CN114592035A - 基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用，属于基因检测技术领域。该文库构建引物组包括：接头序列、由若干种基因特异性引物组成的引物池、通用扩增引物，所述接头序列依次由配对茎结构序列、单分子标签序列、第一样本标签序列和芯片固定序列组成，所述基因特异性引物由特异性互补引物、测序引物和第二样本标签序列组成。本发明的文库构建引物组及采用该文库进行的基因检测，既具有基于多重PCR的二代测序捕获率高，覆盖率高的优点，又能利用UMI进行数据校正，特别适用于微小残留病等靶标含量低、精度要求高的检测中。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别是涉及一种基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用。
背景技术
二代测序在精准医学中发挥极为重要的应用，其中，文库制备是二代测序流程的关键步骤，目前主流的文库制备方法有两种，一种是基于多重PCR的二代测序建库技术；另一种是基于靶向探针捕获方法。
基于靶向探针捕获方法的简要流程是将DNA打断成200-300碱基小片段；进行DNA片段末端补平，并增加一个核苷酸黏性末端；然后连接样本标签接头到DNA片段；将构建好的文库进行探针杂交捕获。
基于多重PCR的二代测序建库简要流程为1)针对靶标区域或设计双端特异性引物，上游引物在下游引物的3’下游100-150bp的位置，混合为定制引物Panel；2)使用引物panel扩增获取目标区域；然后进行DNA片段末端补平，并增加一个核苷酸黏性末端；然后连接样本标签接头到DNA片段。
然而，基于靶向探针捕获方法仅适合于大panel靶向捕获测序，对于单基因或寡基因的小panel，其捕获效率低，覆盖率差，难以适应微小残留病监测(MRD)等应用。
而基于多重PCR的建库方法无法和单分子标签(Unique Molecular Identifier，UMI)联合，无法对残留噪音进行矫正或纠错。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种基于不对称扩增的文库构建引物组，具有较高捕获效率和覆盖率，可适用于微小残留病的监测等。
一种基于不对称扩增的文库构建引物组，包括：接头序列、由若干种基因特异性引物组成的引物池、通用扩增引物，所述接头序列依次由配对茎结构序列、单分子标签序列、第一样本标签序列和芯片固定序列组成，所述基因特异性引物由特异性互补引物、测序引物和第二样本标签序列组成。
上述基于不对称扩增的文库构建引物组，为不对称PCR扩增系统，以针对特定靶标区域的基因特异性引物组成的引物池和常规通用扩增引物联合扩增靶标区域，其中基因特异性引物携带有第二样本标签index2。同时，还在DNA片段两端引入带有单分子标签(Unique Molecular Identifier，UMI)的接头序列，从而在文库构建中，能够基于多重PCR的建库方法，获得带有单分子标签的文库，进而在后续生物信息学分析中对残留噪音进行矫正或纠错，由此消除PCR错误与测序错误。
在其中一个实施例中，所述配对茎结构序列为12±4bp互补配对的碱基对，所述单分子标签为12±4nt的随机碱基，所述第一样本标签序列为8±2nt的index1，所述第二样本标签序列为8±2nt的index2。
在其中一个实施例中，所述芯片固定序列为20nt的P5序列。
在其中一个实施例中，所述基因特异性引物A的浓度为0.04-0.00004μM，所述通用扩增引物B的浓度为0.05-1μM，且所述基因特异性引物的浓度总和与所述通用扩增引物的摩尔浓度比k>38，同时k>n-4，n为基因特异性引物A的种类数。本发明通过实验证实，按照上述条件进行不对称扩增，能够获得较理想的扩增效果。
在其中一个实施例中，所述浓度比k通过以下方法得到：
建立数学模型a+b＝2(aa+ab)+a’+b’，其中，a为基因特异性引物A的浓度，b为通用扩增引物B的浓度b，a’为体系中剩余基因特异性引物A的浓度，b’为体系中剩余通用扩增引物B的浓度；则a’＝a-(2aa+ab)，b’＝b-ab；
由于产生AA的概率aa，产生AB的概率为ab；在ab最大同时aa较小的情况下，以概率模型求得最优的a与b，k＝b/a；
其中根据目的区域设计的特异性引物A包括n种特异性引物，a为各特异性引物A的浓度。可以理解的，按照上述数学模型，本领域技术人员可根据具体引物投入情况及扩增要求，利用常规概率模型求解得到最优值。
在其中一个实施例中，所述特异性互补引物长度为22-26nt，GC含量为45-55％，Tm为60-70℃，且Tm-L–Tm-X≥0；其中，Tm-L为特异性互补引物的熔解温度，Tm-X为通用扩增引物的熔解温度。在不对称PCR中，限制性引物(即通用扩增引物)的浓度较低，会降低其在最优退火反应中的熔解温度，导致扩增效率减弱。为此，我们在引物设计过程中引入了(TmL–TmX)≥0指标，保证整个不对称PCR过程的整体扩增效率。
在其中一个实施例中，所述配合引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因特异性引物序列选自SEQ ID NO.2-412所示序列。
本发明还公开了一种基于不对称扩增的文库构建方法，包括以下步骤：
引物设计：获取目标扩增基因参考序列作为引物设计模板，将模板序列分割为DNA片段，设计每段DNA片段的上下游引物，使所得扩增产物片段比所述DNA片段短20-50bp；
构建引物池：合成上述设计得到的引物，并在其一端添加测序引物和第二标本标签序列；
制备接头序列：制备上述的接头序列，备用；
文库构建：取待测样本，提取核酸并加上所述接头序列，纯化去除多余接头，加入上述述的基因特异性引物和通用扩增引物，进行PCR扩增富集靶标区域，纯化产物，采用通用引物与携带测序引物和第二样本标签序列配对的引物扩增靶标文库，即得所述基于不对称扩增的文库。
在其中一个实施例中，所述引物设计步骤中，将所述引物设计模板分割为245bp长的DNA片段，并使相邻的DNA片段之间有约100bp的重叠区域；设计得到的特异性互补引物长度为22-26nt，GC含量为45-55％，Tm为60-70℃，且Tm-L–Tm-X≥0；其中，Tm-L为特异性互补引物的熔解温度，Tm-X为通用扩增引物的熔解温度。
在其中一个实施例中，所述引物设计步骤中，根据引物之间的距离调整引物，使2条相邻的特异性互补引物之间的距离不小于100bp，且不大于225bp。
本发明还公开了上述的方法构建得到的基于不对称扩增的文库。
本发明还公开了一种基于不对称扩增的基因检测系统，包括：
检测模块，将上述的文库上机检测，获得测序数据；
分析模块，利用所述单分子标签序列信息，对获得的测序数据进行矫正，即得待测样本测序结果。
在其中一个实施例中，所述待测样本为用于微小残留病监测的外周血样本。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种基于不对称扩增的文库构建引物组，为不对称PCR扩增系统，区别于传统的双端特异性引物的PCR扩增，我们设计并合成一种针对特定靶标区域的单端基因特异性引物池，并采用其与一组通用扩增引物配对扩增靶向基因区域，产生5’一端携带单分子标签且3’一端含测序引物和标签序列的目的DNA文库片段，使之可以利用单分子标签准确测定原始DNA分子数量。该引物组相对于传统的多重PCR扩增法构建文库，基于UMI算法，可以对残留噪音进行矫正或纠错，使测序数据更准确，基因变异检测的灵敏度更高。
本发明的基于不对称扩增的文库构建方法中，将原始DNA分子连接上唯一分子标记(一段唯一的DNA序列)，即UMI，后期生物信息学分析，将携带同一个UMI的read合并，由此消除PCR错误与测序错误。
因此，本发明的文库构建引物组及采用该文库进行的基因检测，既具有基于多重PCR的二代测序捕获率高，覆盖率高的优点，又能利用UMI进行数据校正，特别适用于微小残留病等靶标含量低、精度要求高的检测中。
附图说明
图1为连接了接头序列的含单分子标签接头的DNA片段示意图；
图2为第一轮目的基因富集过程中，基因特异性引物与通用扩增联合扩增携带单分子标签接头的靶标区域后生成5’端含单分子标签且3’端含read2 seq引物序列的预文库片段示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用试剂，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现。
以下结合实施例对本发明的基于不对称扩增的文库构建及检测原理进行说明：
本发明的PCR扩增系统主要包括：
1)接头序列，该接头包括4个部分：①12bp互补配对的碱基对(形成茎结构)，②12nt随机的碱基，即单分子标签(UMI)，③8nt p5样本标签index 1，④20nt的P5序列。
2)针对特定靶标区域的基因特异性引物组组成的引物池(Gene specificprimers,基因特异性)，该引物的5’端携带21nt常规read2 seq引物序列，用于添加样本标签index2。
3)通用扩增引物，也即常规引物，如在以下实施例中，可选用上游引物FP：5’AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’(SEQ ID NO.1)。
建库过程中，首先在原样本DNA片段两端引入接头序列，得到如图1所示的带有UMI的DNA片段。
随后以上述2)和3)的试剂联合扩增靶标区域，在第一轮目的基因富集过程中，基因特异性引物(即2)所示)与上游引物P5(即3)所示)联合扩增携带单分子标签接头的靶标区域，生成5’一端含单分子标签且3’一端含read2 seq引物序列的预文库片段，具体如图2所示。
在上述第一轮目的基因富集过程中，本发明通过以下2个方法限制2条相向的基因特异性引物配对扩增靶标区域，避免形成缺少单分子标签与随机起始末端的无用文库片段：
1)采用不对称PCR扩增体系。
在体系中，基因特异性引物与上游引物P5的浓度不同，基因特异性引物与上游引物P5的浓度比为k，基因特异性引物是限制性引物，上游引物P5是冗余引物，基因特异性引物由于数量较少，彼此之间配对的概率较小，因此形成有利于基因特异性引物与上游引物P5配对进行PCR扩增的环境。
但在多重PCR体系中，存在n种基因特异性引物，分别与通用引物P5形成引物对，扩增目的基因片段。因此，我们引入优化的数学模型计算出适合于多重不对称PCR体系的引物比例k。
具体而言，限制性引物太多太少，均不利于制备5’一端携带单分子标签且3’一端含read2seq引物序列的目的DNA文库片段。
对PCR体系进行分析可知，基因特异性引物a(1...n)是限制性的，FP引物b是非限制的，a1与a(n-1)之间可以利用模板生成PCR产物AA(即无效的文库)，a与b之间可以利用模板生成PCR产物AB(即有效的文库),欲使产物AB的产量最高(即限制产物AA的生成)，计算a与b之间最优的比例。
按照通常不对称PCR扩增体系而言，限制性引物浓度在0.04-0.00004μM，而冗余的上游引物浓度在0.05-1μM之间。
建立3个参数的数学模型，a+b＝2(aa+ab)+a’+b’，其中体系中剩余引物a’＝a-(2aa+ab),同理b’＝b-ab；同时产生AA的概率aa，产生AB的概率为ab；在ab最大同时aa较小的情况下，结合概率模型求得最优的a与b，k＝b/a。根据此比例，配制多重PCR反应扩增靶标区域，获得有效的5’一端携带单分子标签且3’一端含read2 SEQ引物序列的目的DNA文库片段。
在本发明的应用场景下，设有n份A引物，每份A引物的浓度为a，B引物浓度b＝ka，初始模板浓度M。
假设每份A引物可以与附近4种其他A引物配对产生预期外的AA产物；若需要PCR产物中AB产物量占比超过95％，k值需要满足什么条件；
引物初始状态为A1、A2...An引物各a，B引物ka，状态记为Z0＝[a,ka,0,0]分别表示单份A引物量、B引物量、AB产物量、AA产物量；
第1轮PCR：A1...An与B结合的组合数为
A与附近4种其他A结合的组合数为
即第1轮PCR产生AB和AA的比例为nka2:2na2＝k:2，在模板浓度M时AB产物为
AA产物为
消耗单份A引物
消耗B引物
结束后状态
因为k较大，近似
第2轮PCR：A1...An与B结合的组合数为
A与附近2种其他A结合的组合数为
即第2轮PCR产生AB和AA的比例为
因为模板相较于引物量少很多，该比例近似为k:2，在模板浓度2M时AB产物为
AA产物为
消耗单份A引物
消耗B引物
结束后状态
同理近似
...
第i轮PCR后，假设AB引物仍较充足，通过归纳得到状态：
若要求AB产物占比超过95％，即
求解得k>38；
另一方面，从第2轮PCR开始，AB产物与AA产物的比例近似为k：2，为保证该比例不低于k：2，需要保持B引物浓度与单份A引物浓度的比例不低于k，即
求解得k>n-4，同理可证第i轮PCR时该条件亦为k>n-4；
综上，当该多重PCR体系中有n种A引物，且每份A引物可以与附近4种其他A引物配对时，为保证PCR产物中AB产物量占比超过95％，需同时满足k>38和k>n-4。
本领域技术人员知晓，具体k值的选择，可根据在具体PCR体系中n的数量，按照上述要求进行调整。
2)DNA片段大小控制。
基因组DNA首先被打断成片段，如200-300碱基小片段，我们通过控制基因特异性引物配对扩增的产物长度，使之比真实的DNA片段长20-50bp，如使得到产物长度为220-350bp，导致其无法以这些扩增产物的DNA片段作为模板发生扩增。
在进一步优化PCR体系中，限制性引物的浓度是优化PCR体系的关键。在不对称PCR中，限制性引物的浓度较低，会降低其在最优退火反应中的熔解温度，导致扩增效率减弱。为此，我们在引物设计过程中引入了熔解温度的条件。
3)熔解温度控制。
优化引物设计的要求为：引物的长度为22-26nt，GC含量45-55％，Tm值60-70℃，引物Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41(G/C)％×100-650/L(引物碱基数)。
要求(Tm-L–Tm-X)≥0指标，即要求限制性引物的熔解温度Tm-L必须大于冗余上游引物P5的熔解温度Tm-X，保证整个不对称PCR过程的整体扩增效率。
实施例1
本实施例为靶向测序TSC1与TSC2基因的全外显子区域。
研究发现，TSC1与TSC2基因变异在淋巴管肌瘤病的发生率超70％，我们设计一种基于多重不对称PCR的基因特异性引物组，用于靶向TSC1与TSC2基因外显子区域测序的文库构建方法。适用于淋巴管肌瘤病患者治疗中的外周血ctDNA突变检测，目的为微小残留病监测(MRD)。
1、接头设计。
设计合成单分子标签接头序列，包括4个部分：①12bp互补配对的碱基对(作为茎结构)，②12nt随机的碱基，即单分子标签UMI，③8nt p5样本标签index 1，④20nt的P5序列。
将单分子标签接头序列交由专业的核酸合成厂家进行引物合成。
2、引物设计。
2.1设计方法
从GRCh38.p7数据库获取TSC1与TSC2基因外显子参考序列，并向内含子外延各50bp，为9651bp，作为基因特异性引物设计的模板。
已知常规的ctDNA片段长度约145bp，将每个外显子序列(含两端50bp内含子序列)分割为245bp长的片段，并使相邻的片段之间有约100bp的重叠区域。
采用常规引物设计方法(Primer3 v.0.4.0)设计每段DNA的上游引物与下游引物，优化引物设计如下：引物的长度为22-26nt，GC含量45-55％，Tm值60-70℃，引物Tm值计算公式：Tm＝69.3+0.41(G/C)％×100-650/L(引物碱基数)。要求(Tm-L–Tm-X)≥0指标，即要求限制性引物的熔解温度Tm-L必须大于冗余上游引物P5的熔解温度Tm-X。避免寡聚核苷酸序列，引物二聚体与发夹结构，产物长度：165～245bp。
设计完成后，将所有引物排列在参考基因组上，根据引物之间的距离调整引物，使之：2条相邻的基因特异性之间的距离不小于100bp，且不大于225bp。得到的特异性互补引物序列如SEQ ID NO.2-412所示，并在上述特异性互补序列的5’端添加包括index2的read2seq引物序列(如QIAseq等)，即得基因特异性引物组成的引物池。
2.2验证方法
以cfDNA为模板进行计算机模拟覆盖度测算，我们将靶向基因区域分割为150bp长度的片段，并使相邻的片段之间有约55bp的重叠区域，将之连接上前述设计方法得到的包括单分子标签(UMI)的接头序列，然后采用上述设计的基因特异性引物与通用引物进行扩增，观察扩增产物对于靶标基因区域的覆盖度与均一性。
计算机模拟的结果显示覆盖度与均一性分别分别为99.5％与99.2％。然后将引物序列交由专业的核酸合成厂家进行引物合成。
3、样本处理。
采集14例淋巴管肌瘤病患者LAM的外周血样本10ml，进行血浆分离，然后对血浆进行常规的cfDNA核酸抽提并定量。
4、文库构建。
4.1对cfDNA进行末端补平，并增加一个核苷酸黏性末端；然后连接带有单分子标签序列的接头序列到cfDNA片段；然后采用磁珠法进行核酸纯化，去剩余接头；
4.2靶标区域富集，该步骤中关键是限制基因特异性引物的绝对量a，以及基因特异性引物与通用引物之间的比例k。
按照前述模型，限制性引物(基因特异性引)浓度在0.04-0.00004μM，而冗余的上游引物(通用扩增引物)浓度在0.05-1μM之间。
而当该多重PCR体系中有n种(具体本实施例中为411种)A引物，且每份A引物可以与附近4种其他A引物配对时，为保证PCR产物中AB产物量占比超过95％，需同时满足k>38和k>n-4，也即k要＞407，因此选择本实施例中k＝408，本实施例中每种基因特异性引物的浓度为1nM，则通用扩增引物B的浓度计算为b＝ka，即为0.408μM，。
因此确认TSC1&2基因特异性引物与通用上游引物的比例k为408。基因特异性引物的浓度为1nM，通用上游引物浓度为0.408μM。
4.3 PCR扩增体系
PCR体系如下表所示。
表1.PCR扩增体系
| Reagent | 体积 |
| 上一步洗脱物(扩增模板) | 9.4μl |
| TEPCR buffer,5x | 4μl |
| Targeted DNA Panel(TSC1&2) | 5ul |
| IL-Forward primer | 0.8μl |
| HotStarTaq DNA Polymerase | 0.8μl |
| Total | 20μl |
扩增反应程序为：[95℃,13min]；(98℃,2min)；{98℃,15s；68℃,10min}x8cycles；[72℃,5min][4℃,5min][4℃,hold]。
反应完成后，然后采用磁珠法进行核酸纯化，去剩余引物。
4.4采用通用引物UP与携带index2的P7引物(与read2 seq引物序列配对)扩增靶标文库，获得完整的文库片段。然后采用磁珠法进行核酸纯化，获得最终的文库。
5、测序及分析
5.1采用illumina测序平台进行常规测序，测序数据量预计为2G，测序深度大于10000x。
5.2获得下机数据后，采用开源的基因变异分析算法进行突变分析，获得如下基因变异列表。
表2. 14例LAM患者血浆ctDNA的TSC1&2靶向测序的基因变异结果
上述结果显示，14例淋巴管肌瘤病患者LAM中检测到5个致病性ctDNA基因变异，阳性率为35.71％，均为低频突变，变异频率区间为[0.1％,1％]。
并且，LAM09患者exon15变异为已知rs118203567变异，LAM12患者exon15变异为已知rs75820036变异，LAM12患者exon14变异为已知rs7862221变异，LAM12患者exon10变异为已知rs1073123变异，LAM13患者exon9变异为已知RCV000042399变异，LAM16患者exon9变异为已知rs137854283变异，LAM17患者exon15变异为Pubmed:31525612,Lin(2019)Seizure71:322报道变异，LAM18患者exon12变异为已知rs118203504变异，LAM20患者exon38变异为已知rs137854156变异，其余为新发变异。
而根据文献检索，已发表的LAM研究没有发现ctDNA变异。上述结果显示我们的方法灵敏性优异，能够检出ctDNA变异。
实施例2
本实施例为靶向测序TSC1与TSC2基因的全外显子区域，与实施例1基本相同，区别仅在于：
本实施例中的基因特异性引物的浓度为1nM，通用上游引物浓度为0.1μM。
结果显示，该方法的覆盖率(≧100x)仅为63.58％，无法检测到基因变异。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州金域转化医学研究院有限公司
<120> 基于不对称扩增的文库构建引物组及其应用
<160> 412
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acga 44
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctcagatgtc cccattcctg tttcgtttg 29
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggccaaacca acaagcaaag attcagg 27
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
attctgttgg gactgggaac accgag 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgggatttg gcctcggtgt tcc 23
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcactctcag tatttccgcg gtgatgataa ac 32
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttctctgca tttccctcta gcctagcaaa g 31
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgtgacttgc agttaaggag accgtgg 27
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgagcatgg aatgtggcct caacaa 26
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cctacctctt caaatttctt ggtttttgcg acttc 35
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtctacgtgc ctctctctag tagctcaact 30
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccagggttc ttggagagca catcc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggcggtcgcg gatctgttgc 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ccgctccggc tgcaacagat c 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cccctgcacg atggccttca g 21
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcctgacgt cacccatccc ag 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gggacttctt ggcagccgtg tg 22
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gctgatcctg tggcttttgt ctttaggg 28
<210> 19
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccctcttctt taaggtcatc aaggattacc cttc 34
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctctgagga cccccaaacg ctc 23
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cttcacgaaa ggctggaggt tttcaagg 28
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cttcacgaaa ggctggaggt tttcaagg 28
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aaggccagag aaacctccaa cccaag 26
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gggaggtgag tgggagatgt agattcg 27
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctgcagtgga tggatgttgg cttgtc 26
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atgttggctt gtcctcggaa ttccttct 28
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgtcgaggta acagctattg aatttgacca agt 33
<210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acttaggacc attatcagaa caggatctca attctt 36
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgccgggact gagctcggtg 20
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaggcactga cctctatgtc cacagag 27
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agcctcccag aaaccagggt gaaat 25
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cctgggtgtc ctctcctgtg gg 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
cgtctccctc tccaccaggt ctc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gcctcccgct gttcatcgtt acc 23
<210> 35
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gttgatggtg cgacagaggg taacgat 27
<210> 36
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agagcagttt cagaaacccc accttcc 27
<210> 37
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ttgtcccatc catgtgctct caggaac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccagcccct gacacgcatt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
ggccacagcg ccatctacaa catg 24
<210> 40
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caccacactc acctgtcctc catgag 26
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gtgtgcttgg caagggacac tgg 23
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cctgctcaca ttccgtctct ctggg 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ccctgctgag aggagccgtg ttttt 25
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ggaactcgcc gacatctgtg ttgc 24
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gagttcctga gagaatagag ccggtgg 27
<210> 46
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cacagaaacc gccttacctg gtaaaatgat g 31
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctcccgttcc tgccagctca ct 22
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gctcaggcgt gctactctcg gt 22
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctggccgggc tcgtgttcca 20
<210> 50
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tccatcacca ggctcatcaa gaagtatagg a 31
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
caggtggtgg cgtgggacat tc 22
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ccaccacctg gagctccttc ctatactt 28
<210> 53
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ggagccgttc gatgatgttc agcagaat 28
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tgcctgtctg ggttcccggt g 21
<210> 55
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gagtggaagt cagcctgtgt catcgt 26
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gaccatcgtc catgacctgt tgacc 25
<210> 57
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tctcaggaga gatactttga actggtggag 30
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
cctgagaccc gtggaactcg ttctg 25
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caggcctctg gtccgcacat ct 22
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ccccaccagc caaagcccaa a 21
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gcccagtgtg gagaaggaga gcg 23
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
cctccctcct gaacctgatc tcctatagag 30
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tgcaggcgct gatggagaga ttcttc 26
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
catcagcgcc tgcaggttct gaatc 25
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
caaggctaca gaggaccccc tacc 24
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
tgctcatcgg gcatcctgag acc 23
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gccgtgcgca tcaaggtgct 20
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gcctggacac gcacctcata gaac 24
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cgcccacgga gaaatagccc tgag 24
<210> 70
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gcgctcattg gcctcccttg tg 22
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gattaactca gtggtcatct cgcagctctc 30
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gggtggccag ctttcggacc 20
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ggctgccaca cacaccactt ca 22
<210> 74
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ctctcacctt ctcgatgatg tccagcag 28
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cacggagctc tggcacgcta g 21
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
gactcagaac catgagcctg tgtgtaagtc 30
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cccggagctg gaagaaaggg atgt 24
<210> 78
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
ggacggctgt cttcacatcc tccaa 25
<210> 79
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
gcagaacacc cacctgaagg atgacc 26
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cagatgcagc tggtggacgc tag 23
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
ccgtggtgag ctgcgtcctc tc 22
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
gccacgcgtg tgtatgagat gct 23
<210> 83
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
tgtagctgtg cttgtagtgg agctgaatg 29
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
gccggatgct gctcgcgatt g 21
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
aggaactggc tgcgcaaccc 20
<210> 86
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
tggctctggc tttcaccatc ctcttc 26
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
ctgctgcggg ccgactcact 20
<210> 88
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gggctgaacc gcacgactcc at 22
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gcgaggtccc gcgtacatgt agt 23
<210> 90
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
ggacatccct cagacatgca aacagc 26
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ggaagagcca agtctgttcc gttcctg 27
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gacttggcct cagctgcttc tcttg 25
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gagagaggct ctgagaagaa gaccagc 27
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
ccccctttct cctcccacag gg 22
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
gggtccgtgc cctactccct 20
<210> 96
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
ggacgcggaa gagcagggag ta 22
<210> 97
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cctgtcctcc tggcccaacg tg 22
<210> 98
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
cgcctctgtc tctagggtcc agaag 25
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tcctcgcagg agtctgactg gaag 24
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gctgcctgag tccctgcgct ata 23
<210> 101
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
gggaagtaaa gatgagcact ttatagcgca gg 32
<210> 102
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
ccaggccggc catggtacca t 21
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
ccagaggctc gcagtctttt ggg 23
<210> 104
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
gggagaggtt tcatgcctgg atttggt 27
<210> 105
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
cccagaaggc ttctccagaa ctgactt 27
<210> 106
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gacagcatta atctcttacc ataactacct ggacaa 36
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
gctgtcagca ctggaaccac g 21
<210> 108
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
gtcctgctct gacctcctac ctgtttg 27
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
ggccccatca agctcgcctg 20
<210> 110
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
cccggtggag cactcgaggt tg 22
<210> 111
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
ggcctgaggt gtcctgtctc ct 22
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
ccagtgcgtc gtggccttgt c 21
<210> 113
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
catctccacg ctgcagatgg acaag 25
<210> 114
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
cctgacatca tcatcaaggc gctgc 25
<210> 115
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gtgaagctca cgcacatctc agcc 24
<210> 116
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
cgtgagcttc accaccagaa cagg 24
<210> 117
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
gggactcact ggacaggaac tcca 24
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
cgcacaggtt acacagcccg aac 23
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
ccttcagagg cgctgcacgg 20
<210> 120
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
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<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
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<210> 125
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
cggcacctga tgaaccacat ggctat 26
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctccttcc tcacccgata gtctga 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
gctgcagagc tctccttgaa ttctttcac 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccgcagcat cagtgtgtct g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctacctgcgg accacatgtt cagaca 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
ctccagcagg atacagacgt ccct 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
gggtctgcag atgagaactc cgtgg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
ccaggtggag gtttttcagg ctatcgt 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
ctcacggaaa cctgtctgga catgatg 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
cagagaggag ccacattgcc gtc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
cagcagcccc gtctgtgtcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
ccagccagga ggagaagtcg ctc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
cagcaggatt ggcttgtttg actcgtc 27
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
ccacgcctac ctcattgggc ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
agccctctgc aagcctgagc tc 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
cctcctgtgg acgggcgtct 20
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
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<210> 207
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
cgggagtgat gccaccctgc 20
<210> 210
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
cgagctcgcc atcctgtcca at 22
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
gcctgggccg gctcatcgag 20
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
gcccgtcagg aactccgtgt acc 23
<210> 213
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
tgccagccgg acaaggtgta cc 22
<210> 214
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
ggctggcagt ccttcagctc gat 23
<210> 215
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
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<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
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<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
gggtagcagg actggatggg agc 23
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
ggccccacaa acccatccgg 20
<210> 219
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 219
gccgtcttcc acatcgccac c 21
<210> 220
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 220
ctgggcaacg actttgtgtc cattgt 26
<210> 221
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 221
caggtggcgc ttcttgtcgc a 21
<210> 222
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 222
gaagtcctca ccggagtcat tgtagacaat 30
<210> 223
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
cctcactgac ggcccctcac tc 22
<210> 224
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 224
ccaccaaccc gggacacagc 20
<210> 225
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 225
tgtctagcag tgcaaccagg cagtag 26
<210> 226
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 226
accctttctc ttgtccgggc agg 23
<210> 227
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 227
ggccagttca actttgtcca cgtgatc 27
<210> 228
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 228
gggacaccag gttgcactcg tagt 24
<210> 229
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 229
ccggccctac ctttcctgca ct 22
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 230
tgcagtgtgg cgccaagagc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 231
ccagcgtggc caagatcgtg tct 23
<210> 232
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 232
gcaggttgcg gtcagacacg atct 24
<210> 233
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 233
cccccactca catttgcgtg cag 23
<210> 234
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 234
gggtgagctc actatcaggt ggca 24
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 235
ccagatggcc tcacaggtgc atcata 26
<210> 236
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 236
ccccaccgat atctacccct ccaagt 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 237
cggagccggg caatccactt g 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 238
gccccatatt ccctacccgc tgg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 239
taagtctggg aggcgtggca acc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 240
tctgccttca gatctgcgag gaag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 241
cctctggtgc accctccgtc c 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 242
gggctttgct atgggacgga ggg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 243
gagcccacac ctggctatga ggt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gccccggcct cacacaaact 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 246
gtcaggactt tatttatttc actgacaggc aatacc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 247
gccaacaata tgcaagttaa cactgattga ccat 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgaccccgga cagtgttgga cag 23
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cgggtgaggg ccatctaggt tcag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtggaagcca agattcccct gaacctag 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctttaggct ctcagaaagg ctactggtca t 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 253
ctgagagcct aaagacagaa ctgggcaaa 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 254
cgctcttatt acgaaataac tctcgagcct tcatac 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 255
ttatttcgta ataagagcga gagccagtgt gatgag 36
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 256
caggaagctt tttgaactgg gaagtgagc 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 257
agttcaaaaa gcttcctggg tatgaaggct 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 258
gcagacgctt ctcccatagt cgtctc 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 259
gccagcatcc ccaccactgt g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctcccaccg actgctgaat ggg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cccagagaaa cccccacacc agag 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 262
cctccaccac ctctgcttcc actac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 263
ggtcttggtc tcaccgttgt ggc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 264
atggtagggc acaatgaaga ggcatctg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 265
ccccggcttt cttacaggct tgact 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 266
gtgtcagtgt aattccacat cctccgaatg t 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 267
cagcttagtc ccaaggtcat gaatcagttc tt 32
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 268
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 269
acctgccata taaatctaag atctccaatt caaacacc 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 270
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 271
gaggctcaga aaaggataac ccaggtgtt 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 272
ggcctgcagc tgtcctctga aagatac 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 273
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 274
tttcctgatg aaagttacct tgcctgga 28
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 275
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 276
ggtctttctt ggccaggtga gattccag 28
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<211> 28
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 277
ctggccaaga aagaccacct tcttttgg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtatcaagc ctctgagtct gctggag 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 279
agaggcttga tacctcccaa aaacggattt 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 280
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 281
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 282
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 283
tgggtctgaa acgctttccc cactaag 27
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 284
gagtgcttgt tctgcagttg ttccaaatag ag 32
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 285
cagctgcctg ttcaagaact ccatct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 286
aacaggcagc tgttggttct tggg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 287
caaacagtga gtcggtccag cagc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 288
tctatgtgct agttttatgt cgtcggattt ttcact 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 289
ctgtctgaag gaagaatgtt agcaaatggt gtt 33
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 290
gtctgcctca tttcttctta ccttttggga aac 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 291
ctgctgctca gtcaggtttc ccaaaa 26
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 292
accttgttgt tggccttctt cagttctatc c 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 293
ggactgcagg aacatgattg cggag 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 294
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<210> 295
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 295
ccggcattct cgcagttggc tttg 24
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 296
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 297
cggtcatgct gcagctgtct gatct 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 298
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 299
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 300
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 301
catttctggt ctctgctaga aagatcagtt gaagt 35
<210> 302
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 302
tgcctgtgtt ggaagacagc taaaatgatg a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 303
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 304
cagtcctcac catggcagca ttatgttc 28
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 305
gctgctgctt tgatcacctt gcg 23
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 306
gctgctgcct cttaaaacgc tcatagagta a 31
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 307
gcagcatgcc ctccggaaca g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 308
cagttgcttt tactgcacaa ccagttactc tatg 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 309
atcaggctct cctccttcag atgagatcc 29
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 310
gggcttgatt gaaccatctg taaaaggcat t 31
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 311
atgtgggctg gatttggagc taaagtaaca a 31
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 312
tcggtaactt tgttactcaa aaactttctt cctagg 36
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 313
gatctaactt tgctgcaaat aaaagtccag atacgt 36
<210> 314
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 314
caataaaatg gaccatttaa cacagaagag agtgcc 36
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 315
gcgtctgctc cctgctgtat cagtc 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 316
cccaatggaa gtgctggaca gactgatac 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 317
tcagtcttcc tgatgacaaa atgatgggct 30
<210> 318
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 318
aggaagactg aggagctgtt aaagaaagc 29
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 319
gcaatgccac ctcaaaaaga tgatcatacg 30
<210> 320
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 320
gggcagcctc ccccgtatga tc 22
<210> 321
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 321
cttccaaagc ccactctcgt cgg 23
<210> 322
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 322
gtccttgtaa aattccacct ccgacgagag 30
<210> 323
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 323
aagtctggca ttccctgtct cccg 24
<210> 324
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 324
gaatgccaga cttctttgga gaccagtatc tt 32
<210> 325
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 325
gcggcagtgc tgatgaaagc cc 22
<210> 326
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 326
agggcaggtc tatgggagta aaggct 26
<210> 327
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 327
tgtcaggccc aagcttgtcc agg 23
<210> 328
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 328
cctgacacac caaagcaagc ctttactc 28
<210> 329
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 329
acgctggcgc cctgagaact 20
<210> 330
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 330
agcgtgaacc ctgagccttt acactc 26
<210> 331
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 331
gggagactgt ctcggtaaaa gggagagt 28
<210> 332
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 332
gtctcccagg ttctcagcgg aagac 25
<210> 333
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 333
ctcgaggagg ctttgactct cccttt 26
<210> 334
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 334
ctctgctgtg gtgatctcag aaagttctct ag 32
<210> 335
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 335
ctctcttcct ctcagctgca atatctagag aactt 35
<210> 336
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 336
aaactgccta gtctttccca ggtggaatac 30
<210> 337
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 337
ggtcaggttt tatcaactca tagcaatccc acata 35
<210> 338
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 338
ctatcttctt cagaggccag atcacctaaa aacc 34
<210> 339
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 339
ctggcagcaa aggttctgtc actctaagt 29
<210> 340
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 340
cagggattac actgtatttc tttgacttca gttgtc 36
<210> 341
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 341
caagcaaggc ctgtagtaac gcagaaa 27
<210> 342
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 342
gcctgtagta acgcagaaat tttacctgat cctc 34
<210> 343
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 343
tatcttttca ggaagagaga atggattctg caagac 36
<210> 344
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 344
cgagaacatg tgcaacattt ttcgtcttgt gata 34
<210> 345
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 345
gagagcagct tgttagtcca ttttcaatta ttctga 36
<210> 346
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 346
tcaaacccat tgcattttag gtcagaattc tatctg 36
<210> 347
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 347
cttctcaaag tgaggcttgc aagtgagtc 29
<210> 348
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 348
cccaggcaca gtgactcact tgc 23
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 349
gagggatagc agacgagctg gatcg 25
<210> 350
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 350
cccccaggaa ggtgcgatcc a 21
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 351
agtgaaatgt gcacgtagtc atccgaatga 30
<210> 352
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 352
ccagccccac tctgtcattc ggatg 25
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 353
ctgcccttgt ctctaagcag gtggaaa 27
<210> 354
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 354
gggctcagtg ttcatatatg ttctgccctt g 31
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<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 355
gccaaaacca actaatcaaa tccaacctaa gaca 34
<210> 356
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 356
gttgtaccaa agactttact gtaagggtgt gaca 34
<210> 357
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 357
caggagaagt tggaggagtg gtcatacc 28
<210> 358
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 358
ctcctccaac ttctcctgga aatgtccc 28
<210> 359
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 359
ggctactctt tggagcccat ctatggttt 29
<210> 360
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 360
gcattccttt gccactgctg atgtacttta ttaac 35
<210> 361
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 361
cttaaaagtg actcctgaaa tgagcagtgt gaaat 35
<210> 362
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 362
tttcccaacc acatactaaa tctgacccaa agg 33
<210> 363
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 363
caggcacact agttgacacc atacttgtg 29
<210> 364
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 364
ggttcagtta tcagccgtgt cgatggg 27
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<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 365
cggctgataa ctgaaccacc acaagtatgg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 366
ccagggcagc tacctcagac tct 23
<210> 367
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 367
atatttaaca acatcagccg agacgtggag taag 34
<210> 368
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 368
cattttaggg tgtgctactt ctacccctta ctc 33
<210> 369
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 369
ctaaaaccac acactaaccc cctgtgttct 30
<210> 370
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 370
ccagagacaa agttgcaaaa cagataagta ccaaag 36
<210> 371
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 371
ctttttacca tagctattct gtgtgtcagc ataagg 36
<210> 372
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 372
cgggctgaga tttggtgaga cacagaat 28
<210> 373
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 373
cagcccgctt tcctcatcgt tcag 24
<210> 374
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 374
ccacagaagc ctcatatgaa gatggctatt ct 32
<210> 375
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 375
gagattttgg cacactcgat cacaacatca tg 32
<210> 376
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 376
ttacaggtgg aagagattag aaactcatga tgttgt 36
<210> 377
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 377
agttgattac agtttgcatt tcttgacttt cattgc 36
<210> 378
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 378
acctcctaga tcacattttc aatctctcga aagat 35
<210> 379
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 379
gacactagtt tctatacctt cgagggtcca gtt 33
<210> 380
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 380
attcatccgg aattagtgac tggatccaag g 31
<210> 381
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 381
caaacattca gccctttata atttgtcaac ccaact 36
<210> 382
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 382
tgcagcctat ctaaacagta tactaagtag caaaca 36
<210> 383
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 383
cttgaccact tcttcaaaag tctccaggtt ttc 33
<210> 384
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 384
tcatactgta atgagaacgc aaaaaggaga cgaag 35
<210> 385
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 385
cattccataa aggcgatgaa agagtgcgta c 31
<210> 386
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 386
cgcctttatg gaatgtaccc ttgcaactt 29
<210> 387
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 387
cgtggcggaa gtctatctcg tccat 25
<210> 388
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 388
caatctgtct ccaactaaga ggctcttctc aac 33
<210> 389
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 389
acagggccca acaggtatat gaggagat 28
<210> 390
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 390
cggccaaaaa tgtcaaagaa atcaagaaga tgct 34
<210> 391
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 391
gatttctttg acatttttgg ccgtctgtca tcat 34
<210> 392
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 392
cagactgtgg aatcattggt agcatggtta 30
<210> 393
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 393
ggcgtcttgg tgttgataac catgct 26
<210> 394
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 394
cctgacagac gtttcctgtt tgacctttt 29
<210> 395
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 395
gaaactatac tcataaaacc atttcattca aatccttaca aaca 44
<210> 396
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 396
acatcctacc ttgagacatt ttagtaaaga aggcaa 36
<210> 397
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 397
gatggctgca gtcttatgac atgaccca 28
<210> 398
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 398
gcagccatct tggaagcata agctctc 27
<210> 399
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 399
tcgtttatcc atcctctcgt tactgggtca t 31
<210> 400
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 400
cttttacatt ttcagcacct cttggacagg attaac 36
<210> 401
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 401
atttgtgtta acttcataca ttcatgtgag gactgc 36
<210> 402
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 402
gctgttgtac tcatgaagaa catatgaaat gcctatg 37
<210> 403
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 403
ctcttgcaag gtggtcagga tgtgc 25
<210> 404
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 404
cctatgcttg taaacacctt ggtggattat tacct 35
<210> 405
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 405
agtatcatcc attgcccttt tcttgattta gaccg 35
<210> 406
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 406
caggaagctg tgtaaggtaa atttaggatg ttaagg 36
<210> 407
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 407
gcaggattct agtggctcta aagtcaatct cttct 35
<210> 408
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 408
gaagataagc taaaaaggat attattttgc taaccagaat tgag 44
<210> 409
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 409
gacagctgtc acgtcgtccc g 21
<210> 410
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 410
gggagcttct tgccatgctg gact 24
<210> 411
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 411
gcgccttcga gcgagagaat gg 22
<210> 412
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 412
cagtttggta gtggccccaa tgaagaac 28
Claims (13)
1.一种基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，包括：接头序列、由若干种基因特异性引物组成的引物池、通用扩增引物，所述接头序列依次由配对茎结构序列、单分子标签序列、第一样本标签序列和芯片固定序列组成，所述基因特异性引物由特异性互补引物、测序引物和第二样本标签序列组成。
2.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述配对茎结构序列为12±4bp互补配对的碱基对，所述单分子标签为12±4nt的随机碱基，所述第一样本标签序列为8±2nt的index1，所述第二样本标签序列为8±2nt的index2。
3.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述芯片固定序列为20nt的P5序列。
4.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述基因特异性引物A的浓度为0.04-0.00004μM，所述通用扩增引物B的浓度为0.05-1μM，且所述基因特异性引物的浓度总和与所述通用扩增引物的摩尔浓度比k>38，同时k>n-4，n为基因特异性引物A的种类数。
5.根据权利要求1-3任一项所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述浓度比k通过以下方法得到：
建立数学模型a+b＝2(aa+ab)+a’+b’，其中，a为基因特异性引物A的浓度，b为通用扩增引物B的浓度b，a’为体系中剩余基因特异性引物A的浓度，b’为体系中剩余通用扩增引物B的浓度；则a’＝a-(2aa+ab)，b’＝b-ab；
由于产生AA的概率aa，产生AB的概率为ab；在ab最大同时aa较小的情况下，以概率模型求得最优的a与b，k＝b/a；
其中根据目的区域设计的特异性引物A包括n种特异性引物，a为各特异性引物A的浓度。
6.根据权利要求1-3任一项所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述特异性互补引物长度为22-26nt，GC含量为45-55％，Tm为60-70℃，且Tm-L–Tm-X≥0；其中，Tm-L为特异性互补引物的熔解温度，Tm-X为通用扩增引物的熔解温度。
7.根据权利要求1所述的基于不对称扩增的文库构建引物组，其特征在于，所述配合引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述特异性互补引物选自SEQ ID NO.2-412所示序列。
8.一种基于不对称扩增的文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
引物设计：获取目标扩增基因参考序列作为引物设计模板，将模板序列分割为DNA片段，设计每段DNA片段的上下游引物，使所得扩增产物片段比所述DNA片段短20-50bp；
构建引物池：合成上述设计得到的引物，并在其一端添加测序引物和第二标本标签序列；
制备接头序列：制备权利要求1-7任一项所述的接头序列，备用；
文库构建：取待测样本，提取核酸并加上所述接头序列，纯化去除多余接头，加入权利要求1-7任一项所述的基因特异性引物和通用扩增引物，进行PCR扩增富集靶标区域，纯化产物，采用通用引物与携带测序引物和第二样本标签序列配对的引物扩增靶标文库，即得所述基于不对称扩增的文库。
9.根据权利要求8所述的文库构建方法，其特征在于，所述引物设计步骤中，将所述引物设计模板分割为245bp长的DNA片段，并使相邻的DNA片段之间有约100bp的重叠区域；设计得到的特异性互补引物长度为22-26nt，GC含量为45-55％，Tm为60-70℃，且Tm-L–Tm-X≥0；其中，Tm-L为特异性互补引物的熔解温度，Tm-X为通用扩增引物的熔解温度。
10.根据权利要求9所述的文库构建方法，其特征在于，所述引物设计步骤中，根据引物之间的距离调整引物，使2条相邻的特异性互补引物之间的距离不小于100bp，且不大于225bp。
11.权利要求8-9任一项所述的方法构建得到的基于不对称扩增的文库。
12.一种基于不对称扩增的基因检测系统，其特征在于，包括：
检测模块，将权利要求11所述的文库上机检测，获得测序数据；
分析模块，利用所述单分子标签序列信息，对获得的测序数据进行矫正，即得待测样本测序结果。
13.根据权利要求12所述的基于不对称扩增的基因检测系统，其特征在于，所述待测样本为用于微小残留病监测的外周血样本。
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