５´－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）
－３´－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９’，１－２´－
オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジ
オレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミ
ル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレ
イルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、又はそれら
の混合物。カチオン性脂質はまた、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（「Ｘ
ＴＣ２」）、ＭＣ３、ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－ＬｅｎＭＣ３、γ－ＬｅｎＭＣ３、ＣＰ－γ
－ＬｅｎＭＣ３、ＭＣ３ＭＣ、ＭＣ２ＭＣ、ＭＣ３エーテル、ＭＣ４エーテル、ＭＣ３ア
ミド、Ｐａｎ－ＭＣ３、Ｐａｎ－ＭＣ４、ＰａｎＭＣ５、又はそれらの混合物であってよ
い。
様々な実施形態において、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約５０ｍｏｌ％
～約９０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％
、約５０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％
～約６５ｍｏｌ％、又は約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含み得る。
他の実施形態では、カチオン性脂質は、粒子に存在する総脂質の約４０ｍｏｌ％～約９
０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約８０ｍｏｌ％、約４
０ｍｏｌ％～約７５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約７０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約６
５ｍｏｌ％、又は約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含み得る。
非カチオン性脂質は、例えば、１以上のアニオン性脂質及び／又は中性脂質を含み得る
。好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の中性脂質の成分のうちの１つを含
む：（１）コレステロール若しくはその誘導体；（２）リン脂質；又は（３）リン脂質と
コレステロール若しくはその誘導体との混合物。コレステロール誘導体の例には、コレス
タノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒド
ロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、及びそれらの
混合物が含まれるが、これらに限定されない。リン脂質は、中性脂質、例えば非限定的に
、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコ
リン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミ
トイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホス
ファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグ
リセロール（ＰＯＰＧ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ
）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－
ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノール
アミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジル
エタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールア
ミン（ＳＯＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、及びそれらの混合物であってよ
い。ある好ましい態様において、リン脂質は、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、又はそれらの混合物
である。
いくつかの実施形態において、非カチオン性脂質（例えば、１以上のリン脂質及び／又
はコレステロール）は、粒子に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１
５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約６
０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１
５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２５ｍｏｌ％～約５
５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約１
５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含み得る。非カチ
オン性脂質がリン脂質とコレステロール又はコレステロール誘導体との混合物である場合
、混合物は粒子に存在する総脂質の最大約４０、５０、又は６０モル％を含んでもよい。
粒子の凝集を阻害する複合脂質は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質
コンジュゲート、ポリアミド（ＡＴＴＡ）－脂質コンジュゲート、カチオン性ポリマー－
脂質コンジュゲート（ＣＰＬ）、又はそれら混合物の１以上を含み得る。１つの好ましい
態様において、核酸－脂質粒子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート又はＡＴＴＡ－脂質コン
ジュゲートのいずれかを含む。特定の実施形態では、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート又はＡ
ＴＴＡ－脂質コンジュゲートはＣＰＬと一緒に使用される。粒子の凝集を阻害する複合脂
質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルキルオキシプロ
ピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、又はそれらの混合物
を含むＰＥＧ－脂質を含み得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、ＰＥＧ－ジラウリル
オキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－
ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、ＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８
）、又はそれらの混合物であり得る。
本発明における使用に適した更なるＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ｍＰＥＧ２
０００－１，２－ジ－Ｏ－アルキル－ｓｎ３－カルボモイルグリセリド（ＰＥＧ－Ｃ－Ｄ
ＯＭＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧの合成は、ＰＣ
Ｔ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号に記載されている。本発明での使用に適した更
に追加のＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、限定されないが、１－［８’－（１，２
－ジミリストイル－３－プロパノキシ）－カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタ
ニル］カルバモイル－ω－メチル－ポリ（エチレングリコール）（２ＫＰＥＧ－ＤＭＧ）
が挙げられる。２ＫＰＥＧ－ＤＭＧの合成は、米国特許第７，４０４，９６９号に記載さ
れている。
場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲー
ト）は、粒子に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～
約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約
０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ
％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１
．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏ
ｌ％、又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、
１．９、又は２ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。
典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する
。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲ
ート）は、粒子に存在する総脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～
約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ
％～約８ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、
１０ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。典型的には
、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
他の実施形態では、組成物は、正電荷とは異なる、少なくとも１つの正電荷担体と少な
くとも１つの負電荷担体とを含む両性リポソームを含むことができ、リポソームの等電点
は４～８である。この目的は、リポソームをｐＨ依存性の変化する電荷で準備するという
事実により達成される。
所望の特性を有するリポソームの構造は、例えば、膜形成又は膜ベースのカチオン電荷
担体の量が、低いｐＨではアニオン電荷担体の量を超え、その比がより高いｐＨでは逆転
するときに形成される。これは、イオン性成分のｐＫａ値が４～９の場合に常に当てはま
る。媒体のｐＨが低下すると、全てのカチオン電荷担体がより荷電し、全てのアニオン電
荷担体はその電荷を失う。
両性リポソームに有用なカチオン性化合物には、本明細書において既に上記したカチオ
ン性化合物が含まれる。限定するものではないが、カチオン性の強い化合物には、例えば
、ＤＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルメタン）カルバモイル］コレ
ステロール、ＴＣ－Ｃｈｏｌ ３－β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’－トリメチルアミノエ
タン）カルバモイルコレステロール、ＢＧＳＣビスグアニジニウム－スペルミジン－コレ
ステロール、ＢＧＴＣビス－グアジニウム－トレン－コレステロール、ＤＯＴＡＰ（１，
２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、Ｄ
ＯＳＰＥＲ（１，３－ジオレオイルオキシ－２－（６－カルボキシ－スペルミル）－プロ
ピルアミド）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジオレオイルオキシプロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリ
メチルアンモニウムクロリド）（リポフェクチン（登録商標））、ＤＯＲＩＥ１，２－ジ
オレオイルオキシプロピル）－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、Ｄ
ＯＳＣ（１，２－ジオレオイル－３－スクシニル－ｓｎ－グリセリルコリンエステル）、
ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－スクシニル－２－ヒドロ
キシエチルジスルフィドオルニチン（ｏｍｉｔｈｉｎｅ））、ＤＤＡＢジメチルジオクタ
デシルアンモニウムブロミド、ＤＯＧＳ（（Ｃ１８）２ＧｌｙＳｐｅｒ３＋）Ｎ，Ｎ－ジ
オクタデシルアミド－グリコール－スペルミン（トランスフェクタム（登録商標））（Ｃ
１８）２Ｇｌｙ＋Ｎ，Ｎ－ジオクタデシルアミド－グリシン、ＣＴＡＢセチルトリメチル
アンモニウムブロミド、ＣｐｙＣセチルピリジニウムクロリド、ＤＯＥＰＣ１，２－ジオ
レオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン又は他のＯ－アルキル－ホスファチ
ジルコリン又はエタノールアミン、リジンからのアミド、アルギニン又はオルニチン（ｏ
ｍｉｔｈｉｎｅ）、及びホスファチジルエタノールアミンを含むことができる。
カチオン性の弱い化合物の例としては、限定するものではないが、Ｈｉｓ－Ｃｈｏｌ（
ヒスタミニル－コレステロールヘミスクシネート）、Ｍｏ－Ｃｈｏｌ（モルホリン－Ｎ－
エチルアミノ－コレステロールヘミスクシネート）、又はヒスチジニル－ＰＥが挙げられ
る。
中性化合物の例としては、コレステロール、セラミド、ホスファチジルコリン、ホスフ
ァチジルエタノールアミン、テトラエーテル脂質、又はジアシルグリセロールが挙げられ
るが、これらに限定されない。
両性リポソームに有用なアニオン性化合物には、本明細書において既に記載した非カチ
オン性化合物が含まれる。限定されないが、弱アニオン性化合物の例には、ＣＨＥＭＳ（
コレステロールヘミスクシネート）、８～２５個の炭素原子を有するアルキルカルボン酸
、又はジアシルグリセロールヘミスクシネートが含まれ得る。追加の弱アニオン性化合物
には、アスパラギン酸、又はグルタミン酸とＰＥ及びＰＳのアミド、並びにグリシン、ア
ラニン、グルタミン、アスパラギン、セリン、システイン、トレオニン、チロシン、グル
タミン酸、アスパラギン酸若しくは他のアミノ酸、又はアミノジカルボン酸とのそのアミ
ドが含まれ得る。同じ原理に従うと、ヒドロキシカルボン酸又はヒドロキシジカルボン酸
とＰＳとのエステルも弱アニオン性化合物である。
いくつかの実施形態では、両性リポソームは、本明細書の上記に記したものなどの複合
脂質を含み得る。有用な複合脂質の特定の例には、ＰＥＧ改変ホスファチジルエタノール
アミン及びホスファチジン酸、ＰＥＧ－セラミドコンジュゲート（例えば、ＰＥＧ－Ｃｅ
ｒＣ１４又はＰＥＧ－ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ改変ジアルキルアミン及びＰＥＧ改変１，
２－ジアシルオキシプロパン－３－アミンが含まれるが、これらに限定されない。特に好
ましいのは、ＰＥＧ改変ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールである。
いくつかの実施形態において、中性脂質は、粒子に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％～
約６０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、
約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～
約５５ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、
約２５ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％～
約５０ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ
％を含み得る。
場合によっては、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲー
ト）は、粒子に存在する総脂質の約０．１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．５ｍｏｌ％～
約２ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ％～約２ｍｏｌ％、約０．６ｍｏｌ％～約１．９ｍｏｌ％、約
０．７ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約０．８ｍｏｌ％～約１．７ｍｏｌ％、約１ｍｏｌ
％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１．８ｍｏｌ％、約１．２ｍｏｌ％～約１
．７ｍｏｌ％、約１．３ｍｏｌ％～約１．６ｍｏｌ％、約１．４ｍｏｌ％～約１．５ｍｏ
ｌ％、又は約１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、
１．９、又は２ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。
典型的には、そのような場合、ＰＥＧ部分は約２，０００ダルトンの平均分子量を有する
。他の場合において、粒子の凝集を阻害する複合脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲ
ート）は、粒子に存在する総脂質の約５．０ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～
約９ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約８ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ％～約９ｍｏｌ％、約６ｍｏｌ
％～約８ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％、６ｍｏｌ％、７ｍｏｌ％、８ｍｏｌ％、９ｍｏｌ％、
１０ｍｏｌ％（又はその任意の画分もしくはその範囲）を含むことができる。典型的には
、そのような場合、ＰＥＧ部分は約７５０ダルトンの平均分子量を有する。
中性及び複合脂質の総量を考慮すると、両性リポソームの残りの残余は、様々な比率で
処方されたカチオン性化合物とアニオン性化合物の混合物を含み得る。カチオン性脂質と
アニオン性脂質の比率は、核酸封入の所望の特性、ゼータ電位、ｐＫａ、又は荷電脂質成
分の存在に少なくとも部分的に依拠する他の物理化学的特性を成し遂げるために選択され
得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、肝臓、特に肝細胞内での送達及び取り込み
を特異的に増強する組成を有する。
２．５組換えＡＡＶベクターの作製方法
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法で使用するための組換えＡＡＶベク
ターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、典型的には、ＨＥＫ－２９３等の哺乳動物細
胞株において産生される。ウイルスのｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、ベクターから除去され
て治療遺伝子（例えばエンドヌクレアーゼ遺伝子）を送達するための空間を設けるために
自己複製を防止するので、これらをパッケージングする細胞株にイントランス（ｉｎ ｔ
ｒａｎｓ）で供給する必要がある。更に、複製を支持するのに必要な「ヘルパー」（例え
ばアデノウイルス）成分を供給することが必要である（Ｃｏｔｓ Ｄ，Ｂｏｓｃｈ Ａ，
Ｃｈｉｌｌｏｎ Ｍ（２０１３）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：３７０－
８１）。多くの場合、組換えＡＡＶベクターは、「ヘルパー」成分をコードする第１のプ
ラスミド、ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を含む第２のプラスミド、並びにウイルスにパッケー
ジングされる介在するＤＮＡ配列を含むウイルスＩＴＲを含む第３のプラスミドで、細胞
株を形質移入する、トリプル形質移入を用いて産生される。次いで、カプシドに包まれた
ゲノム（ＩＴＲ及び対象の介在する遺伝子）を含むウイルス粒子を、凍結融解サイクル、
超音波処理、界面活性剤、又は当技術分野で公知の他の手段によって細胞から単離する。
次いで、粒子を塩化セシウム密度勾配遠心分離又はアフィニティークロマトグラフィーを
使用して精製し、続いて細胞、組織、又はヒトである患者等の生物に対して、目的の遺伝
子に送達する。
組換えＡＡＶ粒子は典型的には細胞で産生（作製）されるので、部位特異的エンドヌク
レアーゼがパッケージング細胞にて発現されないことを確実にするために、本発明を実施
する際に注意を払わなければならない。本発明のウイルスゲノムはエンドヌクレアーゼの
認識配列を含むので、パッケージング細胞株で発現される任意のエンドヌクレアーゼは、
ウイルス粒子にパッケージングされ得る前に、ウイルスゲノムを切断することができる。
これはパッケージング効率の低下及び／又は断片化したゲノムのパッケージングをもたら
す。パッケージング細胞におけるエンドヌクレアーゼの発現を防ぐために、以下のような
いくつかのアプローチを用いることができる。
エンドヌクレアーゼは、パッケージング細胞で活性ではない組織特異的プロモータの制
御下に置くことができる。例えば、ウイルスベクターがエンドヌクレアーゼ遺伝子を筋肉
組織に送達するように開発されている場合、筋肉特異的プロモータを使用することができ
る。筋肉特異的プロモータの例は、Ｃ５－１２（Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｈｕ
ｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５：７８３－９２）、筋肉特異的クレアチンキナーゼ（ＭＣ
Ｋ）プロモータ（Ｙｕａｓａ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１５
７６－８８）、又は平滑筋２２（ＳＭ２２）プロモータ（Ｈａａｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２
０１３）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４９－５４）を含む。ＣＮＳ（ニューロ
ン）特異的プロモータの例には、ＮＳＥ、シナプシン、及びＭｅＣＰ２プロモータが含ま
れる（Ｌｅｎｔｚ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ｄｉｓ．４８：１７
９－８８）。肝臓特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ（Ｐａｌｂ等）、ヒ
トα１－アンチトリプシン（Ｐａ１ＡＴ等）、及びヘモペキシン（Ｐｈｐｘ等）が含まれ
る（Ｋｒａｍｅｒ，ＭＧ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ７：３
７５－８５）。眼特異的プロモータの例には、オプシン、及び角膜上皮特異的Ｋ１２プロ
モータが含まれる（Ｍａｒｔｉｎ ＫＲＧ，Ｋｌｅｉｎ ＲＬ，ａｎｄ Ｑｕｉｇｌｅｙ
ＨＡ（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ（２８）：２６７－７５）（Ｔｏｎｇ Ｙ，ｅｔ ａ
ｌ．，（２００７）Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ，９：９５６－６６）。これらのプロモータ又
は当技術分野で公知の他の組織特異的プロモータは、ＨＥＫ－２９３細胞において高度に
活性であるわけではなく、従って、本発明のウイルスベクターに組み込まれた場合、パッ
ケージング細胞において顕著なレベルのエンドヌクレアーゼ遺伝子発現を生じないと予想
される。同様に、本発明のウイルスベクターは、不適合な組織特異的プロモータ（即ち、
周知のＨｅＬａ細胞系（ヒト上皮細胞）の使用、及び肝臓特異的ヘモペキシンプロモータ
の使用）を用いる他の細胞系の使用を企図する。組織特異的プロモータの他の例には、滑
膜肉腫ＰＤＺＤ４（小脳）、Ｃ６（肝臓）、ＡＳＢ５（筋肉）、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｂ（心臓
）、ＳＬＣ５Ａ１２（腎臓）、コレステロール調節ＡＰＯＭ（肝臓）、及びＡＤＰＲＨＬ
１（心臓）、及び単一遺伝子奇形症候群ＴＰ７３Ｌ（筋肉）が含まれる。（Ｊａｃｏｘ
Ｅ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ｖ．５（８）：ｅ１２２７４）。
あるいは、ベクターは、エンドヌクレアーゼが発現される見込みのない、異なる種由来
の細胞にパッケージングされ得る。例えば、ウイルス粒子は、哺乳動物以外のパッケージ
ング細胞では活性ではない、周知のサイトメガロウイルス又はＳＶ４０ウイルス初期プロ
モータ等の哺乳動物のプロモータを用いて、微生物、昆虫、又は植物細胞にて産生するこ
とができる。好ましい態様において、ウイルス粒子は、Ｇａｏら（Ｇａｏ，Ｈ．，ｅｔ
ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３１（２）：１３８－４３）によって
記載されているように、バキュロウイルス系を用いて昆虫細胞にて産生される。哺乳動物
のプロモータの制御下にあるエンドヌクレアーゼは、これらの細胞において発現される可
能性は低いＡｉｒｅｎｎｅ，ＫＪ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２１（
４）：７３９－４９）。更に、昆虫細胞は哺乳動物細胞とは異なるｍＲＮＡスプライシン
グモチーフを利用する。従って、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）のイントロン又はＳＶ４０
ラージＴ抗原のイントロン等の哺乳動物のイントロンを、エンドヌクレアーゼのコード配
列に組み込むことが可能である。これらのイントロンは昆虫細胞のプレｍＲＮＡ転写物か
ら効率的にはスプライシングされないので、昆虫細胞は機能的なエンドヌクレアーゼを発
現せず、ゲノム全長をパッケージングする。対照的に、得られた組換えＡＡＶ粒子が送達
される哺乳動物の細胞は、プレｍＲＮＡを適切にスプライスし、機能的なエンドヌクレア
ーゼタンパク質を発現する。Ｈａｉｆｅｎｇ Ｃｈｅｎは、昆虫パッケージング細胞にお
ける毒性のタンパク質バルナーゼ及びジフテリア毒素フラグメントＡの発現を減弱するた
めに、ＨＧＨ及びＳＶ４０ラージＴ抗原イントロンの使用を報告しており、これらの毒素
遺伝子を運ぶ組換えＡＡＶベクターの産生を可能にする（Ｃｈｅｎ，Ｈ（２０１２）Ｍｏ
ｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．１（１１）：ｅ５７）。
エンドヌクレアーゼ遺伝子は、小分子インデューサーがエンドヌクレアーゼの発現に必
要とされるように誘導性プロモータに作動可能に連結され得る。誘導性プロモータの例に
は、Ｔｅｔ－Ｏｎシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｃｈｅｎ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（２０
１５）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（１）：４））、及びＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ
システム（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ；Ｓｏｗａ Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｓｐｉｎｅ
， ３６（１０）：Ｅ６２３－８）が含まれる。両方のシステム及び当技術分野で公知の
類似のシステムは、小分子アクチベータ（それぞれ、ドキシサイクリン又はエクジソン）
に応答して転写を活性化するリガンド誘導性転写因子（それぞれ、Ｔｅｔレプレッサー及
びエクジソン受容体の変異体）に依存する。このようなリガンド誘導性転写活性化因子を
用いて本発明を実施することは、１）対応する転写因子に応答するプロモータの制御下に
エンドヌクレアーゼ遺伝子を配置し、エンドヌクレアーゼ遺伝子は転写因子に対する結合
部位を有すること、及び２）パッケージされたウイルスゲノムに転写因子をコードする遺
伝子を含むことを含む。転写アクチベータが同様に同じ細胞に提供されない場合、エンド
ヌクレアーゼは組換えＡＡＶ送達後に標的細胞又は組織において発現されないため、後者
の工程が必要である。次いで転写アクチベータは、同族の小分子アクチベータで処理され
た細胞又は組織においてのみ、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を誘導する。このアプ
ローチは、いつ、どの組織に小分子インデューサーを送達するかを選択することによって
、エンドヌクレアーゼの遺伝子の発現を時空間的様式で調節することを可能にするため、
有利である。しかし、ウイルスゲノムにインデューサーを含める必要性は、運搬能力を著
しく制限するものであり、このアプローチに対する欠点を生み出している。
別の好ましい実施形態では、エンドヌクレアーゼの発現を妨げる転写リプレッサを発現
する哺乳動物細胞株において、組換えＡＡＶ粒子が産生される。転写リプレッサは当技術
分野において公知であり、Ｔｅｔリプレッサ、Ｌａｃリプレッサ、Ｃｒｏリプレッサ、及
びλリプレッサが含まれる。エクジソン受容体等の多くの核ホルモン受容体はまた、それ
らの同族ホルモンリガンドの非存在下で、転写リプレッサとしても作用する。本発明を実
施するために、パッケージングする細胞を、転写リプレッサをコードするベクターで形質
移入／形質導入し、ウイルスゲノムのエンドヌクレアーゼ遺伝子（パッケージングベクタ
ー）を、リプレッサに対する結合部位を含むように改変したプロモータに作動可能に連結
させ、リプレッサはプロモータをサイレンシングするようにする。転写リプレッサをコー
ドする遺伝子は様々な位置に配置することができる。それは、別のベクトルにコードする
ことができる。それはＩＴＲ配列の外部でパッケージングベクターに組み込むことができ
る。それはｃａｐ／ｒｅｐベクター又はアデノウイルスヘルパーベクターに組み込むこと
ができる。あるいは、最も好ましくは、それは構成的に発現されるように、パッケージン
グする細胞のゲノムに安定して組み込むことができる。転写リプレッサ部位を組み込むた
めに一般的な哺乳動物プロモータを改変する方法は、当技術分野において公知である。例
えば、Ｃｈａｎｇ及びＲｏｎｉｎｓｏｎは、強力で構成的なＣＭＶ及びＲＳＶプロモータ
を、Ｌａｃリプレッサ用のオペレータを含むように改変し、改変したプロモータによる遺
伝子発現が、リプレッサを発現する細胞で非常に減弱されることを示した（Ｃｈａｎｇ
ＢＤ，ａｎｄ Ｒｏｎｉｎｓｏｎ ＩＢ（１９９６）Ｇｅｎｅ１８３：１３７－４２）。
非ヒト転写リプレッサを使用することで、エンドヌクレアーゼ遺伝子の転写が、リプレッ
サを発現するパッケージングする細胞においてのみ抑制され、得られた組換えＡＡＶベク
ターで形質導入された標的細胞又は組織においては抑制されないことが確実になる。
２．６ 遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ変異体
本発明の実施形態は、本明細書に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ及びその変
異体を包含する。本発明の更なる実施形態は、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼをコ
ードする核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド及びそのようなポリヌクレオチドの
変異体を包含する。
本明細書で使用しているとき、「変異体」は実質的に類似の配列を意味することを意図
している。「変異体」ポリペプチドは、天然タンパク質の１以上の内部の部位における１
以上のアミノ酸の欠失若しくは付加、及び／又は天然ポリペプチドの１以上の部位におけ
る１以上のアミノ酸の置換によって、「天然」ポリペプチドから誘導されるポリペプチド
を意味することを意図している。本明細書で使用しているとき、「天然の」ポリヌクレオ
チド又はポリペプチドは、変異体が由来する親の配列を含む。実施形態に包含される変異
体ポリペプチドは、生物学的に活性である。即ち、それらは天然のタンパク質の所望の生
物学的活性を保有し続けている。即ち、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型の
ゲノムのＯＲＦ内の認識配列、例えばＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５
－６認識配列（配列番号１２）、ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１４）、又はＨＢＶ１
１－１２認識配列（配列番号１６）を認識して切断する能力を保有し続けている。そのよ
うな変異体は、例えば、人間の操作から生じ得る。実施形態の天然のポリペプチドの生物
学的に活性な変異体（例えば、配列番号１８～３９）、又は本明細書に記載の認識した半
分の部位の結合サブユニットの生物学的に活性な変異体は、本明細書の他の箇所に記載さ
れている配列アラインメントプログラム及びパラメータによって判定されるように、天然
のポリペプチド又は天然のサブユニットのアミノ酸配列に対して、少なくとも約４０％、
約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、
約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、
約９７％、約９８％、又は約９９％の配列同一性を有する。実施形態のポリペプチド又は
サブユニットの生物学的に活性な変異体は、そのポリペプチド又はサブユニットと約１～
４０程度のアミノ酸残基、約１～２０程度、約１～１０程度、約５程度、４、３、２、又
は１アミノ酸残基程度少なくて、異なることがあり得る。
実施形態のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、切断、及び挿入を含む様々な方法
で改変することができる。そのような操作のための方法は、当技術分野で一般的に知られ
ている。例えば、アミノ酸配列変異体は、ＤＮＡの突然変異によって作製することができ
る。突然変異誘発及びポリヌクレオチドの改変のための方法は、当技術分野において周知
である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８２：４８８－４９２；Ｋｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７－３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；Ｗ
ａｌｋｅｒ ａｎｄ Ｇａａｓｔｒａ，ｅｄｓ．（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク州）及びそれに引用されている参考文献を参照されたい
。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸の置換に関する指
針は、参照により本明細書に組み入れられる、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９７８
）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）
のモデルに見出すことができる。１つのアミノ酸を類似した特性を有する他のものと交換
するといった保存的な置換が最適であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、本明細書に
開示されているＨＶＲ１及びＨＶＲ２領域の変異体を含み得る。親ＨＶＲ領域は、例えば
、例示の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの残基２４～７９又は残基２１５～２７０を
含み得る。従って、変異体ＨＶＲは、本明細書に例示の遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼの残基２４～７９又は残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列と少なくとも８０％
、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上の配列同一性
を有するアミノ酸配列を含むことができ、その結果変異体ＨＶＲ領域が、遺伝子操作され
たメガヌクレアーゼの生物学的活性（即ち、認識配列への結合及び切断）を維持するよう
になる。更に、本発明のいくつかの実施形態では、変異型ＨＶＲ１領域又は変異型ＨＶＲ
２領域は、親ＨＶＲ内の特定の位置に見られるアミノ酸残基に対応する残基を含み得る。
これに関連して、「に対応する」とは、変異体ＨＶＲのアミノ酸残基が、同じ対応する位
置で（即ち、親配列の残りのアミノ酸に関連して）親ＨＶＲ配列に存在する同じアミノ酸
残基（即ち、別の同一の残基）であることを意味する。例として、親ＨＶＲ配列が２６位
にセリン残基を含む場合、残基２６に「対応する残基を含む」変異型ＨＶＲはまた、親の
２６位に対応する位置にセリンを含む。
野生型Ｉ－ＣｒｅＩメガヌクレアーゼのＤＮＡ認識ドメインに対するかなりの数のアミ
ノ酸の改変が、以前に同定されており（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号）、そ
れは単独で又は組み合わせて、ＤＮＡの認識配列の半分の部位の中の個々の塩基において
特異性が改変された、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを生じ、得られた合理的に設計
されたメガヌクレアーゼが、野生型酵素とは異なる半分の部位の特異性を有するようにす
る。表５は、認識した半分の部位の各々の半分の部位の位置（－１～－９）に存在する塩
基に基づいて特異性を増強するために遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ単量体又はサブ
ユニットにおいてなされ得る潜在的な置換を提供する。
Figure 2023153824000005
太字のエントリは野生型の接触残基であり、本明細書で使用している「改変」を構成し
てはいない。アスタリスクは、残基がアンチセンス鎖の塩基と接触していることを示す。
ポリヌクレオチドの場合、「変異体」は、天然のポリヌクレオチド内の１以上の部位に
おける１以上のヌクレオチドの欠失及び／又は付加を含む。当業者は、実施形態の核酸の
変異体が、オープンリーディングフレームを維持するように構築されることを認識する。
ポリヌクレオチドに関して、保存的な変異体は、遺伝暗号の縮重のために、実施形態のポ
リペプチドのうちの１つのアミノ酸配列をコードするそれらの配列を含む。変異体のポリ
ヌクレオチドには、例えば部位志向的な突然変異誘発を用いることによって生成されるが
、それでも実施形態の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードするもの等の、合成由
来のポリヌクレオチドが含まれる。一般に、実施形態の特定のポリヌクレオチドの変異体
は、本明細書の他の箇所に記載されている配列アラインメントプログラム及びパラメータ
によって定まる特定の当該のポリヌクレオチドに少なくとも約４０％、約４５％、約５０
％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０
％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８
％、約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する。実施形態の特定のポリヌクレオチド
（即ち、参照ポリヌクレオチド）の変異体はまた、変異体のポリヌクレオチドによってコ
ードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと
の間のパーセントの配列同一性の比較によって評価することができる。
本明細書に包含されるタンパク質の配列の欠失、挿入、及び置換は、ポリペプチドの特
徴に根本的な変化を生じさせるとは予想されない。しかし、置換、欠失、又は挿入の正確
な効果を実行する前に予測することが困難である場合、当業者は、その効果が、Ｂ型肝炎
ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのＯＲＦ内の認識配列を優先的に認識して
切断する能力についてポリペプチドをスクリーニングすることによって評価されるという
ことを認識する。
本発明を以下の実施例によって更に説明するが、これらは限定するものとして解釈され
るべきではない。当業者は、日常的な実験のみを利用して、本明細書に記載の特定の物質
や手順に対する多数の等価物を認識する、又は確認することができる。そのような均等物
は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることを意図している。
実施例１；ＨＢＶ認識配列を認識して切断するメガヌクレアーゼの特性決定
ＨＢＶ１－２認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ（配列番号１８～２１）は、ＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１
０）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、及びＧ（
例えば、それぞれ配列番号３～５及び７～９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク
質、Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２ ＯＲＦ内に位置付けられる。各
ＨＢＶ１－２遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ
局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガ
ヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼの第１のサブユニッ
トは、配列番号１０のＨＢＶ１の認識した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニット
は、ＨＢＶ２の認識した半分の部位に結合する（図２参照）。
ＨＢＶ１結合サブユニット及びＨＢＶ２結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶ１結合サブユニットは
ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ２結合サブユニットもまた、Ｈ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号１８～２１のＨＢＶ１結合領域は、それ
ぞれ配列番号４０～４３として提供される。配列番号４０～４３のそれぞれは、メガヌク
レアーゼＨＢＶ１～２×．２（配列番号１８）のＨＢＶ１結合領域である配列番号４０と
少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号１８～２１のＨＢＶ２結合領域は、
それぞれ配列番号４４～４７として提供されている。配列番号４４～４７のそれぞれは、
メガヌクレアーゼＨＢＶ１～２×．２（配列番号１８）のＨＢＶ２結合領域である配列番
号４４と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
ＨＢＶ ５－６認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ（配列番号２２～２８）は、ＨＢＶ５－６認識配列（配列番号１
２）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＧ（
例えば、それぞれ配列番号３～７及び９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパク質、
Ｓ、ｐｒｅＳ２／Ｓ、及びｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２ ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢ
Ｖ５－６遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在
化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌク
レアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ５－６メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは
、配列番号１２のＨＢＶ５の認識した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニットは、
ＨＢＶ６の認識した半分の部位に結合する（図２参照）。
ＨＢＶ５結合サブユニット及びＨＢＶ６結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶ５結合サブユニットは
ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ６結合サブユニットもまた、Ｈ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号２２～２８のＨＢＶ５結合領域は、それ
ぞれ配列番号４８～５４として提供される。配列番号４８～５４のそれぞれは、メガヌク
レアーゼＨＢＶ５～６×．３３（配列番号２２）のＨＢＶ５結合領域である配列番号４９
と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２２～２８のＨＢＶ６結合領域は
、それぞれ配列番号５５～６１として提供されている。配列番号５５～６１のそれぞれは
、メガヌクレアーゼＨＢＶ５～６×．３３（配列番号２２）のＨＢＶ５結合領域である配
列番号５５と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
ＨＢＶ ７－８認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子操作
されたメガヌクレアーゼ（配列番号２９～３２）は、ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１
４）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、及びＧ（
例えば、それぞれ配列番号３～６、８、及び９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタンパ
ク質ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢＶ７－８遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、
ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブユニッ
ト、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ７－８メ
ガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１４のＨＢＶ７の認識した半分の部位
に結合し、一方第２のサブユニットは、ＨＢＶ８の認識した半分の部位に結合する（図２
参照）。
ＨＢＶ７結合サブユニット及びＨＢＶ８結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及びＨ
ＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶ７結合サブユニットは
ＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ８結合サブユニットもまた、Ｈ
ＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号２９～３２のＨＢＶ７結合領域は、それ
ぞれ配列番号６２～６５として提供される。配列番号６２～６５のそれぞれは、メガヌク
レアーゼＨＢＶ７～８×．２（配列番号２９）のＨＢＶ７結合領域である配列番号６２と
少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号２９～３２のＨＢＶ８結合領域は、
それぞれ配列番号６６～６９として提供されている。配列番号６６～６９のそれぞれは、
メガヌクレアーゼＨＢＶ７～８×．２（配列番号２９）のＨＢＶ８結合領域である配列番
号６６と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
ＨＢＶ １１－１２認識配列を認識し切断するメガヌクレアーゼ
本明細書において、まとめて「ＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼ」と呼ばれる遺伝子
操作されたメガヌクレアーゼ（配列番号３３～３９）は、ＨＢＶ １１－１２認識配列（
配列番号１６）を認識して切断するように遺伝子操作され、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ
、Ｆ、及びＧ（例えば、それぞれ配列番号３～９）を含む複数のＨＢＶ遺伝子型のＰタン
パク質ＯＲＦ内に位置付けられる。各ＨＢＶ１１－１２遺伝子操作されたメガヌクレアー
ゼは、ＳＶ４０由来のＮ末端ヌクレアーゼ局在化シグナル、第１のメガヌクレアーゼサブ
ユニット、リンカー配列、及び第２のメガヌクレアーゼサブユニットを含む。各ＨＢＶ
１１－１２メガヌクレアーゼの第１のサブユニットは、配列番号１６のＨＢＶ１１の認識
した半分の部位に結合し、一方第２のサブユニットは、ＨＢＶ１２の認識した半分の部位
に結合する（図２参照）。
ＨＢＶ１１結合サブユニット及びＨＢＶ１２結合サブユニットはそれぞれ、ＨＶＲ１及
びＨＶＲ２とそれぞれ呼ばれる５６塩基対の超可変領域を含む。ＨＢＶｓ１１結合サブユ
ニットはＨＶＲ１領域外で高度に保存されている。同様に、ＨＢＶ１２結合サブユニット
もまた、ＨＶＲ２領域外で高度に保存されている。配列番号３３～３９のＨＢＶ１１結合
領域は、それぞれ配列番号７０～７６として提供される。配列番号７０～７６のそれぞれ
は、メガヌクレアーゼＨＢＶ１１－１２ｘ．２６（配列番号３３）のＨＢＶ１１結合領域
である配列番号７０と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。配列番号３３～３９の
ＨＢＶ１２結合領域は、それぞれ配列番号７７～８３として提供されている。配列番号７
７～８３のそれぞれは、メガヌクレアーゼＨＢＶ１１－１２ｘ．２６（配列番号３３）の
ＨＢＶ１２結合領域である配列番号７７と少なくとも９０％の配列同一性を共有する。
ＣＨＯ細胞レポーターアッセイにおけるＨＢＶ認識配列の切断
ＨＢＶ１－２、ＨＢＶ５－６、ＨＢＶ７－８、及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼ
がそれらのそれぞれの認識配列（それぞれ配列番号１０、１２、１４、及び１６）を認識
し切断することができるかどうかを判断するために、それぞれ遺伝子操作されたメガヌク
レアーゼを、以前に記載したＣＨＯ細胞レポーターアッセイを使用して評価した（国際公
開第２０１２／１６７１９２号パンフレット、図６を参照）。アッセイを実施するために
、細胞のゲノムに組み込まれた非機能的緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子発現カセッ
トを保有するＣＨＯ細胞レポーター株を作製した。メガヌクレアーゼによるいずれかの認
識配列の細胞内切断が相同組換え事象を刺激して機能的なＧＦＰ遺伝子を生じるように、
各細胞株のＧＦＰ遺伝子を一対の認識配列によって中断した。
この研究のために発現させたＣＨＯレポーター細胞株において、ＧＦＰ遺伝子に挿入さ
れた１つの認識配列は、ＨＢＶ１－２認識配列（配列番号１０）、ＨＢＶ５－６認識配列
（配列番号１２）、ＨＢＶ７－８認識配列（配列番号１２）、及びＨＢＶ１１－１２認識
配列（配列番号１６）であった。ＧＦＰ遺伝子に挿入された第２の認識配列は、ＣＨＯ－
２３／２４認識配列であったが、これは「ＣＨＯ－２３／２４」と呼ばれる対照メガヌク
レアーゼによって認識され切断されるものである。ＨＢＶ１－２認識配列及びＣＨＯ－２
３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ１－２細胞」と呼ばれる。Ｈ
ＢＶ５－６認識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「
ＨＢＶ５－６細胞」と呼ばれる。ＨＢＶ７－８認識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列
を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ７－８細胞」と呼ばれる。ＨＢＶ１１－１２認
識配列及びＣＨＯ－２３／２４認識配列を含むＣＨＯレポーター細胞は、「ＨＢＶ１１－
１２細胞」と呼ばれる。
ＣＨＯレポーター細胞を、それらの対応する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
ドするプラスミドＤＮＡ（例えば、ＨＢＶ１－２細胞を、ＨＢＶ１－２メガヌクレアーゼ
をコードするプラスミドＤＮＡで形質移入した）、又はＣＨＯ－２３／３４メガヌクレア
ーゼをコードするプラスミドＤＮＡで、形質移入した。各アッセイにおいて、４ｅ５のＣ
ＨＯレポーター細胞を、製造元の説明書に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、９６ウェルプレートにおける５０ｎｇのプラスミ
ドＤＮＡで形質移入した。形質移入の４８時間後に、細胞をフローサイトメトリーにより
評価して、形質移入されていない陰性の対照（ＨＢＶ ｂｓ）と比較し、ＧＦＰ陽性細胞
の割合を判定した。図７Ａ～図７Ｄに示しているように、全てのＨＢＶメガヌクレアーゼ
は、陰性の対照を有意に超える頻度で、それらの対応する認識配列を含む細胞株において
ＧＦＰ陽性細胞を産生することが見出された。
また、ＨＢＶ１－２、ＨＢＶ５－６、ＨＢＶ７－８、及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレ
アーゼの有効性は、メガヌクレアーゼをＣＨＯレポーター細胞に導入した後２、５、７、
９、及び１２日後に時間依存的に判定した。この研究では、製造元の説明書に従ってＢｉ
ｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌを使用して、ＨＢＶ１－２、ＨＢＶ５－
６、ＨＢＶ７－８、又はＨＢ１１－１２細胞（１．０×１０６）に１細胞あたり１×１０
６コピーのメガヌクレアーゼｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。形質移入後の指定
の時点で、細胞をフローサイトメトリーによって評価して、ＧＦＰ陽性細胞の割合を判定
した。ＣＨＯ－２３／２４メガヌクレアーゼもまた、各時点で陽性対照として含めた。
図８Ａ～図８Ｄに示すように、異なるＨＢＶメガヌクレアーゼによって産生された％Ｇ
ＦＰは、経時的に変化した。ＨＢＶ５－６及びＨＢＶ１１－１２メガヌクレアーゼが、分
析した１２日間にわたって実質的に一致していた（図８Ｂ及び図８Ｄ）のに対し、ＨＢＶ
１－２及びＨＢＶ７－８メガヌクレアーゼは、実験の過程で減少した初期の時点にて、高
レベルのＧＦＰ陽性細胞を産生した。
結論
これらの研究は、本発明に包含されているＨＢＶメガヌクレアーゼが細胞内のそれぞれ
の認識配列を効率的に標的化して切断することができ、その効果が経時的に一定であるか
、一過性であり得ることを示した。
実施例２；ＨＢＶ特異的ヌクレアーゼは大腸菌のプラスミドＤＮＡを除去する
エピソームＤＮＡを利用した細菌レポーターシステム
本実験の目的は、本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼを、大腸菌レポーターシステムにお
いてエピソームＤＮＡプラスミド内の認識配列を認識して切断する能力について評価する
ことであった。
「ｐＡＲＣＵＳ」と呼ばれるプラスミドを、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼの誘導性発現を駆
動するために作製した（図９Ａ）。ｐＡＲＣＵＳでは、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼ（ここで
は、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×のいずれか）をＩＰＴＧ誘導性プロモ
ータの制御下に置く。更に、形質転換した細菌の選択を可能にするために、ｐＡＲＣＵＳ
はアンピシリン耐性遺伝子をコードする。ｐＡＲＣＵＳは、低コピーのプラスミドである
ので、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼの誘導した発現は、過剰な発現を引き起こさない。
「ｐＨＢＶａ」と呼ばれる追加のプラスミドが生成された（図９Ａ）。ｐＨＢＶａは、
ＨＢＶ５－６及びＨＢＶ１１－１２の認識配列を含む、ＨＢＶゲノムの大きな断片を保有
している。このプラスミドはまた、カナマイシン耐性遺伝子及びＳａｃＢ遺伝子をコード
する。カナマイシン耐性遺伝子は、形質転換させた細菌の選択を可能にするものであり、
ＳａｃＢ遺伝子はスクロースの存在下で活性である毒素である。従って、ｐＨＢＶａで形
質転換された細菌は、培地のカナマイシンの存在下では生存するが、カナマイシン及びス
クロースの存在下では生存しない。ｐＨＢＶａは、ＨＢＶゲノムの多くのコピーがあり得
るＨＢＶ感染細胞を複製する試みにおいて、高コピーのプラスミドであるように設計した
。重要なことに、ｐＨＢＶａは、ｐＡＲＣＵＳとは異なる複製の起点を利用しており、細
菌と両方のプラスミドとの同時の形質転換が可能になる。
細菌をこれらのプラスミドで同時に形質転換し、選択的な圧力の様々な組み合わせを含
有する培地において増殖させた（アンピシリン、カナマイシン、又はスクロース）場合、
複数の可能な結果が存在している。ｐＡＲＣＵＳで形質転換され、アンピシリンの存在下
で増殖される細菌は、ｐＡＲＣＵＳプラスミドを保有するであろうが、増殖培地がＩＰＴ
Ｇを補充されないと、コードされたヌクレアーゼを発現しない。ＩＰＴＧで誘導すると、
コードされたヌクレアーゼが発現される。ｐＨＢＶａで形質転換された細菌はカナマイシ
ンの存在下で増殖するが、カナマイシン及びスクロースの場合は増殖しない。アンピシリ
ン及び／又はカナマイシンの存在下にてｐＡＲＣＵＳ及びｐＨＢＶａで同時に形質転換さ
れた細菌は、スクロースに対して感受性がある。ｐＡＲＣＵＳ及びｐＨＢＶで同時に形質
転換された細菌において、ＩＰＴＧを用いたＡＲＣＵＳヌクレアーゼの誘導は、ヌクレア
ーゼの発現をもたらし、それが次にｐＨＢＶａにてコードされた標的部位を切断し得るこ
とが予測された。当該の部位での切断がｐＨＢＶａプラスミドの線状化をもたらすと予想
したが、それは細菌のヌクレアーゼによって急速に分解されるはずである。ｐＨＢＶプラ
スミドの分解は、細菌がカナマイシンに対する耐性を失うこと、その一方でスクロースの
存在下で生き残ることができること、という２つの結果をもたらすであろう。
同時の形質転換の結果を検証するために、細菌をｐＡＲＣＵＳ及びｐＨＢＶａで（エレ
クトロポレーションにより）同時に形質転換し、播種前に３時間アンピシリンの存在下で
培養した。並行する培養において、同時に形質転換させた細胞をＩＰＴＧで処理し（３時
間）、ヌクレアーゼの発現を誘導し、ｐＨＢＶａの切断を可能にした。次いで、細胞を、
アンピシリン、アンピシリン及びスクロース、又はアンピシリン及びカナマイシンの存在
下で、寒天プレートに蒔いた。プレートを一晩インキュベートし、コロニーを数えて細菌
の生存を評価した。
結果
各選択プレートに存在するコロニーの数により、ＡＲＣＵＳヌクレアーゼがｐＨＢＶａ
プラスミドを切断し得ることの劇的な証拠が得られた。対照のアンピシリンプレートでは
、非誘導培養物又はＩＰＴＧ誘導培養物のいずれかからのコロニー数は、ｐＨＢＶａ及び
いずれかのｐＡＲＣＵＳプラスミドで同時に形質転換された細胞について、同等であった
（図９Ｂ）。ＨＢＶ５－６×．３３をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換した細菌
と、ＨＢＶ１１－１２×．２６をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換した細菌との
間にコロニー数の差があったが、これは形質転換の効率を反映していると思われる。
著しく対照的に、アンピシリンとスクロースの両方を含むプレートでの非ＩＰＴＧ誘導
培養物からのコロニー数は劇的に少なくなっており、これはスクロースが利用可能である
場合にＳａｃＢ遺伝子が細胞殺傷に有効であることを示している（図９Ｂ）。しかし、Ｉ
ＰＴＧで誘導された培養物は、アンピシリンとスクロースの両方を含有するプレートで非
常によく成長しており、このことは、ＳａｃＢ遺伝子を除去したことを示している。ｐＨ
ＢＶａ、及びＨＢＶ１１－１２ｘ．２６をコードするｐＡＲＣＵＳで同時に形質転換され
た（しかしＩＰＴＧで誘導されていない）細菌のコロニー数は、アンピシリン対照プレー
トのものと同じであり、ｐＡＲＣＵＳ５－６ｘ．３３で同時に形質転換された細菌は、対
照プレートと比較して、ほんのわずかに減少した。
非ＩＰＴＧ誘導培養物は、アンピシリンとカナマイシンの両方を含有するプレートで増
殖することができた（図９Ｂ）。ＨＢＶ １１－１２×．２６をコードするｐＡＲＣＵＳ
で同時に形質転換した細菌からのコロニー数は、対照のアンピシリンのみのプレートとほ
ぼ等しく、ｐＡＲＣＵＳ ＨＢＶ５－６×．３３で同時に形質転換した細胞は、対照と比
較して、ほんのわずかに減少した。しかし、アンピシリン及びカナマイシンを含有するプ
レートでＩＰＴＧ誘導細胞を増殖させた場合、コロニー数はゼロに近く、これはカナマイ
シン耐性遺伝子を保有するプラスミドの排除を示していた（図９Ｂ）。
結論
これらのデータは、ＨＢＶゲノムの部位を認識する本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼが
ｐＨＢＶａプラスミドを切断することができ、その結果ｐＨＢＶａプラスミドが排除され
ることを明白に実証している。ＩＰＴＧ誘導培養物では、細胞はスクロースの存在下で増
殖しており、これはＳａｃＢ含有プラスミドを効率的に除去したことを示している。同様
に、ＩＰＴＧ誘導培養物において、細胞はカナマイシンの存在下で死滅し、これはまた、
ｐＨＢＶａプラスミドを破壊したことを強く示唆している。ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡを切断
するために本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼを使用して、ＨＢＶ感染哺乳動物細胞におい
て同様の結果が起こり得る可能性がある。細菌では、直鎖状ＤＮＡはすぐに除去される。
哺乳動物細胞での線状化ｃｃｃＤＮＡも、細胞のヌクレアーゼによって消化されると考え
られる。切断がｃｃｃＤＮＡの線状化及び排除につながらないとしても、ＨＢＶ ＡＲＣ
ＵＳヌクレアーゼによって引き起こされるインデルの突然変異は、コードする領域を破壊
し、ｃｃｃＤＮＡが機能的ＨＢＶタンパク質を産生することを不可能にする見込みがある
。従って、ＨＢＶゲノムの部位を標的とする本発明のメガヌクレアーゼは、ＨＢＶ ｃｃ
ｃＤＮＡを排除又は不活性化するための有効な方法であるはずである。
実施例３；細胞でのＨＢＶウイルスゲノムの標的化
ＨＢＶゲノムを発現するＡＤ３８細胞の治療
これらの実施例の主な目的は、本発明のメガヌクレアーゼがＨＢＶ感染哺乳動物細胞の
ＨＢＶゲノムを不活性化及び／又は排除することができるかどうかを評価することであっ
た。
第１の研究では、メガヌクレアーゼの有効性は、Ｔｅｔプロモータ下でＨＢＶゲノムを
安定的に発現するＡＤ３８細胞系において評価された。このＡＤ３８細胞系は活性ウイル
ス粒子を生成しないが、細胞培地で検出可能であるＨＢＶ Ｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）を生成
する。本研究では、細胞にＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６をコード
するＤＮＡプラスミドで形質移入した。これらの遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは両
方とも、重複するＳ（ＨＢｓＡｇ遺伝子）及びＰ（ポリメラーゼ遺伝子）リーディングフ
レーム内の配列を標的とするＨＢＶ５－６×．３３、及びＰ遺伝子を標的とするＨＢＶ１
１－１２×．２６を用い、ＨＢＶゲノムに特異的な配列を標的とする。対照として、ＡＤ
３８細胞を、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子をコードするプラスミドで形質移入し
た。細胞を播種し、２４時間後にリポソームベースの形質移入プロトコルを用いてプラス
ミドで形質移入した。形質移入の２４時間後、ＡＤ３８細胞を洗浄して、残っているリポ
ソーム複合体を除去した。形質移入後３日目及び７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩ
ＳＡによってＨＢｓＡｇの存在についてアッセイした。
結果
ＥＬＩＳＡのデータを、形質移入後３日目及び７日目に、ＲＦＰ形質移入のＡＤ３８細
胞の上清に存在するＨＢｓＡｇの量に対して正規化した。形質移入後３日目に、ＨＢＶ１
１－１２ｘ．２６をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、ＲＦＰ形質移入の細胞
と比較して、上清に約２５％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１０）。同じ時点で、ＨＢＶ
５－６×．３３をコードするプラスミドで形質移入した細胞は、ＲＦＰ形質移入の細胞
と比較して、上清に約５０％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１０）。非形質移入の対照細
胞は、ＲＦＰ形質移入の細胞と本質的に同じであった。ＨＢｓＡｇの減少は形質移入後７
日目で更に明白であった。ＨＢＶ１１－１２ｘ．２６で形質移入したＡＤ３８細胞は、Ｒ
ＦＰで形質移入した細胞よりも約５０％低いＨＢｓＡｇのレベルを示し、ＨＢＶ５－６ｘ
．３３で形質移入した細胞は、ＲＦＰ対照より約７５％低いレベルを示した（図１０）。
形質移入後７日目に、ＲＦＰで形質移入した細胞は、非形質移入細胞と比較して上清のＨ
ＢｓＡｇが有意に少なく、これは形質移入のプロセスが細胞のＨＢｓＡｇ産生能に悪影響
を及ぼしたことを示唆している。それにもかかわらず、その影響は、ＨＢＶメガヌクレア
ーゼをコードするプラスミドで形質移入された細胞において、はるかに顕著であり、上清
のＨＢｓＡｇレベルの減少がメガヌクレアーゼの活性によるものであることを強く示唆し
ている。
結論
これらのデータは、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６のいずれかを
コードするプラスミドで形質移入されたＡＤ３８細胞が、非形質移入細胞又はＲＦＰレポ
ーター遺伝子で形質移入された細胞と比較して、上清のＨＢｓＡｇが劇的に減少したこと
を示している。ＨＢＶメガヌクレアーゼのいずれかで形質移入した細胞における上清のＨ
ＢｓＡｇレベルの減少は、その減少がＡＤ３８細胞のＨＢＶゲノムに対するメガヌクレア
ーゼ活性に起因することを強く示唆している。
実施例４；細胞でのＨＢＶウイルスゲノムの標的化
ＨＢＶゲノムを発現するＡＤ３８細胞の治療
上記の実施例３の研究は、ＨＢＶゲノム発現ＡＤ３８細胞系からのＨＢｓＡｇの分泌を
減少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証している。ＨＢｓＡｇの分泌の
更に大きな減少が、プラスミドの形質移入の代わりにレンチウイルスの送達を用いて達成
され得るかどうかを判断するために、ＨＢＶ１１－１２ｘ．２６及びＨＢＶ５－６ｘ．３
３メガヌクレアーゼを個々に又は組み合わせて用いるレンチウイルスの送達で、この研究
を繰り返した。
ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６のいずれかを発現するレ
ンチウイルスを作製し、ＡＤ３８細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇの産生に対するメガヌ
クレアーゼの影響を判定した。ＡＤ３８細胞を播種し、２４時間後に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５
－６×．３３、ＨＢＶ１１－１２×．２６をコードするレンチウイルス、又はＨＢＶメガ
ヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物のいずれかで形質導入した。
細胞に、１、２、又は４のＭＯＩで単一のレンチウイルスで形質導入した。ＨＢＶメガヌ
クレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物で形質導入された細胞は、２及
び４の総ＭＯＩで形質導入された。形質導入細胞の培地は、形質導入後１日目及び３日目
に交換した。形質導入後７日目に細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＢｓＡｇの存
在についてアッセイした。
結果
ＥＬＩＳＡのデータを、形質移入後７日目に、ＲＦＰ形質導入のＡＤ３８細胞の上清に
存在するＨＢｓＡｇの量に対して正規化した。ＭＯＩが１の場合、ＨＢＶ５－６×．３３
で形質導入されたＡＤ３８細胞は、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入されたＡＤ３８
細胞よりも上清に約６０％少ないＨＢｓＡｇを示した（図１１）。また、ＭＯＩが１の場
合、ＨＢＶ１１－１２ｘ．２６はＲＦＰよりも約４０％少ないＨＢｓＡｇを示した。より
高いＭＯＩでは、ＨＢＶメガヌクレアーゼの影響はより顕著であった。ＭＯＩが２の場合
、ＨＢＶ５－６×．３３をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、ＲＦＰで
形質導入された細胞と比較して約８０％のＨＢｓＡｇの減少を示し、ＭＯＩが４の場合、
減少は比較すると約９０％であった。同様に、ＭＯＩが２の場合、ＨＢＶ１１－１２×．
２６をコードするレンチウイルスで形質導入された細胞は、ＲＦＰで形質導入された細胞
よりも約７０％少ないＨＢｓＡｇを示し、ＭＯＩが４の場合、ＨＢｓＡｇは約８０％低か
った。また最後に、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合
物で形質導入された細胞は、ＲＦＰ形質導入の対照の細胞と比較して、上清のＨＢｓＡｇ
のレベルが劇的に減少したことを示した（図１１）。総ＭＯＩが２の場合、ＨＢＶ発現レ
ンチウイルスは、ＨＢｓＡｇの発現を約８０％減少させ、総ＭＯＩが４の場合、発現は約
９０％減少した。
結論
これらのデータは、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入された細胞と比較して、ＨＢ
Ｖ ５－６×．３３若しくはＨＢＶ１１－１２×．２６、又は両方の組み合わせをコード
するレンチウイルスで形質導入されたＡＤ３８細胞が、上清のＨＢｓＡｇの劇的な減少を
示すことを実証する。ＨＢＶメガヌクレアーゼのいずれか又は両方を発現するレンチウイ
ルスで形質導入された細胞における上清のＨＢｓＡｇのレベルの減少は、その減少がＡＤ
３８細胞のＨＢＶゲノムに対するメガヌクレアーゼの活性に起因することを強く示唆して
いる。更に、これらのデータは、ＨＢＶメガヌクレアーゼの共発現がＨＢｓＡｇの発現を
効果的に減少させることを実証し、このことは共発現されたメガヌクレアーゼがＨＢＶゲ
ノムを効果的にすることができることを強く示唆している。
実施例５；細胞でのＨＢＶウイルスゲノムの標的化
ＨＢＶゲノムを発現するＡＤ３８細胞の治療
更なる研究において、ＨＢｓＡｇの分泌に対するメガヌクレアーゼの処理の効果、細胞
培養培地に存在するＨＢＶ ＤＮＡコピー、及び細胞内のＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡコピーを
観察するために、ＡＤ３８細胞を、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６
メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスで形質導入した。
上記の実施例４と同様に、ＲＦＰ（ＬＶ２１２）、ＨＢＶ５－６×．３３（ＬＶ２２４
）、又はＨＢＶ１１－１２×．２６（ＬＶ２２５）のいずれかを発現するレンチウイルス
を生成し、ＡＤ３８細胞を形質導入して、メガヌクレアーゼの各実験結果に与える影響を
判定した。ＡＤ３８細胞をテトラサイクリンの存在下で播種し、２４時間後に、４のＭＯ
Ｉで、ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６をコードするレンチ
ウイルスで形質導入した。形質導入細胞の培地を形質導入２４時間後に交換した。形質導
入後７日目に、細胞の上清を回収し、ＥＬＩＳＡによりＨＢｓＡｇの存在についてアッセ
イした。細胞培養液５μＬ当たりの細胞外ＨＢＶ ＤＮＡのコピーを定量的ＰＣＲにより
判断した。細胞溶解物を得て、５μＬの細胞溶解物当たりのＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡの細胞
内のコピーを、定量的ＰＣＲによって判定した。
結果
４のＭＯＩにおいて、ＨＢＶ５－６×．３３及びＨＢＶ１１－１２×．２６で形質導入
されたＡＤ３８細胞は、形質導入後７日で、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入された
ＡＤ３８細胞よりも、細胞培養培地においてそれぞれ約５８％及び２５％少ないＨＢｓＡ
ｇを示した（図１２Ａ）。細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのコピー数もまた、ＲＦＰ発現レンチ
ウイルスによる形質導入と比較した場合、ＨＢＶ５－６×．３３及びＨＢＶ１１－１２×
．２６メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約２８％及び５０％減少した
（図１２Ｂ）。最終的に、細胞内のＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡのコピー数もまた、ＲＦＰ発現
レンチウイルスによる形質導入と比較した場合、ＨＢＶ５－６×．３３及びＨＢＶ１１－
１２×．２６メガヌクレアーゼによる形質導入によって、それぞれ約７１％及び６０％減
少した（図１２Ｃ）。
結論
これらのデータは更に、ＨＢＶ５－６ｘ．３３又はＨＢＶ１１－１２ｘ．２６メガヌク
レアーゼのいずれかをコードするレンチウイルスで形質導入したＡＤ３８細胞が、ＲＦＰ
発現レンチウイルスで形質導入した細胞と比較して、上清のＨＢｓＡｇの劇的な減少を示
すことを実証している。更に、これらのデータは、本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼがま
た細胞外のＨＢＶ ＤＮＡのコピー数を減少させ、重要なことに、ＨＢＶ ｃｃｃＤＮＡ
の細胞内のコピー数を有意に減少させることを実証している。
実施例６；ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の治療
ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の治療
上記の実施例の研究は、ＨＢＶゲノム発現ＡＤ３８細胞系からのＨＢｓＡｇの分泌を減
少させることにおけるメガヌクレアーゼの有効性を実証する。本実施例の研究は、ＨＢＶ
感染初代ヒト肝細胞における本発明のＨＢＶメガヌクレアーゼの有効性を判定するために
行われた。
ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３又はＨＢＶ１１－１２×．２６を発現するレンチウイル
スを作製し、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞を形質導入して、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇの産
生に対するメガヌクレアーゼの影響を判定した。簡潔には、初代ヒト肝細胞を播種し、２
４時間後にＨＢＶに感染させた。感染後１日目に細胞を洗浄し、２４時間後（感染後２日
目）に、ＲＦＰ、ＨＢＶ５－６×．３３、ＨＢＶ１１－１２×．２６をコードするレンチ
ウイルス、又はＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１の混合物の
いずれかで形質導入した。更なる対照として、感染させた細胞をＤＭＳＯで処理した。細
胞の上清を回収し、形質導入後４日目、８日目、１１日目、及び１３日目に培地を交換し
た。各時点で、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇをＥＬＩＳＡにより細胞の上清で測定した。ま
た、上清の中の細胞外ＤＮＡを感染後１３日目に測定した。
結果
一般に、レンチウイルス形質導入がＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇのいずれかの分泌に影響
を及ぼすかどうかを判断するために、ＲＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入した
細胞から得た細胞の上清を、ＤＭＳＯで処理した細胞と比較した（図１３）。ＲＦＰをコ
ードするレンチウイルスを用いたＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の形質導入は、ＨＢｓＡｇ又
はＨＢｅＡｇの分泌に対する影響があったとしてもわずかであった（図１３Ａ及び図１３
Ｂ）。５又は２．５のＭＯＩでは、ＨＢｓＡｇのレベルはＤＭＳＯで処理した細胞と同一
であり、１．２５のＭＯＩではわずかな減少しかない（図１３Ａ）。同様に、ＲＦＰ－レ
ンチウイルス形質導入細胞の上清のＨＢｅＡｇのレベルは、ＤＭＳＯで処理した細胞と比
較した場合に、１．２５、２．５、又は５のＭＯＩでほんのわずかな減少を示している（
図１３Ｂ）。更に、ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の上清にて検出された細胞外のＨＢＶの量
は、ＤＭＳＯで処理した細胞と、ＲＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入された細
胞との間にほとんど差異を示していない（図１３Ｃ）。
レンチウイルス形質導入は、一般に、感染した初代ヒト肝細胞におけるＨＢＶ機能に影
響を及ぼさないことを示したので、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルス
をＲＦＰレンチウイルスと比較した。ＨＢｓＡｇのＥＬＩＳＡのデータを、形質導入後３
日目、８日目、１１日目、及び１３日目に、ＲＦＰ形質導入ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の
上清に存在するＨＢｓＡｇの量に対して正規化した（図１４）。２．５及び１．２５のＭ
ＯＩの両方で、ＨＢＶ５－６×．３３をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は
、実験の経過にわたってＨＢｓＡｇの着実な減少を示し、ＲＦＰ対照と比較したときに、
３日目にわずかにレベルの減少、８日目までに約５０～６０％の減少、並びに１１日目及
び１３日目までに約９０％の減少を示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。ＨＢＶ１１－１２ｘ
．２６で形質導入した感染細胞は、ＭＯＩが２．５と１．２５の両方で同様のパターンを
示し、３日目の時点でより顕著な減少（約５０％の減少）を示し、それでも依然、形質導
入後１１日目及び１３日目までに約９０％の減少を達成した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。
感染細胞を、ＨＢＶメガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１混合物で形質
導入した場合、ＨＢｓＡｇの同様の減少が経時的に観察された。２．５のＭＯＩでは、レ
ベルは形質導入後３日目に約５０％減少し、減少は継続して、形質導入後１１日目及び１
３日目までに９０％に達した（図１４Ａ及び図１４Ｂ）。
また、ＨＢｅＡｇのＥＬＩＳＡのデータを、形質導入後３日目、８日目、１１日目、及
び１３日目に、ＲＦＰ形質導入ＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞の上清に存在するＨＢｅＡｇの
量に対して正規化した（図１４）。２．５及び１．２５のＭＯＩの両方で、ＨＢＶ５－６
×．３３をコードするレンチウイルスで形質導入した細胞は、実験の経過にわたってＨＢ
ｅＡｇの着実な減少を示し、ＲＦＰ対照と比較したときに、３日目に約２５％のレベルの
減少、８日目までに約５０％の減少、並びに１１日目及び１３日目までに約９０％の減少
を示した（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。ＨＢＶ１１－１２ｘ．２６で形質導入した感染細胞
は、ＭＯＩが２．５と１．２５の両方で同様のパターンを示し、３日目の時点で類似した
減少（約３０％の減少）を示し、それでも依然、形質導入後１１日目及び１３日目までに
ＨＢｅＡｇの約９０％の減少を達成した（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。感染細胞を、ＨＢＶ
メガヌクレアーゼをコードするレンチウイルスの１：１混合物で形質導入した場合、ＨＢ
ｅＡｇの同様の減少が経時的に観察された。２．５及び１．２５のＭＯＩでは、レベルは
形質導入後３日目に約５０％減少し、減少は継続して、形質導入後１１日目及び１３日目
までに９０％に達した（図１４Ｃ及び図１４Ｄ）。
結論
これらのデータは、ＲＦＰ発現レンチウイルスで形質導入された細胞と比較して、ＨＢ
Ｖ ５－６×．３３若しくはＨＢＶ１１－１２×．２６、又はその２つの組み合わせをコ
ードするレンチウイルスで形質導入されたＨＢＶ感染初代ヒト肝細胞が、上清のＨＢｓＡ
ｇ及びＨＢｅＡｇの劇的な減少を示すことを実証する。感染させた細胞の上清のＨＢｓＡ
ｇ及びＨＢｅＡｇのレベルにおける減少は、ＨＢＶメガヌクレアーゼのいずれか又は両方
を発現するレンチウイルスで形質導入され、その減少が感染性ウイルスに対するメガヌク
レアーゼの活性に起因することを強く示唆している。
実施例７；ＬＮＰ封入ヌクレアーゼｍＲＮＡの肝臓への送達
脂質ナノ粒子でのｍＲＮＡの封入とマウスへの送達
この研究の目的は、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする脂質ナノ粒子（Ｌ
ＮＰ）封入ｍＲＮＡを作製してインビボで投与でき、肝臓における遺伝子編集が起こり、
観察され得ることを実証することである。
マウスの肝臓で発現されるマウスＣＭＰ－ＮｅｕＡｃヒドロラーゼ（Ｃｍａｈ）遺伝子
の認識配列に対して特異性を有する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを発現させた。Ｃ
ｍａｈメガヌクレアーゼをコードするＡＲＣＡキャップｍＲＮＡをＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉ
ｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＬＬＣ（カリフォルニア州サンディエゴ）が作製し、３つ
の異なる市販のＬＮＰ製剤に封入しており、各々は様々な比率のイオン性カチオン性脂質
、ＰＥＧ脂質、及びコレステロールを含む。ＬＮＰ封入ｍＲＮＡを、１．０ｍｇ／ｋｇの
用量で、ＩＶ注射によりＣＤ－１マウスに投与した。投与の６日後に肝臓を採取した。臓
器採取の前に、動物を食塩水で灌流した。全肝臓ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、Ｃ
ｍａｈ遺伝子における挿入／欠失（インデル）突然変異の頻度を、Ｔ７エンドヌクレアー
ゼＩ（Ｔ７Ｅ）アッセイ及びディープシーケンシングを用いて判定した。Ｔ７Ｅのアッセ
イでは、Ｃｍａｈ認識配列を含むゲノムの領域をＰＣＲ増幅し、その結果、野生型と突然
変異の増幅対立遺伝子の異種混合物が得られた。ＰＣＲ産物を変性させ、ゆっくりと再ア
ニーリングさせ、野生型と突然変異の対立遺伝子の間のヘテロ二本鎖の形成を可能にした
。そのようなヘテロ二本鎖は、ミスマッチで切断するＴ７エンドヌクレアーゼＩによる切
断を受けやすい。Ｔ７Ｅ切断産物をゲルで可視化すると、ヘテロ二本鎖のＴ７Ｅ切断に起
因して複数のバンドが存在するが、野生型のサンプルには単一のバンドが存在する。切断
されていない産物に対する切断された産物の比率は、ヌクレアーゼ切断活性のレベルの尺
度を提供する。
結果
本研究の結果を図１５に示す。レーン１及び２に示されるように、ルシフェラーゼをコ
ードするＬＮＰ封入ｍＲＮＡを投与された対照マウスから得られたｇＤＮＡは、Ｃｍａｈ
認識配列での切断の証拠を示さなかった。ルシフェラーゼｍＲＮＡ処置動物において観察
された切断と非切断の比は、ｍＲＮＡを投与されていない動物において観察された比に匹
敵した（レーン８）。対照的に、レーン３～７及び９～１８はそれぞれ、各レーンに複数
のバンドが存在することによって示されるように、動物に、Ｃｍａｈメガヌクレアーゼを
コードするＬＮＰ封入ｍＲＮＡを投与した場合のＣｍａｈ認識配列での改変を示す。Ｃｍ
ａｈ認識配列における遺伝子改変の割合を確認及び定量化するために、各肝臓から得られ
たｇＤＮＡについてディープシーケンシングも行った。ディープシーケンシングによって
得られた割合は、％ＫＯとして各レーンの下に、図１５に示されている。レーン３～７は
、ＬＮＰ製剤＃１を投与した複製動物における３．４１％～２１．４９％の範囲の改変を
示す。レーン９～１３は、ＬＮＰ製剤＃２を投与した複製動物における１８．４％から２
３．２％の範囲の改変を示す。レーン１４～１８は、ＬＮＰ製剤＃３を投与した複製動物
における５１．１％～６４．８％の範囲の改変を示す。
結論
この研究は、本発明のＨＢＶ特異的メガヌクレアーゼのような遺伝子操作されたメガヌ
クレアーゼをコードするｍＲＮＡが、ＬＮＰにて封入され、インビボで標的肝細胞（即ち
、肝細胞）に送達され得、ゲノムの標的化された認識配列で遺伝子編集を誘導し得ること
を明白に示している。

Claims (65)

  1. Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝子型のゲノムのオープンリーディングフレー
    ム（ＯＲＦ）内の認識配列を認識して切断する、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼであ
    って、
    第１のサブユニット及び第２のサブユニットを含み、
    前記第１のサブユニットが前記認識配列の第１の認識した半分の部位に結合し、第１の
    超可変（ＨＶＲ１）領域を含み、
    前記第２のサブユニットは、前記認識配列の第２の認識した半分の部位に結合し、第２
    の超可変（ＨＶＲ２）領域を含む、遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  2. 前記認識配列が、遺伝子型Ａ（配列番号３）並びに遺伝子型Ｂ（配列番号４）、遺伝子
    型Ｃ（配列番号５）、遺伝子型Ｄ（配列番号６）、遺伝子型Ｅ（配列番号７）、遺伝子型
    Ｆ（配列番号８）、及び遺伝子型Ｇ（配列番号９）の１以上のＯＲＦ内にある、請求項１
    に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  3. 前記認識配列が、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／
    Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表面（Ｓ）タンパク質か
    らなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも１つのＯＲＦ内にある、請
    求項１又は２に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  4. 前記認識配列が配列番号１２を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子操作
    されたメガヌクレアーゼ。
  5. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２１５～２７０又は配
    列番号２５～２８のいずれか１つの残基２４～７９に対応するアミノ酸配列に対して少な
    くとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の遺伝子操作さ
    れたメガヌクレアーゼ。
  6. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
    ９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
    １、２６６、及び２６８に対応する残基、又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基
    ２４、２６、２８、３０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７
    ５、及び７７に対応する残基を含む、請求項４又は５に記載の遺伝子操作されたメガヌク
    レアーゼ。
  7. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２１５～２７０又は配
    列番号２５～２８のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請求項４～６のいずれか１項
    に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  8. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２４～７９又は配列番
    号２５～２８のいずれか１つの残基２１５～２７０に対応するアミノ酸配列に対して少な
    くとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４～７のいずれか１項に
    記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  9. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
    ０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
    る残基、又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１９、２２１
    、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６１、２６６
    、及び２６８に対応する残基を含む、請求項４～８のいずれか１項に記載の遺伝子操作さ
    れたメガヌクレアーゼ。
  10. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基２４～７９、または配
    列番号２５～２８のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む、請求項４～９のいずれか
    １項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  11. 前記第１のサブユニットが、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基１９８～３４４
    又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０％の配
    列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが、配列番号２２～２４
    のいずれか１つの残基７～１５３又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基１９８～
    ３４４に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４～
    １０のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  12. 前記第１のサブユニットが、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基１９８～３４４
    又は配列番号２５～２８のいずれか１つの残基７～１５３を含む、請求項４～１１のいず
    れか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  13. 前記第２のサブユニットが、配列番号２２～２４のいずれか１つの残基７～１５３又は
    配列番号２５～２８のいずれか１つの残基１９８～３４４を含む、請求項４～１２のいず
    れか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  14. リンカーを含み、前記リンカーが前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットと
    を共有結合で結合させる、請求項４～１３のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガ
    ヌクレアーゼ。
  15. 配列番号２２～２８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４～１４のいずれか
    １項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  16. 前記認識配列が配列番号１６を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の遺伝子操作
    されたメガヌクレアーゼ。
  17. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２１５～２７０に対し
    て少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の遺伝
    子操作されたメガヌクレアーゼ。
  18. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２１５、２１７、２１
    ９、２２１、２２３、２２４、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２５９、２６
    １、２６６、及び２６８に対応する残基を含む、請求項１６又は１７に記載の遺伝子操作
    されたメガヌクレアーゼ。
  19. 前記ＨＶＲ１領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２１５～２７０を含む
    、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  20. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２４～７９に対して少
    なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６～１９のいずれか
    １項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  21. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２４、２６、２８、３
    ０、３２、３３、３８、４０、４２、４４、４６、６８、７０、７５、及び７７に対応す
    る残基を含む、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
    ーゼ。
  22. 前記ＨＶＲ２領域が、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基２４～７９を含む、請
    求項１６～２１のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  23. 前記第１のサブユニットが、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基１９８～３４４
    に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユ
    ニットが、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基７～１５３に対して少なくとも８０
    ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の
    遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  24. 前記第１のサブユニットが、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基１９８～３４４
    を含む、請求項１６～２３のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  25. 前記第２のサブユニットが、配列番号３３～３９のいずれか１つの残基７～１５３を含
    む、請求項１６～２４のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  26. リンカーを含み、前記リンカーが前記第１のサブユニットと前記第２のサブユニットと
    を共有結合で結合させる、請求項１６～２５のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメ
    ガヌクレアーゼ。
  27. 配列番号３３～３９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１６～２６のいずれ
    か１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ。
  28. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
    る核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
  29. 前記ポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. 前記ｍＲＮＡが、請求項１～２７に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの１以上
    をコードするポリシストロニックｍＲＮＡである、請求項２９に記載のポリヌクレオチド
    。
  31. 前記ポリシストロニックｍＲＮＡが、
    （ａ）配列番号１２を含む認識配列を認識し切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
    ；及び
    （ｂ）配列番号１６を含む認識配列を認識し切断する遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
    をコードする、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
  32. 前記ポリシストロニックｍＲＮＡが、
    （ａ）請求項４～１５のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ；及び
    （ｂ）請求項１６～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ
    をコードする、請求項３０又は３１に記載のポリヌクレオチド。
  33. 前記ポリシストロニックｍＲＮＡが、配列番号２２のアミノ酸配列を含む遺伝子操作さ
    れたメガヌクレアーゼをコードし、且つ配列番号３３のアミノ酸配列を含む遺伝子操作さ
    れたメガヌクレアーゼをコードする、請求項３０～３２のいずれか１項に記載のポリヌク
    レオチド。
  34. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
    る核酸配列を含む、組換えＤＮＡ構築物。
  35. プロモータと請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアー
    ゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む、請求項３４に記載の組換えＤＮＡ構築
    物。
  36. ２以上のカセットを含み、前記カセットの各々が、プロモータと、請求項１～２７のい
    ずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの各々が、異なるＨＢＶ認識配列に対して特異性
    を有する、請求項３４に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  37. プロモータと、請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
    ーゼの１以上をコードするポリシストロニック核酸配列と、を含むカセットを含み、前記
    プロモータが、前記ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞においてポ
    リシストロニックｍＲＮＡを生成する、請求項３４に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  38. 前記ポリシストロニックｍＲＮＡが、請求項３０～３３のいずれか１項に記載のポリシ
    ストロニックｍＲＮＡである、請求項３６に記載の組換えＤＮＡ構築物。
  39. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
    る前記核酸配列を含むウイルスベクターをコードする、請求項３４に記載の組換えＤＮＡ
    構築物。
  40. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項３９に記載の組換えＤＮ
    Ａ構築物。
  41. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードす
    る核酸配列を含む、ウイルスベクター。
  42. 前記ウイルスベクターが組換えＡＡＶベクターである、請求項４１に記載のウイルスベ
    クター。
  43. 前記ウイルスベクターが、プロモータと請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子
    操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列とを含むカセットを含む、請求項４１
    に記載のウイルスベクター。
  44. ２以上のカセットを含み、前記カセットの各々が、プロモータと、請求項１～２７のい
    ずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする核酸配列と、を含み
    、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの各々が、異なるＨＢＶ認識配列に対して特異
    性を有する、請求項４１に記載のウイルスベクター。
  45. プロモータと、請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレア
    ーゼの１以上をコードするポリシストロニック核酸配列と、を含むカセットを含み、前記
    プロモータが、前記ポリシストロニック核酸配列の発現を駆動して、標的細胞においてポ
    リシストロニックｍＲＮＡを生成する、請求項４１に記載のウイルスベクター。
  46. 前記ポリシストロニックｍＲＮＡが、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の前記ポ
    リシストロニックｍＲＮＡである、請求項４５に記載のウイルスベクター。
  47. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）又はＨＢＶに起因する肝細胞がんを有する対象を治療する
    ための医薬組成物であって、医薬的に許容される担体、及び
    （ａ）請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコー
    ドする核酸；又は
    （ｂ）請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ；
    を含む、医薬組成物。
  48. 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードする前記核酸が、請求項２９～３３の
    いずれか１項に記載の前記ｍＲＮＡである、請求項４７に記載の医薬組成物。
  49. 請求項３４～４０のいずれか１項に記載の組換えＤＮＡ構築物を含む、請求項４７に記
    載の医薬組成物。
  50. 請求項４１～４６のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む、請求項４７に記載
    の医薬組成物。
  51. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを含む、請
    求項４７に記載の医薬組成物。
  52. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの２以上を
    含み、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、異なるＨＢＶ認識配列に対して特異性
    を有する、請求項４７に記載の医薬組成物。
  53. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の遺伝子操作されたメガヌクレアーゼの２以上を
    コードする２以上の核酸を含み、前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、異なるＨＢ
    Ｖ認識配列に対して特異性を有する、請求項４７に記載の医薬組成物。
  54. 脂質ナノ粒子内に封入されている請求項２９～３３のいずれか１項に記載の前記ｍＲＮ
    Ａの１以上を含む、請求項４７に記載の医薬組成物。
  55. ＨＢＶを有する対象を治療する方法であって、前記対象の標的細胞に、
    （ａ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼをコードし、前記標的細胞においてインビボで
    発現される核酸；又は
    （ｂ）遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ；
    を送達することを含み、
    前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼは、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも２つの遺伝
    子型のゲノムのＯＲＦ中の認識配列に対する特異性を有し、前記遺伝子操作されたメガヌ
    クレアーゼは、前記標的細胞中の前記認識配列を認識し切断し、前記対象におけるＨＢＶ
    の感染及び／又は増殖が減少又は排除される方法。
  56. 前記認識配列が、遺伝子型Ａ、並びに遺伝子型Ｂ（配列番号４）、遺伝子型Ｃ（配列番
    号５）、遺伝子型Ｄ（配列番号６）、遺伝子型Ｅ（配列番号７）、遺伝子型Ｆ（配列番号
    ８）、及び遺伝子型Ｇ（配列番号９）の１以上のＯＲＦ内にある、請求項５５に記載の方
    法。
  57. 前記認識配列が、Ｂ型肝炎ウイルスの少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５
    つ、又は少なくとも６つの遺伝子型のＯＲＦ内に見出される、請求項５５又は５６に記載
    の方法。
  58. 前記認識配列が、ポリメラーゼ（Ｐ）タンパク質、大表面（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／
    Ｓ）タンパク質、中表面（ｐｒｅＳ２／Ｓ）タンパク質、及び小表面（Ｓ）タンパク質か
    らなる群から選択されるタンパク質をコードする、少なくとも１つのＯＲＦ内にある、請
    求項５５～５７のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記認識配列が配列番号１２、配列番号１６、配列番号１０、又は配列番号１４を含む
    、請求項５５～５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記認識配列が配列番号１２を含む、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、請求項４～１５のいずれか１項に記載の遺
    伝子操作されたメガヌクレアーゼである、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の方法
    。
  62. 前記認識配列が配列番号１６を含む、請求項５５～５９のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼが、請求項１６～２７のいずれか１項に記載の
    遺伝子操作されたメガヌクレアーゼである、請求項６２に記載の方法。
  64. 前記対象に請求項４７～５４のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む
    、請求項５５～６３のいずれか１項に記載の方法。
  65. 前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼ又は前記遺伝子操作されたメガヌクレアーゼを
    コードする前記核酸が、標的肝細胞に送達される、請求項５５～６４のいずれか１項に記
    載の方法。
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WO (1) WO2018071849A2 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019007450A2 (pt) 2016-10-14 2020-07-07 Precision Biosciences, Inc. meganucleases modificadas específicas para sequências de reconhecimento no genoma do vírus da hepatite b
US11142750B2 (en) 2018-04-12 2021-10-12 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the Hepatitis B virus genome
WO2020227534A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Precision Biosciences, Inc. Optimization of engineered meganucleases for recognition sequences
CN117843811A (zh) 2019-09-30 2024-04-09 吉利德科学公司 Hbv疫苗和治疗hbv的方法
TW202200161A (zh) 2020-03-20 2022-01-01 美商基利科學股份有限公司 4’-c-經取代-2-鹵基-2’-去氧腺苷核苷之前藥及其製造與使用方法
WO2021231259A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
TW202406932A (zh) 2020-10-22 2024-02-16 美商基利科學股份有限公司 介白素2-Fc融合蛋白及使用方法
CN116783293A (zh) * 2020-11-12 2023-09-19 精密生物科学公司 对肌营养不良蛋白基因中的识别序列具有特异性的工程化大范围核酸酶
JP2024518558A (ja) 2021-05-13 2024-05-01 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ＴＬＲ８調節化合物と抗ＨＢＶ ｓｉＲＮＡ治療薬との組合せ

Family Cites Families (272)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
EP0618924B1 (en) 1991-12-23 2001-02-14 Bayer Corporation Hbv amplifier probes for use in solution phase sandwich hybridization assays
EP1288296A3 (en) * 1992-05-11 2003-03-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for inhibiting HBV viral replication
US6015832A (en) 1997-12-31 2000-01-18 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inactivating bacteria including bacterial spores
US6506803B1 (en) 1999-04-28 2003-01-14 Regents Of The University Of Michigan Methods of preventing and treating microbial infections
US7767216B2 (en) 1999-04-28 2010-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial compositions and methods of use
US6559189B2 (en) 1999-04-28 2003-05-06 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US6635676B2 (en) 1999-04-28 2003-10-21 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
US6555674B2 (en) 2000-08-09 2003-04-29 Nsgene A/S JeT promoter
CN1204248C (zh) * 2002-02-05 2005-06-01 中国人民解放军第四军医大学 治疗乙肝病毒感染的靶向核糖核酸酶的制备工艺
US7074596B2 (en) 2002-03-25 2006-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthesis and use of anti-reverse mRNA cap analogues
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
TWI382019B (zh) 2005-08-19 2013-01-11 Array Biopharma Inc 作為類鐸受體（ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）調節劑之胺基二氮雜呯
TW201402124A (zh) 2005-08-19 2014-01-16 Array Biopharma Inc 作為類鐸受體（ｔｏｌｌ-ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）調節劑之８-經取代苯并氮雜呯
SI3611266T1 (sl) 2005-08-23 2023-02-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modificirani nukleozidi, ki vsebujejo RNA, in postopki za njihovo uporabo
EP2484758B1 (en) 2005-10-18 2013-10-02 Precision Biosciences Rationally-designed meganucleases with altered sequence specificity and DNA-binding affinity
JP4235837B2 (ja) 2006-04-04 2009-03-11 セイコーエプソン株式会社 粒状性の予測、プロファイルの作成および印刷装置
ES2437871T3 (es) 2006-07-07 2014-01-14 Gilead Sciences, Inc. Moduladores del receptor tipo toll 7
WO2009001159A1 (en) 2007-06-25 2008-12-31 Cellectis Method for enhancing the cleavage activity of i-crei derived meganucleases
WO2008103380A2 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Fox Chase Cancer Center Hepatitis b virus compositions and methods of use
US7968544B2 (en) 2007-06-29 2011-06-28 Gilead Sciences, Inc. Modulators of toll-like receptor 7
CA2704383A1 (en) 2007-10-31 2009-05-07 James Jefferson Smith Rationally-designed single-chain meganucleases with non-palindromic recognition sequences
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
PE20110308A1 (es) 2008-07-08 2011-06-10 Incyte Corp 1,2,5-oxadiazoles como inhibidores de indolamina 2,3-dioxigenasa
CA2732437C (en) 2008-08-01 2017-11-21 Ventirx Pharmaceuticals, Inc. Toll-like receptor agonist formulations and their use
ES2623794T3 (es) 2008-12-09 2017-07-12 Gilead Sciences, Inc. Intermedios para la preparación de moduladores de receptores tipo toll
US20120171191A1 (en) 2009-05-26 2012-07-05 Cellectis Meganuclease variants cleaving the genome of a pathogenic non-integrating virus and uses thereof
WO2010136841A2 (en) * 2009-05-26 2010-12-02 Cellectis Meganuclease variants cleaving the genome of a non-genomically integrating virus and uses thereof
DK2467377T3 (en) 2009-08-18 2017-04-03 Ventirx Pharmaceuticals Inc SUBSTITUTED BENZOAZEPINS AS MODULATORS OF TOLL-LIKE RECEPTORS
AU2010284241B2 (en) 2009-08-18 2016-11-10 Array Biopharma, Inc. Substituted benzoazepines as Toll-like receptor modulators
NO2491035T3 (ja) 2009-10-22 2018-01-27
US9186337B2 (en) 2010-02-24 2015-11-17 Oryzon Genomics S.A. Lysine demethylase inhibitors for diseases and disorders associated with Hepadnaviridae
MX2012013622A (es) 2010-05-31 2013-02-01 Ono Pharmaceutical Co Derivado de purinona.
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
US20120219615A1 (en) 2010-10-01 2012-08-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Therapeutic Use of a TLR Agonist and Combination Therapy
RU2587061C2 (ru) 2010-10-01 2016-06-10 Вентиркс Фармасьютикалз, Инк. Способы лечения аллергических заболеваний
AR084217A1 (es) 2010-12-10 2013-05-02 Gilead Sciences Inc Inhibidores macrociclicos de virus flaviviridae
PL2663550T4 (pl) 2011-01-12 2017-07-31 Ventirx Pharmaceuticals, Inc. Podstawione benzoazepiny jako modulatory receptora toll-podobnego
PL2663555T4 (pl) 2011-01-12 2017-08-31 Ventirx Pharmaceuticals, Inc. Podstawione benzoazepiny jako modulatory receptora toll-podobnego
EA028659B1 (ru) 2011-02-12 2017-12-29 Глоубиммьюн, Инк. Терапевтическое средство на основе дрожжей для лечения хронического гепатита b
RS60191B1 (sr) 2011-04-08 2020-06-30 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Derivati pirimidina za tretman virusnih infekcija
SI2709989T1 (en) 2011-05-18 2018-04-30 Janssen Sciences Ireland Uc Quinazoline derivatives for the treatment of viral infections and other diseases
EP3683319A1 (en) 2011-06-01 2020-07-22 Precision Biosciences, Inc. Methods and products for producing engineered mammalian cell lines with amplified transgenes
CN103732238A (zh) 2011-06-08 2014-04-16 奥瑞基尼探索技术有限公司 用于免疫调节的治疗性化合物
CA2833778C (en) * 2011-06-30 2021-09-28 Arrowhead Research Corporation Compositions and methods for inhibiting gene expression of hepatitis b virus
WO2013006841A1 (en) * 2011-07-06 2013-01-10 Yale University Stimulation of arterial collateral growth and lymphogenesis
HUE031094T2 (en) 2011-11-29 2017-07-28 Ono Pharmaceutical Co Purinone derivative hydrochloride
EP2794565B1 (en) 2011-12-21 2017-07-26 Novira Therapeutics Inc. Hepatitis b antiviral agents
JP6283320B2 (ja) 2012-02-08 2018-02-21 ヤンセン・サイエンシズ・アイルランド・ユーシー ウイルス感染の治療のためのピペリジノ−ピリミジン誘導体
CN104159911A (zh) 2012-03-07 2014-11-19 奥瑞基尼探索技术有限公司 作为免疫调节剂的模拟肽化合物
RU2014143443A (ru) 2012-03-29 2016-05-20 Ориджин Дискавери Текнолоджиз Лимитед Иммуномодулирующие циклические соединения
US20130267517A1 (en) 2012-03-31 2013-10-10 Hoffmann-La Roche Inc. Novel 4-methyl-dihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection
RU2014142598A (ru) 2012-03-31 2016-05-27 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Новые 4-метилдигидропиримидины для лечения и профилактики инфекции вируса гепатита в
WO2013159109A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
US9856320B2 (en) 2012-05-15 2018-01-02 Bristol-Myers Squibb Company Cancer immunotherapy by disrupting PD-1/PD-L1 signaling
JP6209601B2 (ja) 2012-06-08 2017-10-04 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド フラビウイルス科ウイルスの大環状阻害剤
AR091279A1 (es) 2012-06-08 2015-01-21 Gilead Sciences Inc Inhibidores macrociclicos de virus flaviviridae
ES2656087T3 (es) 2012-06-08 2018-02-23 Gilead Sciences, Inc. Inhibidores macrocíclicos de virus Flaviviridae
BR112015002524B1 (pt) 2012-08-10 2021-11-03 Janssen Sciences Ireland Uc Derivados de alquilpirimidina, composição farmacêutica que os compreende e uso dos mesmos
DK2890683T3 (en) 2012-08-28 2017-01-30 Janssen Sciences Ireland Uc MERGED BICYCLIC SULFAMOYL DERIVATIVES AND THEIR USE AS MEDICINES TO TREAT HEPATITIS B
NZ704752A (en) 2012-08-28 2018-06-29 Janssen Sciences Ireland Uc Sulfamoyl-arylamides and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis b
CA2881322A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 F. Hoffmann-La Roche Ag 6-amino acid heteroaryldihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection
MD20150043A2 (ro) 2012-10-02 2015-08-31 Epitherapeutics Aps Inhibitori ai histon-demetilazelor
TR201807076T4 (tr) 2012-10-10 2018-06-21 Janssen Sciences Ireland Uc Viral enfeksiyonların ve diğer hastalıkların tedavisine yönelik pirolo[3,2-d]pirimidin derivatları.
EP2925729B1 (en) 2012-11-16 2017-10-18 Janssen Sciences Ireland UC Heterocyclic substituted 2-amino-quinazoline derivatives for the treatment of viral infections
WO2014089364A1 (en) 2012-12-06 2014-06-12 Quanticel Pharmaceuticals, Inc Histone demethylase inhibitors
DK2934145T3 (en) 2012-12-19 2018-02-05 Celgene Quanticel Res Inc HISTONDEMETHYLASE INHIBITORS
CA2895808A1 (en) 2012-12-21 2014-06-26 Quanticel Pharmaceuticals, Inc. Histone demethylase inhibitors
KR102300861B1 (ko) 2013-02-21 2021-09-10 얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니 바이러스 감염의 치료를 위한 2-아미노피리미딘 유도체
PE20151667A1 (es) 2013-02-27 2015-11-27 Epitherapeutics Aps Inhibidores de histona desmetilasas
US10125094B2 (en) 2013-02-28 2018-11-13 Janssen Sciences Ireland Uc Sulfamoyl-arylamides and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis B
WO2014164708A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Quanticel Pharmaceuticals, Inc. Histone dementhylase inhibitors
WO2014165128A2 (en) 2013-03-12 2014-10-09 Novira Therapeutics, Inc. Hepatitis b antiviral agents
MX2015011898A (es) 2013-03-13 2016-05-05 Genentech Inc Compuestos de pirazolo y usos de los mismos.
JP6276378B2 (ja) 2013-03-14 2018-02-07 セルジーン クオンティセル リサーチ，インク． ヒストンデメチラーゼ阻害剤
WO2014151106A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Quanticel Pharmaceuticals, Inc. Histone demethylase inhibitors
US9308236B2 (en) 2013-03-15 2016-04-12 Bristol-Myers Squibb Company Macrocyclic inhibitors of the PD-1/PD-L1 and CD80(B7-1)/PD-L1 protein/protein interactions
ES2640063T3 (es) 2013-04-03 2017-10-31 Janssen Sciences Ireland Uc Derivados de n-fenil-carboxamida y su uso como medicamentos para el tratamiento de la hepatitis B
WO2014179760A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 The Regents Of The University Of California Cyclic di-nucleotide induction of type i interferon
MX366787B (es) 2013-05-17 2019-07-23 Janssen Sciences Ireland Uc Derivados de sulfamoiltiofenamida y su uso como medicamentos para tratar la hepatitis b.
JO3603B1 (ar) 2013-05-17 2020-07-05 Janssen Sciences Ireland Uc مشتقات سلفامويل بيرولاميد واستخدامها كادوية لمعالجة التهاب الكبد نوع بي
EP2997032B1 (en) 2013-05-17 2018-07-25 F.Hoffmann-La Roche Ag 6-bridged heteroaryldihydropyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection
SG11201600522UA (en) 2013-07-25 2016-02-26 Janssen Sciences Ireland Uc Glyoxamide substituted pyrrolamide derivatives and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis b
CA2913691C (en) 2013-07-30 2022-01-25 Janssen Sciences Ireland Uc Thieno[3,2-d]pyrimidines derivatives for the treatment of viral infections
EP3030322A2 (en) 2013-08-05 2016-06-15 Cambridge Enterprise Limited Inhibition of cxcr4 signaling in cancer immunotherapy
WO2015023958A1 (en) 2013-08-15 2015-02-19 The University Of Kansas Toll-like receptor agonists
ES2642074T3 (es) 2013-09-04 2017-11-15 Bristol-Myers Squibb Company Compuestos útiles como inmunomoduladores
PL3041468T3 (pl) 2013-09-06 2018-12-31 Aurigene Discovery Technologies Limited Pierścieniowe związki peptydomimetyczne jako immunomodulatory
EP3385257A1 (en) 2013-09-06 2018-10-10 Aurigene Discovery Technologies Limited 1,3,4-oxadiazole and 1,3,4-thiadiazole derivatives as immunomodulators
CA2922607C (en) 2013-09-06 2022-08-30 Aurigene Discovery Technologies Limited 1,2,4-oxadiazole derivatives as immunomodulators
WO2015036927A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunomodulating peptidomimetic derivatives
CA2923090C (en) 2013-09-11 2018-08-21 Poxel Methods and pharmaceutical compositions for the treatment of hepatitis b virus infection
WO2015044900A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Aurigene Discovery Technologies Limited Therapeutic immunomodulating compounds
AU2014334554B2 (en) 2013-10-14 2018-12-06 Eisai R&D Management Co., Ltd. Selectively substituted quinoline compounds
RU2671496C2 (ru) 2013-10-14 2018-11-01 Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. Производные 5-пиперидин-8-цианохинолина
US9567299B2 (en) 2013-10-23 2017-02-14 Janssen Sciences Ireland Uc Carboxamide derivatives and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis B
ES2777248T3 (es) 2013-11-14 2020-08-04 Novira Therapeutics Inc Derivados de azepano y métodos de tratar infecciones por hepatitis B
SG10201804975PA (en) * 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Delivery, Use and Therapeutic Applications of the Crispr-Cas Systems and Compositions for HBV and Viral Diseases and Disorders
US9643967B2 (en) 2013-12-13 2017-05-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Pyrrolo[3,2-c]pyridine derivatives as TLR inhibitors
WO2015095780A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 The University Of Kansas Toll-like receptor 8 agonists
US9181288B2 (en) 2014-01-16 2015-11-10 Novira Therapeutics, Inc. Azepane derivatives and methods of treating hepatitis B infections
US9169212B2 (en) 2014-01-16 2015-10-27 Novira Therapeutics, Inc. Azepane derivatives and methods of treating hepatitis B infections
EA201691261A1 (ru) 2014-01-30 2016-11-30 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Новые дигидрохинолизиноны для лечения и профилактики инфекции, вызванной вирусом гепатита b
NZ722891A (en) 2014-02-04 2021-07-30 Incyte Corp Combination of a pd-1 antagonist and an ido1 inhibitor for treating cancer
AP2016009257A0 (en) 2014-02-06 2016-06-30 Janssen Sciences Ireland Uc Sulphamoylpyrrolamide derivatives and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis b
WO2015134605A1 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Bristol-Myers Squibb Company Treatment of renal cancer using a combination of an anti-pd-1 antibody and another anti-cancer agent
EA030115B9 (ru) 2014-03-07 2018-09-28 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Новые 6-конденсированные гетероарилдигидропиримидины для лечения и профилактики заражения вирусом гепатита b
US9400280B2 (en) 2014-03-27 2016-07-26 Novira Therapeutics, Inc. Piperidine derivatives and methods of treating hepatitis B infections
US9850225B2 (en) 2014-04-14 2017-12-26 Bristol-Myers Squibb Company Compounds useful as immunomodulators
AR100137A1 (es) 2014-04-22 2016-09-14 Hoffmann La Roche Compuestos 4-amino-imidazoquinolina
CR20160512A (es) 2014-05-01 2016-12-21 Novartis Ag Compuestos y composiciones como agonistas del receptor tipo toll 7
JP6541689B2 (ja) 2014-05-01 2019-07-10 ノバルティス アーゲー Ｔｏｌｌ様受容体７アゴニストとしての化合物および組成物
JP6568106B2 (ja) 2014-05-13 2019-08-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療及び予防のための新規ジヒドロキノリジノン類
US20170182003A1 (en) 2014-05-23 2017-06-29 Eisai R&D Management Co., Ltd. Combination therapies for the treatment of cancer
US10066241B2 (en) 2014-05-30 2018-09-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods of delivering treatments for latent viral infections
WO2015188085A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Flexus Biosciences, Inc. Immunoregulatory agents
WO2016012470A1 (en) 2014-07-25 2016-01-28 F. Hoffmann-La Roche Ag New amorphous and crystalline forms of (3s)-4-[[(4r)-4-(2-chloro-4-fluoro-phenyl)-5-methoxycarbonyl-2-thiazol-2-yl-1, 4-dihydropyrimidin-6-yl]methyl]morpholine-3-carboxylic acid
JP6666343B2 (ja) 2014-08-01 2020-03-13 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー 腫瘍を治療するための方法及び組合せ治療薬
BR112017002970B1 (pt) 2014-08-14 2023-04-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Novas piridazonas e triazinonas para o tratamento e profilaxia da infecção pelo vírus da hepatite b
EA032824B1 (ru) 2014-08-15 2019-07-31 Чиа Тай Тяньцин Фармасьютикал Груп Ко., Лтд. Пирролопиримидиновые соединения, используемые в качестве агониста tlr7
EP3398948A3 (en) 2014-08-22 2018-12-05 Janus Biotherapeutics, Inc. 2,4,6,7-tetrasubstituted pteridine compounds and methods of synthesis and use thereof
SG11201701182VA (en) 2014-08-27 2017-03-30 Gilead Sciences Inc Compounds and methods for inhibiting histone demethylases
US9884866B2 (en) 2014-09-08 2018-02-06 Regents Of The University Of Minnesota Immunomodulators and immunomodulator conjugates
CN106999536B (zh) 2014-09-11 2020-11-27 百时美施贵宝公司 Pd-1/pd-l1及cd80(b7-1)/pd-l1蛋白质/蛋白质相互作用的大环抑制剂
WO2016057924A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Genentech, Inc. Pyrrolidine amide compounds as histone demethylase inhibitors
US9732119B2 (en) 2014-10-10 2017-08-15 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
WO2016055553A1 (en) 2014-10-11 2016-04-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Compounds for use in the treatment of infectious diseases
US9637485B2 (en) 2014-11-03 2017-05-02 Hoffmann-La Roche Inc. 6,7-dihydrobenzo[a]quinolizin-2-one derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis B virus infection
UY36390A (es) 2014-11-05 2016-06-01 Flexus Biosciences Inc Compuestos moduladores de la enzima indolamina 2,3-dioxigenasa (ido), sus métodos de síntesis y composiciones farmacéuticas que los contienen
CA2964276A1 (en) 2014-11-05 2016-05-12 Flexus Biosciences, Inc. Immunoregulatory agents
CA2967248A1 (en) 2014-11-13 2016-05-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenine derivatives which are useful in the treatment of allergic diseases or other inflammatory conditions
US9856292B2 (en) 2014-11-14 2018-01-02 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
PL3230298T3 (pl) 2014-12-08 2021-06-14 F.Hoffmann-La Roche Ag 3-podstawione związki 5-amino-6h-tiazolo[4,5-d]pirymidyno-2,7-dionowe do leczenia i profilaktyki zakażenia wirusowego
WO2016096778A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Benzazepine sulfonamide compounds
US9861680B2 (en) 2014-12-18 2018-01-09 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
US9944678B2 (en) 2014-12-19 2018-04-17 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
US9676793B2 (en) 2014-12-23 2017-06-13 Hoffmann-Laroche Inc. Co-crystals of 5-amino-2-oxothiazolo[4,5-d]pyrimidin-3(2H)-yl-5-hydroxymethyl tetrahydrofuran-3-yl acetate and methods for preparing and using the same
AR103222A1 (es) 2014-12-23 2017-04-26 Hoffmann La Roche Procedimiento para la preparación de análogos de 4-fenil-5-alcoxicarbonil-2-tiazol-2-il-1,4-dihidropirimidina
CN105732635A (zh) 2014-12-29 2016-07-06 南京明德新药研发股份有限公司 一类Toll样受体7激动剂
JP6506845B2 (ja) 2014-12-30 2019-04-24 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｂ型肝炎ウイルス感染症の治療及び予防のための新規テトラヒドロピリドピリミジン類及びテトラヒドロピリドピリジン類
WO2016109684A2 (en) 2014-12-30 2016-07-07 Novira Therapeutics, Inc. Derivatives and methods of treating hepatitis b infections
CN107109497A (zh) 2014-12-31 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 通过实时PCR从细胞裂解物定量HBV cccDNA的高通量新方法
MA41338B1 (fr) 2015-01-16 2019-07-31 Hoffmann La Roche Composés de pyrazine pour le traitement de maladies infectieuses
CN107208102B (zh) 2015-01-27 2021-07-06 豪夫迈·罗氏有限公司 重组hbv cccdna、其产生方法及其用途
US20160222060A1 (en) 2015-02-04 2016-08-04 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
CN107207505B (zh) 2015-02-11 2018-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗和预防乙型肝炎病毒感染的 2-氧代-6,7-二氢苯并[a]喹嗪-3-甲酸衍生物
PT3321265T (pt) 2015-03-04 2020-07-07 Gilead Sciences Inc Compostos 4,6-diamino-pirido[3,2-d]pirimidina compounds e a sua utilização como moduladores de receptores do tipo toll
LT3265458T (lt) 2015-03-06 2019-03-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Benzazepino dikarboksamido junginiai
BR112017019304A2 (pt) 2015-03-10 2018-05-08 Aurigene Discovery Technologies Limited compostos de 1,2,4-oxadiazol 3-substituído e tiadiazol como imunomoduladores
CN107427477B (zh) 2015-03-10 2021-11-26 奥瑞基尼探索技术有限公司 作为免疫调节剂的1,2,4-噁二唑和噻二唑化合物
MX2017011611A (es) 2015-03-10 2018-03-23 Aurigene Discovery Tech Ltd Compuestos de tiadiazol y 1,3,4-oxadiazol 3-sustituidos como inmunomoduladores.
SG11201706901TA (en) 2015-03-10 2017-09-28 Aurigene Discovery Tech Ltd Therapeutic cyclic compounds as immunomodulators
CN107405336A (zh) 2015-03-10 2017-11-28 奥瑞基尼探索技术有限公司 作为免疫调节剂的1,3,4‑噁二唑和噻二唑化合物
US9809625B2 (en) 2015-03-18 2017-11-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
US10442788B2 (en) 2015-04-01 2019-10-15 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Hepatitis B antiviral agents
CA2982811A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Indiana University Research And Technology Corporation Hepatitis b viral assembly effectors
WO2016177655A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Tetrahydropyridopyrimidines and tetrahydropyridopyridines as inhibitors of hbsag (hbv surface antigen) and hbv dna production for the treatment of hepatitis b virus infections
EP4001283A1 (en) 2015-05-12 2022-05-25 F. Hoffmann-La Roche AG Substituted aminothiazolopyrimidinedione derivatives for the treatment and prophylaxis of virus infection
WO2016195982A2 (en) 2015-06-01 2016-12-08 The Penn State Research Foundation Hepatitis b virus capsid assembly
WO2017001307A1 (en) 2015-06-30 2017-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel substituted aminothiazolopyrimidinedione for the treatment and prophylaxis of virus infection
GB201511477D0 (en) 2015-06-30 2015-08-12 Redx Pharma Plc Antiviral compounds
US10875876B2 (en) 2015-07-02 2020-12-29 Janssen Sciences Ireland Uc Cyclized sulfamoylarylamide derivatives and the use thereof as medicaments for the treatment of hepatitis B
WO2017007701A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Antiviral phosphodiamide compounds
WO2017013046A1 (en) 2015-07-21 2017-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel tricyclic 4-pyridone-3-carboxylic acid derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection
WO2017016960A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Process for the preparation of (6s)-6-alkyl-10-alkoxy-9-(substituted alkoxy)-2-oxo-6,7-dihydrobenzo[a]quinolizine-3-carboxylic acid analogues
CN107820496B (zh) 2015-07-27 2020-11-03 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗和预防乙型肝炎病毒感染的新的四环4-氧代-吡啶-3-甲酸衍生物
EP3328858B1 (en) 2015-07-28 2019-05-15 H. Hoffnabb-La Roche Ag Novel 6,7-dihydropyrido[2,1-a]phthalazin-2-ones for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection
WO2017017624A1 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Novartis Ag Combination of pd-1 antagonist with an egfr inhibitor
MY192607A (en) 2015-08-10 2022-08-29 Merck Sharp & Dohme Antiviral beta-amino acid ester phosphodiamide compounds
EP3334745B1 (en) 2015-08-13 2024-05-15 Merck Sharp & Dohme LLC Cyclic di-nucleotide compounds as sting agonists
EP3337481B1 (en) 2015-08-21 2020-11-11 The University of Kansas Quinoline-2-amine derivatives as human tlr8-selective agonists for increasing immune response
WO2017038909A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Heterocyclic compounds
KR20180041745A (ko) 2015-08-31 2018-04-24 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 구아니딘 치환된 이미다조[4,5-c] 고리 화합물
TWI786639B (zh) 2015-09-15 2022-12-11 美商艾森伯利生物科學公司 B型肝炎核心蛋白質調節劑
JP6856900B2 (ja) 2015-09-17 2021-04-14 国立大学法人富山大学 トール様受容体７またはトール様受容体９の活性化阻害剤
EP3350168B1 (en) 2015-09-17 2019-12-18 H. Hoffnabb-La Roche Ag Sulfinylphenyl or sulfonimidoylphenyl benzazepines
EP3360554B1 (en) 2015-10-05 2021-07-28 FUJIFILM Toyama Chemical Co., Ltd. Anti-hepatitis b virus agent
US10632192B2 (en) 2015-10-07 2020-04-28 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Pyrimidine compounds and their use as vaccine adjuvants
US10745382B2 (en) 2015-10-15 2020-08-18 Bristol-Myers Squibb Company Compounds useful as immunomodulators
ES2928164T3 (es) 2015-10-19 2022-11-15 Incyte Corp Compuestos heterocíclicos como inmunomoduladores
EP3368072A4 (en) 2015-10-28 2019-07-03 Aduro BioTech, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD FOR ACTIVATING SIGNALING DEPENDENT ON THE STIMULATOR OF THE INTERFERON GENE
SI3371316T1 (sl) 2015-11-04 2023-02-28 Hookipa Biotech Gmbh Cepivo proti virusu hepatitisa B
CA3004083A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Incyte Corporation Pharmaceutical compositions and methods for indoleamine 2,3-dioxygenase inhibition and indications therefor
MX2018005708A (es) 2015-11-05 2018-11-09 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co Ltd Compuesto de 7-(tiazol-5-il)pirrolopirimidina como agonista de tlr7.
WO2017087678A2 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (gitr) and uses thereof
CA3005727A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Incyte Corporation Substituted 2-methylbiphenyl-3-yl heterocyclic compounds and pharmaceutical compositions thereof useful as immunomodulators
CN107849084B (zh) 2015-12-03 2021-09-14 葛兰素史密斯克莱知识产权发展有限公司 作为sting调节剂的环状嘌呤二核苷酸
EP3386512B1 (en) 2015-12-10 2023-11-22 Merck Sharp & Dohme LLC Antiviral phosphodiamide prodrugs of tenofovir
US20180369268A1 (en) 2015-12-16 2018-12-27 Aduro Biotech, Inc. Methods for identifying inhibitors of "stimulator of interferon gene"- dependent interferon production
MY196319A (en) 2015-12-17 2023-03-24 Merck Patent Gmbh Polycyclic TLR7/8 Antagonists and use Thereof in the Treatment of Immune Disorders
WO2017106634A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Incyte Corporation N-phenyl-pyridine-2-carboxamide derivatives and their use as pd-1/pd-l1 protein/protein interaction modulators
PE20230731A1 (es) 2015-12-22 2023-05-03 Incyte Corp Compuestos heterociclicos como inmunomoduladores
WO2017112859A1 (en) * 2015-12-23 2017-06-29 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human beta-2 microglobulin gene
MX2018010010A (es) 2016-02-19 2018-11-09 Novartis Ag Compuestos tetraciclicos de piridona como antivirales.
KR102530488B1 (ko) 2016-03-18 2023-05-08 이뮨 센서, 엘엘씨 사이클릭 디-뉴클레오티드 화합물 및 사용 방법
WO2017163264A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Council Of Scientific & Industrial Research Blocking toll-like receptor 9 signaling with small molecule antagonist
US10358463B2 (en) 2016-04-05 2019-07-23 Bristol-Myers Squibb Company Immunomodulators
BR112018071347A2 (pt) 2016-04-19 2019-02-05 Innate Tumor Immunity Inc moduladores de nlrp3
WO2017184735A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Ifm Therapeutics, Inc Nlrp3 modulators
WO2017186711A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 Invivogen Novel complexes of immunostimulatory compounds, and uses thereof
DK3452583T3 (da) * 2016-05-03 2022-01-10 Prec Biosciences Inc Konstruerede nukleaser, der er nyttige til behandling af hæmofili a
JP6739548B2 (ja) 2016-05-06 2020-08-12 シャンハイ ドーァ ノボ ファーマテック カンパニー，リミティド ベンザゼピン誘導体、その製造方法、薬物組成物および使用
AR108396A1 (es) 2016-05-06 2018-08-15 Incyte Corp Compuestos heterocíclicos como inmunomoduladores
EP3458455B1 (en) 2016-05-20 2021-06-16 F. Hoffmann-La Roche AG Novel pyrazine compounds with oxygen, sulfur and nitrogen linker for the treatment of infectious diseases
JP6918838B2 (ja) 2016-05-23 2021-08-11 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 第三級アミド基を有するベンズアゼピンジカルボキサミド化合物
JP7022702B2 (ja) 2016-05-23 2022-02-18 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 第二級アミド基を有するベンズアゼピンジカルボキサミド化合物
ES2905980T3 (es) 2016-05-26 2022-04-12 Incyte Corp Compuestos heterocíclicos como inmunomoduladores
EP3464278B1 (en) 2016-05-26 2021-06-16 F. Hoffmann-La Roche AG Xanthone derivatives for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus disease
WO2017211791A1 (en) 2016-06-07 2017-12-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of an hbsag inhibitor and a tlr7 agonist
SG11201810834WA (en) 2016-06-10 2018-12-28 Enanta Pharm Inc Hepatitis b antiviral agents
JP7012668B2 (ja) 2016-06-12 2022-02-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト ジヒドロピリミジニルベンズアゼピンジカルボキサミド化合物
WO2017216686A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Novartis Ag 8,9-fused 2-oxo-6,7-dihydropyrido-isoquinoline compounds as antivirals
WO2017216685A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Novartis Ag Pentacyclic pyridone compounds as antivirals
PE20190731A1 (es) 2016-06-20 2019-05-23 Incyte Corp Compuestos heterociclicos como inmunomoduladores
WO2017219931A1 (zh) 2016-06-22 2017-12-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 二氢蝶啶酮类衍生物、其制备方法及其用途
CN109843892B (zh) 2016-06-29 2022-01-25 诺维拉治疗公司 噁二氮杂卓酮衍生物及其在治疗乙型肝炎感染中的用途
CN109641896B (zh) 2016-06-29 2021-09-21 诺维拉治疗公司 二氮杂酮衍生物及其在治疗乙型肝炎感染中的用途
EP3478686B1 (en) 2016-06-29 2020-04-15 H. Hoffnabb-La Roche Ag Novel dihydropyrrolopyrimidines for the treatment and prophylaxis of hepatitis b virus infection
JP6742452B2 (ja) 2016-06-29 2020-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ Ｈｂｖ感染の処置および予防のための新規のテトラヒドロピリドピリミジン
US10071079B2 (en) 2016-06-29 2018-09-11 Bristol-Myers Squibb Company [1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridinyl substituted indole compounds
KR102468272B1 (ko) 2016-06-30 2022-11-18 삼성전자주식회사 음향 출력 장치 및 그 제어 방법
WO2018002319A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Janssen Sciences Ireland Uc Dihydropyranopyrimidines for the treatment of viral infections
WO2018009466A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Aduro Biotech, Inc. Locked nucleic acid cyclic dinucleotide compounds and uses thereof
US10590105B2 (en) 2016-07-08 2020-03-17 Bristol-Meyers Squibb Company 1,3-dihydroxy-phenyl derivatives useful as immunomodulators
JP7051804B2 (ja) 2016-07-14 2022-04-11 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 感染症の治療のための６，７－ジヒドロ－４Ｈ－ピラゾロ［１，５－ａ］ピラジン化合物と６，７－ジヒドロ－４Ｈ－トリアゾロ［１，５－ａ］ピラジン化合物
ES2930092T3 (es) 2016-07-14 2022-12-07 Incyte Corp Compuestos heterocíclicos como inmunomoduladores
EP3484885B1 (en) 2016-07-14 2020-03-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Carboxy 6,7-dihydro-4h-pyrazolo[1,5-a]pyrazine compounds for the treatment of infectious diseases
WO2018011160A1 (en) 2016-07-14 2018-01-18 F. Hoffmann-La Roche Ag 6,7-dihydro-4h-pyrazolo[1,5-a]pyrazine compounds for the treatment of infectious diseases
CN109476659B (zh) 2016-07-14 2021-07-09 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗感染性疾病的新的四氢吡唑并吡啶化合物
WO2018019297A1 (zh) 2016-07-29 2018-02-01 银杏树药业(苏州)有限公司 异喹啉酮类化合物及其制备抗病毒药物的应用
CA3031063A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Newave Pharmaceutical Inc. Benzo-quinolizin-2oxo carboxylic acid derivatives for the treatment of hbv infection
AU2017307208B2 (en) 2016-07-30 2021-01-21 Bristol-Myers Squibb Company Dimethoxyphenyl substituted indole compounds as TLR7, TLR8 or TLR9 inhibitors
CN109195602B (zh) 2016-08-03 2022-01-07 上海齐鲁制药研究中心有限公司 用作免疫调节剂的对称或半对称化合物
WO2018031434A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Merck Patent Gmbh Tlr7/8 antagonists and uses thereof
WO2018036941A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of an hbv capsid assembly inhibitor and a nucleos(t)ide analogue
CA3034553A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 3M Innovative Properties Company Fused [1,2]imidazo[4,5-c] ring compounds substituted with guanidino groups
MA46045A (fr) 2016-08-29 2021-04-28 Incyte Corp Composés hétérocycliques utilisés comme immunomodulateurs
US10144706B2 (en) 2016-09-01 2018-12-04 Bristol-Myers Squibb Company Compounds useful as immunomodulators
ES2826748T3 (es) 2016-09-02 2021-05-19 Gilead Sciences Inc Derivados de 4,6-diamino-pirido[3,2-d]pirimidina como moduladores de receptores de tipo Toll
JP6746776B2 (ja) 2016-09-02 2020-08-26 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｔｏｌｌ様受容体調節剤化合物
WO2018043747A1 (ja) 2016-09-05 2018-03-08 国立大学法人京都大学 抗ｂ型肝炎ウイルス剤
EP3510036B1 (en) 2016-09-07 2021-07-21 GlaxoSmithKline Biologicals SA Imidazoquinoline derivatives and their use in therapy
CN109803967B (zh) 2016-09-09 2022-05-24 浙江海正药业股份有限公司 二氢嘧啶类化合物及其制备方法和用途
WO2018047081A1 (en) 2016-09-09 2018-03-15 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of endosomal toll-like receptors
EP3510024B1 (en) 2016-09-09 2021-11-17 Bristol-Myers Squibb Company Pyridyl substituted indole compounds
WO2018051254A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Aurigene Discovery Technologies Limited Cyclic substituted-1,2,4-oxadiazole compounds as immunomodulators
WO2018051255A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Aurigene Discovery Technologies Limited Cyclic substituted-1,3,4-oxadiazole and thiadiazole compounds as immunomodulators
US10537590B2 (en) 2016-09-30 2020-01-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Cyclic dinucleotide compounds
CR20190168A (es) 2016-10-04 2019-05-17 Merck Sharp & Dohme Compuestos de benzo[b]tiofeno como agonistas de sting
WO2018065360A1 (de) 2016-10-07 2018-04-12 Biolog Life Science Institute Forschungslabor Und Biochemica-Vertrieb Gmbh Benzimidazolhaltige cyclische dinukleotide, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung zur aktivierung von stimulator von interferongenen (sting)-abhängigen signalwegen
BR112019007450A2 (pt) 2016-10-14 2020-07-07 Precision Biosciences, Inc. meganucleases modificadas específicas para sequências de reconhecimento no genoma do vírus da hepatite b
KR20190067235A (ko) 2016-10-20 2019-06-14 오리진 디스커버리 테크놀로지스 리미티드 Vista 및 pd-1 경로의 이중 억제제
WO2018080903A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Antiviral aryl-amide phosphodiamide compounds
WO2018078149A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel cyclicsulfonimidoylpurinone compounds and derivatives for the treatment and prophylaxis of virus infection
KR102526034B1 (ko) 2016-11-07 2023-04-25 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 면역조정제
US11370794B2 (en) 2016-11-11 2022-06-28 Dynavax Technologies Corporation Toll-like receptor antagonist compounds and methods of use
CN108069969B (zh) 2016-11-11 2020-09-18 南京海璞医药科技有限公司 含氮杂环化合物、制备方法、中间体、药物组合物和应用
JOP20170188A1 (ar) 2016-11-25 2019-01-30 Janssen Biotech Inc ثنائي النوكليوتيدات الحلقية كمنبهات ستينغ (sting)
RU2748833C2 (ru) 2016-11-28 2021-05-31 Цзянсу Хэнжуй Медсин Ко., Лтд. Производное пиразоло-гетероарила, способ его получения и медицинское применение
JOP20170192A1 (ar) 2016-12-01 2019-01-30 Takeda Pharmaceuticals Co داي نوكليوتيد حلقي
WO2018118664A1 (en) 2016-12-20 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Combinations of pd-1 antagonists and cyclic dinucleotide sting agonists for cancer treatment
RU2019122598A (ru) 2016-12-20 2021-01-22 Мерк Шарп И Доум Корп. Циклические динуклеотидные агонисты sting для лечения рака
ES2891528T3 (es) 2016-12-20 2022-01-28 Bristol Myers Squibb Co Compuestos útiles como inmunomoduladores
EP3558989B1 (en) 2016-12-22 2021-04-14 Incyte Corporation Triazolo[1,5-a]pyridine derivatives as immunomodulators
ES2899402T3 (es) 2016-12-22 2022-03-11 Incyte Corp Derivados de piridina como inmunomoduladores
MY197635A (en) 2016-12-22 2023-06-29 Incyte Corp Benzooxazole derivatives as immunomodulators
WO2018119263A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Incyte Corporation Heterocyclic compounds derivatives as pd-l1 internalization inducers
US20180179202A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Incyte Corporation Heterocyclic compounds as immunomodulators
KR20190100250A (ko) 2016-12-22 2019-08-28 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 테노포비르의 항바이러스 지방족 에스테르 전구약물
MX2019007262A (es) 2016-12-22 2019-09-05 Merck Sharp & Dohme Compuestos antivirales de bencilamina fosfodiamida.
WO2018199338A1 (ja) 2017-04-27 2018-11-01 国立大学法人広島大学 Ｂ型肝炎治療用核酸分子
US11142750B2 (en) 2018-04-12 2021-10-12 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the Hepatitis B virus genome

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