CN110283895A

CN110283895A - 基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法

Info

Publication number: CN110283895A
Application number: CN201910642659.XA
Authority: CN
Inventors: 王慧慧; 王永生; 王汇源; 席飞虎; 韩茜妹; 顾连峰
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-07-16
Filing date: 2019-07-16
Publication date: 2019-09-27

Abstract

本发明公开了基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，属于分子生物学领域。使用本方法纯化得到的环状RNA测序文库，可以大大提高不相关线性RNA的去除效率，富集得到高纯度的环状RNA。基于基因组注释，构建环状RNA的虚拟数据集。将测序数据的reads进行搜库比对，识别到的环状RNA种类远高于常规方法。这对于研究环状RNA的内部结构和揭示其功能具有重要意义。

Description

基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法。

背景技术

环状RNA（circular RNA）是一类普遍存在于生物体内的封闭式环型RNA分子，不同于线性RNA，环状RNA的3′端和 5′端是闭合的。circRNA的表达量通常比较低，并且表现出明显的细胞类型特异性和组织特异性。它们的生物合成依赖于剪接机制，并且受顺式互补序列和蛋白质因子调控。已有研究标明，一些circRNA与神经元功能、先天免疫反应、细胞增殖及细胞全能性密切相关。在分子水平上，他们通过与microRNAs或蛋白质结合，调节RNA聚合酶II（Pol II）转录，并与pre-mRNA相互作用，从而影响基因的表达。此外，一些重要的环状RNA甚至可以翻译成多肽，行使相应的功能，影响生物的性状。

由于环状RNA不具有线性结构，也不具有多聚腺苷酸化poly(A)尾巴，因此在常规转录组（RNA-seq）分析中很少见到。常规转录组只富集含poly(A)尾巴的RNA，因此，只有用非poly(A) 转录组测序，才能发现环状RNA的广泛存在。环状RNA的文库构建一般采用加RNase R消除线性RNA，但通过该方式构建文库很容易引入线性转录本片段。由于环状RNA的结构和序列与其对应的线性转录本片段十分相似，所以如何高效地排除线性转录本的干扰对于揭示环状RNA内部结构是一个关键的技术挑战。同时如何更全面地识别环状RNA对于揭示环状RNA的功能也具有重要意义。本发明通过依次去除mRNA 、核糖体RNA、线性RNA、给残留的线性RNA加poly(A)尾巴、再次去除含poly(A)尾巴的RNA，可以大大提高不相关线性RNA的去除效率，富集得到高纯度的环状RNA。基于基因组注释，构建环状RNA的虚拟数据集。将测序数据的reads进行搜库比对，识别到的环状RNA种类远高于常规方法。这对于揭示环状RNA的内部结构和功能具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环状RNA测序文库的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

（1）提取样品的总RNA；

（2）去除总RNA 中的多聚腺苷酸化mRNA；

（3）去除总RNA 中的核糖体RNA；

（4）消化总RNA 中的线性RNA；

（5）给总RNA 中残留的线性RNA加poly(A)尾巴；

（6）再次去除含有poly(A)尾的RNA；

（7）富集环状RNA样品，进行基于Illumina平台的转录组测序；

（8）识别测序数据中的环状RNA：基于基因组注释，构建虚拟的环状RNA数据集。将测序数据的reads进行搜库比对，得到环状RNA的种类、数量以及相应的位置信息。

进一步的，上述步骤（1）中的总RNA 提取是采用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（天根，Cat.#DP441）进行的，该提取方法无需酚和氯仿等毒性有机试剂，并且配有高效DNase I，可在吸附柱上快速去除基因组DNA。

进一步的，上述步骤（2）中去除总RNA中的poly(A)+ RNA是采用Dynabeads mRNAPurification kit(Invitrogen，Cat.61006)进行的，该方法使用寡-（dT）25偶联的磁珠来捕获多聚腺苷酸化mRNA，待磁珠聚集后，吸取上清进行RNA沉淀，从而获得不含多聚腺苷酸化mRNA的产物。

进一步的，上述步骤（3）中去除总RNA中的核糖体RNA是采用RiboMinus™ PlantKit for RNA-Seq(Invitrogen，Cat.A1083808)进行的，该方法包含了用于靶向叶绿体rRNA 的质体消除探针，此探针对于提高植物核糖体 RNA 去除效率至关重要。该方法包含了去除植物核糖体 RNA 所需的所有组分，能够高效率地去除许多植物的主要 rRNA 峰。

进一步的，上述步骤（4）中消化线性RNA是采用核糖核酸外切酶Ribonuclease R(RNase R，epicentre，Cat.RNR07250)进行的。RNase R来源于大肠杆菌RNR超家族，可以从3′-5′方向切割降解RNA，几乎能够消化所有的线性RNA分子，但不易消化环状RNA以及含套索结构的双链RNA分子。

进一步的，上述步骤（5）中给残留的线性RNA加poly(A)尾巴是通过Poly(A)Tailing Kit (Invitrogen，Cat.A1083808) 实现的。该方法利用大肠杆菌 Poly(A)聚合酶I（E-PAP）可对RNA 3'末端进行多聚腺苷酸化，添加至少150个腺嘌呤。

进一步的，上述步骤（6）中去除含poly(A)尾巴的RNA是采用和步骤（2）中相同的方法进行的，都是通过Dynabeads mRNA Purification kit(Invitrogen，Cat.61006)将poly(A)+ RNA 去除。

进一步的，上述步骤（8）中识别测序数据中的环状RNA，方法是基于基因组注释，构建环状RNA的虚拟数据集。将测序数据的reads进行搜库比对，得到环状RNA的种类以及相应的位置信息。

环状RNA基因序列：

SEQ ID NO:1 PH01001678G0360

GATTCAAGAAAGATGTTATGAAAGAACTTCCTCCAAAAAAGGAGTTGATTTTACGAGTTGAGCTGACGAGCAAACAGAAAGAGTACTACAAGGCAATTCTCACCAAGAATTACGAAGTGTTATCTCGTCGTAGTGGTGGACAAGTTTCCCTTATAAATGTTGTAATGGAGCTGCGCAAACTTTGTTGCCATGGATTCATGACGGATGAACCTGATGGTGAACCTGCCAACCCAGAAGAAGGTTTAAGGAGGCTTTTAGATTCTTCTGGAAAGATGCAGCTGCTGGACAAGATGATGGTGAAACTGAAAGAGCAGGGTCATAGAGTTCTTATTTATTCACAATTCCAGCATATGTTGGACTTACTGGAGGATTATTTAAGTTACCGGAAATGGAGCTATGAGCGTATTGATGGCAAGATAGGTGGCGCTGAAAGGCAGATACGAATAGATCGCTTCAATGCTAAGAATTCTACTAGGTTTTGCTTTCTTCTTTCCACCAGAGCTGGTGGTCTGGGTATAAATTTGGCAACCGCTGATACTGTTATTATCTATGACAGTGATTGGAACCCACATGCGGATTTACAAGCTATGGCAAGAGCTCATCGCTTAGGACAAACTAGCAAGAAATGGAGCTATGAGCGTATTGATGGCAAGATAGGTGGCGCTGAAAGGCAGATACGAATAGATCGCTTCAATGCTAAGAATTCTACTAGGTTTTGCTTTCTTCTTTCCACCAGAGCTGGTGGTCTGGGTATAAATTTGGCAACCGCTGATACTGTTATTATCTATGACAGTGATTGGAACCCACATGCGGATTTACAAGCTATGGCAAGAGCTCATCGCTTAGGACAAACTAGCAAGGTTATGATATATAGGCTTGTTAGTCGAGGTACAATTGAGGAGCGAATGATGCAGCTTACGAAGAAAAAGATGATATTGGAGCACTTAATTGTTGGTCGACTCACAAAGGCTAATAATGTCAACCAG

SEQ ID NO:2 PH01000306G0430

GTGTGTGGTCATGAAGGCGAAGGAAGCTGAGGACAGGTACATAGCTTCTGTCCATAGCCAGAACCATATAAAGCTGATCAGGAATATCAGCACGAAGAAATATGATTCCCGTCGAAACAAGATTGCTAGGAAACTCAATTCCATTTACTTCAACAAGGGATCCTCAGAGTCTGCTTTTCTTGCAGCTGGCTCTGTCATCGAGGTAGCTGAGAAGGTTGCTGCTGGTGAGTTAAATTCTGCTATTGCTCTAGTCAGACCTCCAGGCCACCATGCAGAACATAATGAGGCAATGGGCTTTTGCCTCTTCAACAATGTGGCAATTGCAGCTGATTATCTCTTAAATGAGAGGCCTGATTTAGGTATCAAGAAAATATTGATTGTCGATTGGGATGTTCATCATGGAAATGGCACACAGAAGATGTTTTACAGTGACCCTCGTGTATTGTTCTTTTCAGTTCACAG

SEQ ID NO:3 PH01001314G0550

ATATGTCGATGCTGGAACGCTGATGAACAACTATGCTCATATATTTGACCTCCTCACAAGGTTGAGACAGGCTGTTGATCATCCATACCTTGTAGCATTTTCTAAGACAGCAGAGCTTCGTGAGGGATGCAAAAATGAAGGAAATGAGGCCAAGGAAAGCCAATGTGGTATATGTTACAATATGGCAGAAGATGTAGTGGTTACCTCTTGTGGTCATGCGTTCTGCAAGATTTGTTTGATAGACTACTCTGCAACTCTGGCGAATGTTTCATGTCCATCTTGTTCAGAACCCCTTACTGTTGACTTAACAACGCAAACTAAAGGGGAAAAGATCACTGCAAATGTCAAGGGTAGCAAACGCTCTGGAATATTAGACAGACTACAAAGCCTTACAGATTTTAAGACAAGTACGAAAATTGATGCCTTG。

本发明的优点在于：

（1）由于环状RNA的结构和序列与其对应的线性转录本片段十分相似，所以如何高效地排除线性转录本的干扰对于揭示环状RNA内部结构是一个关键的技术挑战。利用本发明方法可高效识别环状及线性转录本片段，达到富集高纯度环状RNA的效果。

（2）本发明通过依次去除mRNA 、核糖体RNA、线性RNA、给残留的线性RNA加poly(A)尾巴、去除含poly(A)尾巴的RNA，可以大大提高不相关线性RNA的去除效率，富集得到高纯度的环状RNA。基于基因组注释，构建环状RNA的虚拟数据集。将测序数据的reads进行搜库比对，识别到的环状RNA种类远高于常规方法。这对于揭示环状RNA的内部结构和功能具有重要意义。

附图说明

图1 对mRNA的去除效果的检验。图中泳道1为total RNA样本，泳道2为poly(A)+RNA样本，泳道3为poly(A)- RNA样本。

图2 对核糖体去除效果的检验。图中泳道1为total RNA，泳道2为poly(A)- RNA，泳道3为ribo-/poly(A)- RNA。

图3 RNase R消化后环状RNA明显富集，左边为未经RNase R消化的环状RNA条带，右边为经过RNase R消化的条带，actin为线性内参。

图4 最终纯化环状RNA样品的验证

R+为以RNase R消化后RNA反转录的cDNA作为模板，进行PCR扩增的产物；final为以最终纯化RNA反转录的cDNA作为模板，进行PCR扩增的产物。

具体实施方式

实施例1 总RNA的提取

取研磨好的样品100-150mg，使用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒（天根，Cat.#DP441）提取样品总RNA，接着用DNA消化酶 gDNA Eraser去除基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进行。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带，若28S rRNA亮度为18S rRNA的1.5-2倍，说明RNA未降解。使用NanoDrop 2000c UV-Vis 分光光度计测定RNA浓度和吸光值，A260/280在1.8-2.0之间，说明RNA样品的纯度较高。使用Agilent 2100 生物分析仪进一步检测RNA样品的完整性计数（RNA integrity number, RIN），若RIN值大于7.5，则满足测序要求。取10ug 质量良好的total RNA 进行建库实验。

实施例2 去除总RNA 中的多聚腺苷酸化mRNA

（1）Oligo-dT Dyna磁珠预处理

1）使用Dynabeads mRNA Purification kit(Invitrogen，Cat.61006) 试剂盒，彻底重悬Oligo-dT Dyna磁珠，均匀吸取200μL到一个新的RNase-free管子中，将管子放在磁力架上静置1-2min，磁珠将会聚集在有磁性的一端，用移液器转移上清液，弃掉，同时保持管子始终在磁力架上。

2）用200μL Binding Buffer重悬Oligo-dT Dyna磁珠，将管子从磁力架上取下，温和吸打数次以混匀，放回磁力架，静置1-2min，小心转移上清，弃掉。重复此步骤两次。

3）再次用200μL Binding Buffer重悬Oligo-dT Dyna磁珠，平均分到RNase-free管1、管2中，每管100μL。

（2）去除mRNA

1）调整10ug total RNA体积至50μL，65℃水浴5min，使RNA变性，然后立刻放置在冰上2min。

2）将管1和管2放置在磁力架上静置1-2min，转移上清液，弃掉。在管1中加入50μL新鲜的Binding Buffer，使磁珠彻底重悬，放至在架子上备用。

3）在管1中加入50μL变性RNA，800rpm涡旋5min，混匀。

4）将管1放置于磁力架上1-2min，小心的转移100μL上清至管2中，800rpm涡旋5min，同时保持管1在冰上。

5）将管2放置于磁力架上1-2min，小心的转移100μL上清到一个新的RNase-free管子中，加入20μL 4M LiCl，1μL 糖原，250μL预冷的无水乙醇来沉淀poly(A)- RNA，置于-80℃过夜沉淀。

6）加入100μL Washing Buffer B至管1中，吸打数次混匀，放置于磁力架上1-2min，缓慢抽出上清，弃掉。重复这一步骤两次。

7）在管1中加入21μL Elution Buffer洗脱液，80℃加热2min来洗脱Oligo-dTDyna磁珠上的mRNA。加热后，迅速将管1放回到磁力架上，静置1min，小心的转移20μL上清至一个新的RNase-free管中，保存在-80℃。注意不要扰动磁珠。

（3）沉淀poly(A)- RNA

1）将上述第5)步中含有poly(A)- RNA的管子取出。4℃离心12000g，15min，小心去掉上清。

2）加入500μL 70%预冷乙醇，4℃离心12000g，5min，小心去掉上清，重复此步骤一次。

3）超净台风干5min，用20μL DEPC水重悬poly(A)- RNA，保存于-80℃。

（4）对mRNA去除效果进行验证

分别取等量 poly(A)- RNA与poly(A)+ RNA，使用oligoT引物进行反转录，取1μL cDNA样品、0.5μL actin F端引物、0.5μL actin R端引物、15μL Premix Taq (TaKaRa)、加ddH₂O至30μL的总体系，进行35个循环PCR扩增，反应结束后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。挑选内参基因actin作为mRNA标记，其引物如表1中SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。图1结果表明：actin线性内参基因在poly(A)- RNA中存在量十分微少，其主要富集在poly(A)+RNA中。

表1 内参引物序列

实施例3 去除核糖体RNA

（1）核糖体RNA与探针杂交

1）设置两个水浴锅温度分别为70℃与37℃

2）在1.5mL RNase-free管中加入

核糖体探针与Hybridization buffer 为RiboMinus™ Plant Kit for RNA-Seq(Invitrogen，A1083808)试剂盒中所提供。

3）水浴70℃，5min，使RNA变性。

4）将样品转移至37℃水浴锅，水浴30min，使RNA缓慢降温至37℃

5）在降温过程中，预处理磁珠。

（2）磁珠预处理

1）涡旋小瓶中的磁珠，吸取750μL至1.5mL管中，置于磁力架1min，去掉上清

2）加入750μL DEPC水洗涤，缓慢涡旋重悬，置于磁力架1min，去掉上清，重复此步骤

3）加入750μL Hybridization buffer，缓慢涡旋重悬。转移250μL至1个 RNase-free管中，命名为管B，保持管B 37℃水浴，直到使用。

4）剩余500μL 转移至另1个 RNase-free管中，命名为管A，置于磁力架上1min，弃上清。

5）用200μL Hybridization buffer重悬管A磁珠，保持管A 37℃水浴，直到使用。

（3）去除核糖体RNA

1）37℃水浴上述第（1）-4）步骤中的样品，瞬离使管壁上样品到底部，转移样本到管A中，上下吸打混匀，缓慢涡旋。

2）37℃水浴管A 15min，水浴期间，轻弹混匀，结束后将样品瞬离到管底，置于磁力架上1min，使核糖体RNA与探针的复合物富集。此时的上清不可丢弃，含有非核糖体RNA。

3）将含有250μL 磁珠的管A置于磁力架上1min，弃上清，将上一步中的非核糖体RNA转移至管B中，上下吸打混匀，轻微涡旋。

4）将管B水浴37℃，15min，水浴期间轻弹管B，结束后将样品瞬离到管底。

5）将管B置于磁力架1min，使核糖体RNA与探针的复合物富集，将含有非核糖体RNA的上清（约350μL-370μL）转移至1个新的 RNase-free管中，命名为管C。

（4）沉淀与纯化RNA

1）在管C中加入

涡旋混匀，置于-80℃过夜沉淀

2）4℃离心 12000g，15min，小心去掉上清

3）加入500μL 70%预冷乙醇，4℃离心 12000g，5min，小心去掉上清，重复此步骤。

4）将RNA沉淀置于超净台风干5min，用20μL DEPC水重悬ribo-/poly(A)- RNA，置于-80℃保存。

（5）检验核糖体RNA去除效果

分别取等量 total RNA、poly(A)- RNA、ribo-/poly(A)- RNA进行琼脂糖凝胶电泳，图2结果显示主要核糖体RNA（28s、18s、5s等）已基本去除干净。

实施例4 使用RNase R消化线性RNA

（1）取实施例3中所得ribo-/poly(A)- RNA，加入DEPC水调整体积至25.5μL，加入3μL10x RNase R reaction buffer，1.5μL RNase R（20U/μL）涡旋混匀。37℃，孵育15min。

（2）孵育后，加入30μL苯酚氯仿异戊醇终止反应，涡旋，4℃离心13000g，5min。

（3）取上层清液至新的1.5mL RNase-free管中，加入6μL 4M LiCL，1μL糖原，90μL预冷无水乙醇，颠倒混匀数秒，-80℃过夜沉淀。

（4）将沉淀后的RNA 4℃离心13000g，20min，去掉上清液，用700μL 75%乙醇洗涤沉淀2次，室温下自然风干。用20μL DEPC水溶解RNA，保存于-80℃。

（5）对线性RNA消化效果进行验证

分别取等量 ribo-/poly(A)- RNA与RNase R消化后的RNA，使用oligoT引物进行反转录，取1μL cDNA样品、0.5μL actin F端引物、0.5μL actin R端引物、15μL Premix Taq(TaKaRa)、加ddH₂O至30μL的总体系，进行35个循环PCR扩增，反应结束后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。挑选内参基因actin作为线性RNA标记，其引物如表1中SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。图3结果表明：actin线性内参基因在经受RNase R消化后条带明显变弱。

（6）对环状RNA进行检验

分别取等量 ribo-/poly(A)- RNA与RNase R消化后的RNA，使用随机引物进行反转录，取1μL cDNA样品、0.5μL 环状RNA F端引物、0.5μL环状RNA R端引物、15μL Premix Taq(TaKaRa)、加ddH₂O至30μL的总体系，进行35个循环PCR扩增，反应结束后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。环状RNA的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，引物如表2中SEQID NO:4和SEQ ID NO:9所示。图3结果表明,环状RNA在最终样品中明显富集。

表 2环状RNA引物序列

实施例5 给残留的线性RNA加poly(A)尾巴

（1）在冰上配制如下反应体系：

（2）将上述体系置于 PCR仪中，37℃孵育30min

实施例6 再次去除含有poly(A)尾的RNA

（1）预处理Oligo-dT Dyna磁珠

1）使用Dynabeads mRNA Purification kit(Invitrogen，Cat.61006)试剂盒，彻底重悬Oligo-dT Dyna磁珠，均匀吸取200μL到一个新的RNase-free管子中，将管子放在磁力架上静置1-2min，磁珠将会聚集在有磁性的一端，用移液器转移上清液，弃掉，同时保持管子始终在磁力架上。

（2）去除含poly(A)尾巴的RNA

1）在实施例5得到的40μL反应液中加入10μL DEPC水，65℃水浴5min，使RNA变性，然后立刻放置在冰上2min。

3）在管1中加入50μL变性RNA，800 rpm涡旋5min，混匀。

4）将管1放置于磁力架上1-2min，小心的转移100μL上清至管2中，800 rpm涡旋5min，同时保持管1在冰上。

6）加入100μL Washing Buffer B至管1中，吸打数次混匀，放置于磁力架上1-2min，缓慢吸出上清，弃掉。重复这一步骤两次。

7）在管1中加入21μL Elution Buffer洗脱液，80℃加热2min来洗脱Oligo-dTDyna磁珠上的含poly(A)尾巴的RNA。加热后，迅速将管1放回到磁力架上，静置1min，小心的转移20μL上清至一个新的RNase-free管中，保存在-80℃。注意不要扰动磁珠。

（3）沉淀RNA

1）将上述第5)步中的管子取出，4℃离心12000g，15min，小心去掉上清。

3）超净台风干5min，用20μL DEPC水重悬RNA沉淀

4）最终纯化得到的是环状RNA，保存于-80℃。

（4）对最终纯化得到的环状RNA进行验证

分别取等量RNase R消化处理后的RNA与最终纯化得到的RNA，使用随机引物进行反转录，取1μL cDNA样品、0.5μL 环状RNA F端引物、0.5μL环状RNA R端引物、15μL Premix Taq(TaKaRa)、加ddH₂O至30μL的总体系，进行35个循环PCR扩增，反应结束后取5μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。环状RNA的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，引物如表2 中SEQID NO:4和SEQ ID NO:9所示。图4结果表明，环状RNA在最终样品中依然存在。

将实施例6构建的环状RNA测序文库在Illumina平台进行转录组测序。

实施例7 识别测序数据中的环状RNA

基于基因组注释，构建环状RNA的虚拟数据集。将测序数据的reads与虚拟数据集进行比对，从而得到环状RNA的种类以及相应的位置信息。使用此方法识别到的环状RNA种类远高于常规方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法

<130> 11

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 986

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gattcaagaa agatgttatg aaagaacttc ctccaaaaaa ggagttgatt ttacgagttg 60

agctgacgag caaacagaaa gagtactaca aggcaattct caccaagaat tacgaagtgt 120

tatctcgtcg tagtggtgga caagtttccc ttataaatgt tgtaatggag ctgcgcaaac 180

tttgttgcca tggattcatg acggatgaac ctgatggtga acctgccaac ccagaagaag 240

gtttaaggag gcttttagat tcttctggaa agatgcagct gctggacaag atgatggtga 300

aactgaaaga gcagggtcat agagttctta tttattcaca attccagcat atgttggact 360

tactggagga ttatttaagt taccggaaat ggagctatga gcgtattgat ggcaagatag 420

gtggcgctga aaggcagata cgaatagatc gcttcaatgc taagaattct actaggtttt 480

gctttcttct ttccaccaga gctggtggtc tgggtataaa tttggcaacc gctgatactg 540

ttattatcta tgacagtgat tggaacccac atgcggattt acaagctatg gcaagagctc 600

atcgcttagg acaaactagc aagaaatgga gctatgagcg tattgatggc aagataggtg 660

gcgctgaaag gcagatacga atagatcgct tcaatgctaa gaattctact aggttttgct 720

ttcttctttc caccagagct ggtggtctgg gtataaattt ggcaaccgct gatactgtta 780

ttatctatga cagtgattgg aacccacatg cggatttaca agctatggca agagctcatc 840

gcttaggaca aactagcaag gttatgatat ataggcttgt tagtcgaggt acaattgagg 900

agcgaatgat gcagcttacg aagaaaaaga tgatattgga gcacttaatt gttggtcgac 960

tcacaaaggc taataatgtc aaccag 986

<210> 2

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgtgtggtc atgaaggcga aggaagctga ggacaggtac atagcttctg tccatagcca 60

gaaccatata aagctgatca ggaatatcag cacgaagaaa tatgattccc gtcgaaacaa 120

gattgctagg aaactcaatt ccatttactt caacaaggga tcctcagagt ctgcttttct 180

tgcagctggc tctgtcatcg aggtagctga gaaggttgct gctggtgagt taaattctgc 240

tattgctcta gtcagacctc caggccacca tgcagaacat aatgaggcaa tgggcttttg 300

cctcttcaac aatgtggcaa ttgcagctga ttatctctta aatgagaggc ctgatttagg 360

tatcaagaaa atattgattg tcgattggga tgttcatcat ggaaatggca cacagaagat 420

gttttacagt gaccctcgtg tattgttctt ttcagttcac ag 462

<210> 3

<211> 427

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atatgtcgat gctggaacgc tgatgaacaa ctatgctcat atatttgacc tcctcacaag 60

gttgagacag gctgttgatc atccatacct tgtagcattt tctaagacag cagagcttcg 120

tgagggatgc aaaaatgaag gaaatgaggc caaggaaagc caatgtggta tatgttacaa 180

tatggcagaa gatgtagtgg ttacctcttg tggtcatgcg ttctgcaaga tttgtttgat 240

agactactct gcaactctgg cgaatgtttc atgtccatct tgttcagaac cccttactgt 300

tgacttaaca acgcaaacta aaggggaaaa gatcactgca aatgtcaagg gtagcaaacg 360

ctctggaata ttagacagac tacaaagcct tacagatttt aagacaagta cgaaaattga 420

tgccttg 427

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggagcgaat gatgcagctt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtccaccac tacgacgaga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tctagtcaga cctccaggcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acagagccag ctgcaagaaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acctcttgtg gtcatgcgtt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccacattggc tttccttggc 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atacgcttcc tcacgctatt ctt 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgagcttct cctttatgtc cct 23

Claims

1.基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样品总RNA的提取；

（2）去除总RNA中的多聚腺苷酸化mRNA；

（3）去除总RNA中的核糖体RNA；

（4）使用RNase R消化线性RNA；

（5）给残留的线性RNA加poly(A)尾巴；

（6）再次去除含poly(A)尾的RNA；

（7）得到高纯度的环状RNA，进行基于Illumina平台的转录组测序；

（8）识别测序数据中的环状RNA：基于基因组注释，构建环状RNA的虚拟数据集；将测序数据的reads进行搜库比对，得到环状RNA的种类以及相应的位置信息。

2.根据权利要求1所述的基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤（1）中的总RNA 提取是采用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行的。

3.根据权利要求1所述的基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤（2）中去除总RNA中的多聚腺苷酸化mRNA是采用Dynabeads mRNAPurification kit进行的，该方法使用寡-（dT）₂₅偶联的磁珠来捕获多聚腺苷酸化mRNA，待磁珠聚集后，吸取上清进行RNA沉淀，从而获得不含多聚腺苷酸化mRNA的产物。

4.根据权利要求1所述的基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤（3）中去除总RNA中的核糖体RNA是采用RiboMinus™ Plant Kitfor RNA-Seq进行的，该方法包含了去除植物核糖体 RNA 所需的所有组分，能够高效率地去除许多植物的主要 rRNA 峰。

5.根据权利要求1所述的基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤（4）中消化线性RNA是采用核糖核酸外切酶Ribonuclease R进行的；RNase R来源于大肠杆菌RNR超家族，从3′-5′方向切割降解RNA，能够消化所有的线性RNA分子，不消化环状RNA以及含套索结构的双链RNA分子。

6.根据权利要求1所述的基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤（5）中给残留的线性RNA加poly(A)尾巴是通过Poly(A) TailingKit实现的。

7.根据权利要求1所述的基于二代Illumina测序平台的高效纯化与识别环状RNA的方法，其特征在于，所述步骤（6）中去除含poly(A)尾巴的RNA是采用Dynabeads mRNAPurification kit将poly(A)+ RNA 去除。