JP2021531829A

JP2021531829A - 環状化された遺伝子操作ｒｎａ及び方法

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Publication number: JP2021531829A
Application number: JP2021527008A
Authority: JP
Inventors: リビアクリストファー; ベーファーアタ; サバマイケル
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2019-07-24
Publication date: 2021-11-25
Also published as: EP3826643A4; KR20210057019A; WO2020023595A9; EP3826643A1; US20210277393A1; WO2020023595A1; CA3107456A1; AU2019310448A1

Abstract

環状ＲＮＡが、概して少なくとも１つのコード領域と、このコード領域に動作可能に連結された内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、を含む。このＲＮＡは、環状ＲＮＡの直鎖形態よりもＲＮＡエンドヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性があり得る。別の形態において、ポリヌクレオチドは概して、転写単位と、この転写単位に動作可能に連結されたプロモータと、を含む。この転写単位は、環状化エレメントと、少なくとも１つのコード領域と、このコード領域に動作可能に連結された内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、を含む。細胞により転写されると、転写されたＲＮＡが、環状ＲＮＡ分子を形成する。【選択図】図６

Description

関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書中に取り込まれる、２０１８年７月２４日出願の米国特許仮出願第６２／７０２，８５３号の利益を主張するものである。

本開示は、一形態において、転写単位と、この転写単位に動作可能に連結されたプロモータと、を含むポリヌクレオチドを記載する。転写単位は、環状化エレメントと、少なくとも１つのコード領域と、このコード領域に動作可能に連結された内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）と、を含む。環状化エレメントは、転写単位の５’末端にある第一の配列と、転写単位の３’末端にある第二の配列と、を含む。コード領域は、環状化エレメントの第一の配列と、環状化エレメントの第二の配列の間に置かれる。

様々な態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。

幾つかの態様において、環状化エレメントの第一の配列は、バクテリオファージＲＮＡのチミジル酸シンセターゼ（ｔｄ）からのイントロンの第一の部分を含み、環状化エレメントの第二の配列は、バクテリオファージＲＮＡのチミジル酸シンセターゼ（ｔｄ）からのイントロンの第二の部分を含む。他の態様において、環状化エレメントの第一の配列は、真核生物スプライス受容配列を含み、環状化エレメントの第二の配列は、真核生物スプライス供与配列を含む。

幾つかの態様において、ＩＲＥＳは、クリケット麻痺ウイルスＩＲＥＳ（ＣｒＰＶ−ＩＲＥＳ）又はチャバネアオカメムシ腸管ウイルスＩＲＥＳ（Plautia stali intestine virus IRES）（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）を含む。

幾つかの態様において、コード領域は、治療用ペプチドをコードする。

幾つかの態様において、ＩＲＥＳは、少なくとも２つのコード領域に動作可能に連結されている。

幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二のコード領域に動作可能に連結された第二のＩＲＥＳをさらに含む。

幾つかの態様において、転写単位は、以下のものの１つ又は複数をさらに含む：三重らせんモチーフ、非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＲＮＡ安定性エレメント、ＲＮＡ輸送エレメント、又はアフィニティ精製アプタマー。

別の形態において、本開示は、一般に少なくとも１つのコード領域と、このコード領域に動作可能に連結された内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、を含む環状ＲＮＡ分子を記載する。

幾つかの態様において、ＩＲＥＳは、クリケット麻痺ウイルスＩＲＥＳ（ＣｒＰＶ−ＩＲＥＳ）又はチャバネアオカメムシ腸管ウイルスＩＲＥＳ（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）を含む。

幾つかの態様において、環状ＲＮＡ分子は、第二のコード領域に動作可能に連結された第二のＩＲＥＳをさらに含む。

幾つかの態様において、環状ＲＮＡ分子は、以下のものの１つ又は複数をさらに含む：三重らせんモチーフ、非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＲＮＡ安定性エレメント、ＲＮＡ輸送エレメント、又はアフィニティ精製アプタマー。

幾つかの態様において、環状ＲＮＡは、環状ＲＮＡの直鎖形態よりもＲＮＡエンドヌクレアーゼによる消化に対して抵抗性がある。

別の形態において、本開示は、上記に要約されたポリヌクレオチドのいずれかの態様で形質転換された細胞を記載する。

別の形態において、本開示は、上記に要約された環状ＲＮＡ分子のいずれかの態様を含む細胞を記載する。

別の形態において、本開示は、環状ＲＮＡ分子を作製する方法を記載する。一般にこの方法は、上記に要約されたポリヌクレオチドのいずれかの態様で宿主細胞を形質転換すること、宿主細胞にポリヌクレオチドからの直鎖状ＲＮＡ分子を転写させること、及び環状化エレメントに直鎖状ＲＮＡ分子を環状化させ、それにより環状ＲＮＡ分子を形成させること、を含む。

幾つかの態様において、この方法は、環状ＲＮＡ分子の少なくとも一部を宿主細胞から単離することをさらに含む。

幾つかの態様において、この方法は、直鎖状ＲＮＡ分子をＲＮａｓｅで消化すること、及び未消化の環状ＲＮＡ分子を回収すること、をさらに含む。

幾つかの態様において、環状ＲＮＡ分子は、環状ＲＮＡを宿主細胞内のエクソソームに移動させるのに効果的な細胞外小胞標的配列を含む。これらの態様の幾つかにおいて、この方法は、環状ＲＮＡ分子を含有するエクソソームを単離することをさらに含む。

別の形態において、本開示は、治療用ペプチドにより提供される治療を必要とする対象を処置する方法を記載する。一般にこの方法は、上記に要約されたポリヌクレオチドのいずれかの態様、又は上記に要約された環状ＲＮＡ分子のいずれかの態様、のどちらかを対象に投与することを含み、どちらの場合でも、コード領域は、治療用ペプチドをコードしている。

幾つかの態様において、環状ＲＮＡを対象に投与することは、環状化されたＲＮＡを含有するエクソソームを対象に投与することを含む。

上記概要は、本発明の各開示された態様又は各々の実行を記載することを意図されていない。以下の記載は、より詳細には例示的態様を例示している。本出願全体の幾つかの箇所において、ガイダンスが、実施例のリストを通して提供され、実施例は、様々な組み合わせで使用され得る。各例において、列挙されたリストは、代表的な群として役立つに過ぎず、排他的リストと解釈されるべきでない。

本特許又は出願のファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を有する本特許又は特許出願公報のコピーは、必要な料金の請求及び支払いの際に特許庁により提供されるであろう。

ｃｅＲＮＡ構築物の直線配置図。同定されたヌクレオチドセグメントは、いずれかの所望のプラスミドバックボーンの中にクローニングされていてもよい。ポリＡのストリングとの非カノニカル塩基対合を通して保護された三重らせん構造を作り出すＲＮＡステムループの形成。ポリＡは、直接この配列によりコードされている。（Ａ）５’三重らせん配列。（Ｂ）３’三重らせん配列。インビトロ転写での自己環状化。（Ａ）対照ＲＮＡ及び環状化されたＲＮＡ＋／−ＲＮａｓｅＲ。（Ｂ）通常のＮＴＰ（＋／−ＲＮａｓｅＲ）、又は残りのカノニカルＲＮＡヌクレオチド、ＡＴＰ及びＧＴＰ（＋／−ＲＮａｓｅＲ）に対して等モル比の５−メチルシチジン−５’−トリホスフェート及びシュードウリジン−５’−トリホスフェートで修飾されたＮＴＰのどちらかを有するｃｅＲＮＡ。大腸菌においてＩＰＴＧで誘導されたｃｅＲＮＡ転写。総ＲＮＡが、大腸菌から単離され、その後、ＲＮａｓｅＲと共にインキュベートされた（＋により表される）。ＲＮａｓｅ−Ｒ抵抗性ｃｅＲＮＡは、ＲＮａｓｅＲとのインキュベートの後に唯一検出されたＲＮＡ生成物である。ｃｅＲＮＡをコードしたＤＮＡでトランスフェクトされた（左）、又はｃｅＲＮＡでトランスフェクトされた（右）２９３Ｔ細胞は、ＩＲＥＳエレメントにより駆動されたシグナルタンパク質（ナノルシフェラーゼ）を発現する。相対発光量（ＲＬＵ）。ｃｅＲＮＡの転写及び環状化を表す略図。真核細胞が、前夜に１００，０００細胞／ウェルで播種され、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＳｔｅｍ試薬（５００ｎｇＤＮＡ＋２μｌＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いてｃｅＲＮＡをコードしたＤＮＡでトランスフェクトされた。ＧＦＰ蛍光が、トランスフェクションの２４時間後に捕捉された。（Ａ）及び（Ｂ）は、２回の独立した実験である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされたｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードするインビトロ転写されたｃｅＲＮＡ。トランスフェクションの２４時間後。

本開示は、環状化されたポリヌクレオチド構築物を記載する。幾つかの例において、環状化された遺伝子操作ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。環状化された遺伝子操作ＲＮＡ（ｃｅＲＮＡ）構築物は、ＲＮａｓｅによる分解に対して抵抗性がある。他の例において、環状化されたポリヌクレオチドは、ＲＮＡが転写の際に環状化するのに必要な成分の全てを有するＲＮＡをコードするＤＮＡであってもよい。

本明細書に記載された構築物は、転写されたＲＮＡを安定化するアプローチを提供する。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６３０６０号（国際公開第２０１８／０９８３１２Ａ２号パンフレットとして公開）は、ＲＮＡ分子内にコードされたコード領域の持続可能な発現を促進するためにＲＮＡ分子に作製され得る特定の修飾を記載している。それらの修飾の幾つかとしては、ポリ（Ａ）テールの長さ、５’ｍ７Ｇキャップ、修飾ヌクレオチド、５’ＵＴＲのＩＲＥＳ修飾、及び／又は３’ＵＴＲのシュードノット修飾が挙げられる。この開示は、上述の修飾の１つ又は複数の代わりに、又はこの修飾に加えて、ＲＮＡ分子の中に遺伝子操作され得る代替的構築物を記載している。このＲＮＡ分子は、ＲＮａｓｅによる分解に対して抵抗性があるため、本明細書に記載された構築物は、生存細胞内でＲＮＡ分子を生成させる。

ｃｅＲＮＡの成分が、図１に例示されており、１つ又は複数のプロモータと、環状化エレメントと、１つ又は複数の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、翻訳がＩＲＥＳにより制御される１つ又は複数のコード領域と、を含む。本明細書で用いられるｃｅＲＮＡ（環状化された遺伝子操作ＲＮＡ）の用語法は、ＲＮＡが直鎖形態又は環状化形態であるか否かにかかわらず、以下に列挙された成分の全てを含む転写されたＲＮＡをいうために用いられる。ｃｅＲＮＡはまた、幾つかの使用において、以下に列挙された成分の全てを有するＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡ、をいうことができる。

プロモータは、真核細胞又は原核細胞内でのｃｅＲＮＡの転写を可能にするいずれかの適切なプロモータであり得る。プロモータは、ｃｅＲＮＡが真核細胞内又は原核細胞内のどちらの生成のために設計されているかに応じて、選択され得る。幾つかの例において、ｃｅＲＮＡは、真核生物プロモータ及び原核生物プロモータの両方を含むことができるため、単一構築物が、どちらの型の細胞で用いられてもよい。プロモータは、構成型又は誘導型であり得る。誘導型プロモータの制御下で配置される場合、ｃｅＲＮＡを宿すようにトランスフェクトされた細胞若しくは形質導入された細胞によりｃｅＲＮＡが転写されるかどうか（直接のトランスフェクトにより、又はｃｅＲＮＡをコードするＤＮＡを保有するようにトランスフェクトされた結果として、のどちらか）、ｃｅＲＮＡ転写のタイミング、及び／又はｃｅＲＮＡ転写の程度、を制御し得ることが可能になる。例示的な真核生物プロモータとしては、ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＵｂＣ、ＳＶ４０、ＭＳＣＶ、ＴＲＥ（誘導型）、ＴＥＦ１、ＧＤＳ、ＧＡＬ１、１０、ＣａＭＫＩＩａ、ＣＵＰ１、ＡＤＨ１、ＡＯＸ１、ＨＳＰ７０−ｒｂｃｓ２、ｐｓｂＡ１が挙げられるが、これらに限定されない。形質導入された細胞において、転写は、形質導入された細胞のためのウイルスＬＴＲから開始され得る。例示的な原核生物プロモータとしては、Ｔ７、ＳＰ６、Ｔ７ｌａｃ、内因性ＲＮＡホロ酵素、ａｒａＢＡＤ、ｐＬ、Ｐｔａｃ、及びｔｒｐが挙げられるが、これらに限定されない。

環状化エレメントは、ｃｅＲＮＡが細胞により転写されると、ｃｅＲＮＡを環状化させる１つ又は複数の配列を含み得る。一般に環状化エレメントは、適当な触媒配列部位及び／又はモチーフを形成して、ＲＮＡの自己触媒スプライス反応を可能にするために、ＲＮＡの反対側の末端に置かれた触媒性ＲＮＡ配列エレメントを含む。環状化エレメントは、ｃｅＲＮＡが真核細胞内又は原核細胞内のどちらの発現のために設計されているかに応じて、選択され得る。幾つかの例において、ｃｅＲＮＡは、真核生物環状化エレメント及び原核生物環状化エレメントの両方を含むことができるため、単一構築物が、どちらの型の細胞で用いられてもよい。例示的な真核生物環状化エレメントは、直鎖状ＲＮＡ転写産物の３’末端の真核生物スプライス供与体（図１に示された直鎖状形態の場合）及び５’末端のスプライス受容体を含み得る。その後、内因性ＲＮＡプロセシング機構が、このセグメントをスプライシングして、環状生成物を形成する。幾つかの例において、１つが、直鎖状ＲＮＡのそれぞれの末端に追加の相補的配列を含むことができ、より効率的なスプライシングのために供与部位及び受容部位をより接近した並置にすることができる。例示的な原核生物環状化エレメントは、ｃｅＲＮＡ構築物の自己触媒環状化を可能にするバクテリオファージＲＮＡのチミジンシンセターゼ（Ｔｄ）からのイントロンを含むことができる。イントロンの第一のセグメントは、図１に示される通り、直鎖状ｃｅＲＮＡ構築物の３’末端の場所であり、イントロンの第二のセグメントは、直鎖状ｃｅＲＮＡ構築物の５’末端に配置される。イントロンセグメントは、環状化を自己触媒し、それを実行するプロセスにおいて、自己切断される。

内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、オープンになった５’キャップ構造の末端を用いずに翻訳を開始させる。ＩＲＥＳは、いずれかのクラスのＩＲＥＳ、即ちグループＩ〜ＩＶのいずれかのもの、から選択され得る。幾つかの態様において、ＩＲＥＳは、クリケット麻痺ウイルスＩＲＥＳ（ＣｒＰＶ−ＩＲＥＳ）又はチャバネアオカメムシ腸管ウイルスＩＲＥＳ（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）であり得、それらのそれぞれは、哺乳動物細胞内で翻訳を開始し、翻訳のために細胞内機構の最小限の使用を必要とする。他のＩＲＥＳ配列と比較して細胞内機構への依存が低いというのは、ＣｒＰＶ−ＩＲＥＳ及びＰＳＩＶ−ＩＲＥＳからの翻訳が、他のＩＲＥＳ配列を用いた場合より効率的になり得ることを意味する。ｃｅＲＮＡ構築物内での使用に適した例示的な代わりのＩＲＥＳとしては、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、豚熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ポリオウイルス、又はＡ型肝炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。

コード領域は、発現が望ましいタンパク質又は治療用ＲＮＡをコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド配列を含み得る。図１は、第一のＩＲＥＳがコード領域Ａのすぐ上流にあり、第二のＩＲＥＳがコード領域Ｂのすぐ上流にある、例示的な構築物を例示している。他の態様において、単一のＩＲＥＳエレメントが、複数のコード領域の翻訳を開始し得る。したがってｃｅＲＮＡは、単一のＩＲＥＳ又は複数の（例えば、２つ以上の）ＩＲＥＳを含み得る。発現レベルは、細胞型及び細胞の状況に応じて異なる翻訳能を有する特異的ＩＲＥＳエレメントを用いることにより制御され得る。同じく複数のコード領域の翻訳が、単一ＩＲＥＳの制御下にある場合、コード領域は、例えばＰ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｅ２Ａ、又はＦ２Ａなどの自己切断２Ａペプチドにより分離されてもよい。

コード領域は、例えば治療用タンパク質など、発現が望ましいいずれかの適切なタンパク質をコードし得る。例えば重大な心臓事象に見舞われた、又は見舞われるリスクのある対象は、対象の細胞の少なくとも幾つかを、ＮＡＰ−２、ＴＧＦ−α、ＥｒＢｂ３、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＩＬ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０及び／又はＣＤ８０／８６をコードするｃｅＲＮＡで形質転換して、ＮＡＰ−２、ＴＧＦ−α、ＥｒＢｂ３、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＩＬ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及び／又はＣＤ８０／８６ポリペプチド発現のレベルを上昇させることにより処置され得る。これらのポリペプチドの１つ又は複数のレベルの上昇は、瘢痕のサイズ及び組織リモデリングを低減して、心臓機能を改善するために使用され得る。追加の適切な治療用ポリペプチドが、国際公開第２０１５／０３４８９７号パンフレットに記載されている。

コード領域によりコードされ得る他のタンパク質としては、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インターフェロンγ、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、アビジン、ストレプトアビジン、アシルオキシアシルヒドロラーゼ（ＡＯＡＨ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、骨形成タンパク質７（ＢＭＰ−７）、コンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）、内皮一酸化窒素合成酵素３（ｅＮＯＳ）、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（ＰＰＡＲＧ）、抗体若しくはその断片、抗原性ペプチド、抗ウイルス性タンパク質、又は転写因子が挙げられるが、これらに限定されない。

タンパク質の膜貫通セグメントに融合されるようにｃｅＲＮＡによりコードされたアビジン又はストレプトアビジンは、アビジンタンパク質を細胞の外表面に提示させることができる。アビジン標識又はストレプトアビジン標識細胞は、例えば薬物、エクソソーム、又は免疫細胞などの標的とするビオチン標識治療薬で支援することができる。

ｃｅＲＮＡによりコードされたインターロイキンは、免疫応答、及び標的エリアに動員される免疫細胞を修飾し得る。例えば抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０及びＩＬ−４）は、Ｍ２マクロファージ動員を促進することにより免疫抑制を促進する。別の例として、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＩＬ−８、ＩＦＮγ）は、免疫細胞（例えば、好中球、顆粒球）を標的エリアに動員すること、及び／又はマクロファージ／ファゴサイトーシスを活性化することができる。

ｃｅＲＮＡによりコードされたアシルオキシアシルヒドロラーゼ（ＡＯＡＨ）は、ＬＰＳエンドトキシンを不活性化し得る。ＡＯＡＨは、ＡＯＡＨの小サブユニットと大サブユニットの間に５’分泌シグナル及びプロテアーゼ切断可能リンカーを含むように修飾されてもよい。ＡＯＡＨのこの修飾形態は、それにより細胞から分泌され得、環状化の際に活性化形態に切断されてＬＰＳの不活性化を触媒し得る。

ｃｅＲＮＡによりコードされた骨形成タンパク質は、骨修復を促進し得る。例えば同じｃｅＲＮＡ構築物からＢＭＰ−２及びＢＭＰ−７を発現することが、骨修復を改善するためのＢＭＰ−２／７ヘテロダイマーの形成を促進し得る。

骨髄傷害を処置するために、障害部位での炎症応答を軽減する、細胞外マトリックスを改変する、軸索伸長を直接促進する、そして／又は細胞保護性である、１種又は複数のタンパク質が、ｃｅＲＮＡから発現され得る。例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ（ＣｈＡＢＣ）及び／又はこのタンパク質の修飾された分泌形態は、脊髄傷害部位の軸索伸長を促進するように細胞外マトリックスを改変し得る。

ｃｅＲＮＡによりコードされた機能的な嚢胞性線維症膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）は、嚢胞性線維症を処置するのに用いられ得る。ＣＦＴＲをコードするｃｅＲＮＡは、カプセル化され、エアロゾル形態で吸入されて、ｃｅＲＮＡを気道上皮に導入することができる。

ｃｅＲＮＡによりコードされた抗体は、抗体の標的送達に用いられてもよい。抗体は、ｃｅＲＮＡを宿す細胞により分泌されてもよい。抗体は、従来の完全抗体、抗体断片、又は例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、二機能性抗体（例えば、ＢｉＴＥ又はＢｉＫＥ）、又は三機能性抗体（例えば、ＴｒｉＴＥ又はＴｒｉＫＥ）などのキメラ抗体であってもよい。

ｃｅＲＮＡは、抗原性ペプチドをコードすることができるため、このペプチドの分泌は、ｃｅＲＮＡを受け取った対象を、抗原性ペプチドを発現する病原体に対して免疫化することができる。

ｃｅＲＮＡは、例えばインターフェロン誘導性膜貫通タンパク質（ＩＦＩＴＭ）などの抗ウイルス性タンパク質をコードすることができるため、この抗ウイルス性タンパク質の分泌は、ウイルス感染の程度及び／又は重症度を制限することができる。

図１及び図２は、追加の任意成分を例示している。所望なら、この任意成分の１つ又は複数を含むようにｃｅＲＮＡを設計してもよい。例示的な任意エレメントとしては、５’若しくは３’三重らせんモチーフ、５’若しくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＲＮＡ安定性エレメント、ＲＮＡ輸送若しくはＲＮＡ局在化エレメント、及び／又は精製エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。

５’又は３’三重らせんモチーフが、図１及び図２に例示されている。三重らせんモチーフは、コードされたポリＡトラクトに連結すると、エキソヌクレアーゼ活性に対する保護のためにＲＮＡ三重らせんを形成するステムループ構造を作り出す。三重らせんモチーフは、例えばカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ＭＡＬＡＴ１、テロメラーゼＲＮＡシュードノット、ＭＥＮβ、又はｔＲＮＡ配列などの任意の適切な供給源からのものであってもよい。

５’非翻訳領域（ＵＴＲ）もまた、図１に例示されている。ＵＴＲは、図１に示された直鎖形態で５’又は３’末端のどちらに置かれるかにかかわらず、例えばｍｉＲＮＡ結合配列又は細胞外小胞標的配列を含み得る。ｍｉＲＮＡ結合配列は、ｃｅＲＮＡからの翻訳の調節を援助し得る。ｍｉＲＮＡ結合配列は、翻訳を妨害する、又は翻訳を増強するｍｉＲＮＡに結合し得る。したがって、適当なｍｉＲＮＡ結合配列及びこのｍｉＲＮＡ結合配列に結合するｍｉＲＮＡを選択することにより、ｃｅＲＮＡからの翻訳を「上向きにする」又は「下向きにする」のいずれか望む通り、ｍｉＲＮＡを提供し得る。

細胞外小胞標的配列は、生成細胞株により放出されるエクソソームへのｃｅＲＮＡのシャトリングを補助するヌクレオチド配列である。例えばエクソソームシャトリングエレメントは、ｃｅＲＮＡ局在化をエクソソームにシフトする既存の細胞内機構を利用する。この方法では、コードするｃｅＲＮＡ分子をロードされたエクソソーム製品、例えば治療用タンパク質を生成することができる。その後、標的細胞が、エクソソームを取り込むと、ｃｅＲＮＡが、標的細胞に送達され得る。ｃｅＲＮＡのプラットフォームは、過去に実現不能であったＲＮＡのエクソソーム媒介送達を使用させる。エクソソームは天然では、従来の形態のＲＮＡを消化するために充分なＲＮａｓｅを充分な量で含有する。ｃｅＲＮＡは、直鎖状ＲＮＡ構築物よりもＲＮａｓｅへの感受性が低く、それゆえエクソソーム媒介送達により送達され得る。例示的な細胞外小胞標的配列としては、ＳＥＱＩＤＮＯ：１、３〜１８のヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。

ＲＮＡ安定性エレメントは、ｃｅＲＮＡの安定性を上昇させ得る。例示的なＲＮＡ安定性エレメントは、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。転写されると、ＷＰＲＥは、第三級構造を作り出して、発現を増強する。この配列は、ウイルスベクターを用いて送達されるコード領域の発現を増加させるために分子生物学で一般に用いられる。哺乳動物細胞内での使用のための発現カセットの３’ＵＴＲ内で用いられる場合、ＷＰＲＥは、ｍＲＮＡ安定性及びタンパク質収率を上昇させ得る。他の例示的なＲＮＡ安定性エレメントとしては、大腸菌（E. coli）ＲＥＰ配列、及びグロビンｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内のＣリッチ決定因子が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＲＮＡの安定性は、酵素駆動型（enzyme-driven）ＲＮＡ合成の回避を可能にし、そして／又はこのＲＮＡを生成する原核生物又は真核生物系の使用を可能にする。

ＲＮＡ輸送エレメントは、ｃｅＲＮＡの核輸送を増加させ得る。ＲＮＡ局在化エレメントは、特有の細胞コンパートメントへのＲＮＡのトラフィッキングを指向し得る。

精製エレメントは、ｃｅＲＮＡを精製する際に支援することができる。例えばアプタマー配列が、ｃｅＲＮＡのアフィニティ精製のためにｃｅＲＮＡ内に組み込まれ得る。一例として、配列番号２が、ストレプトアビジンに結合するため、ＳＥＱＩＤＮＯ．２を含有するｃｅＲＮＡが、過剰のビオチンで溶出され得る。免疫化樹脂又はタンパク質に結合するように設計された他のアプタマー配列は、同じく適切であり得る。

ｃｅＲＮＡ系への追加的修飾は、ｃｅＲＮＡそのものへの修飾ではないが、ＲＮａｓｅコード領域をプロデューシング細胞のゲノムＤＮＡ内に安定して導入することを伴う。細胞により生成されたｃｅＲＮＡは、ＲＮａｓｅによる分解に対して抵抗性がある。より高レベルのＲＮａｓｅを発現するためにプロデューシング細胞を修飾することは、細胞により生成された非環状化されたＲＮＡを消化することになり、それゆえプロデューシング細胞からのｃｅＲＮＡの精製を単純化することになろう。図３は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたｃｅＲＮＡのインビトロ転写を示す。図３Ａは、例示的ＲＮａｓｅであるＲＮａｓｅＲで処置された場合の対照直鎖状ＲＮＡの消化を示している。対照的にｃｅＲＮＡは、ＲＮａｓｅＲで処置されたｃｅＲＮＡのレーンに存在する。図３Ｂは、修飾ＮＴＰを用いたｃｅＲＮＡの生成を示す。繰り返すがｃｅＲＮＡは、ＲＮａｓｅＲの存在下で分解に対して抵抗性がある。

ｃｅＲＮＡをコードする配列を含有するＤＮＡプラスミドは、転写と、続く自己スプライシングイントロンセグメントを介したＲＮＡ環状化のために、バクテリア内に形質転換され得る。その後、環状化されたＲＮＡ生成物は、溶解細胞の総ＲＮＡから単離され得る。図４は、ＩＰＴＧで誘導された大腸菌内のｃｅＲＮＡの転写を示す。総ＲＮＡは、バクテリアから単離されて、ゲル精製、ｃｅＲＮＡ構築物に含まれるアプタマーループを用いたアフィニティ精製を受け、その後、非環状生成物のＲＮａｓｅＲ分解を受けた。ＲＮａｓｅＲで処置された場合、ｃｅＲＮＡは、検出されたただ一つのＲＮＡ生成物である（＋レーン）。これらの実験において、ＲＮａｓｅＲは、例示的ＲＮａｓｅとして用いられ；ｃｅＲＮＡは、他のＲＮＡエンドヌクレアーゼによる消化に対して同様に抵抗性がある。

ｃｅＲＮＡをコードするプラスミドＤＮＡは代わりに、転写と、続く自己スプライシングイントロンセグメントを介したＲＮＡ環状化のために、真核細胞に送達され得る。ｃｅＲＮＡプラスミド配列は、安定した生成のために真核細胞の宿主ゲノム内に安定して組み込まれ得る。図５は、ｃｅＲＮＡをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた（左）、又は直接ｃｅＲＮＡでトランスフェクトされた、２９３Ｔ細胞によるナノルシフェラーゼの翻訳を示す（例えば、哺乳動物細胞におけるレンチウイルスベクター又は酵母における組換え事象）。

先行の記述及び以下の特許請求の範囲において、用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ若しくは全て、又は列挙された要素のいずれか２つ以上の組み合わせを意味し；用語「含む」、「含むこと」及びそれらの変形例は、制限がないものと見なされなければならず、即ち追加の要素又はステップが、任意であり、存在しても、又は存在しなくてもよく；他に明示されなければ、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び「少なくとも１つの」は、互換的に用いられ、１又は１より多くを意味し；エンドポイントによる数字範囲の列挙は、その範囲内に包摂された全ての数字を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、その他を含む）。

先行の記述において、特有の態様は、明瞭さのために分離して記載される場合がある。特有の態様の特色が、別の態様の特色と不適合であることが他に明確に明示されなければ、特定の態様は、本明細書に記載された適合性のある特色の組み合わせを１つ又は複数の態様に関連して含み得る。

別々のステップを含む本明細書に開示されたいずれかの方法では、それらのステップは、いずれかの実行可能な順序で実施されてもよい。そして適宜、２つ以上のステップのいずれかの組み合わせが、同時に実施されてもよい。

本発明は、以下の実施例により例示される。特有の実施例、材料、量及び手順が、本明細書に明記された発明の適用範囲及び主旨に応じて広義に解釈されなければならないことが、理解されなければならない。

実施例１
ＲＩＢＯＭＡＸＴ７インビトロ転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用い、以下の表１に明記された反応条件が用いられた。対照テンプレートが、約１８００塩基の直鎖状生成物を作り出すためにキット内に提供されている。

図１に例示されたｃｅＲＮＡ構築物が、テンプレートとして用いられた。反応は、４２℃で２時間実施された。その後、ＲＮＡが、ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツヒルデン）を用い、製造業者の指導に従って単離された。その後、単離されたＲＮＡが、以下の表２に明記された通り、ＲＮａｓｅＲで消化されていずれかの非環状ｍＲＮＡを分解した。

反応物が、３７℃で２０分間インキュベートされた。その後、反応混合物が、２×ＲＮＡローディング緩衝液と１：１で混合されて、１％アガロースＴＢＥゲル＋臭化エチジウムで泳動された。

結果が、図３Ａに示されている。

この方法は、以下の表３に示された通り、１つの反応においてＲＮＡが、残りのカノニカルＲＮＡヌクレオチド（ＡＴＰ及びＧＴＰ）と等しいモル比の５−メチルシチジン−５−トリホスフェート及びシュードウリジン−５’−トリホスフェートを用いて修飾された以外は、図３Ａに記載されたものと同様である。

結果が、図３Ｂに示されている。

実施例２
ｃｅＲＮＡ構築物が、ｐＥＴ２４ａ（＋）プラスミドにクローニングされ、ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）大腸菌中に形質転換された。培養物は、ＯＤ₆₀₀で吸光度０．７になるまで３０℃で生育された。ＲＮＡ転写が、５ｍＭＩＰＴＧで３０分間誘導され、その時点で１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールが図４の８と表記されたレーンに添加された。クロラムフェニコールが添加された２０分後、合計５０分間の誘導の後に、バクテリア培養物が回収された。ＲＮｅａｓｙｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツヒルデン）が用いられて、３回の凍結解凍サイクルの添加でＲＮＡを抽出し、細胞壁及び膜の破壊を補助した。反応物が、以下の表４に示される通り調製された。

ＲＮＡが、ＲＮＡローディング緩衝液と１：１で混合されて、１％アガロースで泳動された。

結果が、図４に示されている。

実施例３
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が、トランスフェクションの前夜に５０，０００細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種された。ｃｅＲＮＡをコードするＤＮＡプラスミド又は直接ｃｅＲＮＡのどちらかが、以下の表５に明記される通り、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＳＴＥＭ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、製造業者の指導に従ってトランスフェクトされた。

ナノルシフェラーゼ発現が、構築物のＩＲＥＳエレメントにより駆動される。ＮａｎｏＧｌｏアッセイが用いられて、培養ウェル内のｎＬｕｃ生成物を検出した。

結果が、図５に示される。

実施例４
真核細胞が、前夜に１００，０００細胞／ウェルで播種され、以下の表６に明記される通り、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＳＴＥＭ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、ｃｅＲＮＡをコードするＤＮＡでトランスフェクトされた。

ＧＦＰ蛍光が、トランスフェクションの２４時間後に捕捉された。結果が、図７に示される。

本明細書で引用された全ての特許、特許出願、及び発行物の完全な開示、並びに電子的に入手可能な材料（例として、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ内の、ヌクレオチド配列登録、並びに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ内の、アミノ酸配列登録、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ内の注釈されたコード領域からの翻訳など）は、全体として参照により取り込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書中に取り込まれるいずれかの文書の開示（複数可）の間にいずれかの不一致が存在する場合には、本出願の開示が、支配することになる。前述の詳細な記載及び実施例は、理解の明瞭さのためだけに与えられた。不要な限定がないことが、そこから理解されなければならない。本発明は、図示及び記載された厳密な詳細に限定されず、当業者に明白な変形については、特許請求の範囲により定義された発明に含まれるであろう。

他に示されなければ、本明細書及び特許請求の範囲で用いられた成分、分子量などの量を表す全ての数字は、用語「約」により全ての例で修飾されると理解されなければならない。したがって、他に反することが示されなければ、本明細書及び特許請求の範囲で明記された数字パラメータは、本発明により得られようと努められた所望の特性に応じて変動し得る近似である。最低限でも、そして特許請求の範囲の適用範囲と同等の学説を制限する試みとしてではなく、各数字パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、そして通常の丸めの技術を適用することにより、解釈されるべきである。

本発明の広い適用範囲を明記する数字範囲及びパラメータは近似であるが、具体的実施例に明記された数値は、可能な限り精密に報告されている。しかし数値は全て、各検査測定で見いだされた標準偏差から必然的に生じた範囲を本質的に含有する。

見出しは全て、読み手の簡便さのためのもので、明示されない限りは見出しに続く本文の意味を限定するために用いられるべきでない。

配列表のフリーテキスト
配列番号１ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＧＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＣＧＡＴＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＣＡＧＧＧＴＧＴＴＧＣＴＡＴＴＣＧＣＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＣＧＡＴＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＣＣＧＡＡＣＴＣＧＣＴＧＴＴＴＡＡＣＴＧＣＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＣＧＣＡＧＧＧＴＧＴＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＧＣＧＴＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＴＡＣＧＣＣＧＡＴＣＡＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＣＣＴＧＴ

配列番号２ − 例示的なＲＮＡ精製エレメント
ＡＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＴＣＡＴＧＣＡＡＧＴＧＣＧＴＡＡＧＡＴＡＧＴＣＧＣＧＧＧＣＣＧＧＧ

配列番号３ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＡＣＣＡＧＧＣＵＵＧＧＡ

配列番号４ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＵＣＡＣＡＵＧＧ

配列番号５ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＣＵＵＧＧＡＡＧＣＡＧＡ

配列番号６ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＵＣＵＵＣＵＣＧＧＡＵＵ

配列番号７ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＧＧＣＣＡＧＧＧＧＵＵＣ

配列番号８ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＡＧＧＡＡＣＧＡＡＣ

配列番号９ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＵＡＵＧＵＧＧＣＣＡＵＣ

配列番号１０ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＡＣＣＡＧＧＣＵＵＧＧＡ

配列番号１１ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣ

配列番号１２ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＣＵＣＡＣＵＵＧＧＧＡＧ

配列番号１３ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＡＧＣＡＣＣＡＣＣＵ

配列番号１４ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＣＡＧＧＡＧＵＣＵＡＣＡ

配列番号１５ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣ

配列番号１６ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＧＧＧＧＡＡＣＣＵＧＣＡ

配列番号１７ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＡＣＣＡＡＵＧＧＧＧ

配列番号１８ − 例示的な細胞外小胞標的配列
ＧＧＧＧＡＡＣＣＵＧＣＡ

Claims

ポリヌクレオチドであって、以下：
転写単位であって、
前記転写単位の５’末端にある第一の配列、及び前記転写単位の３’末端にある第二の配列を含む環状化エレメントと、
前記環状化エレメントの第一の配列と、前記環状化エレメントの前記第二の配列との間にある少なくとも１つのコード領域と、
前記コード領域に動作可能に連結された内部リボソーム進入部位（internal ribosome entry site）（ＩＲＥＳ）と、
を含む、転写単位；並びに
前記転写単位に動作可能に連結されたプロモータ、
を含む、ポリヌクレオチド。
ＤＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
ＲＮＡを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記環状化エレメントの前記第一の配列が、バクテリオファージＲＮＡのチミジル酸シンセターゼ（ｔｄ）からのイントロンの第一の部分を含み；かつ
前記環状化エレメントの前記第二の配列が、バクテリオファージＲＮＡのチミジル酸シンセターゼ（ｔｄ）からの前記イントロンの第二の部分を含む、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記環状化エレメントの前記第一の配列が、真核生物スプライス受容配列を含み；かつ
前記環状化エレメントの前記第二の配列が、真核生物スプライス供与配列を含む、
請求項１に記載のポリヌクレオチド。
前記ＩＲＥＳが、クリケット麻痺ウイルスＩＲＥＳ（ＣｒＰＶ−ＩＲＥＳ）又はチャバネアオカメムシ腸管ウイルスＩＲＥＳ（Plautia stali intestine virus IRES）（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
前記コード領域が、治療用ペプチドをコードする、請求項１〜６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
前記ＩＲＥＳが、少なくとも２つのコード領域に動作可能に連結されている、請求項１〜７のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
第二のコード領域に動作可能に連結された第二のＩＲＥＳをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
前記転写単位が、以下：
三重らせんモチーフ；
非翻訳領域（ＵＴＲ）；
ＲＮＡ安定性エレメント；
ＲＮＡ輸送エレメント若しくはＲＮＡ局在化エレメント；又は
アフィニティ精製アプタマー、
をさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
前記ＵＴＲが、ｍｉＲＮＡ結合部位又は細胞外小胞標的配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
前記ＲＮＡ安定性エレメントが、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
前記ＲＮＡ輸送エレメントが、細胞核からのＲＮＡの輸送を促進する配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
環状ＲＮＡ分子であって、以下：
少なくとも１つのコード領域と；
前記コード領域に動作可能に連結された内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、
を含む、環状ＲＮＡ分子。
前記ＩＲＥＳが、クリケット麻痺ウイルスＩＲＥＳ（ＣｒＰＶ−ＩＲＥＳ）又はチャバネアオカメムシ腸管ウイルスＩＲＥＳ（ＰＳＩＶ−ＩＲＥＳ）を含む、請求項１４に記載の環状ＲＮＡ分子。
前記コード領域が、治療用ペプチドをコードする、請求項１４又は１５に記載の環状ＲＮＡ分子。
前記ＩＲＥＳが、少なくとも２つのコード領域に動作可能に連結されている、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡ分子。
第二のコード領域に動作可能に連結された第二のＩＲＥＳをさらに含む、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡ分子。
三重らせんモチーフ；
非翻訳領域（ＵＴＲ）；
ＲＮＡ安定性エレメント；
ＲＮＡ輸送エレメント若しくはＲＮＡ局在化エレメント；又は
アフィニティ精製アプタマー、
をさらに含む、請求項１４に記載の環状ＲＮＡ分子。
前記ＵＴＲが、ｍｉＲＮＡ結合部位又は細胞外小胞標的配列を含む、請求項１９に記載の環状ＲＮＡ分子。
前記ＲＮＡ安定性エレメントが、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、大腸菌（E. coli）ＲＥＰエレメント、又はベータ−グロビン安定性エレメントを含む、請求項１９に記載の環状ＲＮＡ分子。
前記ＲＮＡ輸送エレメントが、細胞核からのＲＮＡの輸送を促進する配列を含む、請求項１９に記載の環状ＲＮＡ分子。
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで形質転換された細胞。
請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡを含む細胞。
前記環状ＲＮＡが、前記細胞の外部で合成される、請求項２４に記載の細胞。
前記環状ＲＮＡが、前記細胞により合成される、請求項２４に記載の細胞。
エクソソームをさらに含む、請求項２６に記載の細胞。
前記細胞内の前記環状ＲＮＡ分子の少なくとも一部が、前記エクソソーム内に置かれている、請求項２７に記載の細胞。
環状ＲＮＡ分子を作製する方法であって、以下：
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドで宿主細胞を形質転換すること；
前記宿主細胞に前記ポリヌクレオチドからの直鎖状ＲＮＡ分子を転写させること；及び
前記環状化エレメントに前記直鎖状ＲＮＡ分子を環状化させ、それにより環状ＲＮＡ分子を形成させること、
を含む、方法。
前記環状ＲＮＡ分子の少なくとも一部を前記宿主細胞から単離することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
直鎖状ＲＮＡ分子をＲＮａｓｅで消化すること；及び
未消化の環状ＲＮＡ分子を回収すること、
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
前記環状ＲＮＡ分子が、前記環状ＲＮＡを前記宿主細胞内のエクソソームに移動させるのに効果的な細胞外小胞標的配列を含む、請求項２９に記載の方法。
前記環状ＲＮＡ分子を含有するエクソソームを単離することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
治療用ペプチドにより提供される治療を必要とする対象を処置する方法であって、
前記コード領域が前記治療用ペプチドをコードする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド；又は
前記コード領域が前記治療用ペプチドをコードする、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の環状ＲＮＡ分子、
を前記対象に投与することを含む、方法。
前記環状ＲＮＡを前記対象に投与することが、環状化されたＲＮＡを含有するエクソソームを前記対象に投与することを含む、請求項３４に記載の方法。