KR20150130313A

KR20150130313A - 저산소증 유도 인자-1α를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법

Info

Publication number: KR20150130313A
Application number: KR1020157025544A
Authority: KR
Inventors: 데이비드 웨이너; 카루피아 무투마니; 에밀 몰러; 제프리 오우마
Original assignee: 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2015-11-23
Also published as: CN105050616A; CA2898122A1; AU2014228838B2; WO2014144731A2; JP2016516057A; AU2014228838A1; JP2019031511A; US20160031956A1; EP2968448A4; US20190055294A1; EP2968448A2; WO2014144731A3; US10155795B2

Abstract

항원 및 HIF-1a를 포함하는 백신이 본원에 개시된다. 대상체에서 면역 반응을 증가시키기 위한 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법은 백신을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

저산소증 유도 인자-1α를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법{COMPOSITIONS COMPRISING HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR-1 ALPHA AND METHODS OF USING THE SAME}

관련 출원의 교차 참조

본원은 모두가 본원에 참조로 인용된, 2013년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허출원 제61/800,703호에 대한 우선권을 주장한다.

정부 이익에 관한 진술

본 발명은 국립 위생 연구소에 의해 수여된 계약 번호 K12 HL083772-01하에 정부의 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 일정한 권리를 갖는다.

기술 분야

본 발명은 저산소증 유도 인자-1α(HIF-1α)를 포함하는 조성물 및 저산소증 또는 허혈의 치료 방법에 관한 것이다.

포유동물에서, 성인 항상성의 배아 개발 및 유지는 포유동물의 조직 및 세포에 산소(O₂) 및 기타 영양소를 공급하는 기능적인 혈관계의 확립에 의존한다. 이러한 조직 및 세포로의 국소 산소 전달은 기존 혈관의 긴장도의 일시적인 변화를 통한 순환계, 새로운 혈관의 확립(혈관신생) 및 증가된 혈류를 수용하는 기존 혈관의 리모델링(동맥혈관 확장)에 의해 조절된다. 생리학적 및 병리학적 조건하에 조직 관류는 저산소증 유도 인자-1(HIF-1)에 의해 조절된다.

HIF-1은 산소 조절 α 아단위(HIF-1α) 및 구성적으로 발현된 β 아단위(HIF-1β)로 구성된 이종이량체 전사 인자이다. HIF-1은 혈관 긴장도, 혈관신생 및/또는 동맥혈관 확대에 대한 효과를 통해 혈관 항상성에 관련되는 유전자의 전사를 지시함으로써 후생동물 유기체의 유핵 세포에서 저산소증 및 허혈에 대한 적응성 반응을 조정한다. 중증 하지 허혈(CLI)과 같은 병리학적 상태에서, HIF-1을 억제하여 감소된 조직 관류, 휴식시 허혈성 통증의 발현, 궤양 및/또는 괴저, 및 결국 사지 절단을 유도할 수 있다.

따라서, 영향 받은 조직의 조직 관류를 증가시키고, 허혈 및 저산소증에 대한 정상적인 생리학적 반응을 회복함을 포함하여, 허헐 및/또는 저산소증과 관련되는 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법의 인지 및 개발의 필요성이 존재한다.

본 발명은 저산소증 유도 인자-1α(HIF-1α)를 포함하는 치료제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 저산소증 또는 허혈을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

도 1은 저산소증 유도 인자-1α(HIF-1α) 단백질의 기능을 예시하는 개략도를 나타낸다.
도 2는 실험적 연구 설계의 요약을 예시하는 개략도를 나타낸다. EP, 전기천공; HIF-1α, 저산소증 유도 인자 1 α; IM, 근육내 주사; LDPI, 레이저 도플러 관류 영상화 장치; pVAX, 빈 골격 플라스미드 DNA.
도 3은 (a) 레이저 도플러 관류 영상화 장치를 이용하여 기록된 대표적인 영상; (b) 대퇴 동맥 결찰 후 일수 대(vs.) 사지 관류 비율(결찰된/비결찰된)를 도시하는 그래프; (c) 대퇴 동맥 결찰 후 일수 대 사지 움직임 스코어를 도시하는 그래프; 및 (d) 치료 그룹 대 3 미만의 사지 괴사 스코어 %를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 4는 (A) HIF-1α를 인코딩하는 DNA 및 전기천공(EP)의 조합으로 처리된 마우스; (B) HIF-1α를 인코딩하는 DNA의 근육내(IM) 주사로 처리된 마우스; (C) pVAX1 DNA (빈 벡터 대조군) 및 EP의 조합으로 처리된 마우스; 및 (D) 위장 처리된 사지에서 뒷다리 회복 수술후의 전체 묘사도를 나타낸다. 도 4A 내지 4D 각각에서, 화살표는 영향 받은 사지를 나타낸다.
도 5는 (a) 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색된 내전근 조직 부분의 대표적인 현미경 사진(원 배율, x200); (b) 치료 그룹 대 조직 괴사(면적%)를 도시하는 그래프; (c) CD31 + 모세혈관을 위해 염색시킨 내전근 조직의 대표적인 현미경 사진(원 배율, x200); 및 (d) 치료 그룹 대 모세혈관 밀도(CD31+ 세포/HPF)를 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 6은 (a) 치료 그룹 대 총 동맥 수(SMA+ 혈관/HPF); 및 (b) 치료 그룹 대 혈관 면적(㎛²)을 도시하는 그래프를 나타낸다.
도 7은 (a) 마우스 HIF-1α를 인코딩하는 핵산 서열(여기서, 밑줄은 출발 코돈 및 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드를 나타내고, 이중 밑줄 및 볼드체는 프롤린 대신 알라닌을 인코딩하는 코돈을 나타낸다); 및 (b) 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열(여기서, 밑줄은 HIF-1α 아미노산 서열에 연결된 IgE 리더 서열 및 개시제 메티오닌을 나타내고, 이중 밑줄 및 볼드체는 HIF-1α의 아미노산 서열 중의 야생형 프롤린 잔기를 치환한 알라닌 잔기를 나타낸다)을 나타낸다.
도 8은 (a) 마우스 HIF-1α를 인코딩하는 핵산 서열(여기서, 5' 말단에서 밑줄은 클로닝 목적을 위한 BamHI 제한 부위(즉, GGA TCC) 및 코작(Kozak) 서열(즉, GCC ACC)을 나타내고, 3' 말단에서 밑줄은 정지 코돈(즉, TGA TAA) 및 클로닝 목적을 위한 XhoI 제한 부위(즉, CTC GAG)를 나타내고, 이중 밑줄 및 볼드체는 프롤린 대신 알라닌을 인코딩하는 코돈을 나타낸다); 및 (b) 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열(여기서, 이중 밑줄 및 볼드체는 HIF-1α의 아미노산 서열 중의 야생형 프롤린 잔기를 치환한 알라닌 잔기를 나타낸다)을 나타낸다.
도 9는 (a) 인간 HIF-1α를 인코딩하는 핵산 서열(여기서, 이중 밑줄 및 볼드체는 프롤린 대신 알라닌을 인코딩하는 코돈을 나타낸다); 및 (b) 인간 HIF-1α의 아미노산 서열(여기서, 이중 밑줄 및 볼드체는 HIF-1α의 아미노산 서열 중의 야생형 프롤린 잔기를 치환한 알라닌 잔기를 나타낸다)을 나타낸다.

상세한 설명

본 발명은 저산소증 또는 허혈을 치료하기 위한 치료제에 관한 것이다. 치료제는 저산소증 유도 인자-1α(HIF-1α)를 포함할 수 있다. 치료제는 혈관신생을 촉진시키거나 유도할 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 모세혈관 밀도, 측부 혈관 형성, 혈관 크기 또는 이의 조합을 증가시킬 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 조직 관류를 증가시킬 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 조직 괴사를 감소시킬 수 있다.

따라서, 치료제는 저산소증 또는 허혈의 치료 방법에 사용할 수 있다. 저산소증 또는 허혈은 중증 하지 허혈과 관련될 수 있다.

1. 정의

다르게 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 모순되는 경우, 정의를 포함하는 본 문서를 우선시 한다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명을 실시 또는 시험하는데 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이하 기술된다. 본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 이의 전문이 참고로 인용된다. 본원에 개시되어 있는 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적이고, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "포함한다", "포함한다", "갖는", "갖는다", "할 수 있다", "함유한다" 및 이의 변형은 추가적인 행위 또는 구조의 가능성을 배제하지 않는 개방형 전이 어구, 용어 또는 단어인 것으로 의도된다. 단수 형태("a", "and" 및 "the")는 문맥상 명백하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 참조물을 포함한다. 본 명세서는 또한 명시적으로 기재하든 하지 않든, 본원에 제시된 구현예 또는 요소를 "포함하는", "이로 구성된" 및 "본질적으로 이로 구성된" 다른 구현예를 또한 고려한다.

본원에 사용된 "코딩 서열" 또는 "인코딩 핵산"은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산(RNA 또는 DNA 분자)을 의미한다. 코딩 서열은 핵산이 투여되는 개체 또는 포유동물의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종결 신호를 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "상보체" 또는 "상보적인"은 핵산 분자의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 동족체 사이의 왓슨-크릭(Watson-Crick)(예: A-T/U 및 C-G) 또는 후그스틴(Hoogsteen) 염기쌍 형성을 의미한다.

본원에 상호교환적으로 사용된 "전기천공", "전기-투과화" 또는 "전기-역학 증강"("EP")은 생체막에서 미시적 경로(세공)를 유도하기 위한 막 관통 전기장 펄스의 사용을 의미하고; 이들의 존재는 생체 분자, 예를 들면, 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약물, 이온 및 물이 세포막의 한 측면으로부터 다른 측면으로 통과하도록 한다.

본원에 사용된 "단편"은, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 혈관 긴장도, 혈관신생 및/또는 동맥혈관 확장에 대한 효과를 통해 포유동물에서 혈관 항상성의 변화를 변경하거나 이에 영향을 미칠 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열 또는 이의 일부를 의미한다. 단편은 이하 기재된 단백질 단편을 인코딩하는 각종 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. 단편은 이하 기재된 단백질 단편을 인코딩하는 각종 뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 DNA 단편일 수 있다. 단편은 이하 기재된 하나 이상의 핵산 서열의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 이하 기재된 핵산 서열 중 적어도 하나의 적어도 20개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 30개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 40개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 50개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 60개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 70개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 80개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 90개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 100개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 150개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 200개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 250개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 300개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 350개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 400개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 450개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 500개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 550개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 600개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 650개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 700개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 750개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 800개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 850개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 900개 뉴클레오티드 또는 그 이상, 적어도 950개 뉴클레오티드 또는 그 이상 또는 적어도 1000개 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

폴리펩티드 서열과 관련하여, "단편"은, 예를 들면, 이에 한정되지 않지만, 혈관 긴장도, 혈관신생 및/또는 동맥혈관 확장에 대한 효과를 통해 포유동물에서 혈관 항상성의 변화를 변경하거나 이에 영향을 미칠 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 이하 기재된 각종 아미노산 서열 중 적어도 하나로부터 선택된 폴리펩티드 단편일 수 있다. 단편은 이하 기재된 하나 이상의 단백질의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 이하 기재된 단백질 중 적어도 하나의 적어도 20개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 30개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 40개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 50개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 60개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 70개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 80개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 90개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 100개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 110개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 120개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 130개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 140개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 150개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 160개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 170개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 180개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 190개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 200개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 210개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 220개 아미노산 또는 그 이상, 적어도 230개 아미노산 또는 그 이상 또는 적어도 240개 아미노산 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "유전적 작제물" 또는 "작제물"은 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 상기 코딩 서열은 핵산 분자가 투여될 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동가능하게 연결된 개시 및 종료 신호를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "발현 가능한 형태"는 개체의 세포에 존재하는 경우, 코딩 서열이 발현되도록 단백질을 인코딩하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 작제물 또는 작제물을 나타낸다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "저산소증"은 주변 산소 (O₂) 농도의 감소를 의미한다.

둘 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 본원에서 사용되는 "상동한" 또는 "상동성"은 서열이 명시된 영역에 걸쳐 상동한 명시된 잔기의 백분율을 가짐을 의미할 수 있다. 상기 백분율은 두 서열을 최적으로 정렬하고, 지정된 영역에 대해 두 서열을 비교하고, 두 서열에서 상동한 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치된 위치의 수를 산출하고, 상기 일치된 위치의 수를 명시된 영역 내의 위치의 총 수로 나누고, 상기 결과에 100을 곱하여 서열 상동성의 백분율을 산출함으로써 계산될 수 있다. 두 서열이 상이한 길이이거나 상기 정렬이 하나 이상의 어긋난(staggered) 말단을 생성하고, 비교된 상기 명시된 영역이 단일 서열만을 포함하는 경우, 단일 서열의 상기 잔기들은 상기 계산의 분모에 포함되지만 분자에 포함되지 않는다. DNA 및 RNA를 비교할 때, 티민 (T) 및 우라실 (U)은 동등한 것으로 간주될 수 있다. 상동성은 수동으로 또는 BLAST 또는 BLAST 2.0과 같은 컴퓨터 서열 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다.

본원에서 사용되는 "허혈"은 조직 관류가 감소하여 산소 (O₂) 이용가능성이 조직 대사 요구조건을 만족하기에 불충분한 상태를 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이“핵산” 또는 “올리고뉴클레오티드” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 함께 공유결합된 적어도 2개의 뉴클레오티드를 의미할 수 있다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적 가닥을 포괄한다. 핵산의 많은 변이체들이 주어진 핵산과 상동한 목적을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 상동한 핵산 및 이의 보체를 포괄한다. 단일 가닥은 엄격한 혼성화 조건 하에서 표적 서열에 혼성화할 수 있는 프로브를 제공한다. 따라서, 핵산은 또한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 프로브를 포괄한다.

핵산은 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있거나, 이중가닥 및 단일가닥 서열 둘다의 부분을 함유할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 둘다, RNA, 또는 하이브리드일 수 있으며, 여기서 핵산은 데옥시리보- 및 리보-뉴클레오티드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 잔틴 하이포잔틴, 이소시토신 및 이소구아닌을 포함하는 염기들의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 화학적 합성 방법에 의해 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다.

본원에서 사용되는 "작동 가능하게 연결된"은 유전자의 발현이 이것이 공간적으로 연결된 프로모터의 제어 하에 있음을 의미할 수 있다. 프로모터는 그의 제어 하에서 유전자의 5'(상류) 또는 3'(하류)에 배치될 수 있다. 프로모터와 유전자 간의 거리는 프로모터가 유도된 유전자 내에서 그것이 제어하는 프로모터와 유전자 간의 거리와 대략 상동할 수 있다. 당분야에 알려진 바와 같이, 상기 거리의 변동은 프로모터 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

본원에서 사용되는 "펩티드", "단백질", 또는 "폴리펩티드"는 아미노산의 연결된 서열을 의미할 수 있고, 천연, 합성, 또는 천연 및 합성의 개질 또는 조합일 수 있다.

본원에서 사용되는 "프로모터"는 세포 내 핵산의 발현을 부여하거나, 활성화하거나, 개선할 수 있는 합성 또는 천연-유래 분자를 의미할 수 있다. 프로모터는 발현을 더 개선하고/하거나 상동한 것의 공간적 발현 및/또는 일시적 발현을 변경하는 하나 이상의 특이적 전사 조절 서열을 포함할 수 있다. 프로모터는 또한 말단(distal) 인핸서 또는 억제자 요소를 포함할 수 있고, 이는 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 정도에 위치할 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 진균, 식물, 곤충, 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래될 수 있다. 프로모터는 발현이 일어나는 세포, 조직 또는 기관에 대해, 발현이 일어나는 발달 단계에 대해, 또는 외부 자극, 예컨대 생리적 스트레스, 병원체, 금속 이온 또는 유도제에 반응하여 구성적으로 또는 별도로 유전자 성분의 발현을 조절할 수 있다. 프로모터의 대표예에는 박테리오파지 T7 프로모터, 박테리오파지 T3 프로모터, SP6 프로모터, lac 작동유전자-프로모터, tac 프로모터, SV40 후기 프로모터, SV40 초기 프로모터, RSV-LTR 프로모터, CMV IE 프로모터, SV40 초기 프로모터 또는 SV 40 후기 프로모터 및 CMV IE 프로모터가 포함된다.

"신호 펩티드" 및 "리더 서열"은 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 본원에 나타낸 단백질 또는 아미노산의 아미노 말단에 연결될 수 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 신호 펩티드/리더 서열은 전형적으로 단백질의 국지화를 지시한다. 본원에서 이용된 신호 펩티드/리더 서열은 바람직하게는 이것이 생산되는 세포로부터 단백질의 분비를 촉진한다. 신호 펩티드/리더 서열은 종종 세포로부터의 분비 시, 종종 성숙 단백질로 불리는 단백질의 나머지로부터 절단된다. 신호 펩티드/리더 서열은 단백질의 아미노 말단에 연결된다.

본원에서 사용되는 "엄격한 혼성화 조건"은 제1 핵산 서열(예로, 프로브)이 제2 핵산 서열(예로, 표적)에, 예컨대 핵산의 복합 혼합물에서 혼성화할 조건을 의미할 수 있다. 엄격한 조건은 서열 의존적이며, 상이한 상황에서 상이할 것이다. 엄격한 조건은 정의된 이온 강도 pH에서 특정 서열에 대한 열 용융점(T_m)보다 약 5-10℃ 더 낮게 선택될 수 있다. T_m은 표적에 상보적인 프로브의 50%가 평형 시(표적 서열이 과량으로 존재하므로, T_m에서 프로브의 50%가 평형 시 점유됨) 표적 서열에 혼성화하는 온도(정의된 이온 강도, pH 및 핵산 농도 하에)일 수 있다. 엄격한 조건은 염 농도가 약 1.0M 나트륨 이온 미만, 예컨대 pH 7.0 내지 8.3에서 약 0.01-1.0M 나트륨 이온 농도(또는 다른 염)이고 온도가 짧은 프로브(예로 약 10-50개 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 30℃이고 긴 프로브(예로 약 50개 초과 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 60℃인 것들일 수 있다. 엄격한 조건은 또한 탈안정화 제제, 예컨대 포름아미드의 첨가로 달성될 수 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 배경 혼성화의 적어도 2 내지 10배일 수 있다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건에는 하기가 포함된다: 50% 포름아미드, 5xSSC, 및 1% SDS, 42℃에서 인큐베이션하거나, 또는 5xSSC, 1% SDS, 65℃에서 인큐베이션하고, 65℃에서 0.2xSSC, 및 0.1% SDS 중에 세척.

본원에 사용된 "대상체"는 본원에 기술된 치료제로 면역화를 원하거나, 이를 필요로 하는 포유 동물을 지칭한다. 상기 포유동물은 인간, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 마우스 또는 래트일 수 있다.

본원에서 사용되는 "실질적으로 상보적인"은 제1 서열이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100개 또는 그 초과의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 제2 서열의 상보체에 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동함을, 또는 두 서열이 엄격한 혼성화 조건 하에 혼성화함을 의미할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이 “실질적으로 상동한”은, 제1 및 제2 아미노산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 또는 그 이상의 아미노산의 영역에 걸쳐, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,또는 99% 상동하다는 것을 의미할 수 있다.“실질적으로 상동한”은, 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐, 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,또는 99% 상동하다는 것을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 예방, 억제, 진압 또는 완전 제거 수단을 통한 질병으로부터의 동물의 보호를 의미할 수 있다. 질환의 예방은 질환의 개시 전에 동물에 대한 본 발명의 치료제 투여를 포함한다. 질환의 억제는 질환의 유도 후 그러나 그 임상적 출현 전에 동물에 대한 본 발명의 치료제 투여를 포함한다. 질환의 진압은 질환의 임상적 출현 후 동물에 대한 본 발명의 치료제 투여를 포함한다. 상기 질환은 저산소증 및/또는 허혈과 관련될 수 있다.

핵산에 대해 본원에서 사용되는 "변이체"는 (i) 참조된 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편; (ii) 참조된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 부분의 상보체; (iii) 참조된 핵산 또는 그의 상보체와 실질적으로 상동한 핵산; 또는 (iv) 참조된 핵산, 그의 상보체, 또는 이들과 실질적으로 상동한 서열에 엄격한 조건 하에 혼성화하는 핵산을 의미할 수 있다.

“변이체”는 추가로 아미노산의 삽입, 결실, 또는 보존적 치환에 의해 아미노산 서열이 상이하지만, 적어도 하나의 생물학적 활성을 유지하는 펩티드 또는 폴리펩티드로서 정의될 수 있다. 생물학적 활성의 대표적인 예시는 특정 항체와 관련된, 또는 면역 반응을 촉진하는 능력을 포함한다. 변이체는 또한 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 아미노산을 갖는 참조된 단백질과 실질적으로 상동한 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. 아미노산의 보존적 치환, 즉 유사한 특성 (예로, 친수성, 하전된 영역의 정도 및 분포)의 상이한 아미노산으로 아미노산을 대체하는 것은 당분야에서 전형적으로 작은 변화를 포함하는 것으로 인식된다. 이들 사소한 변화는 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 아미노산의 수치요법 지수(hydropathic index)를 고려함으로써, 부분적으로 식별될 수 있다. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). 아미노산의 수치요법 지수는 그 소수성 및 전하의 고려에 기반한다. 유사한 수치요법 지수의 아미노산이 치환될 수 있고 여전히 단백질 기능을 보유한다는 것이 당해기술분야에 공지되어 있다. 일 측면에서, ±2의 수치요법 지수를 갖는 아미노산이 치환된다. 아미노산의 친수성은 또한 생물학적 기능을 보유하는 단백질을 야기할 치환을 밝히는데 사용될 수 있다. 펩티드의 문맥에서 아미노산의 친수성의 고려는 항원성 및 면역원성과 상관관련이 있다고 보고된 유용한 수단인 상기 펩티드의 가장 큰 국소적 평균 친수성의 계산을 가능하게 한다. 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산의 치환은, 당해 기술분야에서 이해되는 바와 같이, 생물학적 활성, 예를 들면 면역원성을 보유하는 펩티드를 야기할 수 있다. 치환은 서로 ±2 이내의 친수성 값을 갖는 아미노산을 이용하여 수행될 수 있다. 아미노산의 소수성 지수 및 친수성값은 모두 아미노산의 특정 측쇄에 의해 영향을 받는다. 그 관찰과 일치하게, 생물학적 기능과 호환성인 아미노산 치환은 아미노산, 및 특히 소수성, 친수성, 전하, 크기 및 다른 특성으로 드러나는 바와 같은 이들 아미노산의 측쇄의 상대적 유사성에 따라 달라지는 것으로 이해된다.

변이체는 전체 유전자 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 실질적으로 상동한 핵산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 유전자 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동할 수 있다. 변이체는 아미노산 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 실질적으로 상동한 아미노산 서열일 수 있다. 아미노산 서열은 아미노산 서열의 전장 또는 그의 단편에 걸쳐 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 상동할 수 있다.

본원에서 사용되는 "벡터"는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 의미할 수 있다. 벡터는 바이러스 벡터, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 DNA 또는 RNA 벡터일 수 있다. 벡터는 자가-복제 염색체외 벡터일 수 있고, 바람직하게는 DNA 플라스미드이다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 이종성 핵산 서열을 함유 또는 포함할 수 있다.

본원에서 수치 범위의 언급에 있어서, 상동한 정도의 정밀도를 갖는 그 사이의 각각의 개입 숫자가 명백하게 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 있어서, 숫자 7 및 8은 6 및 9에 부가하여 고려되며, 범위 6.0-7.0에 있어서, 숫자 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 및 7.0이 명백하게 고려된다.

2. 치료제

치료제는 제제, 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 제제는 혈관신생을 촉진시키거나 유도할 수 있다. 제제는 혈관 긴장도, 혈관신생 및/또는 동맥혈관 확장을 촉진시키거나 유도할 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 모세혈관 밀도, 측부 혈관 형성, 혈관 크기 또는 이의 조합을 증가시킬 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 조직 관류를 증가시킬 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 조직 괴사를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 치료제는 치료제 자체가 질병 또는 사망을 일으키지 않도록 안전하고, 질병에 대해 보호적인 것과 같은 효과적인 치료제의 필요한 특징을 가질 수 있고, 투여 용이함, 적은 부작용, 생물학적 안정성 및 용량당 적은 비용을 제공할 수 있다. 치료제는 제제를 포함시킴으로써 이러한 기능 중의 일부 또는 모두를 달성할 수 있다.

a. 제제

치료제는 제제를 포함할 수 있다. 제제는 핵산 서열, 아미노산 서열 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 DNA, RNA, cDNA, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합일 수 있다. 핵산 서열은 또한 펩티드 결합에 의해 제제에 결합된 링커 또는 태그 서열을 인코딩하는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 아미노산 서열은 단백질, 펩티드, 이의 변이체, 이의 단편 또는 이의 조합일 수 있다.

(1) HIF-1α

제제는 저산소증 유도 인자-1α(HIF-1α), 이의 단편, 이의 변이체 또는 이의 조합일 수 있다. HIF-1α는 전사 인자 HIF-1의 두 아단위 중의 하나이다. 다른 아단위는 HIF-1β이다. 따라서, HIF-1은 α 및 β 아단위의 이종이량체이고, 여기서 β 아단위는 구성적으로 발현되고, α 아단위의 안정성은 산소 농도에 의해 조절된다.

두 아단위는 전사 인자의 기본적인 헬릭스-루프-헬릭스(Helix-Loop-Helix) PER-ARNT-SIM(bHLH-PAS) 부류의 일원이다. 도 1에 도시된 바와 같이, HIF-1α는 bHLH 도메인 및 두 개의 PAS 도메인뿐만 아니라 N-말단 전사활성 도메인(NTAD) 및 C-말단 전사활성 도메인(CTAD)을 함유한다. 추가로, HIF-1α는 프롤릴-하이드록실라제 도메인(PHD), 즉, PHD1, PHD2 및 PHD3을 함유하는 효소로 하이드록실화된 두 개의 프롤린 잔기(예: 인간 HIF-1α 중의 P402 및 P564), 및 HIF를 억제하는 인자(FIH)를 통해 하이드록실화된 CTAD에 위치된 아스파라긴 잔기(예: 인간 HIF-1α 중의 N803)를 함유한다. 이러한 잔기는 산소의 존재하에 HIF-1α에서 하이드록실화된다.

구체적으로, 하이드록실화 아스파라긴 잔기는 HIF-1α 및 전사 공활성제 사이의 상호작용을 입체적으로 억제하는 반면, 하이드록실화 프롤린 잔기는 폰 히펠-린다우(von Hippel-Lindau) 종양 억제 단백질(pVHL)에 의해 인지되고 결합된다. pVHL은 엘론긴 B, 엘론긴 C 및 쿨린-2를 포함하는 복합체에서 발견되고, 유비퀴틴 리가제 E3 활성을 갖는다. 이 복합체는 하이드록실화 HIF-1α의 유비퀴틴화를 조정하고, 26S 프로테아솜을 통한 분해가 이어진다.

따라서, 정상산소증의 존재하에, HIF-1α는 불안정하고/하거나 전사 공활성제와 상호작용할 수 없고, 따라서 HIF-1은 불활성이다. 저산소증 또는 허혈 조건하에, HIF-1α의 하이드록실화를 감소시키거나 억제하여 HIF-1α를 안정화시키고 HIF-1이 저산소증 및 허혈에 대한 적응 반응을 조정할 수 있게 한다. 이러한 적응 반응은 혈관 긴장도, 혈관신생 및/또는 동맥혈관 확장에 대한 효과를 통해 혈관 항상성에 관련되는 유전자의 전사를 지시함을 포함할 수 있다.

그러나, 병리학적 조건하에, HIF-1을 억제시켜 감소된 조직 관류, 휴식시 허혈성 통증의 발현, 궤양 및/또는 괴저, 및 최종적으로 절단을 유도할 수 있다. 그러한 병리학적 상태는 중증 하지 허혈을 포함할 수 있다.

따라서, 치료제는 저산소증 및/또는 허혈과 관련된 병리학적 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 저산소증 또는 허혈은 중증 하지 허혈, 말초 동맥 질환, 상처 치유, 혈관 질환, 순환기 질환, 관상 동맥 질환, 심혈관 질환, 당뇨병 또는 이의 조합과 관련될 수 있다. 저산소증 또는 허혈은 중증 하지 허혈과 관련될 수 있다.

치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 모세혈관 밀도, 측부 혈관 형성, 혈관 크기 또는 이의 조합을 증가시킬 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 조직 관류를 증가시킬 수 있다. 치료제는 치료제를 투여하지 않은 대상체와 비교하여 치료제를 투여한 대상체에서 조직 괴사를 감소시킬 수 있다.

HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 임의 수의 유기체, 예를 들면, 마우스(무스 무수쿨러스(Mus musculus)) 및 인간(호모 사피엔스(Homo sapiens))으로부터 수득할 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 코돈 사용량 및 상응하는 RNA 전사물과 관련하여 최적화될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 발현을 위해 최적화된 코돈 및 RNA일 수 있다. 일부 구현예에서, HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 번역의 효율을 증가시키기 위해 코작(Kozak) 서열(예: GCC ACC)을 포함할 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 번역 종결의 효율을 증가시키기 위해 복수의 정지 코돈(예: TGA TGA, TGA TAA 등)을 포함할 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 또한 면역글로불린 E(IgE) 리더 서열을 인코딩할 수 있다. IgE 리더 서열은 핵산 중의 HIF-1α에 대한 5'에 위치할 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 또한 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 IgE 리더 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 없거나 이를 함유하지 않는다.

일부 구현예에서, HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 이종성 핵산 서열이고/이거나 하나 이상의 이종성 핵산 서열을 함유하거나 포함할 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 HIF-1α의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 또는 잔기가 또 하나의 아미노산 또는 잔기로 대체되거나 치환되도록 돌연변이될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 하이드록실화될 수 있는 HIF-1α의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 잔기(예: 프롤린, 아스파라긴 등)가 하이드록실화될 수 없는 잔기로 대체되거나 치환되도록 돌연변이될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 HIF-1α의 아미노산 서열 중의 하나 이상의 프롤린 잔기는 하이드록실화될 수 없는 잔기로 대체되거나 치환되도록 돌연변이될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 HIF-1α의 아미노산이 pVHL에 의해 인지되고/되거나 결합될 수 없도록 돌연변이될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 HIF-1α의 아미노산 서열이 유비퀴틴화될 수 없도록 돌연변이될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 HIF-1α의 아미노산 서열이, 예를 들면, 비제한적으로, 26S 프로테아솜에 대해 분해될 수 없도록 돌연변이될 수 있다. HIF-1α를 인코딩하는 핵산은 HIF-1α의 아미노산 서열이 세포 및/또는 조직 중의 산소 농도와 무관하게 안정하도록 돌연변이될 수 있고, 따라서 HIF-1α 단백질은 세포 및/또는 조직에 축적될 수 있다.

마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 2를 인코딩하는 서열 식별 번호: 1의 핵산 서열일 수 있다(도 7a 및 7b). 서열 식별 번호: 2는 두 개의 프롤린 잔기가 알라닌으로 대체된 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열이다. 이러한 대체는 HIF-1α의 하이드록실화 및 따라서 pVHL에 의한 HIF-1α의 인지를 방지하거나 감소시킬 수 있다. 서열 식별 번호: 2는 펩티드 결합을 통해 IgE 리더 서열에 결합된 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열이다.

일부 구현예에서, 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 1에 기재된 핵산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 기타 구현예에서, 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 2에 기재된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 2에 기재된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 구현예에서, 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 4를 인코딩하는 서열 식별 번호: 3의 핵산 서열일 수 있다(도 8a 및 8b). 서열 식별 번호: 4는 두 개의 프롤린 잔기가 도 8b에 도시된 바와 같이 알라닌으로 대체된 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열이다. 이러한 대체는 HIF-1α의 하이드록실화 및 따라서 pVHL에 의한 HIF-1α의 인지를 방지하거나 감소시킬 수 있다. 서열 식별 번호: 4는 펩티드 결합을 통해 IgE 리더 서열에 결합되지 않은 마우스 HIF-1α의 아미노산 서열이다.

일부 구현예에서, 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 3에 기재된 핵산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 기타 구현예에서, 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 4에 기재된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 마우스 HIF-1α는 서열 식별 번호: 4에 기재된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

인간 HIF-1α는 서열 식별 번호: 6을 인코딩하는 서열 식별 번호: 5의 핵산 서열일 수 있다(도 9a 및 9b). 서열 식별 번호: 6은 두 개의 프롤린 잔기가 도 9b에 도시된 바와 같이 알라닌으로 대체된 인간 HIF-1α의 아미노산 서열이다. 이러한 대체는 HIF-1α의 하이드록실화 및 따라서 pVHL에 의한 HIF-1α의 인지를 방지하거나 감소시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 인간 HIF-1α는 서열 식별 번호: 5에 기재된 핵산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 핵산 서열일 수 있다. 기타 구현예에서, 인간 HIF-1α는 서열 식별 번호: 6에 기재된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산 서열일 수 있다. 인간 HIF-1α는 서열 식별 번호: 6에 기재된 아미노산 서열의 전장에 대해 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다.

일부 구현예는 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 3 및 서열 식별 번호: 5의 단편에 관한 것이다. 단편은 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 3 및/또는 서열 식별 번호: 5의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 리더 서열, 예를 들면, IgE 리더 서열과 같은 면역글로불린 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않을 수 있다.

서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 3 및/또는 서열 식별 번호: 5의 단편에 대해 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 단편이 제공될 수 있다. 이러한 단편은 서열 식별 번호: 1, 서열 식별 번호: 3 및/또는 서열 식별 번호: 5에 대해 95% 이상의 상동성을 갖는 핵산의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 핵산 서열의 단편에 대해 96% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 핵산 서열의 단편에 대해 97% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 핵산 서열의 단편에 대해 98% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 핵산 서열의 단편에 대해 99% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 단편은 리더 서열, 예를 들면, IgE 리더 서열과 같은 면역글로불린 리더 서열을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 리더 서열을 인코딩하는 코딩 서열을 함유하지 않을 수 있다.

서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 4 및 서열 식별 번호: 6의 단편이 제공될 수 있다. 단편은 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 4 및/또는 서열 식별 번호: 6의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 단편은 리더 서열, 예를 들면, IgE 리더 서열과 같은 면역글로불린 리더 서열을 포함한다. 기타 구현예에서, 단편은 리더 서열을 함유하지 않을 수 있다.

서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 4 및/또는 서열 식별 번호: 6의 단편에 대해 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 단편이 제공될 수 있다. 그러한 단편은 서열 식별 번호: 2, 서열 식별 번호: 4 및/또는 서열 식별 번호: 6에 대해 95% 이상의 상동성을 갖는 단백질의 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 단백질 서열의 단편에 대해 96% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 단백질 서열의 단편에 대해 97% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 단백질 서열의 단편에 대해 98% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예는 본원의 HIF-1α 단백질 서열의 단편에 대해 99% 이상의 상동성을 갖는 단편에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 단편은 리더 서열, 예를 들면, IgE 리더 서열과 같은 면역글로불린 리더 서열을 포함한다. 기타 구현예에서, 단편은 리더 서열을 함유하지 않을 수 있다.

b. 벡터

치료제는 제제를 인코딩하는 이종 핵산을 포함하는 하나 또는 그 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 벡터는 제제를 발현할 수 있다. 백터는 제제를 인코딩하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 벡터는 복제 기원을 함유하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 또는 효모 인공 염색체일 수 있다. 벡터는 자가 복제 염색체외 벡터, 또는 숙주 게놈 내로 통합되는 벡터일 수 있다.

하나 이상의 벡터는 발현 작제물일 수 있고, 이는 일반적으로 표적 세포 내로 특정 유전자를 도입하기 위해 사용되는 플라스미드이다. 일단 발현 벡터가 세포 내로 들어가면, 상기 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 세포성-전사 및 번역 기전 리보솜 복합체에 의해 생성된다. 플라스미드는 종종 인헨서 및 프로모터 영역으로 작용하고 발현 벡터 상에 운반된 유전자의 효과적인 전사를 야기하는 조절 서열을 함유하도록 조작된다. 본 발명의 벡터는 다량의 안정한 메신저 RNA, 그리고 이에 따른 단백질을 발현한다.

벡터는 발현 신호, 예컨대 강한 프로모터, 강한 종결 코돈, 프로모터 및 클로닝된 유전자 사이의 거리 조정, 및 전자 종결 서열 및 PTIS (이동가능한 번역 개시 서열)의 삽입을 가질 수 있다.

(1) 발현 벡터

벡터는 원형 플라스미드 또는 선형 핵산일 수 있다. 원형 플라스미드 및 선형 핵산은 적절한 대상체 세포에서 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있다. 벡터는 종결 신호와 작동적으로 연결될 수 있는, 항원-인코딩 뉴클레오티드 서열과 작동적으로 연결된 프로모터를 가질 수 있다. 벡터는 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역을 위하여 요구되는 서열을 또한 함유할 수 있다. 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 키메라일 수 있으며, 이는 그 성분의 적어도 하나가 그 다른 성분의 적어도 하나에 대해 이종성이라는 것을 의미한다. 발현 카세트 내의 뉴클레오티드 서열을 발현은 구성적 프로모터 또는 숙주 세포가 부분 특정 외부 자극에 노출되는 경우에만 전사를 개시하는 유도 가능한 프로모터의 통제 하에 있을 수 있다. 다세포 개체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달 단계에 특이적일 수 있다.

(2) 원형 및 선형 벡터

벡터는 원형 플라스미드일 수 있고, 이는 세포 게놈 내로의 통합에 의해 표적 세포를 형질전환시키거나 염색체외(예로 복제 기원이 있는 자가 복제 플라스미드)로 존재할 수 있다.

벡터는 pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스(provax), 또는 항원을 인코딩하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포로 하여금 면역계에 의하여 인식된 항원에 대한 서열을 번역하게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

또한 선형 핵산, 또는 선형 발현 카세트("LEC")가 본원에 제공되며, 이는 전기천공을 통해 대상체에 효율적으로 전달될 수 있고 하나 이상의 바람직한 제제를 발현할 수 있다. LEC는 임의의 인산염 골격이 없는 임의의 선형 DNA일 수 있다. DNA는 하나 또는 그 이상의 제제를 인코딩할 수 있다. LEC는 프로모터, 인트론, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 함유할 수 있다. 제제의 발현은 프로모터에 의하여 제어될 수 있다. LEC는 임의의 항생제 내성 유전자 및/또는 인산염 골격을 함유하지 않을 수 있다. LEC는 원하는 제제 발현에 관련되지 않은 다른 핵산 서열을 함유하지 않을 수 있다.

LEC는 선형화될 수 있는 임의의 플라스미드로부터 유래될 수 있다. 플라스미드는 제제를 발현할 수 있을 수 있다. 플라스미드는 pNP(Puerto Rico/34) 또는 pM2(New Caledonia/99)일 수 있다. 플라스미드는 WLV009, pVAX, pcDNA3.0, 또는 프로박스(provax), 또는 제제를 인코딩하는 DNA를 발현할 수 있고, 세포로 하여금 면역계에 의하여 제제에 대한 서열을 번역하게 하는 임의의 다른 발현 벡터일 수 있다.

LEC는 pcrM2일 수 있다. LEC는 pcrNP일 수 있다. pcrNP 및 pcrMR은 각각 pNP(Puerto Rico/34) 및 pM2(New Caledonia/99)로부터 유래될 수 있다.

(3) 프로모터, 인트론, 종결 코돈, 및/또는 폴리아데닐화 신호

벡터는 프로모터를 가질 수 있다. 프로모터는 유전자 발현을 구동할 수 있고 단리된 핵산의 유전자 발현을 조절할 수 있는 임의의 프로모터일 수 있다. 그러한 프로모터는 DNA 의존적 RNA 폴리머라아제를 통해 본원에 기술된 제제 서열을 전사하기 위하여 요구되는 시스-작용 서열 요소이다. 이종 핵산의 직접적인 발현에 사용되는 프로모터의 선택은 특정 적용에 따라 달라진다. 프로모터는 이것이 그 천연 설정에서 전사 개시 부위로부터 유래되므로, 벡터에서 전사 개시로부터 대략 상동한 거리에 배치될 수 있다. 그러나 상기 거리의 변동이 프로모터의 기능의 손실 없이 수용될 수 있다.

프로모터는 전사물, 리보솜 결합 부위 및 번역 종결의 효과적인 폴리아데닐화를 위하여 요구되는 신호를 인코딩하는 핵산 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 또 다른 프로모터일 수 있다.

벡터는 인헨서 및 기능적 스플라이스 공여체 및 수신체 부위를 갖는 인트론을 포함할 수 있다. 벡터는 효과적 종결을 제공하기 위하여 구조적 유전자의 하류에 전사 종결 영역을 함유할 수 있다. 종결 영역은 프로모터 서열과 상동한 유전자로부터 수득될 수 있거나, 상이한 유전자로부터 수득될 수 있다.

c. 치료제의 부형제 및 다른 성분

상기 치료제는 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 기능적 분자, 예컨대 운반체, 담체, 또는 희석제일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 형질감염 촉진 제제일 수 있고, 이는 표면 활성 제제, 예컨대 면역 자극 복합체(ISCOMS), 프로인트(Freunds) 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A, 무라밀 펩티드, 퀴논 유사체, 소포체, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌, 히알루론산, 지질, 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 나노입자를 포함하는 LPS 유사체, 또는 다른 알려진 형질감염 촉진 제제일 수 있다.

형질감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함하는, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 지질이다. 형질감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트이고, 폴리-L-글루타메이트는 6mg/ml 미만의 농도로 치료제에 존재할 수 있다. 상기 형질감염 촉진제는 계면 활성제 예컨대 면역-자극 복합체 (ISCOMS), 프로인트 불완전 보조제, 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 LPS 유사체, 뮤라밀 펩티드, 퀴논 유사체 및 소포, 예컨대 스쿠알렌 및 스쿠알렌을 포함할 수 있고, 상기 히알루론산은 상기 유전적 작제물과 함께 투여되어 사용될 수 있다. DNA 플라스미드 치료제는 또한 형질감염 촉진제, 예컨대 지질, DNA-리포좀 혼합물 (예를 들면 W09324640 참고)로서 레시틴 리포좀 또는 본 기술분야에 알려진 다른 리포좀을 포함하는 리포좀, 칼슘 이온, 바이러스 단백질, 다중음이온, 다중양이온, 또는 나노입자, 또는 다른 알려진 형질감염 촉진제를 포함할 수 있다. 형질감염 촉진 제제는 폴리-L-글루타메이트(LGS)를 포함하는, 다중 음이온, 다중 양이온, 또는 지질이다. 치료제 중 형질감염 제제의 농도는 4mg/ml 미만, 2mg/ml 미만, 1mg/ml 미만, 0.750mg/ml 미만, 0.500mg/ml 미만, 0.250mg/ml 미만, 0.100mg/ml 미만, 0.050mg/ml 미만, 또는 0.010mg/ml 미만이다.

상기 치료제는 미국 출원 시리즈 번호 021,579 (1994년 4월 1일 출원)에 기재된 바와 같은 유전적 촉진제를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 완전히 참고로 통합되어 있다.

상기 치료제는 사용될 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 주사가능한 치료제 약제학적 조성물은 멸균되고, 발열물질이 없고 미립자가 없을 수 있다. 등장성 제형물 또는 용액이 사용될 수 있다. 등장성을 위한 첨가제에는 나트륨 클로라이드, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 및 락토오스가 포함될 수 있다. 상기 치료제는 혈관수축제를 포함할 수 있다. 등장성 용액에는 인산염 완충 식염수가 포함될 수 있다. 치료제는 젤라틴 및 알부민을 포함하는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. LGS 또는 다중양이온 또는 다중음이온을 포함하는 안정화제는 제형이 연장된 시기 동안 실온 또는 상온에서 안정하도록 할 수 있다.

3. 치료 방법

본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 저산소증 또는 허혈을 치료하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 본원에 개시된 치료제를 대상체에게 투여함을 포함할 수 있다. 치료제를 투여한 대상체는 모세혈관 밀도, 측부 혈관 형성, 혈관 크기 또는 이의 조합을 증가시킬 수 있다. 치료제를 투여한 대상체는 증가된 조직 관류를 가질 수 있다. 치료제를 투여한 대상체는 조직 괴사를 감소시킬 수 있다.

저산소증 또는 허혈은 중증 하지 허혈, 말초 동맥 질환, 상처 치유, 혈관 질환, 순환기 질환, 관상 동맥 질환, 심혈관 질환, 당뇨병 또는 이의 조합과 관련될 수 있다. 저산소증 또는 허혈은 중증 하지 허혈과 관련될 수 있다. 치료 방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 중증 하지 허혈을 감소시키거나, 제거하거나 방지할 수 있다.

치료 용량은 1㎍ 내지 10mg 활성 성분/kg 체중/시간일 수 있고, 20㎍ 내지 10mg 성분/kg 체중/시간일 수 있다. 치료제는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31일마다 투여될 수 있다. 효과적인 치료를 위한 치료 용량의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 용량일 수 있다.

a. 투여

치료제는 제약 분야의 숙련가들에게 잘 알려진 표준 방법에 따라 제형화될 수 있다. 그러한 조성물은 용량으로, 그리고 의학 분야에서 숙련가들에게 잘 알려진 기술에 의하여, 나이, 성별, 체중, 및 특정 개체의 병태 및 투여 경로과 같은 그러한 인자를 고려하여 투여될 수 있다. 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간, 말, 소, 돼지, 양, 고양이, 개, 래트, 또는 마우스일 수 있다.

치료제는 방지적으로 또는 치료적으로 투여될 수 있다. 방지적 투여에서, 치료제는 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료적 투여에서, 치료제는 치료를 필요로하는 대상체에서 치료성 효과를 야기하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 이를 달성하기 위한 적당한 양은“치료적으로 효과적인 용량”으로 정의될 수 있다. 이러한 용도를 위한 효과적인 양은 예를 들어, 투여된 치료제는 복용법의 특정 조성물, 투여 방법, 질병의 단계 및 중증도, 환자 건강의 일반적 상태, 및 처방 의사의 판단에 따라 달라질 것이다.

치료제는 Donnelly et al. (Ann. Rev. Immunol. 15:617-648 (1997)); Felgner et al. (미국 특허 번호 5,580,859, 1996년 12월 3일 발행됨); Felgner (미국 특허 번호 5,703,055, 1997년 12월 30일 발행됨); 및 Carson et al. (미국 특허 번호 5,679,647, 1997년 10월 21일 발행됨)에 기술된 바와 같이 본 분야에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있으며, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다. 치료제의 DNA는 개체에게, 예를 들어 백신 건을 사용하여 투여될 수 있는 입자 또는 비드로 복합체화될 수 있다. 본 분야의 숙련가는 생리학적으로 수용 가능한 화합물을 포함하는 제약학적으로 수용가능한 담체의 선택은 예를 들어 발현 벡터의 투여 경로에 따라 달라질 수 있다는 것을 알 것이다.

치료제는 다양한 경로를 통하여 전달될 수 있다. 전형적인 전달 경로는 비경구 투여, 예를 들어, 피내, 근육내, 또는 피하 전달을 포함한다. 다른 경로는 경구 투여, 비강내, 질내 경로를 포함한다. 특히 치료제의 DNA에 대하여, 치료제는 개체의 조직의 틈새 공간으로 전달될 수 있다 (Felgner et al., 미국 특허 번호 5,580,859 및 5,703,055, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다). 치료제는 또한 근육에 투여될 수 있거나, 피내 또는 피하 주사를 통하여, 또는 예컨대 이온도입법과 같은 경피형태로 투여될 수 있다. 치료제의 표피 투여 또한 채용될 수 있다. 표피 투여는 자극물에 대해 면역 반응을 촉발하는 표피 최외층을 기계적 또는 화학적으로 자극하는 것을 포함한다 (Carson et al., 미국 특허번호 5,679,647, 이들 모두의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다).

치료제는 비강 통로를 통한 투여를 위하여 또한 제형화될 수 있다. 비강 투여에 적절한 제형은, 스너프(snuff)가 행해지는, 즉, 코 가까이에서 홀딩된 파우더의 콘테이너로부터 비강 통로를 통한 빠른 흡입에 의한 방법으로 투여되는, 예를 들어 약 10 내지 약 500 마이크론의 범위의 입자 크기를 갖는 조분말을 포함할 수 있으며, 여기서 담체는 고형이다. 상기 제형은 비강 스프레이, 비강 액적, 또는 분무기에 의한 에어로졸 투여에 의한 것일 수 있다. 상기 제형은 치료제의 수성 또는 유성 용액을 포함할 수 있다.

치료제는 현탁액, 시럽, 또는 엘릭시르와 같은 액상 조제물일 수 있다. 치료제는 비경구, 피하, 피내, 근육내, 또는 정맥내 투여 (예를 들어, 주사 가능한 투여)를 위한 조제물, 예컨대 무균성 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다.

치료제는 리포좀, 마이크로스피어, 또는 다른 폴리머 매트리스로 포함될 수 있다 (Felgner et al., 미국 특허번호 5,703,055; Gregoriadis, Liposome Technology, Vols. Ito III (2nd ed. 1993), 이들 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함됨). 리포좀은 인지질 또는 다른 지질로 구성될 수 있으며, 제조 및 투여하기에 비교적 단순한 비독성이고, 생리학적으로 수용 가능하고, 그리고 대사가능한 담체일 수 있다.

치료제는 전기천공을 통하여, 예컨대 미국 특허 번호 7,664,545에 기술된 방법에 의하여 투여될 수 있으며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다. 전기천공은 미국 특허 번호 6,302,874; 5,676,646; 6,241,701; 6,233,482; 6,216,034; 6,208,893; 6,192,270; 6,181,964; 6,150,148; 6,120,493; 6,096,020; 6,068,650; 및 5,702,359에 기술된 방법 및/또는 장치에 의하여 투여될 수 있으며, 이의 내용은 그 전체가 참고로서 본원에 포함되어 있다. 전기천공은 최소 침습성 장치를 통해 수행될 수 있다.

상기 최소 침습 전기천공 장치 (“MID”)는 상기 기술된 치료제 및 관련 유체를 신체 조직에 주입하기 위한 장치일 수 있다. 상기 장치는 속이 빈 니들, DNA 카세트, 유체 전달 수단을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 상기 유체 전달 수단을 체조직에 니들을 삽입하는 동안 동시에 (예를 들어, 자동적으로) DNA를 체조직에 주입하기 위하여 유체 전달 수단을 사용되도록 구동하기 위하여 조정될 수 있다. 이는 DNA 및 관련 유체를, 상기 니들이 삽입되는 동안 서서히 주입하여 체조직을 통하여 유체가 더욱 골고루 분배되도록 하는 장점을 갖는다. 주입 동안 경험된 고통은 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사된 DNA의 분배로 인하여 감소할 수 있다.

MID는 니들의 사용 없이 조직에 치료제를 주입할 수 있다. MID는 치료제가 조직 표면을 관통하고 그 밑의 조직 및/또는 근육에 진입하는 그러한 힘으로 작은 스트림 또는 제트(jet)로서 치료제를 주입할 수 있다. 작은 스트림 또는 제트(jet) 뒤의 그 힘은 가압 기체, 예컨대 1초 분획내 미세-구멍을 통한 이산화탄소의 확장을 통하여 제공될 수 있다. 최소 침습 전기 천공의 예시, 및 그들을 사용하는 방법은 공표된 미국 특허 출원 번호 20080234655; 미국 특허 번호 6,520,950; 미국 특허 번호 7,171,264; 미국 특허 번호 6,208,893; 미국 특허 번호 6,009,347; 미국 특허 번호 6,120,493; 미국 특허 번호 7,245,963; 미국 특허 번호 7,328,064; 및 미국 특허 번호 6,763,264에 기술되며, 이들 각각의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.

MID는 조직을 고통없이 관통하는 액상의 고속 제트를 생성하는 주입기를 포함할 수 있다. 그러한 무침 주입기는 상업적으로 이용가능하다. 본원에서 사용될 수 있는 무침 주입기의 예시는 미국 특허 번호3,805,783; 4,447,223; 5,505,697; 및 4,342,310에 기술된 것들을 포함하며, 이들 각각의 내용은 참고로 본원에 포함되어 있다.

직접 또는 간접 전기운반에 적합한 형태로의 바람직한 치료제는 무침 주입기를 사용하여 처리될 조직내로 도입 (예를 들어, 주입)될 수 있으며, 이는 보통 제제의 제트의 전달을 구동하기 위하여 조직에 치료제의 관통을 야기할 충분한 힘으로 조직 표면을 주입기에 접촉함으로써 행해진다. 예를 들어, 만약 처리될 조직이, 점막, 피부, 또는 근육일 경우, 상기 제제는 상기 제제가 각질층을 통하여 그리고 피부 층으로, 또는 그 밑의 조직 및 근육으로 각각 관통하는 것을 야기하기에 충분한 힘으로 상기 점막 또는 피부 표면에 투사된다.

무침 주입기는 조직의 모든 유형, 특히 피부 또는 점막에 치료제를 전달하도록 잘 맞춰져 있다. 일부 구현예에서, 무침 주입기는 치료제를 함유하는 액상을 표면으로 그리고 대상체의 피부 또는 점막으로 나아가게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 조직의 다양한 유형의 대표 예시는 췌장, 후두, 비인두, 아랫 인두, 인두 중앙부, 입술, 목구멍, 폐, 심장, 신장, 근육, 유방, 결장, 전립선, 흉선, 고환, 피부, 점액성 조직, 난소, 혈관 또는 그의 임의의 조합을 포함한다.

MID는 조직을 전기천공하는 니들 전극을 가질 수 있다. 다중 전극 어레이, 예를 들어 직사각 또는 사각 패턴으로의 설정 내에서 전극의 다중 쌍 사이에서 펄싱(pulsing)함으로써, 전극 쌍 사이의 펄싱에 대한 개선된 결과가 제공된다. 예를 들어“약물 및 유전자의 매개된 전달을 위한 니들 전극”을 표제로 한 미국 특허 번호 5,702,359에서와 같이, 니들의 어레이가 개시되며, 여기서 니들의 다수의 쌍은 치료적 치료 동안 펄싱될 수 있다. 그 전체가 참고로 개시되어 본원의 포함된 출원에서, 니들은 원형 어레이에 배치되었으나, 니들 전극의 반대 쌍 사이에서 펄싱을 가능하게 하는 커넥터 및 스위칭 장치를 갖는다. 재조합 발현 벡터를 세포로 전달하기 위한 니들 전극 쌍이 사용될 수 있다. 그러한 장치 및 시스템은, 미국 특허 번호 6,763,264에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다. 대안적으로, DNA의 주입 및 정상 주입 니들과 유사한 단일 니들로의 전기 천공을 허용하고 현재 사용되는 장치에 의하여 전달되는 것들보다 더 낮은 펄스를 적용하여, 이로써 환자에 의하여 경혐되는 전기적 느낌이 감소하는 단일 니들 장치가 사용될 수 있다.

MID는 하나 또는 그 이상의 전극 어레이를 포함할 수 있다. 어레이는 상동한 직경 또는 상이한 직경의 2개 이상의 니들을 포함할 수 있다. 니들은 고르게 또는 고르지 않게 떨어져 있을 수 있다. 니들은 0.005 인치 및 0.03 인치 사이, 0.01 인치 및 0.025 인치 사이; 또는 0.015 인치 및 0.020 인치 사이일 수 있다. 니들은 직경이 0.0175 인치일 수 있다. 니들은 0.5 mm, 1.0 mm, 1.5 mm, 2.0 mm, 2.5 mm, 3.0 mm, 3.5 mm, 4.0 mm, 또는 그 이상 떨어져 있을 수 있다.

MID는 펄스 생성기 및 단일 단계에서 치료제 및 전기천공 펄스를 전달하는 2 이상의 니들 주입기로 구성될 수 있다. 펄스 생성기는 플래시 카드 작동된 퍼스널 컴퓨터를 통하여 펄스 및 주입 파라미터의 유연한 프로그래밍 뿐만 아니라, 전기천공 및 환자 데이터의 전체적인 기록 및 저장을 가능케할 수 있다. 펄스 생성기는 짧은 기간의 시간 동안 다양한 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 예를 들어, 펄스 생성기는 100 ms의 기간 동안 15 볼트 펄스를 전달할 수 있다. 그러한 MID의 예시는 Inovio Biomedical Corporation에 의한 엘젠(Elgen) 1000 시스템이며, 이는 미국 특허 번호 7,328,064에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다.

MID는 CELLECTRA (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell PA) 장치 및 시스템일 수 있으며, 이는 거대분자, 예컨대 DNA를 인체 또는 식물 내의 선택된 조직의 세포로 도입을 촉진하는 모듈식 전극 시스템이다. 상기 모듈식 전극 시스템은 복수의 니들 전극; 피하 주사침; 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러로부터 복수의 니들 전극까지 전도성 링크를 제공하는 전기적 커넥터; 및 전원 공급원을 포함할 수 있다. 작업자는 지지 구조 상에 올려진 복수의 니들 전극을 붙잡아 몸 또는 식물에서 선택된 조직 내로 이들을 단단하게 삽입할 수 있다. 거대분자는 이후 선택된 조직 내로 피하 주사침을 통해 전달된다. 프로그램가능한 정전류 펄스 컨트롤러가 활성화되고 정전류 전기 펄스가 복수의 니들 전극에 적용된다. 상기 적용된 정전류 전기 펄스는 복수의 전극 사이에 있는 세포 내로 거대분자의 도입을 촉진한다. 세포 과열에 의한 세포 사멸은 일정-전류 펄스 덕분에 조직에서의 전력 소실을 제한함으로써 최소화된다. 셀렉트라(Cellectra) 장치 및 시스템은, 미국 특허 번호 7,245,963에 기술되며, 이의 내용은 참고로서 본원에 포함되어 있다.

MID는 Elgen 1000 시스템 (Inovio Pharmaceuticals)일 수 있다. Elgen 1000 시스템은 속이 빈 니들, DNA 카세트, 유체 전달 수단을 제공하는 장치를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 장치는 상기 유체 전달 수단, 상기 기술된 치료제를 체조직에 니들을 삽입하는 동안 동시에 (예를 들어, 자동적으로) DNA를 체조직에 주입하기 위하여 유체 전달 수단을 사용되도록 구동하기 위하여 조정될 수 있다. 이는 상기 유체를, 상기 니들이 삽입되는 동안 서서히 주입하여 체조직을 통하여 유체가 더욱 골고루 분배되도록 하는 장점을 갖는다. 주입 동안 경험된 고통은 더욱 큰 영역에 걸쳐 주사된 유체의 용적의 분배로 인하여 감소할 수 있다고 또한 알려져 있다.

또한, 유체의 자동 주입은 주입된 유체의 실제적 용량의 자동 모니터링 및 기록을 촉진한다. 이러한 데이터는 원한다면 기록 목적을 위한 제어 유닛에 의하여 저장될 수 있다.

주입의 비율은 선형 또는 비선형일 수 있으며, 주입은 니들이 치료받을 대상체의 피부를 통해 주입된 후, 그리고 그것이 추가로 체조직에 삽입되는 동안 수행될 수 있다는 것이 인지될 것이다.

유체가 본 발명의 장치에 의하여 주입될 수 있는 적절한 조직은 종양 조직, 피부, 또는 폐 조직을 포함할 수 있으나, 근육 조직일 수 있다.

상기 장치는 추가로 체조직으로 니들을 삽입 인도하기 위한 니들 삽입 수단을 포함한다. 유체 주입 비율은 니들 삽입의 비율에 의하여 제어된다. 이는 유체의 니들 삽입 및 주입 둘 다가 삽입의 비율이 주입 비율에 원하는 바와 같이 매칭될 수 있도록 제어될 수 있다는 장점을 갖는다. 이는 또한 상기 장치를 사용자로 하여금 작동하기 더욱 쉽게 만든다. 원할 경우, 체조직으로 니들을 자동 삽입하기 위한 수단이 제공될 수 있다.

사용자는 언제 유체의 주입이 발생할지 선택할 수 있다. 이상적으로는 그러나, 주입은 니들의 끝이 근육 조직에 도달할 때 발생하고, 상기 장치는 상기 니들이 상기 유체의 주입이 발생하기에 충분한 깊이로 삽입될 때를 감지하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이는 유체의 주입이 니들이 원하는 깊이 (이는 보통 근육 조직이 시작되는 깊이일 것이다)에 도달할 때 자동적으로 발생하도록 촉진될 수 있다는 것을 의미한다. 근육 조직이 시작되는 깊이는 예를 들어 미리 설정된 니들 삽입 깊이, 예컨대 피부 층을 통하여 니들이 들어갈 수 있기에 충분하게 여겨질 깊이인 4 mm의 값으로 여겨질 수 있다.

감지 수단은 초음파 프로브를 포함할 수 있다. 상기 감지 수단은 임피던스와 내성의 변화를 감지하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 이 경우에서 상기 수단은 체조직에서 니들의 깊이를 기록하는 그러한 것을 하지 않을 수 있지만, 그 대신 니들이 상이한 유형의 체조직으로부터 근육으로 이동할 때 임피던스 또는 내성의 변화를 감지하도록 조정될 수 있다. 이러한 대안들 중 어느 하나는 주입이 발생할 수 있는 상대적으로 정확하고 간결하게 작동하는 감지 수단을 제공할 수 있다. 니들 삽입의 깊이는 원하다면 추가로 기록될 수 있으며, 주입될 유체의 부피가 니들 삽입의 깊이가 기록되는 바와 같이 결정되도록 유체의 주입을 제어하는데 사용될 수 있다.

상기 장치는 추가로: 니들을 지지하기 위한 베이스, 그 안에 베이스를 수용하기 위한 하우징을 포함하며, 여기서 상기 베이스는 상기 하우징에 대해 이동가능하여 상기 베이스가 상기 하우징에 대해 제1 후면 위치에 있을 때 상기 니들이 상기 하우징 내에서 후퇴하며, 상기 베이스가 하우징 내에서 제2 정면 위치에 있을 때 상기 하우징 밖으로 연장하도록 한다. 이는 상기 하우징이 환자의 피부 상에서 정렬될 수 있고, 상기 니들이 이후 상기 베이스에 대해 상기 하우징을 이동시킴으로써 상기 환자의 피부로 삽입될 수 있으므로 사용자에게 이롭다.

상기 기술한 바와 같이, 상기 유체가 피부에 삽입될 때 니들 길에에 걸쳐 고루 분배되로록 유체 주입의 제어된 비율을 달성하는 것이 바람직하다. 유체 전달 수단은 제어된 비율에서 유체를 주입하도록 조절된 피스톤 구동 수단을 포함할 수 있다. 피스톤 구동 수단은 예를 들어 서보 모터에 의하여 활성화될 수 있다. 그러나, 피스톤 구동 수단은 하우징에 대해 축방향으로 이동하는 베이스에 의하여 구동될 수 있다. 유체 전달을 위한 대안적인 수단이 제공될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 그러므로, 예를 들어, 제어된 또는 비-제어된 비율로의 유체 전달을 위하여 스퀴징되는 밀폐 콘테이너가 주사기 및 피스톤 시스템의 위치에서 제공될 수 있다.

상기 기술된 장치는 주입의 임의의 유형을 위하여 사용될 수 있다. 이는 그러나 전기천공 분야에서 특이 유용한 것으로 구상될 것이며, 그러므로 이는 니들에 전압을 적용하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 이는 상기 니들이 주입만을 위하여 사용되는 것이 아니라 또한 전기천공동안 전극으로서도 사용될 수 있도록 허용한다. 이는 전장이 주입된 유체와 같은 영역에 적용된다는 것을 의미하므로 특히 이롭다. 전통적으로 전기천공에 대해서 이것이 전극을 이전에 주입된 유체와 정확하게 배치하는 것이 매우 어렵다는 점과, 그러므로 사용자가 요구된 양에 비하여 더 많은 용적의 유체를 더욱 큰 영역에 걸쳐 주입하고 더욱 높은 영역에 걸쳐 전장을 적용하여 주입된 물질 및 전장 사이의 겹침을 보장하도록 하는 경향이 있다는 문제가 있어 왔다. 본 발명을 사용하면서, 전장 및 유체 사이에 적합성을 달성하면서도 주입된 유체의 용적 및 적용된 전장의 크기 둘 다가 감소될 수 있다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시되는 다수 측면을 갖는다.

4. 실시예

실시예 1

실시예 2 내지 5의 재료 및 방법

실시예 2 내지 5에서 이하 기재된 실험은 실시예 1에서 본원에 기재된 방법을 사용하고, 조직 허혈 동안 혈관신생의 자극을 조사했다. 특히, 조사는 조직 허혈 동안 HIF-1α에 의한 혈관신생의 자극을 시험했다. 구성적으로 발현된 HIF-1α 유전자를 인코딩하는 DNA 플라스미드(상기한 바와 같고, 따라서 프롤린의 알라닌으로의 치환을 포함)를 생체내 전기천공(EP) 또는 근육내(IM) 주사 단독으로 투여했다.

방법의 요약

왼쪽 대퇴 동맥 결찰은 세 그룹으로 배당된 마우스에서 수행하였다: (1) HIF-EP (n = 13); (2) HIF-IM (n = 14); 및 (3) 빈 플라스미드 (pVAX)-EP (n = 12). HIF-1α 또는 pVAX DNA(각각 5㎍/μL의 20μL)의 단일 용량을 EP(그룹 1 및 3)가 이어지는 허혈성 내전근에 주사하였다. 그룹 2의 마우스는 HIF-1α 플라스미드 DNA의 IM 주사 단독을 수용했다. 결찰전부터 결찰 0, 3, 7, 14 및 21일후까지, 레이저 도플러 관류 영상화 장치에 의해 정량화된 사지 관류 회복, 사지 기능, 및 사지 괴사를 이하 보다 상세히 기술된 바와 같이 측정하였다. 21일째에, 생존하고 있는 마우스(그룹당 4 내지 5마리)를 희생시키고, 내전근 조직은 이하 보다 상세히 기술된 바와 같이 항-평활근 액틴 항체를 통해 헤마톡실린 및 에오신을 사용하는 괴사, 모세혈관 밀도(항-CD31 항체) 및 측부 혈관을 위해 염색했다.

상세한 방법

실험 프로토콜. 실험은 다음 변수를 평가하기 위해 수행하였다(도 2): (1) 초음파 레이저 도플러를 사용하여 경시적으로 사지 관류의 회복을 평가하고; (2) 자가절단으로부터 사지 구제 및 생존 정도를 조사하고; (3) 조직 괴사 정도를 포함하는 조직의 조직학적 특징의 개선을 평가한다. 39세 나이 및 성별 일치된 야생형 Balb/c 마우스를 다음 3개의 치료 그룹 중의 하나에 배당하였다: (1) 13마리 마우스(활성 치료, HIF-1a DNA/EP); (2) 14마리 마우스(양성 대조군, HIF-1a DNA/IM); 및 (3) 12마리 마우스(음성 대조군, 빈 플라스미드 [pVAX] DNA/EP). 왼쪽 사지는 개입을 받는 반면, 오른쪽 사지는 측정된 변수의 마우스내 비교 및 조정을 허용하지 않았다. 21일의 말기에 그룹당 평균 4 내지 5마리 동물을 최종 조직 분석에 포함시켰다.

대퇴 동맥 결찰. 25g 내지 30g 중량의 상기한 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me)를 돌보고, 펜실베니아 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 지침에 의한 승인 후 수술했다. 수술 전, 마우스를 0.1mL/10g 체중(마우스당 0.25mL 내지 0.30mL)에서 케타민/크실라진 칵테일(100mg/kg 케타민 Þ10mg/kg 크실라진)의 복강내 주사를 사용하여 마취시켰다. 대퇴 동맥 결찰은 상기한 바와 같이 수행하였다. 7,8 간단하게, 무균 방식으로 왼쪽 대퇴 동맥을 노출시키고, 대퇴 신경 및 정맥으로부터 단리시키고, 6.0 실크 봉합사(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), Pittsburgh, Pa)를 사용하여 깊은 대퇴 동맥의 기원에 원위 결찰시켰다. 이어서, 피부를 중단된 4.0 실크 봉합사(피셔 사이언티픽)로 폐쇄시켰다.

플라스미드. 왼쪽 대퇴 동맥 결찰 직후, 내전근에 30게이지의 침을 갖는 인슐린 시린지를 사용하여 결찰 부위에 원위로 제조업자 사양(GenScript USA Inc, Piscataway, NJ)당 구성적으로 발현된 HIF-1a 플라스미드 DNA(변형되고 최적화됨) 또는 pVAX 플라스미드 DNA를 주사했다. 치료는 다음과 같이 투여했다: (1) 20mL(5 mg/mL)의 HIF-1a 플라스미드 DNA의 IM 주사를 EP가 계속되는 실험 그룹(HIF-EP)의 왼쪽 내전근에 투여했고; (2) 20mL(5 mg/mL)의 HIF-1a 플라스미드 DNA의 IM 주사를 양성 대조군(HIF-IM)의 왼쪽 내전근에 투여했고; (3) 20mL(5mg/mL)의 pVAX 플라스미드 DNA의 IM 주사를 EP가 계속되는 음성 대조군(pVAXEP)의 왼쪽 내전근에 투여했다.

생체내 EP. 플라스미드 주사 직후, 생체내 방형파-펄스 EP를 3-전극 어레이 셀렉트라(CELLCTRA) DNA 전달 장치(Inovio Biomedical, Blue Bell, Pa)를 사용하여 치료 부위에 투여하였다. 3-전극 어레이는 이등변 삼각형 형성에서 3개의 26게이지고체 스테인레스 강 전극으로 이루어진다. 특정 EP 조건은 0.1amp의 전류, 두 펄스, 52ms/펄스(50-100V) 및 펄스간 4초로 일정하게 설정했다. 플라스미드 주사 및 EP 사이의 지속기간은 20초였다. 플라스미드 주사/EP를 위한 이벤트의 순서는 다음과 같다: (1) 1회용 전극 조립체를 핸들의 리셉터클에 배치하고, 핸들 위 개시 버튼을 누르고; (2) 20mL(5mg/mL)의 HIF-1a 플라스미드 DNA의 IM 주사를 30게이지의 침을 갖는 인슐린 시린지를 사용하여 투여하고; (3) 직후에, 3개의 어레이 침을 주사 부위 주위 영역에 배치하고; (4) 이어서, 핸들 위 개시 버튼을 누르고, 4초 카운트다운 후, 펄스를 전달한다. 이어서, 어레이를 근육으로부터 완만하게 제거한다. 동일한 순서를 pVAX-EP 그룹에 대해 반복하였다.

사지 관류 측정. 기준 사지 관류 측정은 레이저 도플러 관류 영상화 장치(LDPI)를 사용하여 수술전 수행하고, 대퇴 동맥의 결찰 수술후 즉시 반복하였다. 간단하게, 일련의 관류 측정은 LDPI(Moor Instruments Inc, Wilmington, Del)를 사용하여 각 시점에서 수행하였다. 관류 비를 계산하였고(결찰된/결찰되지 않은 사지), 평균은 각 시점에서 각 마우스에 대해 수득하였다. 관류 신호는 (0) 내지 (1000) 범위의 코드로 나타내었다.

발 움직임 및 괴사 스코어. 뒷다리의 기능 회복을 평가하기 위해, 활동적인 발 움직임에 기초하는 스코어화 시스템은 터치를 사용하여 각 시점에서 치료 그룹을 알지 못하는 맹검 관찰자에 의해 연속적으로 수행하였다. 간단하게, 스코어화는 다음과 같이 수행하였다: 스코어 0, 다리 사용 없음; 스코어 1, 다리 사용; 스코어 2, 활동적인 발 사용; 스코어 3, 완전한 발의 사용 또는 발가락의 확산; 및 스코어 4, 무제한 움직임. 추가로, 괴사의 증증도는 각 시점에서 안락사를 필요로 하는 마우스를 평가하기 위해 유사하게 맹검 관찰자에 의해 스코어화했다. 간단하게, 스코어화는 다음과 같이 수행하였다: 스코어 0, 괴사 없음; 스코어 1, 치아노제/변색; 스코어 2, 1 내지 2개의 발가락의 괴사/손실; 스코어 3, 3 내지 5개의 발가락의 괴사/손실; 스코어 4, 심각한 괴사(발등 이상으로 연장). ≥ 3 스코어화 또는 사지 자가절단된 마우스를 안락사시켰다.

괴사 및 혈관신생을 위한 조직 수집 및 면역조직화학. 조직 수집 및 형태계측 분석을 괴사 분석 21일째에 수행하였다. 모세혈관 성장 및 측부 혈관 형성/리모델링에 대한 면역조직화학을 수행하였다. 간단하게, 마우스를 CO₂ 흡입으로 희생시키고, 인산염 완충 식염수에 이어, 4% 파라포름알데히드로 심장내 관류시켰다. 내전근을 해부하고, 48시간 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 저온 유지 장치로 구분(10 내지 15mm 부분) 전에 파라핀으로 봉입했다. 형태계측 분석을 위해, 부분을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고, 조직 괴사율을 평가하기 위해 플루오로마운트(Fluoromount)-G 배지(Southern Biotech, Birmingham, Ala)에 장착했다. 면역형광 염색을 수행하였다. 간단하게, CD31을 위한 염색은 인간 CD31(Dako Cytomation, Inc, Carpentaria, Calif)에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하여 수행하였고, 혈관 내피 세포를 검출하기 위해 텍사스(Texas) 레드 형광 염료(Gene Link Inc, Hawthorne, NY)를 사용하여 대비염색시켰다. a-SMA(Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ)에 대한 마우스 모노클로날 항체를 사용하고, 혈관 평활근 세포를 검출하기 위해 알렉사(Alexa) 568 형광 염료(Life Technologies, Grand Island, NY)로 대비염색시켰다. 마이크로파 조사는 항원 검색을 위해 수행하였다. 부분(section)을 퍼옥시다제 활성을 차단하기 위해 0.3% 과산화수소로 배양하였다. 단백질 차단, 2차 비오티닐화 항체에 의한 배양 및 아바틴-비오틴 상호작용을 벡타스타틴 키트(Vectastain kit)(Vector Laboratories, Burlingame, Calif)를 사용하여 수행하였다. 괴사, 모세혈관 성장 및 측부 혈관 형성의 정량화는 조직 슬라이드 당 x200 배율로 5개의 무작위로 선택된 필드의 평균으로 수행하고, 분석은 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

통계 분석. 요약 통계는 샘플 크기 및 평균 ± 평균의 표준 오차로서 제공된다. 분석을 위한 계산된 변수는 각 영상을 위한 LDPI 비 및 각 시점에서 마우스당 평균 LDPI 비를 포함한다. 동시에, 임상적 발 움직임, 괴사 스코어 및 면역조직학적 분석 결과를 평가하였다. 데이터는 하나의 반복 인자(일) 및 하나의 비반복 인자(치료)를 갖는 두-인자 혼합 효과 실험 설계를 따른다. 수술 후의 진행 일로 치료의 효과 변형의 존재를 인지하고, 연속 반응 변수에 대한 치료의 간단한 효과는 매일 단방향 고정 효과 모델에 적합한 분산 분석에 의해 평가하였다. 통계학적으로 유의한 차이가 치료 그룹 중에서 발견되었을 경우, 치료 그룹의 쌍대 비교 사이의 차이는 매일 다중 비교용 본페론니(Bonferonni) 조정의 적용으로 평가하였다. 분산 분석에 대한 가정이 불합리한 것으로 나타났을 때, 윌콕슨(Wilcoxon) 순위-합 비모수 시험을 실시하였다. 사지 괴사 스코어 대 치료 그룹의 분할표는 치료 그룹 사이의 사지 괴사 스코어 차이의 분포를 평가하기 위해 피어슨(Pearson) 비정정된 χ² 시험으로 분석하였다. 가설의 모든 시험을 위해, I형 오차(a)를 통계적 유의성을 선언하기 위해 .05로 고정시켰다. 모든 분석은 STATA (중간냉각됨), 버젼 11 통계 소프트웨어(STATACorp, LP, College Station, Tex)를 사용하여 수행하였다.

실시예 2

HIF-1αDNA의 생체내 EP 및 사지 혈류 회복

사지 혈류 회복은 HIF-1α DNA 플라스미드의 생체내-EP 매개 전달 및 HIF-1α DNA 플라스미드의 IM 전달을 수용한 마우스의 허혈 조직에서 시험하였다.

도 3a는 주사된 플라스미드의 전기천공(EP)(저산소증 유도 인자-EP[HIF-EP] 및 빈 골격 플라스미드 DNA-EP[pVAX-EP]) 또는 주사된 플라스미드 단독(저산소증 유도 인자-근육내 주사[HIF-IM])가 이어지는 대퇴 동맥 결찰 후 뒷다리 혈류의 시간 과정을 나타낸다. 도 3a에서, 대표적인 레이저 도플러 관류 영상화 장치(LDPI)는 지시된 날에 기록하였고, 관류 신호는 코드로 나타냈다, 즉 불량한 관류는 (0)이었고, 양호한 관류는 (1000)이었다.

혈류의 급격한 감소는 대퇴 동맥 결찰 후 0일째에 왼쪽 사지(결찰된, 백색 화살표)에서 명백했다(도 3a). 따라서, 이러한 LDPI 측정은 성공적인 대퇴 동맥 결찰과 일치하여 0일째에 결찰되지 않은 사지와 비교하여 결찰된 사지에서 급격하게 감소된 흐름을 나타냈다(도 3a). 지속적인 혈류 회복은 다른 두 그룹(HIF-IM 및 pVAX-EP)과 비교하여 HIF-EP로 처리된 그룹에서 관찰되었다(도 3a).

더욱이, 일련의 LDPI 측정은 결찰된 사지에서, 그러나 변동 비율 및 조도로 정상 혈류 회복을 나타냈다. 혈류 회복은 활성 치료 그룹(HIF-EP) 및 양성 대조군(HIFIM)에서 3일 내지 7일째에 명백했다. 회복은 두 그룹에서 14일째에 감소되었지만, 이는 21일째에 증가하였다. 결국, HIF-EP 마우스는 HIF-IM 마우스와 비교하여 3일부터 14일까지 유사한 흐름 회복을 가졌다.

도 3b는 저산소증 유도 인자 1α(HIF-1α) DNA에 이은 EP에 의한 치료가 마우스에서 대퇴 동맥 결찰 후 사지 관류 회복을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 사지 관류 회복은 LDPI를 사용하여 수술전 날부터 수술후 21일까지 순차적으로 수행하였다. 평균 관류 비(결찰된/결찰되지 않은 사지)를 각 시점에서 각 마우스에 대해 및 각 치료 그룹에 대해 계산하였다. 데이터는 21일까지 통계적 유의성에 대해 평균 ± 평균의 표준 오차(각 동물을 교차하는 오차 막대)로서 나타냈다(P < .05). *HIF-EP 대 pVAX-EP; P < .001; **HIF-IM 대 pVAX-EP; P < .01; 및 ^aHIF-EP 대 HIF-IM; P < .05. HIF-EP 및 HIF-IM 사이의 사지 혈류의 유의한 개선이 21일째에 검출되었다(1.03 ± 0.15 대 0.78 ± 0.064; 도 3b). 혈류 회복은 pVAX-EP 그룹에서 훨씬 더 느린 속도로 유지되었다.

실시예 3

사지 기능 회복 및 HIF-1α DNA의 생체내 EP

사지 기능 회복은 HIF-1α DNA 플라스미드의 생체내-EP 매개 전달 및 HIF-1α DNA 플라스미드의 IM 전달을 수용한 마우스의 허혈 조직에서 시험하였다.

도 4A, 4B, 4C 및 4D는 대퇴 동맥 결찰 및 각각 HIF-EP, HIF-IM, pVAX-EP, 및 통상 위장 처리된 사지에 의한 치료 후 중증 하지 허혈의 회복을 나타낸다. 도 3c는 임상적 발 움직임이 HIF-1α DNA에 이어 EP로 처리된 마우스에서 대퇴 동맥 결찰 후 향상되었음을 나타낸다. 발 움직임을 측정하였고, 허혈 유도후의 기능 결손을 평가하기 위해 기능적 판독 파라미터로서 0 내지 4로 스코어화했다. 활동적인 발 움직임은 pVAX-EP 마우스에서 상당히 손상되었지만, 21일째에 HIF-EP 마우스에서 상당히 향상되었다. 데이터는 통계적 유의성(P < .05)에 대해 평균 ± 평균의 표준 오차(각 마우스를 교차하는 오차 막대)였다. *HIF-EP 대 pVAX-EP; P < .001; **HIF-IM 대 pVAX-EP; P < .01; 및 ^aHIF-EP 대 HIF-IM; P < .05.

이러한 데이터는, 세 치료 그룹 모두 에 대해 0일째에 급성 사지 기능 손상이 존재했다는 것을 나타냈다. HIF-EP 및 HIF-IM 마우스는 3 내지 14일에 걸쳐 사지 기능이 유사한 향상을 나타냈다. 발 움직임 스코어에서 통계적으로 유의한 차이는 21일째에 나타났고(3.5 ± 0.58 대 2.4 ± 1.14; P < .05), 여기서 발 움직임 스코어는 HIF-IM 마우스와 비교하여 HIF-EP 마우스로부터 상당히 더 높았다. pVAX-EP 마우스는 21일까지 모두 최악의 사지 기능 회복을 나타냈다(도 3c).

실시예 4

HIF-1α DNA의 생체내 EP 및 사지 괴사

사지 괴사는 HIF-1α DNA 플라스미드의 생체내-EP 매개 전달 및 HIF-1α DNA 플라스미드의 IM 전달을 수용한 마우스의 허혈 조직에서 시험하였다.

도 3d는 임상적 사지 괴사 스코어가 HIF-1α에 이어 EP로 처리된 마우스에서 21일에 걸쳐 향상되었음을 나타낸다. 0으로부터 4까지의 임상적 스코어화 시스템을 사용하여 대퇴 정맥 결찰 후 사지 괴사율을 측정하였고, ≥3의 스코어를 갖는 마우스는 심각한 괴사를 갖는 것으로 간주하여 안락사시켰다. 추가의 pVAX-EP 마우스는 >3의 사지 괴사를 가져 HIF-EP 및 HIF-IM 마우스와 비교할 때 안락사를 필요로 했다. 데이터는 21일까지 39마리 마우스에 대해 평균 ± 평균의 표준 오차(오차 막대), (HIF-EP, n = 13; HIF-IM, n = 14; pVAX-EP, n =12), P < .05에서 통계적 유의성으로서 요약된다.

이러한 데이터는, 사지 기능 회복이 괴사 정도 및/또는 심각한 괴사 또는 자가 절단에 기인하는 안락사의 필요성에 상관된다는 것을 나타냈다. HIF-EP 마우스는 HIF-IM 마우스와 비교하고(77% 6 12% 대 43% 6 14%; P < .05) 및 HIF-EP를 pVAX-EP와 비교할 때(77% 6 12% 대 17% 6 11%; P < .01; 도 3d), 가장 낮은 비율의 사지 괴사(사지 괴사 스코어 <3) 및 안락사를 필요로 하는 자가절단을 나타냈다.

실시예 5

조직 괴사, 모세혈관 밀도, 측부 혈관 및 혈관 영역

조직 괴사, 모세혈관 밀도, 측부 혈관 및 혈관 영역은 HIF-1α DNA 플라스미드의 생체내-EP 매개 전달 및 HIF-1α DNA 플라스미드의 IM 전달을 수용한 마우스의 허혈 조직에서 시험하였다.

괴사, CD31-양성 내피 세포 및 α-SMA-양성 혈관을 위해 헤마톡실린 및 에오신 및 면역형광성 염료로 21일째에 염색된 내전근 조직 부분의 대표적인 현미경 사진은 각각 도 5a 및 5c에 도시된다. 도 5a는 21일째에 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색된 내전근 조직 부분(section)의 대표적인 현미경 사진(원 배율, x200)을 도시하여 양성 대조군(저산소증 유도 인자-근육내 주사[HIF-IM])과 비교하여 음성 대조군(빈 골격 플라스미드 DNA-전기천공[pVAX-EP]) 중의 결찰된 근육에 더 많은 괴사 조직이 존재하였음을 나타낸다. 활성 치료 그룹(HIF-EP)에는 보다 적은 괴사성 침투 염증 세포가 존재하였다.

도 5c는 모세혈관 밀도를 정량화하기 위해 21일째에 CD31+모세혈관을 위해 염색된 내전근 조직의 대표적인 현미경 사진(원 배율, x200)을 나타낸다. CD31+모세혈관의 수는 음성 대조 요법을 수용한 것들(pVAX-EP) 및 양성 대조군(HIF-IM)과 비교할 때 HIF-EP 치료를 수용한 결찰된 사지 근육에서 더 많았다.

도 5b는 요약된 정량적 데이터가 양성 대조군(HIF-IM) 및 음성 대조군(pVAX-EP)과 비교하여 활성 치료 그룹(HIF-EP)에서 괴사 조직의 상당히 낮은 비율의 영역을 나타냈다는 것을 나타낸다. 데이터는 P <.05에서 설정된 통계적 유의성에서 평균 ± 평균의 표준 오차(오차 막대)로서 제시된다. *P < .001 (HIF-EP 대 HIF-IM); **P < .01 (HIF-IM 대 pVAX-EP); 및 ^#P < .0001 (HIF-EP 대 pVAX-EP). HIF-EP 마우스는 21일에 대조군과 비교하여 보다 적은 내전근 괴사를 가졌다(HIF-EP 대 HIF-IM, 20.7% ± 1.75% 대 44% ± 3.73%; P < .001; HIF-EP 대 pVAX-EP, 20.7% ± 1.75% 대 60.05% ± 2.17%; P <.0001; 및 HIF-IM 대 pVAX-EP, 44% ± 3.73% 대 60.05% ± 2.17%; P < .01; 도 5b).

도 5d는 CD31+모세혈관이 음성 대조군(pVAX-EP) 및 양성 대조군(HIF-IM)과 비교하여 활성 치료 그룹(HIF-EP)에서 상당히 높았다는 것을 증명한 정량적 데이터 요약을 나타낸다. 데이터는 P <.05에서 평균 ± 평균의 표준 오차, 통계적 유의성으로서 제시된다. *P < .001 (HIF-EP 대 HIF-IM); **P < .001 (HIF-IM 대 pVAX-EP); 및 ^#P < .0001 (HIF-EP 대 pVAX-EP). 모세혈관 밀도(CD31+ 내피 세포)는 대조군과 비교하여 HIF-EP 마우스의 내전근에서 증가되었다(HIF-EP 대 HIF-IM, 96.83 ± 5.72 혈관/고배율 시야[hpf] 대 62.87 ± 2.0 혈관/hpf; P < .001; HIF-EP 대 pVAX-EP, 96.83 ± 5.72 혈관/hpf 대 39.37 ± 2.76 혈관/hpf; P < .0001; 및 HIF-IM 대 pVAX/EP, 62.87 ± 2.0 혈관/hpf 대 39.37 ± 2.76 혈관/hpf; P < .001; 도 5d).

도 6a는 평활근 액틴(SMA)+ 혈관(혈관 리모델링/측부)이 음성 대조군(빈 골격 플라스미드 DNA-EP[pVAX-EP]) 및 양성 대조군(저산소증 유도 인자-근육내 주사[HIF-IM])와 비교하여 활성 치료 그룹(저산소증 유도 인자-전기천공[HIF-EP])에서 상당히 높았다는 것을 보여주는 요약된 정량적 데이터를 묘사한다. 데이터는 P <.05에서 평균 ± 평균의 표준 오차, 통계적 유의성으로서 제시된다. *P < .0001 (HIF-EP 대 HIF-IM); **P < .0001 (HIF-IM 대 pVAX-EP); 및 ^#P < .001 (HIF-EP 대 pVAX-EP). 측부 혈관 수/혈관 리모델링은 대조군과 비교하여 HIF-EP 마우스에서 또한 증가하였다(HIF-EP 대 HIF-IM, 76.33 ± 1.94 혈관/hpf 대 37.5 ± 1.56 혈관/hpf; P < .0001; HIF-EP 대 pVAXEP, 76.33 ± 1.94 혈관/hpf 대 18.5 ± 1.34 혈관/hpf; P < .00001; 및 HIF-IM 대 pVAX-EP, 37.5 ± 1.56 혈관/hpf 대 18.5 ± 1.34 혈관/hpf; P < .001; 도 6a).

도 6b는 SMA+ 혈관이 음성 대조군(pVAX-EP) 및 양성 대조군(HIF-IM)과 비교하여 활성 치료 그룹(HIF-EP)에서 총 면적(㎛²)에서 상당히 컷다는 것을 증명하는 정량적 데이터 요약을 묘사한다. 통계적 유의성은 P < .05에서 설정되었다. *P < .001 (HIF-EP 대 HIF-IM); **P < .05 (HIF-IM 대 pVAX-EP); 및 ^#P < .0001 (HIF-EP 대 pVAX-EP). 총 혈관 면적은 대조군과 비교하여 HIF-EP에서 더 컷다(HIF-EP 대 HIF-IM, 15,521.67 ± 1298.16㎛² 대 7788.87 ± 392.04㎛²; P < .001; HIF-EP 대 pVAX-EP, 15,521.67 ± 1298.16㎛² 대 4640.25 ± 614.01㎛²; P < .0001; 및 HIF-IM 대 pVAX-EP, 7788.87 ± 392.04㎛² 대 4640.25 ± 614.01㎛²; P < .05; 도 6b).

실시예 6

실시예 2 내지 5로부터의 결과의 요약

상기 조사를 요약하면, HIF-1α 플라스미드 DNA의 생체내 EP 매개 전달은 사지 허혈의 마우스 모델에서 혈관신생을 개선시켰다. 구체적으로, 조사는, HIF-1α DNA의 생체내 EP가 사지 관류(HIF-EP: 1.03 ± 0.15 대 HIF-IM: 0.78 ± 0.064; P < .05, 대 pVAX-EP: 0.41 ± 0.019; P < .001), 사지 기능 회복(HIF-EP: 3.5 ± 0.58 대 HIF-IM, 2.4 ± 1.14; P < .05, 대 pVAX-EP: 2.4 ± 1.14; P < .001) 및 21일째 사지 자가절단(HIF-EP: 77% ± 12% 대 HIF-IM: 43% ± 14%; P < .05 대 pVAX-EP: 17% ± 11%; P < .01)을 상당히 개선시켰다는 것을 입증하였다.

조사는 또한 내전근 조직 괴사가 감소되었고(HIF-EP: 20.7% ± 1.75% 대 HIF-IM: 44% ± 3.73; P < .001, 대 pVAX-EP: 60.05% ± 2.17%; P < .0001), 모세혈관 밀도가 증가되었고(HIF-EP: 96.83 ± 5.72 혈관/고배율 시야[hpf] 대 HIF-IM: 62.87 ± 2.0 혈관/hpf; P < .001, 대 pVAX-EP: 39.37 ± 2.76 혈관/hpf; P < .0001), 측부 혈관 형성이 증가되었고(HI-EP: 76.33 ± 1.94 혈관/hpf 대 HIF-IM: 37.5 ± 1.56 혈관/hpf; P < .0001, 대 pVAX-EP: 18.5 ± 1.34 혈관/hpf; P < .00001), 혈관이 더 커졌다(HIF-EP: 15,521.67 ± 1298.16㎛² 대 HIF-IM: 7788.87 ± 392.04㎛²; P < .001 대 pVAX-EP: 4640.25 ± 614.01㎛²; P < .0001)는 것을 입증하였다.

따라서, 이러한 데이터는 연구의 종점(즉, 21일째)까지 HIF-1α 플라스미드 DNA의 생체내 EP-매개 전달을 수용한 마우스에서 사지 관류 회복, 생리학적 사지 기능, 모세혈관 수준에서 개선된 혈관분포, 혈관 리모델링 및 조직 형태학적 특징에서 통계적으로 유의한 개선을 입증하였다. HIF-1α 플라스미드 DNA의 IM 전달을 수용한 마우스는 연구의 종점(즉, 21일째)까지 이러한 이점을 유지하지 않았다. 이러한 데이터는 또한 HIF-1α 플라스미드 DNA의 생체내 EP-매개 전달을 수용한 마우스가 상당히 낮은 비율의 사지 괴사 및 자가 절단을 가졌다는 것을 입증하였다.

상기 상세한 설명 및 동반되는 실시예는 단지 예시적이고, 첨부되는 특허청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 정의되는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안되는 것으로 이해된다.

개시된 구현예에 대한 다양한 변화 및 변형이 당업자에게 자명하다. 본 발명의 화학적 구조물, 치환체, 유도체, 중간체, 합성, 조성물, 제형 또는 사용 방법에 관련된 것들을 제한 없이 포함하는 이러한 변화 및 변형은 이의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않고 수행될 수 있다.

<110> THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA WEINER, David MUTHUMANI, Karuppiah MOHLER, Emile OUMA, Geoffrey <120> METHOD FOR STIMULATING THE IMMUNE SYSTEM WITH HYPOXIA INDUCIBLE FACTOR-1 <130> 61800703 <150> US 61/800,703 <151> 2013-03-15 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1647 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-bet <400> 1 atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctgggatt 60 gtggaacctg gatgtggaga tatgctgact ggaacagaac ctatgccttc agatgagggg 120 agaggacccg gcgcagatca gcagcacaga ttcttttacc cagagccagg agcacaggac 180 cctactgata ggagagctgg cagctccctg ggaaccccat acagcggagg agccctggtc 240 cctgcagctc cagggcgctt cctgggctcc tttgcttatc cacccagggc ccaggtggct 300 ggatttcctg gaccagggga gttctttcca ccccctgctg gagcagaagg gtacccaccc 360 gtggacggct atcccgctcc tgatccacga gcaggactgt accccgggcc tagggaggac 420 tatgcactgc cagccggcct ggaagtgtcc ggaaagctgc gggtcgccct gtccaaccac 480 ctgctgtggt ctaagttcaa tcagcatcag accgagatga tcattacaaa acagggcagg 540 aggatgttcc 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gagaatcaag tccccagaga gctgagaggt gtaagaagtc ctggctgctg 120 tgcatcgtcg ccctgctgct gatgctgctg tgcagtctgg gaactctgat ctacacctca 180 ctgaaaccta cagccattga gagctgtatg gtgaagttcg aactgagctc ctctaaatgg 240 cacatgacta gtcccaagcc tcattgcgtg aacaccacat ccgacgggaa gctgaaaatc 300 ctgcagtctg ggacctacct gatctatggc caggtcatcc cagtcgacaa gaaatacatc 360 aaggataatg cccccttcgt ggtccagatc tacaagaaaa acgacgtgct gcagacactg 420 atgaatgatt ttcagatcct gcccattggc ggagtctacg agctgcacgc tggcgacaac 480 atctatctga agtttaattc caaggatcat attcagaaaa caaacaccta ttgggggatt 540 atcctgatgc cagacctgcc cttcattagc taatga 576 <210> 7 <211> 803 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TWEAK <400> 7 atggattgga cttggatctt atttttagtt gctgctgcta ctagagttca ttctgccgca 60 agacggagtc agcgaagacg gggaagaagg ggagaacctg gcaccgcact gctggcacct 120 ctggtcctga gcctgggact ggctctggca tgcctggggc tgctgctggt ggtcgtgtct 180 ctgggcagtt gggcaactct gtcagcccag gagccaagcc aggaggaact gaccgccgaa 240 gacaggagag agccccctga actgaaccct cagaccgagg aatcccagga tgtcgtgcca 300 ttcctggagc agctggtccg accacggcgc tctgccccaa agggacgaaa agctcgaccc 360 cgaagggcaa tcgccgctca ctacgaggtg catccacgac caggacagga cggagcacag 420 gctggagtcg atggcaccgt gagcggatgg gaggaaacaa agattaacag ctcctctcct 480 ctgagatatg acagacagat cggcgagttc acagtgatta gagcaggact gtactatctg 540 tactgtcagg tccactttga cgaaggaaag gccgtgtacc tgaaactggt ctgctggtca 600 atggggtgct ggccctgcga tgcctggagg agttcagcgc cacagcagcc agttcacctg 660 gaccacagct gcgactgtgc caggtgtctg gactgctgcc actgcgacct gggagctccc 720 tgagaatccg gactctgccc tgggctcatc tgaaggctgc tccatttctg acatactttg 780 ggctgttcca ggtccactaa tga 803

Claims

저산소증 유도 인자-1α(HIF-1α)를 포함하는, 치료제.
청구항 1에 있어서, HIF-1α가 서열 식별 번호: 1에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 3에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 5에 기재된 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 1과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열, 서열 식별 번호: 3과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열 또는 서열 식별 번호: 5와 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열로 인코딩되는, 치료제.
청구항 2에 있어서, HIF-1α가 서열 식별 번호: 5에 기재된 뉴클레오티드 서열로 인코딩되는, 치료제.
청구항 2에 있어서, 서열 식별 번호: 2에 기재된 아미노산 서열, 서열 식별 번호: 4에 기재된 아미노산 서열, 서열 식별 번호: 6에 기재된 아미노산 서열, 서열 식별 번호: 2와 95% 이상 동일한 아미노산 서열, 서열 식별 번호: 4와 95% 이상 동일한 아미노산 서열 또는 서열 식별 번호: 6과 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 치료제.
청구항 3에 있어서, 서열 식별 번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 추가로 포함하는, 치료제.
청구항 1에 있어서, HIF-1α는, HIF-1α가 세포 내에서 하이드록실화될 수 없도록 돌연변이되는, 치료제.
청구항 6에 있어서, HIF-1α의 프롤린 잔기가 세포 내에서 하이드록실화될 수 없는, 치료제.
청구항 1에 있어서, 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 치료제.
치료를 필요로 하는 대상체에서 저산소증 또는 허혈을 치료하는 방법으로서, 청구항 1의 상기 백신을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 백신을 투여하는 단계는 전기천공을 포함하는, 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 백신을 투여하는 단계는 근육내 투여 및 피내 투여 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 저산소증 또는 허혈이 중증 하지 허혈, 말초 동맥 질환, 상처 치유, 혈관 질환, 순환기 질환, 관상 동맥 질환, 심혈관 질환 또는 당뇨병과 관련되는, 방법.
청구항 12에 있어서, 상기 저산소증 또는 허혈이 중증 하지 허혈과 관련되는, 방법.
청구항 9에 있어서, 모세혈관 밀도, 측부 혈관 형성 또는 혈관 크기 중의 적어도 하나가 상기 백신을 투여하지 않은 대상체와 비교하여 상기 백신을 투여한 상기 대상체에서 증가되는, 방법.
청구항 9에 있어서, 조직 관류가 상기 백신을 투여하지 않은 대상체와 비교하여 상기 백신을 투여한 상기 대상체에서 증가되는, 방법.
청구항 9에 있어서, 조직 괴사가 상기 백신을 투여하지 않은 대상체와 비교하여 상기 백신을 투여한 상기 대상체에서 감소되는, 방법.
서열 식별 번호: 5 및 서열 식별 번호: 5와 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산 분자.
청구항 17에 있어서, 상기 뉴클레오티드는 플라스미드인, 핵산 분자.
서열 식별 번호: 6 및 서열 식별 번호: 6과 95% 이상 동일한 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 핵산 분자.