CN114107443B

CN114107443B - 一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法

Info

Publication number: CN114107443B
Application number: CN202111386710.9A
Authority: CN
Inventors: 范国强; 翟晓巧; 王哲
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2041-11-22
Also published as: CN114107443A

Abstract

本发明公开了一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，属于分子生物学领域；包括下述步骤：(1)提取泡桐总RNA；(2)m6A测序：利用泡桐总RNA构建m6A文库，进行测序；(3)转录组测序：利用泡桐总RNA构建转录组文库，进行测序；(4)生物信息学分析：对m6A测序结果进行Peak分析，绘制出白花泡桐m6A修饰图谱，并基于Peak分析结果进行m6Amotif预测；对转录组测序结果进行转录组分析；进行m6A与转录组的关联分析，筛选出泡桐丛枝病相关基因。通过本发明方法进行泡桐丛枝病相关基因的分析筛选，为进一步探究泡桐丛枝病的发病机理提供研究思路并打下基础，有助于泡桐丛枝病的防治研究。

Description

一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法。

背景技术

泡桐，树皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼时平滑，老时纵裂；假二杈分枝，单叶，对生，叶大，卵形，全缘或有浅裂，具长柄，柄上有绒毛；喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强；其生长速度快，耐瘠薄，材性优良，在防风固沙、保障粮食安全和木材供应等方面起着重要的作用。

在生产中，由植原体引起的泡桐丛枝病是制约泡桐产业发展的重要因素，由于泡桐丛枝植原体不能体外培养，严重限制了泡桐丛枝病发病机理的阐明。泡桐丛枝病的发生、发展是一个非常复杂的过程，目前泡桐丛枝病发病机理仍未阐明，丛枝病的防治的有效方法仍未建立，因此，还需要开辟新的途径进行研究。

因此，如何提供一种泡桐丛枝病的研究方法，为泡桐丛枝病的防治提供依据是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，从m6A修饰调控泡桐丛枝病的角度入手，结合转录组分析结果进行泡桐丛枝病相关基因的分析筛选，为进一步探究泡桐丛枝病的发病机理提供研究思路并打下基础，有助于泡桐丛枝病的防治研究。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，包括下述步骤：

(1)提取泡桐总RNA

分别提取泡桐丛枝病样本与健康样本，提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测；

(2)m6A测序

利用泡桐总RNA构建m6A文库，进行测序；

(3)转录组测序

利用泡桐总RNA构建转录组文库，进行测序；

(4)生物信息学分析

对m6A测序结果进行Peak分析，绘制出白花泡桐m6A修饰图谱，并基于Peak分析结果进行m6Amotif预测；

对转录组测序结果进行转录组分析；

进行m6A与转录组的关联分析，筛选出泡桐丛枝病相关基因。

优选地，步骤(2)中，

通过m6A特异性抗体对具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段构建文库，进行高通量测序。

优选地，步骤(3)所用泡桐总RNA和步骤(2)所用泡桐总RNA为同时获得的，一份用于m6A测序，另一份用于转录组测序。

优选地，步骤(4)中，

富集最显著的Motif序列为UUGUUUUGUACU，SEQ ID NO.1。

优选地，步骤(4)中，

转录组分析包括基本信息分析、基因的表达水平分析、差异表达分析、GO富集分析和KEGG富集分析。

优选地，步骤(4)中，进行m6A与转录组的关联分析时：

根据m6A-seq差异筛选标准“p<0.05”将差异甲基化基因分为上调和下调；

根据RNA-seq差异筛选标准“|log2 fold change|≥1，p<0.05”将转录组分析获得的差异基因分为上调和下调；

比较m6A甲基化水平与基因表达之间的关系：

①m6A修饰水平和转录水平都上调的基因；

②m6A修饰水平上调而转录水平下调的基因；

③m6A修饰水平下调而转录水平上调的基因；

④m6A修饰水平和转录水平都下调的基因；

从中筛选出泡桐丛枝病相关基因。

综上所述，本发明通过m6A免疫共沉淀结合高通量测序技术，绘制了白花泡桐m6A修饰图谱，揭示了丛枝植原体侵染后发生m6A修饰基序为UUGUUUUGUACU，筛选出泡桐丛枝病相关基因，为泡桐丛枝病的防治提供有力依据。

附图说明

图1所示为样品对比图片；其中，

A.不使用MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗，具有明显的丛枝症状；

B.使用60mg·L^-1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗，丛枝症状恢复为健康状态。

图2所示为白花泡桐m6A修饰图谱；

A.白花泡桐丛枝病苗；

B.60mg·L^-1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.提取泡桐总RNA

取白花泡桐丛枝病苗，分别设置使用60mg·L^-1甲基磺酸甲酯(MMS)处理组和未使用60mg·L^-1甲基磺酸甲酯(MMS)处理组，培养30d；如图1所示，未使用60mg·L^-1甲基磺酸甲酯处理组白花泡桐丛枝病苗具有明显的丛枝症状，使用60mg·L^-1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗丛枝症状恢复为健康状态。

取每组长势均匀的泡桐顶芽作为样本，每组设置平行试验，液氮速冻保存于-80℃冰箱，为后续试验做准备。

分别提取上述保存的泡桐丛枝病样本与健康样本，提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测，样品总RNA经检测合格，用于后续试验。

2.m6A测序

将检测合格的样品总RNA分成2份，其中一份与m6A特异性抗体在IP缓冲液(50mMTris-HCl，750mM NaCl和0.5％Igepal CA-630)中4℃孵育2h，孵育产物再与A蛋白珠孵育，并用洗脱缓冲液(1×IP buffer and 6.7mM m6A)进行洗脱，再用75％乙醇沉淀洗脱的RNA。最后，对洗脱的含m6A片段(IP)进行回收，将富集到的RNA构建文库，在IlluminaNovaseq6000平台上进行双端2×150bp测序。

3.转录组测序

另一份样品总RNA用于转录组测序，采用Illumina公司Ribo-Zero Gold试剂盒去除核糖体RNA，纯化收回剩余RNA。纯化回收的RNA被片段化试剂(Franmentation Buffer)随机打断成短片段，以此为模板，用六碱基随机引物(Random hexamers)合成第一链cDNA，随后加入缓冲液、dNTP和DNA Polymerase I进行第二链cDNA合成。AMPure XPbeads纯化双链产物，然后将DNA的粘性末端修复为平末端，3’末端加接头，AMPure XP beads进行片段选择，最后进行PCR扩增获得最终测序文库，文库质检合格后采用Illumina Novaseq6000进行测序，测序读长为2×150bp。

4.生物信息学分析

IlluminaNovaseq6000测序结果显示m6A-seq文库有约为8千万的reads数，RNA-seq文库有约为5千万的reads数(表1)。其中有效数据中有近94％reads比对到外显子上，其余reads比对到内含子或基因间区。

表1测序统计结果

对m6A-seq文库测序数据进行m6Apeak分析，构建白花泡桐m6A修饰图谱，结果如图2所示，图A为PFI样本(泡桐丛枝病样本)m6Apeak位置在染色体上的分布，图B为PFIM60样本(健康样本)m6Apeak位置在染色体上的分布。不同白花泡桐染色体上发生甲基化修饰的基因数目不同，PFI和PFIM60之间发生甲基化修饰的基因数目类似，peak数目的分布也类似，且主要分布在转录组起始位点TSS和TES附近。

通过PFI vs.PFIM60分析，共鉴定到了1807个基因上的2050个差异peak。利用HOMER软件在差异peak分析的基础上进行Motif预测，共鉴定出10个高度富集的Motif序列(表2)，富集最显著的序列为UUGUUUUGUACU，SEQ ID NO.1。

表2m6A的基序预测

对RNA-seq文库测序数据进行转录组分析，基因表达定量的结果以FPKM(fragments perkb permillion fragments)为单位，具体计算公式如下:

设FPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的fragments数量，N为唯一比对到参考基因的总fragments数，L为基因A编码区的碱基数。

根据RNA-seq差异筛选标准(|log2 fold change|≥1，p<0.05)将差异转录组基因分为上调和下调；在PFI vs.PFIM60中，共检测到1,877个差异表达的基因，其中有754个表达上调的基因，1,123个表达下调的基因。通过GO富集分析和KEGG富集分析，这些基因主要参与植物昼夜节律、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成和甘油酯代谢等途径。

根据m6A-seq差异筛选标准(p<0.05)将差异甲基化基因分为上调和下调。

m6A甲基化水平与基因表达之间呈现四种关系：

①m6A修饰水平和转录水平都上调的基因有92个；

②m6A修饰水平上调而转录水平下调的基因有18个；

③m6A修饰水平下调而转录水平上调的基因有47个；

④m6A修饰水平和转录水平都下调的基因有45个，主要参与植物激素信号转导和苯丙烷生物合成等途径；

可根据上述结果进行泡桐丛枝病相关基因的筛选。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> 一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> RNA

<213> Artificial

<400> 1

uuguuuugua cu 12

Claims

1.一种基于 m6A 甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）提取泡桐总 RNA

分别提取泡桐丛枝病样本与健康样本，提取泡桐总 RNA，进行RNA样品检测；

（2）m6A 测序

利用泡桐总 RNA 构建 m6A 文库，进行测序；

（3）转录组测序

利用泡桐总 RNA 构建转录组文库，进行测序；

（4）生物信息学分析

对m6A 测序结果进行 Peak 分析，绘制出白花泡桐 m6A 修饰图谱，并基于Peak 分析结果进行m6A motif 预测；对转录组测序结果进行转录组分析；进行m6A与转录组的关联分析，筛选出泡桐丛枝病相关基因；富集最显著的Motif 序列为 UUGUUUUGUACU，SEQ IDNO.1。

2.根据权利要求1所述的一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤（2）中，通过m6A特异性抗体对具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段构建文库，进行高通量测序。

3.根据权利要求 2 所述的一种基于 m6A 甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤（3）所用泡桐总 RNA 和步骤（2）所用泡桐总RNA为同时获得的，一份用于m6A测序，另一份用于转录组测序。

4.根据权利要求1所述的一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤（4）中，转录组分析包括基本信息分析、基因的表达水平分析、差异表达分析、GO富集分析和 KEGG 富集分析。

5.根据权利要求1所述的一种基于m6A甲基化测序研究泡桐丛枝病的方法，其特征在于，步骤（4）中，进行m6A与转录组的关联分析时：根据 m6A-seq 差异筛选标准“p<0.05”将差异甲基化基因分为上调和下调；根据 RNA-seq 差异筛选标准“|log2 fold change|≥1，p<0.05”将转录组分析获得的差异基因分为上调和下调；比较 m6A 甲基化水平与基因表达之间的关系：

①m6A 修饰水平和转录水平都上调的基因；

②m6A 修饰水平上调而转录水平下调的基因；

③m6A 修饰水平下调而转录水平上调的基因；

④m6A 修饰水平和转录水平都下调的基因；

从中筛选出泡桐丛枝病相关基因。