CN113667769A - 一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法 - Google Patents

一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法 Download PDF

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范国强
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Abstract

本发明公开了一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，属于分子生物学领域；本发明通过建立泡桐丛枝病发生模拟系统、取样全转录组测序、构建文库、对miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA进行生物信息学分析，筛选出筛选泡桐丛枝病相关调控RNA及ceRNA网络，为泡桐丛枝病的防治提供有力依据。

Description

一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法。
背景技术
泡桐，树皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼时平滑，老时纵裂；假二杈分枝，单叶，对生，叶大，卵形，全缘或有浅裂，具长柄，柄上有绒毛；喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强；其生长速度快，耐瘠薄，材性优良，在防风固沙、保障粮食安全和木材供应等方面起着重要的作用。
在生产中，由植原体引起的泡桐丛枝病是制约泡桐产业发展的重要因素，由于泡桐丛枝植原体不能体外培养，严重限制了泡桐丛枝病发病机理的阐明。泡桐丛枝病的发生、发展是一个非常复杂的过程，目前泡桐丛枝病发病机理仍未阐明，丛枝病的防治的有效方法仍未建立，因此，还需要开辟新的途径进行研究。
因此，如何提供一种泡桐丛枝病的分析方法，为泡桐丛枝病的防治提供依据是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，可用于实现相关编码RNA和非编码RNA的联合分析、ceRNA等，从而快速全面准确地获得与特泡桐丛枝病相关的RNA数据信息，进而将调控机制研究延伸到“网、多层面”结合的立体模式，有助于泡桐丛枝病的防治研究。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，包括下述步骤：
(1)建立泡桐丛枝病发生模拟系统
利用不同浓度的甲基磺酸甲酯MMS和/或利福平Rif处理泡桐丛枝病苗，模拟泡桐丛枝病恢复和发病的过程，确定测序取样时间点；
(2)全转录组测序及文库构建
提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测，构建全转录组文库；
所述全转录组文库包括小RNA文库和去除核糖体RNA的链特异性文库；
所述小RNA文库用于获得miRNA序列信息；
所述去除核糖体RNA的链特异性文库用于获得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息；
(3)生物信息学分析
分别对miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA数据进行数据分析，以及ceRNA分析，筛选泡桐丛枝病相关调控RNA及ceRNA网络。
MMS和/或Rif处理可有效模拟泡桐丛枝病恢复和发病的过程，进而为调控RNA的筛选提供有利条件，保证miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA分析以及ceRNA分析的可靠性。
优选地，步骤(1)中，
60mg·L-1MMS或100mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗，用于使病苗恢复健康；
20mg·L-1MMS或30mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗，用于使病苗恢复健康，但此时，相当于无症状感染者，将恢复健康的病苗继代后，感病状态又出现。
优选地，步骤(1)中，
60mg·L-1MMS或100mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗后，取样时间为处理后5-20d多时间点取样；
20mg·L-1MMS或30mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗后，取样时间为处理后10-30d至少两次取样，继代后20-40d至少两次取样。
优选地，步骤(2)中，
小RNA文库测序策略为50SE；
去除核糖体RNA的链特异性文库测序策略为150PE。
优选地，步骤(3)中，
数据分析包括基本分析、miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA的表达水平分析、差异表达分析、GO富集分析、KEGG富集分析和ceRNA分析。
优选地，步骤(3)中，
筛选泡桐丛枝病相关调控RNA时，包括如下步骤：
1)筛选出泡桐丛枝病恢复过程表达量升高或下降的RNA，以及泡桐丛枝病发病过程表达量下降或升高的RNA，
2)比较获得泡桐丛枝病恢复过程与桐丛枝病发病过程表达量变化趋势相反的RNA；
3)对于同种处理试剂的不同剂量组，筛选出共同确定的RNA。
优选地，步骤(3)中，
对于不同处理试剂组，分别按照1)-3)筛选出调控RNA，再比较筛选出不同处理试剂组共同确定的RNA。
优选地，步骤(3)中，
筛选出的泡桐丛枝病相关miRNA包括：pf-mir122、pf-miR156f-5p、pf-miR159a-3p、pf-miR169f；
筛选出的泡桐丛枝病相关mRNA包括：多聚半乳糖醛酸酶、cullin 1、泛素结合酶E2、squamosa启动子结合蛋白3、squamosa启动子结合蛋白6、脱落酸受体Pyr1、肌醇加氧酶、葡糖醛酸激酶、延伸因子1-α、MADS box蛋白、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶、泛素化结构域蛋白DSK2a、质体移动受损蛋白2、蓝光下的叶绿体运动蛋白1、泛素化受体Rad23c、叶绿体积累响应所需的J结构域蛋白、BRANCHED1-like相关mRNA；
筛选出的泡桐丛枝病相关lncRNA包括：MSTRG.18394.1、MSTRG.22708.1、MSTRG.29927.1、MSTRG.33514.1；
筛选出的泡桐丛枝病相关circRNA包括：circRNA7714、circRNA315、circRNA6856、circRNA466、circRNA2705、circRNA6438。
优选地，步骤(3)中，
分析得到的泡桐丛枝病相关ceRNA包括circRNA7714-miR156f-5p-SPL3/6。
综上所述，本发明通过建立泡桐丛枝病发生模拟系统、取样全转录组测序、构建文库、对miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA进行生物信息学分析，筛选出筛选泡桐丛枝病相关调控RNA及ceRNA网络，为泡桐丛枝病的防治提供有力依据。
附图说明
附图1所示为泡桐丛枝病相关RNA表达量变化趋势图；其中，
a.60mg·L-1MMS模拟泡桐丛枝病恢复过程中RNA表达量呈下降趋势；
b.60mg·L-1MMS模拟泡桐丛枝病恢复过程中RNA表达量呈升高趋势；
c.20mg·L-1MMS模拟泡桐丛枝病恢复过程中RNA表达量呈下降趋势；
d.20mg·L-1MMS模拟泡桐丛枝病恢复过程中RNA表达量呈上升趋势；
e.20mg·L-1MMS模拟泡桐丛枝病发病过程中RNA表达量呈下降趋势；
f.20mg·L-1MMS模拟泡桐丛枝病发病过程中RNA表达量呈上升趋势
图2所示为泡桐丛枝病相关ceRNA网络。
图3所示为qrt-PCR验证结果。
图4所示为毛果杨中miR156f-5p过表达验证结果。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，包括下述步骤：
1.建立泡桐丛枝病发生模拟系统
利用不同浓度的甲基磺酸甲酯(MMS)和利福平(Rif)处理白花泡桐丛枝病苗，模拟泡桐丛枝病恢复和发病的过程，确定测序取样时间点。
60mg·L-1MMS或100mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗后，可使病苗恢复健康；取样时间为处理后5、10、15、20d。
20mg·L-1MMS或30mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗后，也可使病苗恢复健康，但此时，相当于无症状感染者，将恢复健康的病苗继代后，感病状态又出现。取样时间为处理后10、30d，继代后20、40d。
在上述确定的取样时间点，取长势均匀的泡桐顶芽，液氮速冻保存于-80℃冰箱，为后续试验做准备。并且设置健康苗组PF和患病苗组PFI作为对照。
每个样品三个生物学重复，各样品分组如表1所示。
表1
Figure BDA0003211419480000061
Figure BDA0003211419480000071
2.全转录组测序及文库构建
提取各泡桐样品总RNA，进行总RNA样品检测，构建全转录组文库。
全转录组文库包括小RNA文库和去除核糖体RNA的链特异性文库；小RNA文库用于获得miRNA序列信息；去除核糖体RNA的链特异性文库用于获得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。
采用50SE测序策略构建小RNA文库：
样品总RNA经检测合格后，采用TruSeq Small RNA Sample Prep Kits(Illumina,San Diego,USA)试剂盒制备小RNA测序文库。首先连接3’和5’端RNA接头序列，再使用试剂盒进行逆转录反应，将带有接头的sRNA片段反转录成cDNA，然后进行PCR扩增。扩增产物经过PAGE胶电泳后，回收片段构建文库。库制备工作完成后，对构建好的文库使用IlluminaHiseq2500进行测序，测序读长为单端1×50bp。
采用150PE测序策略构建去除核糖体RNA的链特异性文库：
样品总RNA经检测合格后，采用Illumina公司Ribo-Zero Gold试剂盒去除核糖体RNA，纯化收回剩余RNA。纯化回收的RNA被片段化试剂(Franmentation Buffer)随机打断成短片段，以此为模板，用六碱基随机引物(Random hexamers)合成第一链cDNA，随后加入缓冲液、dNTP和DNAPolymerase I进行第二链cDNA合成。AMPure XPbeads纯化双链产物，然后将DNA的粘性末端修复为平末端，3’末端加接头，AMPure XPbeads进行片段选择，最后进行PCR扩增获得最终测序文库，文库质检合格后采用IlluminaHiseq4000进行测序，测序读长为2×150bp(PE150)。
3.miRNA分析
miRNA测序获得原始数据705,982,419个reads。过滤掉除3′接头序列，碱基长度小于18nt的序列，富含(80％)A或C或G或T，只有A、C没有G、T，或只有G、T没有A、C，或者是连续的核苷酸二聚体，三聚体序列。然后测得序列与mRNA，RFam(包含rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA等)和Repbase数据库进行比对，结果如表2所示。
表2 miRNA文库比对统计结果
Figure BDA0003211419480000091
Figure BDA0003211419480000101
过滤后得到的cleanreads有401,203,924个，clean reads用于miRNA的比对鉴定和预测分析。通过与白花泡桐基因组和miRbase的比对，共鉴定到668个miRNA，其中427个是已知miRNA，241个是新miRNA。
响应丛枝病miRNA的筛选：
miRNA表达量以归一化后的nor值进行分析。
在MMS处理组中，60mg·L-1MMS组模拟泡桐丛枝病恢复的过程，找出表达量呈升高(图1b)或下降(图1a)的miRNA；20mg·L-1MMS组模拟泡桐丛枝病恢复及发病的过程，在恢复过程中，鉴定出表达量升高(图1d)或下降(图1c)的miRNA，发病过程中，找出表达量下降(图1e)或升高(图1f)的miRNA，再找出恢复和发病过程中表达量变化趋势相反的转录本。
为了消除MMS的影响，找出60mg·L-1MMS组和20mg·L-1MMS组共同确定到的泡桐丛枝病相关miRNA。
对于Rif处理组，100mg·L-1Rif处理组参考60mg·L-1MMS组，30mg·L-1Rif处理组参考20mg·L-1MMS组，再找出共同确定到的泡桐丛枝病相关miRNA。
最终，为了消除试剂的影响，找出MMS处理组和Rif处理组共同确定到的响应泡桐丛枝病miRNA，如表3所示。
表3 泡桐丛枝病相关miRNA
Figure BDA0003211419480000111
4.mRNA分析
采用去除rRNA的建库方式进行测序，整个测序过程中既能检测lncRNA和mRNA的表达水平，也能检测circRNA的表达水平。结果如表4所示，本次测序得到12,423,427,214个clean reads，共鉴定到28,514个转录本。
表4 去除核糖体RNA的链特异性文库与白花泡桐参考基因组比对统计结果
Figure BDA0003211419480000121
Figure BDA0003211419480000131
注：Valid reads：质控后的数据；Mapped reads：能比对到基因组上的reads数；Unique Mapped reads：只能唯一比对到基因组一个位置的reads数；Multi mapped reads：能比对到基因组多个位置的reads数；Reads map to sense strand：Read比对到基因组上正义链的统计数；Reads map to antisense strand：Read比对到基因组上负义链的统计数；Non-splice reads Read：能够end-to-end比对到基因组区域，为整段比对统计；Splicereads Read：无法end-to-end比对到基因组区域，为分段比对统计；Back-splicedjunctions reads：Back-splicedjunctions reads数，TopHat-Fusion比对统计结果。
响应丛枝病mRNA的筛选：
mRNA表达定量的结果以FPKM(fragments perkb permillion fragments)为单位，具体计算公式如下:
Figure BDA0003211419480000132
设FPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的fragments数量，N为唯一比对到参考基因的总fragments数，L为基因A编码区的碱基数。
参考响应泡桐丛枝病miRNA的筛选方法，得到的泡桐丛枝病相关mRNA如表5所示。
表5 泡桐丛枝病相关mRNA
Figure BDA0003211419480000141
5.lncRNA分析
共鉴定到5,118个lncRNA，lncRNA表达定量的结果以FPKM((fragments per kbper million fragments))为单位，具体计算公式如下:
Figure BDA0003211419480000142
设FPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的fragments数量，N为唯一比对到参考基因的总fragments数，L为基因A编码区的碱基数。
参考响应泡桐丛枝病miRNA的筛选方法，得到的泡桐丛枝病相关lncRNA如表6所示。
表6 泡桐丛枝病相关lncRNA
Figure BDA0003211419480000151
6.circRNA分析
共鉴定到5,118个circRNA，circRNA表达定量的结果以FPKM(fragments per kbpermillion fragments)为单位，具体计算公式如下:
Figure BDA0003211419480000152
设FPKM(A)为基因A的表达量，则C为唯一比对到基因A的fragments数量，N为唯一比对到参考基因的总fragments数，L为基因A编码区的碱基数。参考响应泡桐丛枝病miRNA的筛选方法，得到的泡桐丛枝病相关circRNA如表7所示。
表7 泡桐丛枝病相关circRNA
Figure BDA0003211419480000153
7.ceRNA分析
鉴定到的28,514个转录本、5,118个lncRNA、9,927个circRNA和668个miRNA构建circRNA-miRNA-mRNA和lncRNA-miRNA-mRNA调控网络，结果显示共获得到36,531条lncRNA-miRNA-mRNA和84,445条circRNA-miRNA-mRNA互作关系。重点关注鉴定到的与丛枝病有关的17个转录本，4个lncRNA，6个circRNA，4个miRNA涉及的调控关系，结果见图2，从中发现了circRNA7714-pf-miR156f-5p-SPL3/6是这一关键的ceRNA。
8.circRNA7714-pf-miR156f-5p-SPL3/6调控研究
首先，进行qrt-PCR验证，结果见图3，从中发现circRNA7714、SPL3、SPL6感病后下调，miR156f-5p上调，与测序结果一致。
进一步地，在毛果杨(Populus trichocarpa)中进行miR156f-5p过表达分析，结果显示miR156f-5p过表达的转基因苗中呈现了分枝增多，植株矮小，叶片减小现象(图4)。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)建立泡桐丛枝病发生模拟系统
利用不同浓度的甲基磺酸甲酯MMS和/或利福平Rif处理泡桐丛枝病苗，模拟泡桐丛枝病恢复和发病的过程，确定测序取样时间点；
(2)全转录组测序及文库构建
提取泡桐总RNA，进行总RNA样品检测，构建全转录组文库；
所述全转录组文库包括小RNA文库和去除核糖体RNA的链特异性文库；
所述小RNA文库用于获得miRNA序列信息；
所述去除核糖体RNA的链特异性文库用于获得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息；
(3)生物信息学分析
分别对miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA数据进行数据分析，以及ceRNA分析，筛选泡桐丛枝病相关调控RNA及ceRNA网络。
2.根据权利要求1所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(1)中，
60mg·L-1MMS或100mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗，用于使病苗恢复健康；
20mg·L-1MMS或30mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗，用于使病苗恢复健康，但此时，相当于无症状感染者，将恢复健康的病苗继代后，感病状态又出现。
3.根据权利要求2所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(1)中，
60mg·L-1MMS或100mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗后，取样时间为处理后5-20d多时间点取样；
20mg·L-1MMS或30mg·L-1Rif处理白花泡桐病苗后，取样时间为处理后10-30d至少两次取样，继代后20-40d至少两次取样。
4.根据权利要求1所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(2)中，
小RNA文库测序策略为50SE；
去除核糖体RNA的链特异性文库测序策略为150PE。
5.根据权利要求1所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(3)中，
数据分析包括基本分析、miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA的表达水平分析、差异表达分析、GO富集分析、KEGG富集分析和ceRNA分析。
6.根据权利要求5所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(3)中，
筛选泡桐丛枝病相关调控RNA时，包括如下步骤：
1)筛选出泡桐丛枝病恢复过程表达量升高或下降的RNA，以及泡桐丛枝病发病过程表达量下降或升高的RNA，
2)比较获得泡桐丛枝病恢复过程与桐丛枝病发病过程表达量变化趋势相反的RNA；
3)对于同种处理试剂的不同剂量组，筛选出共同确定的RNA。
7.根据权利要求6所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(3)中，
对于不同处理试剂组，分别按照1)-3)筛选出调控RNA，再比较筛选出不同处理试剂组共同确定的RNA。
8.根据权利要求1所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(3)中，
筛选出的泡桐丛枝病相关miRNA包括：pf-mir122、pf-miR156f-5p、pf-miR159a-3p、pf-miR169f；
筛选出的泡桐丛枝病相关mRNA包括：多聚半乳糖醛酸酶、cullin 1、泛素结合酶E2、squamosa启动子结合蛋白3、squamosa启动子结合蛋白6、脱落酸受体Pyr1、肌醇加氧酶、葡糖醛酸激酶、延伸因子1-α、MADS box蛋白、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶、泛素化结构域蛋白DSK2a、质体移动受损蛋白2、蓝光下的叶绿体运动蛋白1、泛素化受体Rad23c、叶绿体积累响应所需的J结构域蛋白、BRANCHED1-like相关mRNA；
筛选出的泡桐丛枝病相关lncRNA包括：MSTRG.18394.1、MSTRG.22708.1、MSTRG.29927.1、MSTRG.33514.1；
筛选出的泡桐丛枝病相关circRNA包括：circRNA7714、circRNA315、circRNA6856、circRNA466、circRNA2705、circRNA6438。
9.根据权利要求1所述的一种泡桐丛枝病相关基因网络分析方法，其特征在于，
步骤(3)中，
分析得到的泡桐丛枝病相关ceRNA包括circRNA7714-miR156f-5p-SPL3/6。
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