CN111733276B - 耐盐基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐盐基因及其应用，具体的涉及耐盐基因LOC8076251和/或LOC8056787，其在耐盐过程或者耐盐株中高表达。可以将LOC8076251和/或LOC8056787应用于植物的培育中，选育出具有耐盐胁迫能力的植物品种。

Description

耐盐基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及耐盐基因及其应用。
背景技术
2009年，美国能源部联合基因组研究所的科学家们利用全基因组鸟枪测序法完成了对高粱全基因组的测序及分析，结果显示，高粱基因组大约有3万个基因，7.3亿个核苷酸。高粱全基因组测序的完成对高粱后续各项研究的进展提供了坚实的基础。
随着三代测序技术的到来，三代全长转录组的应用在植物研究领域带来了更广阔的前景。Salah E.Abdel-Ghany等通过对高粱转录组的二代测序和三代测序数据进行比较分析，结果表明三代测序在识别全长亚型，多聚腺苷酸化等方面具有二代测序无可比拟的优势。
本研究使用Oxford Nanopore Technologies三代全长转录组测序方法对高粱苗期耐盐品种和敏盐品种进行测序比较分析，旨在探究两个品种耐盐机制的异同，发掘耐盐性关键基因，为后续高粱耐盐机制的深入研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与高粱耐盐相关的分子标志物，可以为高粱品种的筛选、推广种植以及改良提供理论依据和新的手段。
为了实现上述目的，本发明采用了如下的技术方案：
本发明第一方面提供了一种与高粱耐盐相关的分子标志物，所述分子标志物选自：LOC8076251和/或LOC8056787。
本发明第二方面提供了一种预测或辅助预测高粱耐盐的方法，通过检测样品中本发明第一方面所述的分子标志物的表达水平来预测或辅助预测植物的耐盐性。
进一步，通过northern blotting、实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、高通量测序技术、蛋白免疫技术检测样品中本发明第一方面所述的分子标志物的表达水平。
进一步，通过实时荧光定量PCR检测样品中本发明第一方面所述的分子标志物的表达水平。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述的方法在筛选耐盐高粱中的应用。
本发明第四方面提供了本发明第二方面所述的方法在高粱育种中的应用。
本发明第五方面提供了一种检测本发明第一方面所述的分子标志物的试剂，所述试剂能够检测LOC8076251或LOC8056787的水平。
本发明的第六方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第五方面所述的试剂。
本发明第七方面提供了本发明第五方面所述的试剂或本发明第六方面所述的试剂盒在预测或辅助预测高粱耐盐中的应用；和/或在筛选耐盐高粱中的应用。
本发明第八方面提供了一种提高高粱耐盐性的方法，所述方法包括：增加本发明第一方面所述的分子标志物的表达。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了LOC8076251或LOC8056787与植物耐盐相关，对于研究植物抗逆的遗传本质及提高植物耐盐具有重要的意义。
附图说明
图1是分子标志物LOC8076251和LOC8056787在敏盐株和耐盐株中的表达情况图；其中，A是LOC8076251；图B是LOC8056787；
图2是LOC8076251和LOC8056787在盐胁迫中的表达情况图；其中，图A是LOC8076251，图B是LOC8056787。
具体实施方式
本发明通过对敏盐高粱和耐盐高粱进行转录组测序，利用遗传学手段来寻找耐盐和敏盐基因表达谱的差异，并同时通过盐胁迫试验检测盐响应的基因，挖掘耐盐的功能基因，解析其复杂的分子机理奠定理论基础，同时为耐盐高粱的鉴定以及育种提供重要的手段。
在本发明中，可以利用本领域内已知的任何方法对分子标志物进行检测，包括但不限于northern blotting、实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、高通量测序技术、蛋白免疫技术。
Northern blot是最为经典的核酸杂交技术，被广泛用于基因的表达检测，也是唯一能可视化检测基因表达的方法。
实时荧光定量PCR是目前最常用的定量检测特定基因表达的方法，此方法是在反应体系中加入荧光基团，利用信号的积累检测PCR进程，通过标准曲线及CT值来计算模板浓度，从而达到定量的目的。
原位杂交是指将核酸探针标记后，与组织或细胞中的核酸杂交，将已知序列的基因在组织、细胞或亚细胞定位的一种检测技术。该方法可以更直观地探测基因在组织或细胞中的时空表达模式。
本领域技术人员应当理解，检测基因的手段或方法不是本发明的重要方面，只要可以确定本发明所述的分子标志物表达水平即可。
应当知道，本发明的分子标志物包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整分子标志物核酸分子相同的功能，它们可能通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
本领域技术人员熟知，在不影响分子标志物功能的条件下，对分子标志物进行碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
本发明的基因核酸分子可以以单链或双链的形式存在，本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
本发明的分子标志物可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达分子标志物的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核表达载体。
病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。
本发明提供了一种提高高粱耐盐性的方法，所述方法包括：增加植物中本发明所述的分子标志物的表达。
在得知了本发明所述的分子标志物的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的分子标志物的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带分子标志物基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达。
作为本发明的一种实施方式，将本发明所述的分子标志物通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述分子标志物的植物。
优选的，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
(1)将外源的分子标志物的多核苷酸转入植物细胞、组织、器官或组织，获得转化入分子标志物多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子；和
(2)将步骤(1)获得的转入了外源分子标志物多核苷酸的植物细胞、组织、器官或种子再生成植物植株。
其它增加分子标志物其同源基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强分子标志物基因或其同源基因的表达。或者通过增强子来增强该分子标志物基因的表达。
此外，本发明还涉及利用分子标志物作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用分子标志物作为一种分子标记，通过检测植物中分子标志物的表达情况，鉴定植物的耐盐能力。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1耐盐基因的筛选
1、实验材料
苗期极耐盐品种圪红(GH，00000601，河北)和极敏盐品种褐高粱(HGL，00013200，贵州)。
2、实验方法
2.1材料的处理
选用苗期耐盐品种(00000601)及盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m-2·s-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用，每组设三个重复。
2.2转录组测序
叶片总RNA的提取纯化与质量评估、cDNA文库的构建、转录组测序工作交由北京百迈客生物科技有限公司完成。转录组测序平台使用Oxford Nanopore Technologies的PromethION测序平台。
2.2.1 RNA的提取与质量评估
液氮研磨幼苗叶片，使用天根生化的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒按说明书提取总RNA，用Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对样品纯度、浓度、RNA完整性等指标进行检测。
2.2.2文库的构建与转录组测序
整个文库构建与测序工作根据牛津纳米孔技术公司(ONT)提供的方案，用1ug的总RNA经过SQK-PCS109系统进行cDNA文库制备。简而言之，使用SuperScript IV第一链合成系统(Invitrogen)进行全长mRNA逆转录，然后对cDNA进行PCR扩增反应14个循环，DNA聚合酶使用LongAmp热启动Taq DNA聚合酶(NEB)。对PCR产物进行FFPE DNA损伤修复和末端修复(NEB)，使用T4 DNA连接酶(NEB)进行测序接头连接。随即用Agencourt XP对DNA进行磁珠纯化。将最终的cDNA文库添加到FLO-MIN109流通池中，在百迈客生物科技有限公司(北京)的PromethION平台上测序。
2.2.3测序数据与质量控制
从原始下机序列中过滤序列中的低质量(长度小于500bp，Qscore小于7)序列和核糖体RNA序列，并根据识别序列两端是否存在引物得到全长序列。
全长序列用minimap2软件与参考基因组进行比对，通过比对信息进行聚类后，得到一致性序列。
合并每个样品的一致性序列，通过minimap2与参考基因组(Sorghum_bicolor_NCBIv3，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝sorghum)进行比对，对比对到参考基因组的读长序列进一步使用cDNA_Cupcake程序包(https://github.com/Magdoll/cDNA_Cupcake)进一步去冗余，过滤identity小于0.9，coverage小于0.85的序列，合并仅5’端外显子有差异的比对。
2.2.4数据分析
1)新基因、SSR及转录因子的预测
使用TransDecoder软件(http://transdecoder.github.io/)预测转录本中编码区序列(Coding Sequence，CDS)，使用MISA软件鉴定转录组的简单重复序列(SimpleSequence Repeats，SSR)，用iTAK软件预测转录因子。
2)LncRNA预测
因长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)不编码蛋白，因此，通过对转录本进行编码潜能筛选，判断其是否具有编码潜能，从而可以判定该转录本是否为lncRNA。分别应用CPC分析、CNCI分析、CPAT、pfam蛋白结构域分析四种方法对新发现的转录本进行lncRNA的预测。CPC(Coding Potential Calculator)是基于序列比对的蛋白质编码潜能计算工具。CNCI(Coding-Non-Coding Index)分析是一种通过相邻核苷酸三联体特征区分编码-非编码转录本的方法。CPAT(Coding Potential Assessment Tool)分析是一种通过构建逻辑回归模型，基于ORF长度、ORF覆盖度，计算Fickett得分和Hexamer得分来判断转录本编码和非编码能力的分析方法。Pfam数据库是最全面的蛋白结域注释的分类系统构。
3)基因功能的注释分类
主要利用NR(NCBI non-redundant protein sequences)数据库，该数据库是NCBI中的非冗余蛋白质数据库；Pfam(Protein family)数据库是最全面的蛋白结构域注释的分类系统；COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)数据库是对基因产物进行同源分类的数据库；KOG(euKaryotic Ortholog Groups)数据库是针对真核生物，基于基因直系同源关系，结合进化关系将来自不同物种的同源基因分为不同的Ortholog簇；Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)数据库是由EBI(欧洲生物信息学研究所)负责维护的数据库，包含了有相关参考文献且经过校对的蛋白质注释信息数据库，可信度很高；KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系统分析基因产物在细胞中的代谢途径以及这些基因产物功能的数据库；GO(GeneOntology)数据库是一个国际标准化的基因功能分类体系，提供了一套动态更新的标准词汇表来全面描述生物体中基因和基因产物的功能属性。
4)转录表达水平的定量与差异表达分析
转录组测序可以模拟成一个随机抽样的过程，为了让片段数目能真实地反映转录本表达水平，需要对样品中的Mapped Reads的数目进行归一化。采用CPM(counts permillion)作为衡量转录本或基因表达水平的指标，CPM计算公式如下(“reads mapped totranscript”表示比对到某一转录本上的reads数目；“total reads aligned in sample”表示比对到参考转录组的片段总数)：
Figure BDA0002590232810000071
使用DESeq R软件包(1.18.0)和EBSeq软件对盐胁迫下不同处理时间、不同品种幼苗叶片进行差异表达分析。在此过程中，Fold Change≥2且FDR<0.01作为筛选标准。符合筛选条件的基因为差异表达基因。差异倍数(Fold Change)表示两样品(组)间表达量的比值。FDR(False Discovery Rate)是通过对差异显著性p值(p-value)进行校正得到的。由于转录组测序的差异表达分析是对大量的转录本表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值(p-value)进行校正，并最终采用FDR作为差异表达转录本筛选的关键指标。
5)差异表达基因的功能富集分析
差异表达基因的功能富集分析主要包括GO富集分析和KEGG通路富集分析，其中GO富集分析是通过GOseq R程序包完成，KEGG通路富集分析由KOBAS软件进行分析。
6)数据的统计与图形绘制
差异表达基因的韦恩图统计、GO注释分类、KEGG富集分析图形绘制使用百迈客云分析平台完成，GO富集分析图使用ggplot2 R程序包完成，样本表达量相关性分析聚类热图、盐胁迫响应基因差异表达热图绘制使用pheatmap R程序包完成，差异表达基因统计、转录因子统计柱形图使用origin 8.5完成，使用EXCEL 2016进行数据统计，其他图形绘制由百迈客生物科技公司提供完成。
2.3 qRT-PCR验证
使用金百特生物的RT Kit With gDNA Eraser试剂盒将提取的总RNA反转录成cDNA,反转录体系以及步骤如下：
Figure BDA0002590232810000081
依次加入，在加入5×RT MasterMix之前，轻轻混匀，42℃孵育2min，全部加入后，轻轻混匀，42℃孵育20min,85℃加热5s。置冰上，合成的cDNA用于qRT-PCR，使用前加180μLddH2O稀释至终浓度约为5ng/μL。
随机选取6个差异表达基因，使用ABI 7300Real-Time PCR System(USA)进行qRT-PCR，验证转录组测序数据的准确性，使用金百特生物2×Sybr Green qPCR Mix(High ROX)试剂，反应液配制在冰上进行，PCR反应液体系如下：
Figure BDA0002590232810000082
qRT-PCR反应程序设置如下：
反应条件 循环数
94℃ 3min 1
94℃ 10s，60℃ 34s 40
Dissociation Stage
qRT-PCR引物设计使用NCBI Primer Blast工具完成，具体引物序列如表1所示，引物序列由北京擎科生物公司合成。使用Sorbi.3007G140700(GAPDH)基因作为内参基因，使用2-ΔΔCt相对定量方法以耐盐品种和敏盐品种非处理样本为对照进行表达定量，每个样本三个重复。
表1 qRT-PCR选用基因及引物序列
Figure BDA0002590232810000091
2.4结果与分析
2.4.1 RNA质量检测
转录组测序对于RNA的质量要求很高，良好的RNA质量是获得可靠测序数据的前提，经Nanodrop2000、Caliper LabChip GX对总样品进行检测，结果显示8.2<RIN<8.6，2.11<OD260/OD280<2.16，28S/18S在1.3到1.6之间，说明总RNA质量较高，完整性较好，能够满足构建cDNA文库需求。
2.4.2测序数据质量
对总样品进行全长转录组测序，每个样品测序产出clean data均达到6.38GB,过滤短片度和低质量的reads后的信息见表2得到的clean read数从6319936到10297642不等，N50在1134-1282之间，平均质量值在Q9以上，总的clean data去除核糖体RNA(ribosomeRNA，rRNA)并通过reads两端的引物序列鉴定全长(full length)序列详见表3，每个样品得到的全长，率均在80％以上。将clean reads与参考基因组进行比对，比对统计结果见表3，比对上的序列为99.47％以上。
表2总样品的clean data数据统计
Figure BDA0002590232810000101
表3总样品全长序列数据统计表
Figure BDA0002590232810000102
2.4.3两个品种的基因表达情况分析
对耐盐品种圪红(GH)和敏盐品种(HGL)全部样本进行全长转录组测序分析，与敏盐品种相比，呈现显著性差异的有604个基因，其中，显著上调的有212个，显著下调的有392个。
LOC8076251和LOC8056787在耐盐品种中显著上调(图1，表4)，说明LOC8076251和LOC8056787作为可能的耐盐基因在植物的耐盐中起着重要的作用。
表4分子标志物的表达水平
Figure BDA0002590232810000111
2.4.5 qRT-PCR验证分析
随机挑选6个差异表达基因进行定时荧光定量PCR以验证转录组数据的准确性，结果显示，6个差异表达基因与转录组测序结果中的表达量变化倍数趋势基本一致，说明转录组测序数据准确可靠。
实施例2耐盐基因对盐胁迫的响应
1、材料处理
选用盐敏感品种(00013200)种子，将蛭石装入育苗盘中，并用蒸馏水对其完全浸润，种子消毒处理后种入育苗盘，播种深度约1cm，放入光照培养箱中，在25℃恒温、昼夜光照周期为12h/12h、70％湿度、光照强度200μmol·m-2·s-1条件下培养，约7天种子发芽，用1/2Hoagland营养液浇灌，待幼苗长至四叶一心期，开始用含有150mmol·L-1NaCl溶液胁迫处理幼苗，分别设胁迫处理时间梯度为0h(CK)、6h、24h、48h，每个处理三个重复。为保持盐胁迫浓度，处理NaCl溶液每24h更新一次。胁迫处理结束，迅速剪下幼苗叶片，液氮速冻，随后放入-80℃冰箱保存备用。
2、转录组测序及数据分析方法同实施例1。
3、结果
结果显示，敏盐株在适应盐胁迫的过程中，LOC8076251和LOC8056787基因显著上调(图2，表5)，同耐盐株与敏盐株的基因表达趋势一致，说明LOC8076251和LOC8056787是耐盐基因。
表5盐胁迫试验中分子标志物的表达水平
Figure BDA0002590232810000112
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 耐盐基因及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtacaggcag agctgaggtg 20

Claims (6)

1.一种预测高粱耐盐的方法，其特征在于，通过检测样品中分子标志物LOC8076251和/或LOC8056787的表达水平来预测植物的耐盐性，其中，LOC8076251、LOC8056787在耐盐高粱中表达上调。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过 northern blotting、实时荧光定量PCR、原位杂交、基因芯片、高通量测序技术、蛋白免疫技术检测样品中分子标志物的表达水平。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过实时荧光定量PCR检测样品中分子标志物的表达水平。
4.权利要求1-3任一项所述的方法在筛选耐盐高粱中的应用。
5.检测分子标志物表达水平的试剂在预测高粱耐盐中的应用和/或在筛选耐盐高粱中的应用，其特征在于，所述分子标志物为LOC8076251和/或LOC8056787。
6.试剂盒在预测高粱耐盐中的应用和/或在筛选耐盐高粱中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测分子标志物LOC8076251和/或LOC8056787表达水平的试剂。
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