CN110592183A - 一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法 - Google Patents

一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，其主要特征为将目标细胞的RNA反转录为互补DNA，然后以合成或其它方式取得的RNA同义DNA，与互补DNA杂交，如果存在突变，那么突变区就不能完全杂交。由于DNA内切酶只能切割完全杂交的双链DNA而不能切除不完全杂交的双链DNA，所以我们可以用特定的内切酶切除完全杂交的DNA片断而保存不能完全杂交的DNA片断。然后将带有突变位点的不能完全杂交的而保留的DNA片断扩增，构建高通量测序库进行高通量测序。然后根据测序数据分析出突变位点。

Description

一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法
技术领域
本发明属于生命科学和医学技术领域，具体地说，是关于一种RNA水平经济、准确、灵敏、稳定地检测在大量的正常细胞中混有极少量(低于1/1000)基因突变细胞(癌细胞)时突变细胞的突变基因的高通量测序文库的制备方法。
背景技术
研究表明，物种的进化、细胞变异都是由于微小的基因突变而导致不同的表型。就大型物种而言，每个物种的基因组约有数亿到数十亿个碱基数，而许多关键突变只有几个碱基甚至只有一个碱基。如果没有明确的目标，要从浩如烟海的基因组中，找到突变的碱基，就如大海捞针。用常规一代测序方法进行人类基因组的测序，需要花费数十亿美元。
随着近几年高通量测序技术的成熟，高通量测序已经成为基因研究及基因突变检测的常规有力武器，可以轻松实现一次测出数十亿到数百亿的碱基数，但其存在如下问题：一方面，其成本高，检测一次需要要数万元；另一方面，其检测难，如果待测样品中混有极少量的突变样品，那突变位点的碱基数相对于整个样品的碱基数而言，只有万亿分之一，纵然是高通量测序，也很难在没有明确基因目标的待测样品中检测出突变样品。
为了去除非突变干扰基因信息的影响，科学家们探索了多种方法。其中一类为差减杂交法，主要可分为两种：一种是利用参照样品的cDNA与目标样品mRNA杂交，然后纯化mRNA，此方法的mRNA获得效率低，且有可能去除目标样品中带有突变的mRNA,丢失需要检测的目标信息；另一种是只用目标样品构建高通量测序双链DNA文库高温变性后快速复性，样品中高丰度的DNA就由于随机碰撞能更多遇到配对序列因而更可能多的形成双链，然后用双链特异性DNA酶切除双链，此方法可以一定程度降低高丰度基因的丰度到1/10，但低丰度基因的丰度提高2-3倍，但对于样品中极少量突变细胞中的少数基因突变，这种方法完全无能为力，并且双链特异性DNA酶可以识别20bp以上的双链并切断，这样的话，单点突变的基因形成的杂合链由于部分区域形成20bp以上的双链，会被双链特异性DNA酶切断，因而有可能造成目标信息的丢失，不能达到精准甄别基因差异或基因表达差异的要求。
另一类为当前研究比较热门的单细胞法，将癌变或特异细胞从大量正常细胞中分离出来，再对单细胞进行高通量测序，但在应用过程中，单细胞的分离非常复杂，一方面需要昂贵的仪器，比如显微切割仪，单细胞分离仪、流式细胞仪等，另一方面，由于分离单细胞还需要一定的标记，而标记物对高通量测序存在一定的干扰作用，易造成假阳性或假阴性，影响实验结果。另外，单细胞分离及后续的实验处理等对实验技术条件及人员的要求非常高，成本高，普及难，不实用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种RNA水平经济、准确、灵敏、稳定地检测细微变异的品种、组织或细胞样品间超低频基因变的高通量测序文库的制备方法。
一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，包括如下步骤：
A、以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库；
B、以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；
C、将反义链单链DNA文库与编码链单链DNA文库进行杂交；
D、补齐杂交区与识别区的单链区域，以使限制性内切酶在识别区外下游切除完全杂交的杂交体，保留不能完全杂交或不能杂交的差异片断；
E、以不能完全杂交或不能杂交的差异片断为模板进行PCR扩增，纯化扩增产物，获得双链DNA高通量测序文库。
根据本发明，所述步骤A的RNA的反义链单链DNA文库的制备方法包括：以RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA的反义链单链DNA文库，所述RNA的两端带有不同接头，且一端接头带有限制性内切酶识别位点，所述RNA的一端还带有引物。
根据本发明，所述步骤A的RNA的反义链单链DNA的序列长度为30～40bp。
根据本发明，所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：以外显子组为模板进行PCR扩增，获得外显子组的反义链单链DNA文库。
进一步的，所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：所述外显子组的两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并利用高密度外显子组捕获试剂进行捕获基因编码链或反义链单链DNA；接着，用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头。
根据本发明，所述步骤B的RNA的编码链单链DNA文库的构建方法包括：
A、以RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA的反义链单链DNA文库，所述RNA的两端带有不同接头，且一端接头带有限制性内切酶识别位点，所述RNA的一端还带有引物；
B、以步骤A获得的反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得RNA的编码链单链DNA文库；
C、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的至少一端的外源接头。
根据本发明，所述步骤B的RNA的编码链单链DNA的序列长度为20～50bp。
根据本发明，所述步骤B的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：
A、以外显子组为模板进行PCR扩增，获得外显子组的反义链单链DNA文库；
B、以步骤A获得的反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得外显子组的编码链单链DNA文库；
C、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的至少一端的外源接头。
进一步的，所述步骤B的外显子组的编码链单链DNA文库的构建方法包括：所述外显子组的两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并利用高密度外显子组捕获试剂进行捕获基因编码链或反义链单链DNA；接着，用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头；最后，用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的一端的外源接头。
根据本发明，所述以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库替换为以目标样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；所述以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库替换为以参照样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库。
本发明的检测超低频基因突变细胞的基因突变的高通量测序文库的制备方法，其有益效果是：
1、精度高：目标样品反义链单链DNA与参照样品编码链单链DNA通过DNA单链杂交进行精确匹配，或目标样品编码链单链DNA与参照样品反义链单链DNA通过DNA单链杂交进行精确匹配，并利用DNA聚合酶从杂交双链区延伸直至补齐反义链DNA单链的内切酶识别区，在识别区与杂交区形成完整DNA双链，然后用限制性内切酶准确识别限制性内切酶识别位点并在其下游完全匹配区进行切割的方式精确去除完全匹配的杂交体，从而精确去除目标样品中与参照样品一致的基因信息，保留不能完全匹配的差异表达基因信息或突变基因片断。
2、灵敏度高：可高效去除99.99％以上的与参照样品一致性序列，从而保留其目标样品中微量的特异基因表达或基因突变信息，经过PCR扩增后进行有效的高通量测序。
3、稳定性高：所使用的仪器、试剂、操作方法均为常规高通量测序及基因克隆所用仪器、试剂，其所采用的仪器、试剂、操作技术成熟稳定，检测结果稳定可靠，可重复性好。
4、成本低：通过差减杂交，去除了目标样品中99.99％以上的参照样品一致性序列，测序数据量大大降低，测序及分析成本也大大降低。另外，检测样品处理过程均为常规的分子生物学仪器与试剂，无需再行配置昂贵的仪器及试剂即可实施。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，包括如下步骤：
A、以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库；
B、以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；
C、将RNA或外显子组的反义链单链DNA文库与RNA或外显子组的编码链单链DNA文库进行杂交；
D、补齐杂交区与识别区的单链区域，以使限制性内切酶在识别区外下游切除完全杂交的杂交体，保留不能完全杂交或不能杂交的差异片断；
E、以不能完全杂交或不能杂交的差异片断为模板进行PCR扩增，纯化扩增产物，获得双链DNA高通量测序文库。
所述步骤A的RNA的反义链单链DNA文库的构建方法如下：
A1、纯化RNA并去除rRNA等高丰度干扰RNA；
A2、然后，打断RNA至40-50bp；
A3、接着，RNA的3’端和5’端分别添加不同接头，且一端接头带有内切酶识别位点，孵育过夜；
A4、接着，在RNA的5’端添加引物；
A5、以加过接头和引物的RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA反义链单链DNA文库。
进一步的，所述RNA反义链单链DNA的序列长度为30～40bp。
所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法如下：
A6、基因组打断至40～50bp左右；
A7、两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并进行适当扩增，以保证单拷贝或低拷贝突变的拷贝数；
A8、利用高密度外显子组捕获试剂进行外显子组捕获基因编码链或反义链单链DNA；
A9、用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头。
所述步骤B的RNA的编码链单链DNA文库的构建方法如下：
B1、纯化RNA并去除rRNA等高丰度干扰RNA；
B2、然后打断RNA至主要片段集中于40～50bp；
B3、将RNA的3’端和5’端分别添加不同接头，且一端接头带有内切酶识别位点，孵育过夜；
B4、将RNA的3’端添加引物；
B5、以加过接头和引物的RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA反义链单链DNA文库；
B6、以参照样品反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得RNA编码链单链DNA文库；
B7、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的3’端的外源接头。
进一步的，所述编码链单链DNA的序列长度为20～50bp。
所述步骤B的外显子组的编码链单链DNA文库的构建方法如下：
B8、基因组打断至40～50bp左右；
B9、两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并进行适当扩增，以保证单拷贝或低拷贝突变的拷贝数；
B10、利用高密度外显子组捕获试剂进行外显子组捕获基因编码链或反义链单链；
B11、用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头；
B12、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的3’端的外源接头。
优选的，所述步骤A的限制性内切酶识别位点设置于5’端，所述步骤B的限制性内切酶识别位点设置于3’端。
优选的，所述步骤D的限制性内切酶为Ecop15I。
进一步的，上述所述的以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库可以替换为以参照样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库；所述以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库可以替换为以目标样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库。
实施例1：同一品种不同植株的微量基因差异或突变的高通量测序文库的制备方法
一、样品前处理
1、取样
本实施例采用来源于同一拟南芥Columbia品种的甲、乙两棵不同植株的含根茎叶组织300mg，采用Reagent(AmbionTMcat#:15596018)依照说明提取叶片总RNA。
2、rRNA去除
甲、乙两样品各取50ug采用Ribo-Zero rRNA Removal Kit(Plant)(illumina,cat#MRZPL116)依试剂说明去除rRNA并纯化。
3、实验组目标样品及参照样品RNA打断
甲、乙两样品rRNA去除后RNA各取10ng,采用RNA FragmentationReagents(Ambion,Cat#AM8740)依试剂说明打断RNA至主要片断集中于40～50bp。
4、对照组目标样品及参照样品RNA打断
甲、乙两样品rRNA去除后RNA各取10ng,采用RNA FragmentationReagents(Ambion,Cat#AM8740)依试剂说明打断RNA至主要片断集中于300bp。
二、实验组样品处理
1、构建实验组目标样品链特异性单链DNA库：
(1)3’端添加腺苷化接头
A、片断化的RNA 65℃加热30s,立刻置于冰上变性。
B、5’端腺苷化的接头(3’端氨基化的CTGTGAAGAGCATCAAT)65℃加热30s,立刻置于冰上变性。
C、向管中加入下列试剂，混匀：
8ul目标样品片断化RNA
1ul adapter(10uM)
2ul 10XT4 RNA Ligase2 buffer without ATP
0.5ul RNase inhibitor
5ul PEG8000
0.5ul T4 RNA Ligase 2
D、18℃孵育过夜。
E、加入下列试剂，混匀：
0.5ul 5’端氨基化的接头(序列：ATTGATGCTCTTCACAG)(20uM)
F、65℃加热15min，然后25℃加热10min。
(2)5’端添加接头(序列：GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUGC)
A、将目标样品5‘端接头(10uM)65℃加热30s，立刻置于冰上。
B、向管中加入下列试剂，混匀：
1ul 5’adapter(10uM)
1ul 10XT4 RNA ligase 1buffer with ATP
0.5ul RNase inhibitor
2ul ATP(10AM)
4ul RNase-free water
1ul T4 RNA ligase1
C、25℃孵育4h。
D、依使用说明(Zymo Research Cat#R1015)进行RNA的纯化浓缩，最后洗脱体积为8ul。
(3)、目标样品第一链反转录
A、在一个薄壁无酶PCR管中加入下列试剂，混匀：
7ul加过接头的RNA
1ul 5X PrimeScriptⅡBuffer
1ul RNase Inhibitor
1ul PrimeScriptⅡRTase
44℃温浴1小时。此处的样品可安全保存在-20℃。
B、PAGE胶电泳，割胶取80～90bp单链条带，胶回收纯化得到目标样品反义链DNA单链库。
三、实验组参照样品反向互补单链DNA库的构建
(1)参照样品3’端添加腺苷化接头
A、片断化的RNA 65℃加热30s,立刻置于冰上变性。
B、5’端腺苷化的接头(3’端氨基化的CTGTGAAGAGCATCAAT)65℃加热30s,立刻置于冰上变性。
C、向管中加入下列试剂，混匀：
8ul参考样品片断化RNA
1ul adapter(10uM)
2ul 10XT4 RNA Ligase2 buffer without ATP
0.5ul RNase inhibitor
5ul PEG8000
0.5ul T4 RNA Ligase 2
D、18℃孵育过夜。
E、加入下列试剂，混匀：
0.5ul 5’端氨基化的接头(序列：ATTGATGCTCTTCACAG)(20uM)
F、65℃加热15min，然后25℃加热10min。
(2)参照样品5’端添加接头(序列：GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUGC)
A、将参照样品5’端接头(10uM)65℃加热30s，立刻置于冰上。
B、向管中加入下列试剂，混匀：
1ul 5‘adapter(10uM)
1ul 10XT4 RNA ligase 1buffer with ATP
0.5ul RNase inhibitor
2ul ATP(10AM)
4ul RNase-free water
1ul T4 RNA ligase1
C、25℃孵育4h。
D、依使用说明(Zymo Research Cat#R1015)进行RNA的纯化浓缩:
(3)参照样品第一链反转录
A、在一个薄壁无酶PCR管中加入下列试剂，混匀：
7ul加过接头的RNA
1ul 5X PrimeScriptⅡBuffer
1ul RNase Inhibitor
1ul PrimeScriptⅡRTase
44℃温浴1小时。此处的样品可安全保存在-20℃。
B、PAGE电泳，割胶取70～80bp条带，胶回收去除遗留接头并筛选所需片断。
(4)不对称扩增编码链DNA单链
按60:1上、下游扩增接头混合引物(上游GTTCAGAGTTCTACAGT，下游：ATTGATGCTCTTCACAG),终浓度为25μM，30循环PCR，扩增cDNA文库的反向互补单链片断库。体系如下：
10ul参照样品第一链反转录纯化产物
13ul RNase-free H2O
25ulHigh-Fidelity PCR MM w/HF Buffer
0.5 25μM引物混合物
1.5ul ddH2 O
PCR循环参数(加样之前PCR仪的温度至少为65℃)
(5)参照样品编码链DNA单链下游接头去除
A、在PCR产物中，加入0.5ul 25μM下游引物ATTGATGCTCTTCACAG，98℃变性10分钟，室温冷却至37℃。
B、按使用说明，加入内切酶SapI(Thermo Scientific，cat#FD1934)及对应buffer，37℃温浴60分钟，65℃5分钟灭活，切除单链库片断的3’端的外源序列。
C、PAGE胶电泳，割胶取60～70bp条带，胶回收进行片断筛选。形成参照样品反向互补单链DNA库。
6、按总量10：1的比例加入参照样品单链DNA库及目标样品单链DNA库至10ul,95度变性5分钟，然后温室冷却至37℃,按使用说明，加入klenow(NEB，cat#M0212L)、dNTP及buffer,将双链由杂交区延伸至Ecop15I酶识别区。
7、依使用说明，加入Ecop15I酶及其酶切缓冲液(Thermo ScientificTM，cat#FD0344)切割杂交区完全匹配的DNA杂交体。然后65℃5分钟灭活。
8、在处理好的酶切体系中按下表加入如下引物及PCR反应体系：
上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGGCCAAGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR反应体系：
25ulHigh-Fidelity PCR MM w/HF Buffer
0.5ul 25μM引物混合物
X ul酶切体系
24.5-Xul ddH2 O
PCR循环参数(加样之前PCR仪的温度至少为65℃)
PCR体系补水至50ul，进行20circle高保真PCR。
9、PAGE胶电泳，割胶取150～160bp条带，胶回收进行片断筛选。形成目标样品差异信息双链DNA高通量测序文库。
三、对照组样品处理
取片断化甲、乙样品RNA，依经典方法进行RNA高通量测序。参见文献Transcriptome analysis by strand-specific sequencing of complementary DNANucleic Acids Res.2009
四、文库质检测序及数据分析
1、依说明使用Agilent Bioanalyzer 2100对实验组文库及对照组进行质检。
2、实验组样本差减文库采用Hiseq20001*50SR模式测序，产生10M读段，总数据量0.5G。对照组甲、乙样品普通文库均用Hiseq4000高通量测序仪上进行2*150PE基因测序，产生20M读段，总数据量6G。
3、数据分析，鉴定差异表达基因或突变基因。
数据分析参照Transcriptome analysis by strand-specific sequencing ofcomplementary DNA，Nucleic Acids Res.2009，对比拟南芥Columbia基因组，有5个以上读段支持的突变为确定的突变位点。分析结果如下：
组别\突变数\分组 对照组 实验组
1 45 1250
2 58 875
3 70 1430
4 81 589
5 26 698
6 68 2430
显著性分析表明，P<0.05,实验组明显比对照组能检测到更多的突变。
4PCR验证
对实验中发现在突变，按10％的比例抽样进行PCR验证
对照组检测到的都是高丰度基因的突变，几乎全部可以得到验证。实验组由于检测到了一些极低表达甚至是单拷贝的基因，因此少数突变在PCR验证没有进一步证实，但总体上采用本专利技术的实验组能检测到的突变数仍然远大于采用传统方法的对照组。
综上所述，本发明采用高通量测序方法对超低频基因突变细胞的基因突变的检测过程中，创造性地以RNA构建目标样品反义链单链DNA片断库，并引入参照样品以RNA构建编码链单链DNA片断库，利用过量的参照样品编码链单链DNA片断库与目标样品反义链单链DNA片断库杂交，保证目标样品反义链单链DNA片断都能正确匹配所对应的对应的编码链从而形成DNA双链。
同时，本发明创新性地在目标样品反义链DNA单链片断库的接头上，设置在识别位点下游切割的Ecop15I DNA限制性内切酶识别位点，以精确识别并切除与参照样品编码链DNA单链与目标样品反义链形成完美匹配杂交双链DNA的方式，精确去除目标样品中与参照样品相同的绝大部分的干扰片断，从而保留不能杂交的或错配杂交的异常信息，经过PCR扩增后进行有效的高通量测序。本发明的实施例可以用于鉴定差异表达基因或突变基因，这些对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (10)

1.一种检测超低频基因突变的高通量测序文库的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库；
B、以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；
C、将反义链单链DNA文库与编码链单链DNA文库进行杂交；
D、补齐杂交区与识别区的单链区域，以使限制性内切酶在识别区外下游切除完全杂交的杂交体，保留不能完全杂交或不能杂交的差异片断；
E、以不能完全杂交或不能杂交的差异片断为模板进行PCR扩增，纯化扩增产物，获得双链DNA高通量测序文库。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的RNA的反义链单链DNA文库的制备方法包括：以RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA的反义链单链DNA文库，所述RNA的两端带有不同接头，且一端接头带有限制性内切酶识别位点，所述RNA的一端还带有引物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的RNA的反义链单链DNA的序列长度为30～40bp。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：以外显子组为模板进行PCR扩增，获得外显子组的反义链单链DNA文库。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：所述外显子组的两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并利用高密度外显子组捕获试剂进行捕获基因编码链或反义链单链DNA；接着，用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的RNA的编码链单链DNA文库的构建方法包括：
A、以RNA为模板进行PCR扩增，获得RNA的反义链单链DNA文库，所述RNA的两端带有不同接头，且一端接头带有限制性内切酶识别位点，所述RNA的一端还带有引物；
B、以步骤A获得的反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得RNA的编码链单链DNA文库；
C、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的至少一端的外源接头。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的RNA的编码链单链DNA的序列长度为20～50bp。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的外显子组的反义链单链DNA文库的构建方法包括：
A、以外显子组为模板进行PCR扩增，获得外显子组的反义链单链DNA文库；
B、以步骤A获得的反义链单链DNA为模板进行不对称PCR扩增，获得外显子组的编码链单链DNA文库；
C、用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的至少一端的外源接头。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B的外显子组的编码链单链DNA文库的构建方法包括：所述外显子组的两端修复成平头并加上Y型平头连接接头，并利用高密度外显子组捕获试剂进行捕获基因编码链或反义链单链DNA；接着，用只捕获一端接头的DNA单链制剂再次捕获，以保证同一基因位点对应的单链DNA的5’端只有一种带有内切酶识别位点的接头；最后，用DNA限制性内切酶切除编码链单链DNA的一端的外源接头。
10.如权利要求1-9任一所述的制备方法，其特征在于，所述以目标样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库替换为以目标样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库；所述以参照样品构建RNA或外显子组的编码链单链DNA文库替换为以参照样品构建RNA或外显子组的反义链单链DNA文库。
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