CN105330732B - 腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其应用 - Google Patents
腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105330732B CN105330732B CN201510730274.0A CN201510730274A CN105330732B CN 105330732 B CN105330732 B CN 105330732B CN 201510730274 A CN201510730274 A CN 201510730274A CN 105330732 B CN105330732 B CN 105330732B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hif
- alpha
- mutant
- inductive factor
- hypoxic inductive
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体,该突变体是由野生型人低氧诱导因子1α蛋白质的第402位脯氨酸(Pro)、第564位脯氨酸(Pro)、第803位天冬酰胺(Asn)、第532位赖氨酸(Lys)以及第551位丝氨酸(Ser)、第555位苏氨酸(Thr)、第589位丝氨酸(Ser)均突变为丙氨酸(Ala)而得。在常氧条件下,该突变体的降解速度要明显低于野生型的降解速度,具有更加稳定的特性,且能明显促进创伤修复。本发明还涉及该腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体在制备具有创伤修复功能药物、用于促进血管新生或者改善缺血的药物、用于提高人低氧诱导因子1α蛋白质在常氧条件下的稳定性药物中的用途。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域,具体涉及一种腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其在制备具有创伤修复功能、促进血管新生或者改善缺血等药物中的用途。
背景技术
1998年美国费城威斯特研究所的Ellen Heber-Katz教授的实验室发现了一种小鼠Murphy Roths Large(MRL),在其耳朵上打孔后,其耳朵上的组织会在4周内自动再生,让耳洞消失,恢复到打孔前的状态,并不留下疤痕。二十多年来这个研究团队一直在寻找这种小鼠拥有罕见再生机能的原因。近日,该研究团队发现,一个功能强大的调节蛋白,低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α),参与MRL小鼠组织的再生。提高HIF-1α的表达水平,能使小鼠的伤口迅速愈合,甚至再生耳组织中还有含有软骨和毛囊(YongZhang et al.,2015)。关于HIF家族促进组织修复和重塑的报道还有很多,如能帮助肾脏细胞和组织修复(Bernhardt et al.,2006; Weidemann et al., 2008; Ma et al., 2009;Jianping Peng et al.,2011)。HIF-1α是关键性成血管因子,能够显著增强血管的再生和重建(Pajusola K et al.,2005;Sarkar K et al.,2009;Chang E1 et al.,2007;Bosch-Marce M et al.,2007;Rajagopalan S et al.,2007)。
HIF-1α是一种氧调节分子,无论是表达水平、蛋白质的稳定性,还是促转录活性都受到机体内氧浓度和各种细胞内外信号的调控,HIF-1α成为影响HIF-1作用的主要因子,然而HIF-1α是氧气敏感的亚基,其半衰期在常氧状态下通常不超过5分钟。
影响HIF-1α稳定性的主要原因在于:1)一些翻译后修饰作用,如羟基化、乙酰化、磷酸化以及S-亚硝基化反应会影响HIF-1α蛋白质稳定性和转录活性;2)HIF-1α可以通过依赖于泛素-蛋白酶体途径和不依赖于泛素-蛋白酶体途径被降解。常氧状态下,氧敏感的脯氨酸羟化酶1,2,3(PHDs1-3)处于激活状态,可以促使HIF-1α氧依赖降解结构域(ODD)的402和/564位点的脯氨酸残基发生羟基化修饰,导致HIF-1α与特异的E3泛素连接酶-肿瘤抑制蛋白pVHL(von Hippel- Lindau)结合,并通过泛素-蛋白酶途径降解。同时,羟化酶还可以作用于HIF-1α转录激活区803位点的天冬酰胺残基(Asn803),通过HIF-1α抑制因子(FIH)抑制HIF-1α与辅助激活因子(CBP/P300)结合,从而抑制其转录活性。除了羟基化修饰,HIF-1α的ODD结构域的赖氨酸位点(Lys532)还可以被一种称为ARD1的乙酰转移酶修饰,这种修饰能增加常氧条件下HIF-1α与pVHL的相互作用,从而促进它的泛素化和降解。磷酸化作用对HIF-1α的转录活性和稳定性均有影响, HIF-1α的磷酸化水平主要是由两条激酶的磷酸化活化通路决定的:P42/P44丝裂源激活的蛋白激酶(MAPK)通路和磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)通路,前者主要是对HIF-1α转录活性产生影响,后者不仅对HIF-1α的转录活性产生影响,而且还对其蛋白质稳定性产生影响,PI3K/Akt通路不能直接磷酸化HIF-1α,而是通过mTOR(mammalian target of rapamycin)或GSK3(glycogen synthase kinase 3)来调节,GSK3能使HIF-1α磷酸化而被蛋白酶体识别并降解,影响其稳定性,目前,HIF-1α的Ser551、Thr555和Ser589位点已被证实是PI3K/Akt/ GSK3途径的磷酸化位点(D. Mottet et al.,2003;D. Flugel et al., 2007;S.E. Schnitzer et al., 2005)。
常氧条件下降低HIF-1α降解速度的方式主要是添加PHD、FIH和ARD1蛋白酶活性抑制剂来避免HIF被蛋白酶体降解,从而调节HIF稳定性和/或活性,如:1)Wanja M. 等人利用FG-4487抑制PHD活性,从而增加HIF稳定性;2)CN 101664553 B 低氧诱导因子(HIF)α的稳定化,通过加入杂环羧酰胺化合物抑制HIF脯氨酰羟化酶活性来稳定HIFα亚基(HIFα);3)CN102272117 B 作为HIF羟化酶抑制剂的苯并噻喃衍生物,通过加入苯并噻喃衍生物来抑制HIF羟化酶活性,从而提高HIF稳定性。
除此以外,通过基因工程手段,直接将有可能影响HIF稳定性的羟基化、乙酰化、磷酸化等位点的氨基酸突变为其他氨基酸,从而增加HIF的稳定性。目前,突变的氨基酸位点主要是第402位脯氨酸(Pro)、第564位脯氨酸(Pro)和第803位天冬酰胺(Asn),以下简称HIF-1α 3mut。如:1)CN 101307102 A 人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体及其应用,将野生型HIF-1α蛋白质在常氧条件下发生羟基化的第402位、第564位脯氨酸(Pro)和第803位天冬酰胺(Asn)突变为其他氨基酸,防止HIF-1α通过泛素-蛋白酶系统降解。2)Jiajia Xie等人将野生型HIF-1α蛋白质在常氧条件下发生羟基化的第402位、第564位脯氨酸(Pro)和第803位天冬酰胺(Asn)突变为丙氨酸,突变型HIF-1α的半衰期要长于野生型HIF-1α。除此以外,还未见有其他氨基酸突变位点。
腺相关病毒(AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒,具有安全性好、宿主范围广、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长、物理性质稳定等特点,被视为最有前途的基因转载体之一。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种HIF-1α的突变体,将影响HIF-1α稳定性的羟基化位点、乙酰化位点、磷酸化位点的氨基酸突变为其他氨基酸,以期获得在常氧条件下稳定高活性的HIF-1α突变体,为以后的临床应用打好基础。为实现此目的,本发明人将野生型HIF-1α蛋白质的第402位脯氨酸(Pro)、第564位脯氨酸(Pro)、第803位天冬酰胺(Asn)、第532位赖氨酸(Lys)以及第551位丝氨酸(Ser)、第555位苏氨酸(Thr)、第589位丝氨酸(Ser)均突变为丙氨酸(Ala),在常氧条件下,该HIF-1α突变体的降解速度要明显低于野生型HIF-1α,具有更加稳定的特性。
本发明的第二个目的是提供该HIF-1α突变体的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供构建HIF-1α突变体的高效表达载体,优选是病毒载体,更优选是腺相关病毒载体。
本发明的第四个目的是提供含有本发明核苷酸序列或者本发明载体的宿主细胞。
本发明的最后一个目的是提供腺相关病毒介导的HIF-1α突变体在制备具有创伤修复功能药物、用于促进血管新生或者改善缺血的药物、用于提高HIF-1α蛋白质在常氧条件下的稳定性药物中的用途。
本发明的有益效果在于:在常氧条件下,本发明公开的HIF-1α突变体的降解速度要明显低于野生型的降解速度,具有更加稳定的特性。该HIF-1α突变体能更有效的促进毛细血管管腔生成,具有更加高效的创伤修复能力。
附图说明
附图1 为不同时间点ELISA检测HIF-1α含量变化趋势图。
附图2 为体外毛细血管管腔生成实验图(A:AAV-HIF-1a 7mut;B:AAV-HIF-1a3mut;C:AAV- HIF-1α;D:PBS )。
附图3 为促大鼠创伤修复实验图。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如分子克隆实验指南(第三版,J. 萨姆布鲁克等著)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非特殊定义,本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。例如:“低氧诱导因子1α”和“ HIF-1α”具有相同的含义。
实施例1 HIF-1α野生型及其突变型的活性测定。
获得目的基因片段。
由上海生物工程有限公司全基因合成野生型HIF-1α(测序结果见SEQ ID NO.1)、三突变型HIF-1α(命名为HIF-1α 3mut,测序结果见SEQ ID NO.2)和七突变型HIF-1α(命名为HIF-1α 7mut,测序结果见SEQ ID NO.3),并构建到puc57载体中。载体分别命名为puc57-HIF-1α、puc57-HIF-1α 3mut和puc57-HIF-1α 7mut,并提供对应的质粒和菌液。
吸取puc57-HIF-1α菌液2ul加入5ml LB培养基中(含氨苄青霉素1/1000),放入37℃恒温培养箱中培养12小时。离心收集菌体,提取质粒(详细步骤参见Takara质粒小量提取纯化试剂盒说明书)。采用限制性内切酶EcoRI和BamHI(购自Takara公司)双酶切质粒puc57-HIF-1α,酶切体系如下:
37℃水浴30min。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物,回收HIF-1α的片段,条带位置在2.2kb(操作步骤参照Takara琼脂糖核酸纯化回收试剂盒说明书)。
采用同样的方法,酶切回收纯化基因片段HIF-1α 3mut和HIF-1α 7mut。
采用同样的方法,酶切回收纯化pTRE Tight四环素调控载体(购自Clontech公司)的载体骨架。
构建四环素调控载体介导的HIF-1α野生型及其突变型表达载体。
将HIF-α基因片段插入步骤1得到的酶切回收pTRE Tight载体中(具体步骤参照Takara公司DNA Ligation Kit Ver. 2.1试剂盒说明书)。连接体系如下:
16℃孵育30min。取连接产物10ul加入100ul DH5α感受态细胞(购自Takara公司)中吹打均匀,冰上静置20min,再放入42℃水浴90s,迅速置于冰中,静置3min,加入500ul LB液体培养基,180rpm 、37℃振荡培养1h,取菌液100ul均匀涂布于LB固体培养基(含1/1000AMP),37℃培养过夜。挑取单克隆菌落于5ml LB培养基(含1/1000氨苄青霉素)中,180rpm 、37℃培养 12h。
用1.5mL离心管收集1-5mL菌液。12000rpm离心1min,弃上清;加入250μL溶液Ⅰ/RNase A混合液,漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮,室温静置1-2min;加入250μL溶液Ⅱ,轻柔地反复颠倒混匀5-6次,室温放置1-2min,使菌体充分裂解,直至形成澄清的裂解溶液;加入350μL溶液Ⅲ,立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次,此时会出现白色絮状沉淀;12000rpm室温离心10min,收集上清;将上清置于DNA纯化柱中,静置1-2min;12000rpm离心1min,弃上清,加入500μL溶液PB,12000rpm离心1min,弃上清,加入500μL溶液W,12000rpm离心1min,弃上清。加入500μL溶液W,12000rpm离心1min,弃上清,12000rpm离心3min,以彻底去除纯化柱中残留的液体;将DNA纯化柱置于新的离心管中,向纯化柱中央处悬空滴加50-100μL溶液Eluent,室温放置2min,12000rpm离心1min,管底即为高纯度质粒DNA。
取样送至上海生物工程有限公司测序验证确认正确。将构建的质粒命名为pTRETight-HIF-1α。同理,构建pTRE Tight-HIF-1α 3mut和pTRE Tight-HIF-1α 7mut质粒载体。
无内毒素质粒DNA 的制备。
A、分别取步骤2获得的pTRE Tight-HIF-1α、pTRE Tight-HIF-1α 3mut和pTRETight-HIF-1α 7mut重组质粒1μL加入100μL DH5α感受态细胞中吹匀,放置冰中静置20min,再放入42℃水浴90s,迅速置于冰浴中3min,加入500μL LB液体培养基,放置摇床180rpm 37℃1h,取菌液100μL均匀涂布于Amp浓度为100 μg/mL 的LB固体培养基37℃培养过夜;
B、取单菌落于3mL Amp浓度为100 μg/mL的LB液体培养基中,250rpm、37℃振荡培养8小时;从中取300μL菌液接种于300mL Amp浓度为100 μg/mL的LB液体培养基中,并于250rpm、37℃振荡培养12~16小时;
C、收集菌液,然后在4℃、4000rpm条件下离心15min,弃上清,收集菌体,然后按照QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi Kit试剂盒说明书操作步骤提取质粒,得无内毒素的pTRETight-HIF-1α、pTRE Tight-HIF-1α 3mut和pTRE Tight-HIF-1α 7mut质粒。
细胞株HEK293Tet-Off® Advanced的复苏与培养。
取液氮冻存的HEK 293 Tet-Off® Advanced 细胞株(购自Clontech公司),迅速放于37℃水浴中解冻,期间不断晃动使离心管内溶液尽量受热均匀;解冻后迅速加入7mL体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液中(DMEM培养液需要提前预热至37℃),枪头轻轻吹打至无细胞团存在,然后在1300rpm条件下离心6min,弃去上清;再向离心管中加2 mL提前预热至37℃体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液,吹打细胞使其悬浮,按照5×104个细胞将细胞接种于培养皿,并于37℃、含5%的CO2培养箱中培养24h,然后换液,以后每隔2天换液至细胞密度达90%时传代。
脂质体转染。
转染前一天,按照每瓶4×105个HEK 293细胞接种到培养瓶中,培养24 h后细胞约有70% 融合,转染前4h,用无双抗PBS清洗2次细胞,将含血清的培养液换为无双抗、无血清的优化培养液Opti-MEM I(2 mL/瓶);LipofectamineTM2000(购自Invitrogen公司)作为转染试剂将pTRE Tight-HIF-1α转染至HEK 293 Tet-Off® Advanced,具体步骤依照说明书进行,转染体系如下:
按照与上述相同的方法分别转染pTRE Tight-HIF-1α 3mut质粒和pTRE Tight-HIF-1α 7mut质粒。
检测HIF-1a蛋白含量。
转染48小时后,更换含有四环素的DMEM培养基培养。分别培养1min,3min、5 min、7min、9 min、11 min、13 min、15 min、17 min、19 min、21 min、23 min、25min、27 min、29min、31 min、33min、35 min、37 min、39min、41 min、43 min、45min、47 min(共24个时间点)后,吸出培养液,将PBS加入培养瓶中洗涤,吸出PBS,加入4%多聚甲醛,室温下静置10min,固定细胞。胰酶消化细胞,用PBS(pH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成分,2000-3000rpm离心20min。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心;
应用人HIF-1α ELISA试剂盒(购自上海酶联生物)检测细胞培养上清液中的HIF-1α含量,具体操作步骤参照试剂盒说明书;
实验重复三次,实验结果见附图1。由附图1可看出,本发明公开的HIF-1α 7mut在细胞中的存留时间在47min以上,其降解速率明显低于HIF-α和HIF-1α 3mut的降解速率。
实施例2 重组腺相关病毒的包装。
构建腺相关病毒介导的HIF-1α野生型及其突变型载体。
采用实施例1步骤1同样的方法,酶切回收纯化pAAV-MCS腺相关病毒载体(购自Stratagene公司)的载体骨架。将HIF-α、HIF-1α 3mut、HIF-1α 7mut基因片段分别连接到酶切回收pAAV-MCS载体中(具体步骤参见实施例1步骤2),命名为pAAV-HIF-1α、pAAV-HIF-1α3mut和pAAV-HIF-1α 7mut质粒载体;
AAV病毒包装。
参见实施例1步骤5的方法将pAAV-HIF-1α、pAAV-HIF-1α 3mut和pAAV-HIF-1α7mut质粒分别转染至AAV- 293细胞(购自ATCC)。转染体系为:
AAV病毒收毒。
病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可以将细胞和培养上清都收集下来以获得最好的收率:
1)准备一个干冰乙醇浴(将乙醇倾入装有干冰的泡沫盒即可,也可用液氮替代干冰乙醇浴)和37°C水浴;
2)将产毒的细胞连同培养基一同收集到一个15ml的离心管中。收集细胞时,将培养盘倾斜一定角度将细胞刮到培养基中;
3)1000rpm/min,离心3分钟,分离细胞和上清,将上清液另外存放,细胞用1ml PBS重悬;
4)将细胞悬浮液在干冰乙醇浴和37°C水浴中反复转移,冻融四次。每次融解后稍加震荡。注意:每次凝固和解冻大概需要十分钟的时间。
病毒浓缩。
1)10,000g离心去除细胞碎片,将离心上清液转移到一个新离心管中;
2)将两次收集的上清混合在一起,用0.45um滤器过滤除杂质;
3)加入1/2体积的1M NaCl,10% PEG8000溶液,混合均匀,4℃过夜;
4)12,000rpm离心2h,弃上清,病毒沉淀用适量的PBS溶液溶解,待完全溶解后用0.22um滤器过滤除菌;
5)加入Benzonase核酸酶消化去除残留的质粒DNA(终浓度为50U/ml)。合上管盖,颠倒几次以充分混合。在37°C孵育30分钟;
6)用0.45μm过滤头过滤,取滤出液,即为浓缩的AAV病毒。
病毒包装滴度测定(采用Q-PCR法)。
1)取20ul浓缩病毒液,加入1ul RNase-free DNase,混匀,37℃水浴反应30min;
2)4℃,12000rpm/min,离心10min,取10ul上清到另一个无菌的1.5ml EP管中;
3)加入90ul Dilution Buffer(1mM Tris-HCl, pH8.0,0.1m MEDTA,150mMNaCl),混匀,37℃金属浴反应30min;
4)自然冷却至室温,加入1ul蛋白酶K,65℃水浴反应1h;
5)100℃金属浴反应10min,自然冷却至室温;
6)进行Q-PCR检测滴度。
包装出的重组腺相关病毒命名为AAV-HIF-1a,滴度为2.5×1011,采用同样的方法包装重组腺相关病毒AAV-HIF-1a 3mut,滴度为1.7×1011;AAV-HIF-1a 7mut,滴度为1.6×1011。
收到病毒液后在很短时间内即使用腺相关病毒进行实验,可以将病毒暂时放置于4℃保存;如需长期保存请放置于-80℃保存。
实施例3 HMEC-1体外毛细血管管腔生成实验。
细胞培养。
HMEC-1人微血管内皮细胞株(购于上海中科院细胞库);
培养条件:RPMI-1640培养基(Gibco,美国),10% FBS,1%抗生素 (GibcoBRL),2-3d换液1次,细胞80% 融合度时传代。可按照1∶4传代比例进行,37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。
腺相关病毒感染目的细胞。
取对数生长期的HMEC-1细胞,无血清培养基重悬,调整细胞密度为2×106/ml;
第一天,准备细胞:在24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种5×104个HMEC-1人微血管内皮细胞,每孔培养基体积为250 µl;进行病毒感染时细胞的融合度约为70%左右;
第二天,准备病毒:取出4℃保存的AAV-HIF-1a 7mut、AAV-HIF-1a 3mut、AAV-HIF-1α,使用瞬时离心机离心20秒(使病毒完全悬于离心管底部即可);
感染目的细胞:病毒准备好之后,从培养箱中拿出细胞,以MOI=15进行后续试验,计算好每孔所需病毒原液量。吸去培养基的培养器皿中的培养基(如果细胞生长良好,密度适宜,则不用换液),24孔板中每孔在分别加入相应的病毒原液量,以PBS作为对照组,同时加入5ug/mL的Polybrene(购于Sigma)助转染试剂,以提高感染效率。混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)孵育过夜;
第三天,更换培养液:24小时后将含有腺相关病毒的培养液更换成正常培养液,500ul/孔。
血管形成实验。
实验前提前将基质胶Matrigel(美国,BD公司)置于冰上溶解过夜(20℃保存时为固体状态,冰上过夜后溶解为液态)。将实验中所用的96孔培养板、枪头提前置于冰箱中预冷,每孔内加入Matrigel 200ul,轻微震荡使其均匀平铺,置于37℃培养箱内,30min观察已形成凝胶状后取出。在胶凝固定的过程中,可以开始准备细胞悬液,细胞消化后将细胞悬液浓度调整到2×105cell/mL。从培养箱中取出培养皿,每孔加入200μL细胞悬液,每组3个复孔。盖上盖子后放入培养箱培养。12h后在倒置显微镜(40X)下观察小管形成情况。
结果表明AAV-HIF-1a 7mut(图2A)形成的管腔数要明显多于AAV-HIF-1a 3mut(图2B)、AAV- HIF-1α(图2C)及PBS对照组(图2D)。
实施例4 大鼠创伤修复实验
将SD大鼠随机分为4组,每组10只,称重标记。将SD大鼠适用性喂养1w,实验前一天脱毛、称重。采用10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔麻醉,麻醉成功后,将大鼠固定于手术台上,剃去大鼠耳朵及其周围的毛,碘伏消毒后,在两侧耳朵的中央用金属耳号钳打一直径为3mm的孔。为了防止感染,术后连续5天在大鼠饮用水中加入甲氧苄胺嘧啶,术后的第二天开始给药,1×109pfu的AAV-HIF-1a 7mut、AAV-HIF-1a 3mut、AAV- HIF-1α用50ul 0.9%的无菌生理盐水稀释后尾静脉注射至大鼠体内,以PBS缓冲液作为对照。
于创伤后第3、14、28天用透明薄膜覆盖创面,描摹创面面积,沿边缘剪膜,置于万分之一分析天平上称重,换算创面面积,计算创面愈合率,评价大鼠创面愈合速度。
实验结果表明,AAV-HIF-1a 7mut在促进创伤修复和血管生成方面有明显作用(图3、表1)。
Claims (8)
1.人低氧诱导因子1α突变体,其特征在于该突变体是由野生型人低氧诱导因子1α蛋白质的第402位脯氨酸(Pro)、第564位脯氨酸(Pro)、第803位天冬酰胺(Asn)、第532位赖氨酸(Lys)以及第551位丝氨酸(Ser)、第555位苏氨酸(Thr)、第589位丝氨酸(Ser)均突变为丙氨酸(Ala)而得。
2.一种核苷酸序列,其特征在于编码权利要求1所述的人低氧诱导因子1α突变体,核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种表达载体,其特征在于所述表达载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的表达载体,其特征在于所述的载体为腺相关病毒载体。
5.含有权利要求2所述的核苷酸序列或者含有权利要求3或4的载体的宿主细胞。
6.权利要求1-5中任意一权利要求所述的腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体在制备具有创伤修复功能药物中的用途。
7.权利要求1-5中任意一权利要求所述的腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体在制备用于促进血管新生或者改善缺血的药物中的用途。
8.权利要求1-5中任意一权利要求所述的腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体在制备用于提高人低氧诱导因子1α蛋白质在常氧条件下的稳定性药物中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510730274.0A CN105330732B (zh) | 2015-11-02 | 2015-11-02 | 腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510730274.0A CN105330732B (zh) | 2015-11-02 | 2015-11-02 | 腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105330732A CN105330732A (zh) | 2016-02-17 |
CN105330732B true CN105330732B (zh) | 2019-03-15 |
Family
ID=55281519
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510730274.0A Active CN105330732B (zh) | 2015-11-02 | 2015-11-02 | 腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105330732B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MX2019001276A (es) * | 2016-07-29 | 2019-06-13 | Univ California | Viriones de virus adenoasociados con cápside variante y métodos para su uso. |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101307102A (zh) * | 2007-10-22 | 2008-11-19 | 南方医科大学南方医院 | 人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体及其应用 |
CN102120764A (zh) * | 2010-01-11 | 2011-07-13 | 吴平生 | 三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用 |
-
2015
- 2015-11-02 CN CN201510730274.0A patent/CN105330732B/zh active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101307102A (zh) * | 2007-10-22 | 2008-11-19 | 南方医科大学南方医院 | 人低氧诱导因子1α重组腺病毒载体及其应用 |
CN102120764A (zh) * | 2010-01-11 | 2011-07-13 | 吴平生 | 三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响;陈娓等;《第四军医大学学报》;20081231;第29卷(第15期);1360-1363 |
氧浓度和钙离子对野生型及突变型低氧诱导因子-1α基因真核表达的影响;傅锐斌等;《南方医科大学学报》;20091231;第29卷(第7期);1321-1323,1328 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105330732A (zh) | 2016-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN108315330B (zh) | CRISPR-Cas9系统特异性靶向人RSPO2基因的sgRNA及敲除方法和应用 | |
EP3168298B1 (en) | Production method for non-enveloped virus particles | |
Wang et al. | Mouse γ-synuclein promoter-mediated gene expression and editing in mammalian retinal ganglion cells | |
JP2018516572A (ja) | Rna誘導性の、hiv感染の処置のための、方法および組成物 | |
CN110337493A (zh) | 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法 | |
CN110234762A (zh) | 用于治疗肌强直性营养不良的组合物和方法 | |
CN108715849B (zh) | 一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用 | |
CN105330732B (zh) | 腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体及其应用 | |
Brumm et al. | Astrocytes can adopt endothelial cell fates in a p53-dependent manner | |
CN105586391B (zh) | 人gtpbp4基因的用途及其相关药物 | |
US8183220B2 (en) | Double-effective vaccine vector against foot-and-mouth disease virus (FMDV), methods of preparing and using the same | |
Song et al. | Multiplexed targeting of microRNA in stem cell-derived extracellular vesicles for regenerative medicine | |
Feng et al. | Lentiviral-mediated RNAi targeting p38MAPK ameliorates high glucose-induced apoptosis in osteoblast MC3T3-E1 cell line | |
CN104894223B (zh) | 人copb2基因的用途及其相关药物 | |
CN105624162A (zh) | 针对哺乳动物R-Spondin2基因靶点的小干扰RNA、短发卡RNA及载体和应用 | |
US9434949B2 (en) | Uses of the human ZFX gene and drugs associated with same | |
CN103667422B (zh) | 人cul4b基因的用途及其相关药物 | |
CN103623427B (zh) | 人usp14基因的用途及其相关药物 | |
Loi et al. | Decoy peptides effectively inhibit the binding of SARS-CoV-2 to ACE2 on oral epithelial cells | |
Ameri et al. | Reduced expression of vegf-a in human retinal pigment epithelial cells and human muller cells following CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene disruption | |
CN104450781A (zh) | 一种过表达ciapin1蛋白的细胞系及其制备方法和应用 | |
CN112391385A (zh) | 靶向抑制NCEH1基因表达的siRNA、siRNA质粒、慢病毒及其构建方法和应用 | |
CN104774928B (zh) | 人rrs1基因的应用以及抑制剂 | |
CN111686124A (zh) | miR-486-3p在制备治疗SAH导致的神经炎症产品中的应用 | |
CN104368012B (zh) | 人rpl34基因的用途及其相关药物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |