CN114875053A - 一种高效稳定环状rna的构建方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种高效稳定环状RNA的构建方法及其产品。本发明开发的环状RNA制备方法能够快速高效制备可表达特定蛋白质的环状RNA。具体地，环状RNA的通用模板质粒pCR可用于构建任意表达蛋白的载体，只需要合成需要表达蛋白的对应DNA片段，通过重组即可得到环状RNA的特定DNA模板。本发明采用一型内含子自我剪接原理，通过设计特殊的高效剪接成环序列，只需要在RNA中添加GTP和Mg2+即可在37℃15分钟内成环，本发明方法相比于溴化氰或者T4连接酶(等成环方法，具有试剂价格便宜易购买、简单高效、试剂无毒性的特点。

Description

一种高效稳定环状RNA的构建方法及其产品
技术领域
本发明属于中医药技术领域，涉及一种高效稳定环状RNA的构建方法及其产品。
背景技术
近年来，RNA分子由于其独特的功能特征而作为预防性和治疗性疫苗的理想抗原而被受到越来越广泛的重视，特别是在COVID-19(新型冠状病毒)等的疫苗开发和使 用上体现了其特有的功能和优势(Tang et al.,2020)。除了在COVID-19疫苗的开发上， RNA分子在遗传病、肿瘤治疗、伤口愈合和干细胞生物等研究领域都具有潜在的广泛 的用途(Sahin et al.,2014)。相较于传统使用DNA或者小分子化学物，RNA分子具有 多个优点：1)设计合成方便，研发速度特别快；2)RNA可以不包含严重干扰细胞生 理的病毒类启动子(如SV40、CMV)或者类似的启动子序列；3)RNA不包含会导 致毒副作用的细菌来源序列；4)RNA不参与宿主基因组的整合，从而消除了有害突 变的不良影响；5)RNA在细胞内可以直接进行翻译为有功能的蛋白质，相较于DNA 省去了转录过程，会更快更安全地发挥作用；6)RNA不需要进入细胞核即可被翻译 为蛋白质，有助于提高在非分裂细胞种的转染效率；7)RNA分子带负电荷，无法直 接穿透细胞膜进入细胞内部，适宜的剂型能够将RNA投递到细胞内部，使细胞表达 RNA编码的蛋白质；8)相比于双链的DNA，单链的RNA分子量更小，更容易在适宜 的剂型下投递到细胞内部，有更高的投递效率(Sahin et al.,2014；Tang et al.,2020)。 RNA分子的这些优点也在COVID-19疫苗的开发过程中体现了出来。然而，除了如上的诸多优点之外，RNA分子本身的特性也带来了一些挑战，具体有：1)RNA是单链 的脱氧核糖核酸，非常容易在正常环境中降解，因此需要极低温保存且保存时间有限， 这也增加了RNA作为疫苗或者药物应用的成本，提高了对RNA药物冷链运输的要求， 限制了RNA药品制剂在冷链运输和低温保存设备落后地区的推广和使用；2)RNA在 细胞内的存在时间有比较有限，对于长期的治疗则需要高频率的给药或者提高给药剂量； 3)目前的RNA剂型递送效率不高，因而需要提高给药剂量，过于频繁的给药和高剂 量的给药都会带来相应的副作用。因此，解决这些目前存在的挑战具有重要意义。
环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类特殊的新型RNA分子，与传统的线性mRNA通过切除内含子、将相邻外显子彼此连接的顺式剪接不同，环状RNA可通过外 显子之间的反式剪接生成，呈封闭环状结构，因此不受RNA外切酶的影响(Chen,2020)。 因而，环状RNA在其结构上就呈现出了比线性RNA更稳定的特性。尽管环状RNA转 录物在上世纪九十年代初就已经被发现，但关于编码基因来源的环状RNA的研究一直 鲜有报道。随着RNA深度测序以及生物信息学分析技术的发展，大量内源性的环状 RNA被发现存在于哺乳动物细胞中(Chen,2020)，而且其中许多含量丰富且稳定。最 新的研究则显示，极少数的环状RNA能够在细胞内进行翻译并表达蛋白(Yang et al., 2017)。这些最新的研究进展提示着环状RNA能够提供更稳定的状态并且具备蛋白的翻 译和表达功能。
本发明针对当前线性RNA分子在疫苗、遗传病、肿瘤治疗、伤口愈合和干细胞生 物等用途的不足和挑战，即稳定性差、保存要求严苛和成本高、表达时间短且需要频繁 给药等问题，并基于环状RNA稳定和可以翻译表达的生物学特性，开发出了一种高效 稳定环状RNA的构建方法。本发明开发出的这种全新的用于RNA治疗的新型环状RNA， 为各种疾病的治疗提供了新的治疗方法，具有潜在而重要的生物医学意义。
本发明开发出的全新的用于RNA治疗的新型环状RNA，相较于当前的线性RNA具 备非常显著的稳定性，一方面更容易保存和运输且保存时间更长，另一方面在细胞和 体内存在时间更长且能够持续稳定表达。相应的减少了RNA药品制剂在冷链运输和低 温保存严苛要求和成本，提高了药物的有效性并减少了给药频率和相应的副作用，为 各种疾病的治疗提供了新的治疗方法。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种用于合成环状RNA的目的模板质粒(pCR)的构建方法，包含以下步骤：
(1)在通用质粒上按顺序分别插入T7启动子、5’端一型内含子配对序列、CVB3IRES序列、翻译增强元件、两个限制性内切酶位点、poly A序列和3’端一型内含子配 对序列，构建完成合成环状RNA的通用模板质粒(pCR)；其中两个限制性内切酶之 间插入任意需要编码蛋白的序列；所述两个限制性内切酶为BamH I和Xho I；
(2)将通用模板质粒进行对应限制性内切酶双酶切，获得线性载体，用于后续构建目的pCR。
(3)设计包含DNA重组序列的引物，并通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增， 获得表达目的蛋白质相对应的目的DNA片段。
(4)将步骤(2)双酶切后的线性载体和步骤(3)目的DNA片段混合后进行DNA 重组，获得插入目的DNA的pCR载体。
作为优选，步骤(2)双酶切后的线性载体和步骤(3)目的DNA片段的碱基长度 比为1：2-5。
(5)将插入目的DNA的pCR载体进行转化和克隆筛选、质粒提取和测序验证， 获得正确的可用于合成环状RNA的目的模板质粒。
本发明的第二个目的是提供一种环状RNA的体外大规模制备方法，包含以下步骤：
(1)线性RNA的构建
1-1设计可扩增包含从T7启动子到3’端一型内含子配对序列完整序列的引物，以上述目的模板质粒pCR作为DNA模板，通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增获得 用于合成RNA的目的线性DNA。
作为优选，可扩增包含从T7启动子到3’端一型内含子配对序列完整序列的引物具体是：Forward引物序列：gacccaagctttaatacgac，如SEQ ID NO.6所示；Reverse引物序 列：cctctagactagatatgctg，如SEQ ID NO.7所示；
1-2将目的线性DNA进行PCR产物纯化。
1-3以纯化后目的线性DNA为模板，采用T7 RNA聚合酶进行体外合成，合成条 件为1ug目的线性DNA，37℃反应2小时转录生产RNA。根据所需RNA的量设置多 个反应或增加反应体系。
1-4在转录完成后的RNA体系中加入脫氧核糖核酸酶I(DNase I)去除DNA模板， 反应条件为37℃，二十分钟。
1-5乙醇沉淀法进行纯化，用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水溶解获得 线性RNA。
此线性RNA可进一步环化得到环状RNA或者进一步进行mRNA 5’端加帽(capping)和3’端加尾(tailing)处理获得修饰后的可用于翻译的线性mRNA。
(2)采用一型内含子自我剪接原理，将体外合成的线性RNA环化得到环状RNA； 具体如下：
先将线性RNA加热到70℃反应5分钟，再将RNA放置于冰上静置3分钟，以解 除RNA的多级结构。然后将RNA加入到环化反应体系：2mM GTP，10mM MgCl2， 50mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM DTT，55℃环化反应15分钟即可得到环状RNA。
(3)将环化反应后的环状RNA进行乙醇沉淀纯化，用不含脫氧核糖核酸酶和不 含核糖核酸酶的水溶解获得环化后的RNA。
(4)重复步骤(2)-(3)进行再次环化以提高环化效率，增加环状RNA的产量。
(5)应用核酸纯化柱方法将环化后的RNA进行纯化，根据具体环状RNA在琼脂 胶的核酸条带位置，收集环状RNA。
(6)切胶回收法和核酸纯化柱的环状RNA用乙醇沉淀法纯化，最后用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水溶解获得大量环状RNA。
本发明的第三个目的是提供一种用于合成环状RNA的目的模板质粒(pCR)。
本发明的第四个目的是提供一种环状RNA。
本发明的有益效果是：
本发明针对当前线性RNA分子在疫苗、遗传病、肿瘤治疗、伤口愈合和干细胞生 物等用途的不足和挑战，即稳定性差、保存要求严苛和成本高、表达时间短且需要频繁 给药等等问题，并基于环状RNA稳定和可以翻译表达的生物学特性，开发出了一种高 效稳定环状RNA的构建方法。
本发明开发的环状RNA制备方法能够快速高效制备可表达特定蛋白质的环状RNA。具体地，环状RNA的通用模板质粒pCR可用于构建任意表达蛋白的载体，只 需要合成需要表达蛋白的对应DNA片段，通过重组即可得到环状RNA的特定DNA模 板。
本发明采用一型内含子自我剪接原理，通过设计特殊的高效剪接成环序列，只需要 在RNA中添加GTP和Mg2+即可在37℃15分钟内成环，本发明方法相比于溴化氰(含 剧毒)或者T4连接酶(价格较贵、步骤繁琐费时)等成环方法，具有试剂价格便宜易 购买、简单高效、试剂无毒性的特点。
成环后的环状RNA则采用Rnase R和胶纯化富集环状RNA，此方法具备损失低、 纯度高的特性。
本发明开发出的新型环状RNA，相较于当前的线性RNA具备非常显著的稳定性， 更容易保存且保存时间更长，可在4℃到-80℃保存相应的可以降低RNA药品制剂在冷 链运输和低温保存严苛要求和成本。
相较于当前的线性RNA，本发明开发出的新型环状RNA在细胞和动物体内存在时间更长且能够持续稳定高表达，提高了药物的有效性并减少了给药频率和相应的副作 用，为各种疾病的治疗提供了新的治疗方法。
附图说明
图1.本发明构建的用于合成环状RNA的通用质粒pCR示意图。在通用质粒上按顺序分别插入T7启动子、5’端一型内含子序列、CVB3 IRES序列、翻译增强元件、特定 限制性内切酶位点(BamH I和Xho I)、poly A序列和3’端一型内含子序列，其中coding region可插入任意需要翻译表达的蛋白所对应的序列。
图2.用于合成环状RNA的DNA模板的制备。A)限制性内切酶验证构建的用于合 成环状RNA的通用质粒pCR，其中Un-D表示未被双酶切的质粒，GFP-D、PTEN-D和 TP53-D则是被Hind III和Xba I双酶切的质粒，箭头所指为双酶切后得到合成环状 RNA所需要的DNA模板。B)以特定pCR为模板，通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩 增包含从T7启动子到3’端一型内含子配对序列完整序列，PCR产物即为可用于合成环状 RNA的DNA模板。C)以B为模板，再次通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，可以 得到大量可用于合成RNA的高特异性和高纯度的目的DNA模板。
图3.RNase R处理线性荧光素RNA(LinLuciferase)、环状荧光素RNA(CircLuciferase)、线性绿色荧光蛋白RNA(LinGFP)、环状绿色荧光蛋白RNA(CircGFP)。
图4.环状RNA具备非常显著的稳定性。(A)线性绿色荧光蛋白RNA(LinGFP) 和环状绿色荧光蛋白RNA(CircGFP)在-80℃下存放30天后Bioanalyzer检测RNA的完 整性，其中样品重复量n＝3。(B)对Bioanalyzer结果的统计分析。(C)1ug线性绿色 荧光蛋白RNA(LinGFP)和1ug环状绿色荧光蛋白RNA(CircGFP)在室温分别存放3 天、7天和10天后跑胶检测RNA稳定性。****代表显著性差异分析结果<0.0001。
图5.环状RNA转染进入293T细胞后的验证。将0.5ug绿色荧光蛋白GFP的线性 mRNA和环状RNA分别转染进入293T细胞中，48小时后分别检测(A)GFP、(B) CVB3 IRES和(C)环状RNA的RNA水平。***和****分别代表显著性差异分析结果 <0.001和<0.0001。
图6.环状RNA在细胞水平成功表达目的蛋白。将0.5ug绿色荧光蛋白GFP的线性mRNA和环状RNA分别转染小鼠成纤维细胞NIH-3T3和人胚胎肾细胞293T中，48小时后 观察绿色荧光蛋白的表达。(A)和(B)分别是NIH-3T3细胞的荧光照片及荧光统计 结果。(C)和(D)分别是293T细胞的荧光照片及荧光统计结果。荧光照片在10倍放 大倍数下拍摄。****代表显著性差异分析结果<0.0001。
图7.环状RNA在细胞中稳定持续高表达蛋白。将0.5ug绿色荧光蛋白GFP的线性mRNA和环状RNA分别转染人胚胎肾细胞293T中，按照不同时间点提取蛋白质检测绿 色荧光蛋白GFP的表达水平。(A)Westernblot检测GFP的蛋白水平。(B)统计Western blot条带的信号结果。b-actin作为上样量内参。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1.用于合成环状RNA的目的模板质粒(pCR)的构建
为了缩减整个环状RNA的制备和应用中的步骤和时间，提高制备效率，首先构建了一个用于合成环状RNA的通用模板质粒pCR。通用模板质粒pCR包含RNA体外转 录的基本元件、RNA环化所需元件、用于RNA翻译的元件和可插入任意DNA片段的 可编码区域。因此在通用质粒上按顺序分别插入T7启动子(见SEQ ID NO.1)、5’端 一型内含子配对序列(见SEQID NO.2)、CVB3 IRES序列(见SEQ ID NO.3)、翻 译增强元件(见SEQ ID NO.4)、特定限制性内切酶位点(BamH I和Xho I)、poly A 序列和3’端一型内含子配对序列(见SEQ ID NO.5)，其中两个限制性内切酶之间可根 据实际情况插入任意需要编码蛋白的序列(图1)。其中T7启动子用于体外转录所需， 而两段内含子序列则用于RNA环化。通过各种选择和优化，目前选取的内含子序列能 够非常高效的使RNA在GTP和Mg2+作用下环化。对应翻译所需的IRES序列，采用 了相对翻译更强的CVB3。另外，在翻译起始密码子之前增加了能够增强翻译水平的 m6A修饰位点和Kozak序列。在可编码区域之间加入了常见的两个限制性内切酶位点，用于插入所需编码蛋白的序列。与此同时，在可编码区域后面增加了poly A序列用于 增强蛋白的表达水平。总体上，构建的通用质粒pCR为合成环状RNA提供了一个高效 便捷的模板。
以构建绿色荧光蛋白GFP为例。首先将pCR用BamH I和Xho I进行双酶切获得 线性载体。然后只需要合成含有BamH I和Xho I酶切位点的GFP DNA片段，通过DNA 重组方法(将双酶切后的线性载体和目的GFP DNA片段1：2混合)或者酶切方法(将 双酶切后的线性载体和双酶切后的目的GFP DNA片段1：3混合)与线性载体进行连 接。将重组后的产物pCR-GFP进行转化和克隆筛选、质粒提取和测序验证，即可获得 正确的可用于合成环状GFP RNA的目的模板质粒。
实施例2.体外线性RNA的大规模合成
首先，以1ng特定pCR为模板(以GFP、PTEN和TP53为例)，使用通用引物(Forward 引物序列：见SEQ ID NO.6和Reverse引物序列：见SEQ ID NO.7)通过高保真DNA 聚合酶进行PCR扩增包含从T7启动子到3’端一型内含子配对序列完整序列，PCR体 系为100ul，30个PCR循环，此PCR产物通过PCR纯化柱过柱纯化后即为可用于合 成环状RNA的DNA模板(图2B)。然后再以纯化后的PCR产物为模板，再次使用 通用引物通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR体系为100ul，25个PCR循环， 此时可以得到大量可用于合成RNA的高特异性和高纯度的目的线性DNA模板(图2C)。
PCR循环条件如下：
Figure BDA0003541922930000071
以纯化后的线性DNA为模板，采用T7 RNA聚合酶进行体外合成，合成条件为1 ug线性DNA模板，37℃反应2小时转录生产RNA。根据所需RNA的量设置多个反 应或增加反应体系，即可大规模合成线性RNA。然后在转录完成后的体系中加入脫氧 核糖核酸酶I(DNaseI)去除DNA模板，反应条件为37℃二十分钟。接着利用乙醇沉淀 法进行纯化，用不含核糖核酸酶的水溶解获得线性RNA。
此线性RNA可进一步环化得到环状RNA或者进一步进行mRNA 5’端加帽(capping)和3’端加尾(tailing)处理获得修饰后的可用于翻译的线性mRNA。修饰后的线性mRNA 为当前普遍采用的mRNA制剂，可用于后续实验的对照。
实施例3.体外环状RNA的大规模合成
将体外合成的线性RNA加热到70℃反应5分钟后，立即将RNA放置于冰上静置 3分钟，以解除RNA的多级结构。然后将RNA加入到环化反应体系：2mM GTP，10 mM MgCl2，50mMTris-HCl(pH 7.5)，1mM DTT。55℃环化反应15分钟即可得到 环状RNA。环化反应后的环状RNA通过乙醇沉淀纯化，用不含核酸酶的水溶解获得环 化后的RNA。环化后的RNA进行再次环化以提高环化效率，增加环状RNA的产量。 接着，使用核酸纯化柱方法将环化后的RNA进行纯化，根据具体环状RNA出峰时间， 收集环状RNA并用乙醇沉淀法纯化，最后用不含核酸酶的水溶解即可获得大量环状 RNA。
制备的环状RNA使用特异性的核算外切酶RNase R验证，以circLuciferase和circGFP为例，线性LinLuciferase和LinGFP在RNase R 37℃处理20分钟后全部被降解， 而环状RNA circLuciferase和circGFP没有被降解(图3)。
实施例4.探究环状RNA的稳定性
为了探究环状RNA的稳定性，首先对比了低温情况下环状RNA的稳定性。将1ug 线性绿色荧光蛋白RNA(LinGFP)和1ug环状绿色荧光蛋白RNA(CircGFP)在-80℃ 下存放30天，然后使用Bioanalyzer检测RNA的完整性。Bioanalyzer结果显示线性 的LinGFP有明显的降解，而环状的CircGFP保存完整RNA大小，显示着环状RNA 在低温下比线性的RNA具有更优的稳定性(图4A、B)。
进一步地，对比室温环境(20℃)下环状RNA的稳定性。将1ug线性绿色荧光蛋 白RNA(LinGFP)和1ug环状绿色荧光蛋白RNA(CircGFP)在室温分别存放3天、 7天和10天后，跑胶检测RNA，结果显示线性RNA LinGFP随着时间推移显著减少， 而环状RNA CircGFP则基本不变，显示着环状RNA在室温下比线性RNA有更加稳定 的特性(图4C)。这些结果证明了制备的环状RNA具备非常稳定的特性，有利于环 状RNA制剂的保存和运输。
实施例5.探究环状RNA细胞水平的转染效率和表达水平
将0.5ug绿色荧光蛋白GFP的实施例2线性LinGFP和环状CircGFP采用常规技 术进行纳米脂质体包封形成脂质纳米颗粒，分别转染进入293T细胞中，48小时后检测 RNA的水平。通过设计特异性的引物分别检测GFP、CVB3 IRES和环状RNA的RNA 水平。可以看到实施例2的线性LinGFP和环状的CircGFP都成功转染进了293T细胞 中，而且经过48小时后，细胞中环状circGFP水平更高，一方面证明了转染方法的可 行性，另一方面证明了环状RNA在细胞中更稳定(图5)。
为了进一步验证环状RNA的蛋白表达情况。将0.5ug绿色荧光蛋白GFP的线性LinGFP和环状CircGFP采用常规技术进行纳米脂质体包封形成脂质纳米颗粒，分别转 染小鼠成纤维细胞NIH-3T3和人胚胎肾细胞293T中，48小时后荧光显微镜观察绿色 荧光蛋白的表达。可以看到脂质纳米颗粒可以成功将线性的LinGFP和环状的CircGFP 转染进NIH-3T3细胞和293T细胞中，即都能够成功表达绿色荧光蛋白，且两种细胞中 环状circGFP的荧光水平更高，一方面证明了转染方法的可行性，另一方面证明了环状 RNA在细胞中表达更强(图6)。
实施例6.探究CircRNA-NPs在细胞中的表达持续性
将0.5ug绿色荧光蛋白GFP的线性LinGFP和环状CircGFP采用常规技术进行纳米脂质体包封形成脂质纳米颗粒，分别转染进入293T细胞中。按照不同时间点提取蛋白质， 通过Westernblot检测绿色荧光蛋白GFP的蛋白水平。实验结果显示转染相同量的RNA， 环状RNA比线性RNA能够表达更多的绿色荧光蛋白，环状RNA是线性RNA的5-10蛋白 表达量(图7)。此外，环状RNA能够持续的高表达绿色荧光蛋白，在转染后第5天还 能够表达相当于线性RNA第一天的表达水平(图7)。这些实验结果一方面证明了环状 RNA能够高表达蛋白，另一方面证明了环状RNA的蛋白表达时间更长、持续性更久。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本 发明要求，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 杭州师范大学
<120> 一种高效稳定环状RNA的构建方法及其产品
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactatagg 19
<210> 2
<211> 285
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggagaccct cgaccgtcga ttgtccactg gtcaacaata gatgacttac aactaatcgg 60
aaggtgcaga gactcgacgg gagctaccct aacgtcaaga cgagggtaaa gagagagtcc 120
aattctcaaa gccaataggc agtagcgaaa gctgcaagag aatgaaaatc cgttgacctt 180
aaacggtcgt gtgggttcaa gtccctccac ccccacgccg gaaacgcaat agccgaaaaa 240
caaaaaacaa aaaaaacaaa aaaaaaacca aaaaaacaaa acaca 285
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttaaaacagc ctgtgggttg atcccaccca caggcccatt gggcgctagc actctggtat 60
cacggtacct ttgtgcgcct gttttatacc ccctccccca actgtaactt agaagtaaca 120
cacaccgatc aacagtcagc gtggcacacc agccacgttt tgatcaagca cttctgttac 180
cccggactga gtatcaatag actgctcacg cggttgaagg agaaagcgtt cgttatccgg 240
ccaactactt cgaaaaacct agtaacaccg tggaagttgc agagtgtttc gctcagcact 300
accccagtgt agatcaggtc gatgagtcac cgcattcccc acgggcgacc gtggcggtgg 360
ctgcgttggc ggcctgccca tggggaaacc catgggacgc tctaatacag acatggtgcg 420
aagagtctat tgagctagtt ggtagtcctc cggcccctga atgcggctaa tcctaactgc 480
ggagcacaca ccctcaagcc agagggcagt gtgtcgtaac gggcaactct gcagcggaac 540
cgactacttt gggtgtccgt gtttcatttt attcctatac tggctgctta tggtgacaat 600
tgagagatcg ttaccatata gctattggat tggccatccg gtgactaata gagctattat 660
atatcccttt gttgggttta taccacttag cttgaaagag gttaaaacat tacaattcat 720
tgttaagttg aatacagcaa a 741
<210> 4
<211> 6
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccacc 6
<210> 5
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatgg 225
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacccaagct ttaatacgac 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctctagact agatatgctg 20

Claims (7)

1.一种用于合成环状RNA的目的模板质粒pCR的构建方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)在通用质粒上按顺序分别插入T7启动子、5’端一型内含子配对序列、CVB3IRES序列、翻译增强元件、两个限制性内切酶位点、poly A序列和3’端一型内含子配对序列，构建合成环状RNA的通用模板质粒pCR；其中两个限制性内切酶之间插入需编码蛋白的序列；所述两个限制性内切酶为BamH I和Xho I；
(2)将通用模板质粒进行对应限制性内切酶双酶切，获得线性载体，用于后续构建目的pCR；
(3)设计包含DNA重组序列的引物，并通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，获得表达目的蛋白质相对应的目的DNA片段；
(4)将步骤(2)双酶切后的线性载体和步骤(3)目的DNA片段混合进行DNA重组，获得插入目的DNA的pCR载体；
(5)将插入目的DNA的pCR载体进行转化和克隆筛选、质粒提取和测序验证。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于DNA重组过程中步骤(2)双酶切后的线性载体和步骤(3)目的DNA片段的碱基序列长度比为1：2-5。
3.一种环状RNA的体外大规模制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)利用权利要求1所述方法制备得到的目的模板质粒pCR合成线性RNA；
(2)采用一型内含子自我剪接原理，将体外合成的线性RNA环化得到环状RNA；具体如下：
将线性RNA加热到70℃反应5分钟，再将RNA放置于冰上静置3分钟，以解除RNA的多级结构；然后将RNA加入到环化反应体系：2mM GTP，10mM MgCl2，50mM pH 7.5Tris-HCl，1mMDTT，55℃环化反应15分钟即可得到环状RNA；
(3)将上述环状RNA进行乙醇沉淀纯化，用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水溶解获得环化后的RNA；
(4)重复步骤(2)-(3)进行再次环化；
(5)采用高效液相色谱法将环化后的RNA进行纯化，根据具体环状RNA出峰时间，收集环状RNA；
(6)将上述收集的环状RNA用乙醇沉淀法纯化，最后用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水溶解获得环状RNA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)具体是：
1-1设计可扩增包含从T7启动子到3’端一型内含子配对序列完整序列的引物，以权利要求1所述方法制备得到的目的模板质粒pCR作为DNA模板，通过高保真DNA聚合酶进行PCR扩增获得用于合成RNA的目的线性DNA；
1-2将目的线性DNA进行PCR产物纯化；
1-3以纯化后目的线性DNA为模板，采用T7 RNA聚合酶进行体外合成；
1-4在转录完成后的RNA体系中加入脫氧核糖核酸酶I去除DNA模板；
1-5采用乙醇沉淀法进行纯化，用不含脫氧核糖核酸酶和不含核糖核酸酶的水溶解获得线性RNA。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于可扩增包含从T7启动子到3’端一型内含子配对序列完整序列的引物具体是：Forward引物序列：gacccaagctttaatacgac；Reverse引物序列：cctctagactagatatgctg。
6.一种用于合成环状RNA的目的模板质粒pCR，其特征在于采用如权利要求1或2所述方法构建得到。
7.一种环状RNA，其特征在于采用如权利要求3-5任一项所述方法构建得到。
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