CN114350772A - 一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，属于分子生物学领域；包括下述步骤：(1)样本处理：分别取健康植物样本与植原体侵染植物样本，裂解植物细胞获得细胞核；(2)文库制备及测序：利用步骤(1)获得的细胞核，使用Tn5转座酶酶切并纯化，回收DNA片段，构建高通量测序文库后进行测序；(3)生物信息学分析：对健康植物样本与植原体侵染植物样本的测序结果进行Peak分析，筛选植原体病害相关基因。本发明方法可为研究植原体病害发病相关转录因子功能的预测和验证奠定基础，提供借鉴。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法。
背景技术
植原体(Phytoplasma)是一类没有细胞壁，不能离体培养的柔膜菌纲(Mollicutes)微生物，可诱发1,000多种植物病害，并造成严重的的生态破坏和经济损失，但目前尚未阐明植原体的具体致病机理。由于植原体不能体外培养，严重限制了植原体病害发病机理的阐明。
泡桐，树皮灰色、灰褐色或灰黑色，幼时平滑，老时纵裂；假二杈分枝，单叶，对生，叶大，卵形，全缘或有浅裂，具长柄，柄上有绒毛；喜光，较耐阴，喜温暖气候，耐寒性不强；其生长速度快，耐瘠薄，材性优良，在防风固沙、保障粮食安全和木材供应等方面起着重要的作用。
泡桐丛枝病是植原体病害的一种，制约泡桐产业发展的重要因素，丛枝病的防治的有效方法仍未建立，还需要开辟新的途径进行研究。因此，如何提供一种泡桐丛枝病的分析方法，为泡桐丛枝病及其他植原体病害的防治提供依据是本领域亟待解决的问题。
发明内容
本发明公开了一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，有助于了解植原体病害发生过程中染色质开放性的变化，为进一步探究植原体病害的发病机理打下基础和提供研究思路，有助于泡植原体病害的防治研究。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，包括下述步骤：
(1)样本处理
分别取健康植物样本与植原体侵染植物样本，裂解植物细胞获得细胞核；
(2)文库制备及测序
利用步骤(1)获得的细胞核，使用Tn5转座酶酶切并纯化，回收DNA片段，构建高通量测序文库后进行测序；
(3)生物信息学分析
对健康植物样本与植原体侵染植物样本的测序结果进行Peak分析，筛选植原体病害相关基因。
进一步地，步骤(1)中，
白花泡桐丛枝病苗经60mg·L-1甲基磺酸甲酯处理后恢复健康状态后取顶芽作为健康植物样本，并以长势一致的白花泡桐丛枝病苗顶芽作为植原体侵染植物样本。
进一步地，步骤(2)中，
构建好的高通量测序文库用Illumina HiSeq4000平台进行PE150测序。
进一步地，步骤(3)中，
数据分析包括Peak的基本分析、Peak关联基因分析及转录因子分析、GO富集分析、KEGG富集分析。
进一步地，步骤(3)中，
Peak关联基因分析：从Peak上下游5kb中，找到最近的转录起始位点对应的基因。
进一步地，步骤(3)中，
根据健康植物样本与植原体侵染植物样本Peak关联基因筛选差异Peak；
筛选标准条件为：FDR值小于0.05，并且Fold change大于0；
从差异Peak区域鉴定出植原体病害相关转录因子家族。
进一步地，步骤(3)中，
对差异Peak关联基因区域进行GO富集分析、KEGG富集分析，筛选染色质开放性增强的区域和染色质开放性减弱的区域。
进一步地，步骤(3)中，
对染色质开放性增强的区域和染色质开放性减弱的区域内peak关联基因进行转录因子的鉴定与分类，从中筛选植原体病害相关基因。
综上所述，本发明通过染色质开放性测序技术，揭示了植原体病害发病过程染色质可及性发生显著改变，并预测出与染色质开放区域互作的转录因子。为之后研究植原体病害发病相关转录因子功能的预测和验证奠定了基础，为其他植原体病害研究提供借鉴。
附图说明
附图1所示为样品对比图片；其中，
A.未使用MMS试剂处理的白花泡桐丛枝病苗，具有明显的丛枝症状；
B.使用60mg·L-1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗，丛枝症状恢复为健康状态。
附图2所示为开放性增强区域检测到的转录因子家族；
附图3所示为开放性减弱区域检测到的转录因子家族。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，包括下述步骤：
1.样本处理
取白花泡桐丛枝病苗，分别设置使用60mg·L-1甲基磺酸甲酯(MMS)处理组(PFIM60)和未使用60mg·L-1甲基磺酸甲酯(MMS)处理组(PFI)，培养30d；如图1所示，未使用60mg·L-1甲基磺酸甲酯处理组白花泡桐丛枝病苗具有明显的丛枝症状，使用60mg·L-1MMS试剂处理后的白花泡桐丛枝病苗丛枝症状恢复为健康状态。
取每组长势均匀的泡桐顶芽作为样本，每组设置3个平行试验，液氮速冻保存于-80℃冰箱，为后续试验做准备。
取0.1g干净的样本，用液氮研磨，转移材料到1.5mL预冷的NPB中(Sigma-Aldrich)，裂解15min；用双层Miracloth滤布过滤，并收集液体于新的离心管中，之后，6000g，4℃，离心10min；小心移去上清，并用1mL冰冷的NEB2(aladdin)重悬沉淀，转移悬液到1.5mL离心管中，12000g，4℃，离心10min；移去上清，并用300μL的NEB3重悬沉淀；小心地将悬液加入装有300μL预冷NEB3(aladdin)的1.5mL离心管中，16000g，4℃，离心10min；小心除去上清，并用1mL预冷的NPB重悬沉淀，使用终浓度0.04％的台盼蓝染色，在显微镜下进行细胞核计数；取50000细胞核对应体积的NPB悬液于新的EP管中；500g，4℃，离心10min，弃上清，获得细胞核。
2.文库制备及测序
利用获得的细胞核，使用Tn5转座酶酶切并纯化，最后回收DNA片段，对回收片段进行末端修复、3'端加A、连接测序接头，片段大小选择以及PCA扩增等步骤获得标准的高通量测序文库，文库质检合格后采用IlluminaHiSeq4000进行测序，测序读长为2×150bp。
3.生物信息学分析
Illumina HiSeq 4000测序结果显示染色质开放性测序文库有约为8千万的reads数(表1)。使用deeptools软件分析基因转录起始位点(TSS)上下游2kb的reads分布情况，发现2个样本均在TSS附近均有很明显的富集。
表1测序统计结果
对测序数据进行Peak分析，Peak在基因组范围内的分布区域显示：PFI中有26.52％，PFIM60有27.9％，分布在启动子区。
Peak关联基因分析：从Peak上下游5kb中，找到最近的转录起始位点对应的基因，结果显示，PFI和PFIM60分别鉴定到2,192和2,021个基因。
通过PFI vs.PFIM60 Peak关联基因对比，筛选差异Peak，筛选标准条件为：FDR值小于0.05，并且Fold change大于0。
对差异Peak关联基因区域进行GO富集分析、KEGG富集分析，结果显示，染色质开放性增强的区域主要涉及环境信号传导、遗传信息处理以及细胞加工等通路；开放性减弱的区域主要涉及信号传导、碳水化合物代谢和能量代谢等通路。
使用iTAK软件(version 1.7a)对peak关联的基因进行转录因子(Transcriptionfactors)的鉴定与分类。开放性增强的区域鉴定到28个转录因子家族(图2)，开放性减弱的区域鉴定到88个转录因子家族(图3)。
可根据上述结果进行泡桐丛枝病相关转录因子的筛选，使得泡桐丛枝病相关转录因子的筛选更为快速、精准。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (8)
1.一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)样本处理
分别取健康植物样本与植原体侵染植物样本，裂解植物细胞获得细胞核；
(2)文库制备及测序
利用步骤(1)获得的细胞核，使用Tn5转座酶酶切并纯化，回收DNA片段，构建高通量测序文库后进行测序；
(3)生物信息学分析
对健康植物样本与植原体侵染植物样本的测序结果进行Peak分析，筛选植原体病害相关基因。
2.根据权利要求1所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(1)中，
白花泡桐丛枝病苗经60mg·L-1甲基磺酸甲酯处理后恢复健康状态后取顶芽作为健康植物样本，并以长势一致的白花泡桐丛枝病苗顶芽作为植原体侵染植物样本。
3.根据权利要求1所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(2)中，
构建好的高通量测序文库用Illumina HiSeq 4000平台进行PE150测序。
4.根据权利要求1所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(3)中，数据分析包括Peak的基本分析、Peak关联基因分析及转录因子分析、GO富集分析、KEGG富集分析。
5.根据权利要求4所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(3)中，
Peak关联基因分析：从Peak上下游5kb中，找到最近的转录起始位点对应的基因。
6.根据权利要求5所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(3)中，
根据健康植物样本与植原体侵染植物样本Peak关联基因筛选差异Peak；
筛选标准条件为：FDR值小于0.05，并且Fold change大于0；
从差异Peak区域鉴定出植原体病害相关转录因子家族。
7.根据权利要求6所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(3)中，
对差异Peak关联基因区域进行GO富集分析、KEGG富集分析，筛选染色质开放性增强的区域和染色质开放性减弱的区域。
8.根据权利要求6所述的一种基于染色质开放性测序技术研究植原体病害的方法，其特征在于，
步骤(3)中，
对染色质开放性增强的区域和染色质开放性减弱的区域内peak关联基因进行转录因子的鉴定与分类，从中筛选植原体病害相关基因。
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| WANG 等: "Protocol for assaying chromatin accessibility using ATAC-seq in plants." * |
| YAN 等: "Genome-wide analysis of three histone marks and gene expression in Paulownia fortunei with phytoplasma infection" * |
| 谢博洋: "甲基磺酸甲酯对‘豫杂一号’泡桐丛枝病发生基因表达变化的影响" * |
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