CN112852745A - Hdac3基因敲除的bhk-21细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了HDAC3基因敲除的BHK‑21细胞系的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK‑21中的HDAC3进行基因敲除，将用于敲除HDAC3的CRISPR质粒转染BHK‑21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆。提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了2个HDAC3基因发生纯合移码突变的细胞克隆。HDAC3敲除的BHK‑21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度有显著提高，且HDAC3敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK‑21细胞中敲除HDAC3，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。

Description

HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)感染所引起的一种急性、热性、高度接触传染性疫病，主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物。该病传播途径多、传播速度快，曾在世界范围内造成巨大经济损失，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病之首。目前对于该病的防控以疫苗免疫预防为主，而且传统灭活疫苗仍占据市场主导地位。口蹄疫灭活疫苗的生产完全依赖口蹄疫病毒在幼仓鼠肾传代细胞BHK-21(Baby hamster kidney cell)中的复制。BHK-21细胞最早由MacPherson和Stoker于1962年利用1日龄叙利亚仓鼠肾细胞建系。该细胞生长迅速、病毒敏感谱较广，随后被用于多种病毒的增殖及疫苗生产，如口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等。原始的BHK-21细胞为贴壁生长型细胞，不利于商业化疫苗的大规模生产。Capstick等对BHK-21细胞进行了悬浮培养驯化，并于1965年在不锈钢发酵罐中用驯化的悬浮培养型BHK-21细胞培养生产了口蹄疫疫苗，开启了利用悬浮培养BHK-21细胞生产口蹄疫疫苗的新时代。我国口蹄疫疫苗的生产工艺最早是将贴壁培养的BHK-21细胞经多次传代扩大培养后接种口蹄疫病毒进行生产。2009年开始我国口蹄疫疫苗生产企业相继进行了BHK-21细胞悬浮培养的工艺改造，在短短几年时间内全部实现了生物反应器悬浮培养工艺。目前贴壁生长型BHK-21细胞主要用于实验室的前期研究，而商业化疫苗生产则完全采用悬浮培养型BHK-21细胞。尽管BHK-21细胞在口蹄疫疫苗生产中已经应用了50多年，除了悬浮培养驯化外，目前尚没有研究利用遗传手段改造BHK-21细胞，使其更有利于病毒复制，并将遗传改造后的BHK-21细胞应用于口蹄疫疫苗的生产。
CRISPR/Cas9技术是近些年迅速发展起来的能够用于哺乳动物细胞的新型基因编辑技术，在很多领域均具有非常好的应用前景。利用该技术对BHK-21细胞中调控口蹄疫病毒感染与免疫的相关基因进行改造，提高口蹄疫病毒在BHK-21细胞中的复制效率，将有助于提高口蹄疫疫苗的产量或质量。
蛋白乙酰化是一种重要的蛋白翻译后修饰，已有的研究表明蛋白乙酰化通过病毒本身蛋白的乙酰化、宿主免疫相关基因启动子区域组蛋白的乙酰化、免疫信号分子的乙酰化等多种方式影响病毒的感染与免疫过程。蛋白乙酰化水平受到组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的动态调节。哺乳动物中HDACs家族共有18个成员，且不同HDAC具有特定的功能，无明显的功能冗余性。HDACs家族的个别成员已经被证明在病毒-宿主相互作用过程中发挥着重要的调控作用。然而，关于蛋白乙酰化以及HDACs家族基因在口蹄疫病毒感染过程中的作用却并不清楚。
发明内容
本发明旨在提供一种有望用于口蹄疫疫苗生产的基因编辑BHK-21细胞系。即利用CRISPR/Cas9技术，在BHK-21细胞中敲除HDAC3后，口蹄疫病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高，有望用于口蹄疫疫苗生产，提高疫苗产量及质量。
本发明所用口蹄疫病毒为近些年我国境内的流行毒株FMDV/O/BY/2010，该毒株目前也是疫苗毒株。本发明所用细胞系为贴壁培养型BHK-21细胞系。细胞培养在5％CO2培养箱中，温度为37℃，DMEM培养基中添加有10％胎牛血清和1％抗生素(penicilin-streptomycin)。具体技术方案如下：
1.利用CRIPSR/Cas9技术构建HDAC3敲除的BHK-21细胞系
根据NCBI中金仓鼠(Mesocricetus auratus)的HDAC3基因序列，利用CRISPOR软件(http://crispor.tefor.net/)在HDAC3的第1个外显子区域设计gRNA序列：GGGGTCGTAGAAATACGCCA。设计好的gRNA按照张锋实验室已经发表的方法(NatureProtocols,2013)，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒。测序正确的CRISPR质粒中抽备用。根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养。收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定。DNA水平鉴定时用以下引物扩增：GT-FP(CTAGGAAGGATGTCGCGGTC)，GT-RP(ATGTCCAGCCCACCTATCCT)，扩增产物进行Sanger测序。蛋白水平鉴定时用HDAC3的抗体(CST，85057)利用Westernblot检测HDAC3的蛋白表达水平。
2.口蹄疫病毒感染实验及病毒复制速率的评价
HDAC3敲除的BHK-21细胞系及对照细胞系(转染PX459空质粒的BHK-21细胞系)在60mm的细胞培养皿中培养到大约80％的汇合度时，吸掉培养基，加入2mL PBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入1mLDMEM(对照)或稀释至MOI＝0.1的口蹄疫病毒，在培养箱中孵育1h，吸掉病毒液，加入2mLPBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入3mL DMEM培养基。分别在感染不同时间收集上清及细胞样品，利用RT-qPCR、Western blot、病毒滴度测定等方法综合评价口蹄疫病毒的复制情况。
RT-qPCR检测病毒RNA的相对表达量：
收集的细胞样品利用Trizol法提取总RNA，测定浓度后利用PrimeScriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,RR047A)反转录试剂盒进行反转录，qPCR则是用SYBR Green qPCR SuperMix(Takara)试剂完成。β-Actin作为内参基因，对VP1的相对表达水平进行定量。所用引物为：VP1-q-FP(GACAACACCACCAACCCA)，VP1-q-RP(CCTTCTGAGCCAGCACTT)；β-actin-q-FP(GCTGGCCGGGACCTGACAGACTACC)，β-actin-q-RP(TCTCCAGGGAGGAAGAGGATGCGGC)。
Westernblot检测口蹄疫病毒结构蛋白VP1的蛋白表达水平：
收集的细胞样品中加入170μl细胞裂解液(Pierce)，待细胞充分裂解之后离心除去细胞碎片收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒(Thermo)定量总蛋白。剩余部分加入四分之一体积的4×上样缓冲液混匀，煮沸5分钟，室温静置冷却。利用定量结果确定上样体积，上样量一般为20-40μg。蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，冰浴中90V恒压转膜2h。5％脱脂奶粉封闭1h。β-Actin抗体(Santa Cruz)1:6000倍稀释,VP1的抗体(由本所郑海学实验室提供)1:1000倍稀释，一抗4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记的对应二抗1:4000倍稀释，二抗室温孵育1h。蛋白检测用Thermo公司的显色试剂盒(PierceTM ECLWesternBlotting Substrate)，洗片时使用X光片自动洗片机。
病毒滴度的测定：
BHK-21细胞在96孔微量培养板中生长到汇合度大约为70％时备用。首先在1.5mL离心管中将待检测病毒液分别作连续10倍的梯度稀释，细胞用100μl PBS洗两遍之后，将稀释好的病毒液接种到96孔板中，每一稀释度接种一列共8孔，每孔接种100μl。在培养箱中孵育1h,吸掉病毒液，用100μl PBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入含有1％FBS的维持培养基，培养箱中继续培养。逐日观察并记录细胞病变结果，连续观察5-7天后根据Reed-Muench两氏法计算TCID50值。
3.细胞生长速率的测定
细胞消化后计数，以每孔10000个细胞，接种至96孔板，置细胞培养箱正常培养。为了测定特定时间的细胞活力，培养基中添加终浓度为0.5mg/ml的MTT，培养箱继续孵育培养4h，吸除培养基，每孔加150μl DMSO充分裂解后，在VarioskanTM LUX多功能酶标仪(Thermo)上测定595nm处的吸光值。根据测定的吸光值制作细胞的生长曲线。
发明人以实验室常用贴壁生长型BHK-21细胞为对象，通过对HDACs家族的基因进行前期筛选，利用CRISPR/Cas9技术构建HDAC基因敲除细胞系，发现HDAC3具有非常明显的抗口蹄疫病毒感染的作用。HDAC3敲除的BHK-21细胞系中口蹄病毒复制速率明显加快，最终病毒滴度显著提高，且HDAC3敲除后对细胞生长速率无显著影响，说明其有用于口蹄疫疫苗生产的前景。为进一步在悬浮培养型BHK-21细胞中敲除HDAC3，直接用于口蹄疫疫苗生产奠定了基础。
有益效果：
本发明利用CRISPR/Cas9技术成功构建了HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系；首次证明HDAC3基因具有非常明显的抗口蹄病毒感染的作用，HDAC3敲除的BHK-21细胞系中口蹄疫病毒复制速率加快，病毒滴度显著提高，且对细胞生长速率无显著影响，有望用于口蹄疫疫苗的商业化生产。
附图说明
图1显示了HDAC3敲除细胞系的鉴定。
图1A显示了BHK-21细胞中野生型HDAC3(WT)和敲除细胞系中突变型HDAC3在突变位置附近的部分序列比对结果。
图1B显示了BHK-21细胞中野生型HDAC3和敲除细胞系中突变型HDAC3在突变位置附近的测序峰图。
图1C在蛋白表达水平证明了HDAC3的成功敲除。收集对照细胞系和HDAC3敲除细胞系的正常培养细胞，Western blot检测内源HDAC3蛋白表达水平，β-Actin作为内参对照。
图2显示了HDAC3敲除细胞系中口蹄疫病毒的复制速率显著加快。
图2A显示了口蹄疫病毒感染后病毒RNA在HDAC3敲除细胞系(HDAC3-KO-1，HDAC3-KO-2)中的复制水平显著高于对照细胞系(WT)。不同细胞系用0.1MOI的口蹄疫病毒感染不同时间后收集细胞样品，利用RT-qPCR法对病毒VP1 RNA进行相对定量。
图2B显示了口蹄疫病毒感染后HDAC3敲除细胞系中VP1的蛋白积累显著加快。不同细胞系用0.1MOI的口蹄疫病毒感染分别在不用时间收集细胞样品，用Western blot检测VP1的蛋白水平，β-Actin作为内参对照。
图2C显示了口蹄疫病毒感染后病毒滴度在HDAC3敲除细胞系培养基中显著升高。0.1MOI的口蹄疫病毒感染不同细胞系，培养不同时间收集细胞培养基，用TCID50法测定病毒滴度。
图3显示HDAC3敲除后并未显著影响细胞的生长速率。对照细胞系和HDAC3敲除细胞系接种于96孔板正常培养，每隔一定时间利用MTT法测定细胞活力，制作生长曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步描述：
利用CRISPR/Cas9技术成功构建HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系
根据对HDAC家族成员进行的前期筛选及初步功能分析，发明人发现HDAC3具有重要的抗口蹄疫病毒感染的作用。因此，发明人拟利用CRISPR/Cas9技术对口蹄疫疫苗生产用细胞系BHK-21中的HDAC3进行基因敲除，以期提高口蹄疫病毒在细胞系中的复制效率，改进口蹄疫疫苗产量或质量。发明人将用于敲除HDAC3的CRISPR质粒转染BHK-21细胞后，利用抗生素筛选结合梯度稀释，用克隆环法分离到了多个细胞克隆。提取基因组DNA后进行PCR扩增、测序，成功鉴定到了2个HDAC3基因发生纯合移码突变的细胞克隆。其中HDAC3-KO-1在Cas9预定切割位置处(距离PAM基序第3和第4个碱基之间切割)有4个碱基的缺失，而HDAC3-KO-2则在该位置有1个碱基的插入(图1A)。这种移码突变预期会造成蛋白翻译的移码、提前终止及功能丧失。突变位置附近测序峰图质量很高(图1B)，表明测序结果可靠。为了进一步证实HDAC3的基因敲除，发明人收集对照细胞系和HDAC3敲除细胞系的正常培养细胞样品，用Western blot检测内源HDAC3的蛋白表达水平，如图1C所示，对照细胞系中能够检测到HDAC3的表达，而在2个敲除细胞系中都不能检测到HDAC3的蛋白表达，证明发明人成功获得了HDAC3基因完全敲除的BHK-21细胞系。
实施例1
根据NCBI中金仓鼠(Mesocricetus auratus)的HDAC3基因序列，利用CRISPOR软件(http://crispor.tefor.net/)在HDAC3的第1个外显子区域设计gRNA序列：GGGGTCGTAGAAATACGCCA。设计好的gRNA按照张锋实验室已经发表的方法(NatureProtocols,2013)，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒。测序正确的CRISPR质粒中抽备用。根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养。收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定。DNA水平鉴定时用以下引物扩增：GT-FP(CTAGGAAGGATGTCGCGGTC)，GT-RP(ATGTCCAGCCCACCTATCCT)，扩增产物进行Sanger测序。蛋白水平鉴定时用HDAC3的抗体(CST，85057)利用Western blot检测HDAC3的蛋白表达水平。
试验例1
HDAC3敲除细胞系中口蹄疫病毒的复制速率明显加快
为了评价HDAC3敲除细胞系中口蹄疫病毒的复制速率，发明人用0.1MOI的口蹄疫病毒分别感染对照细胞系和HDAC3敲除细胞系，培养不同时间收集样品，分别检测病毒RNA的复制水平、病毒蛋白的积累以及病毒滴度，综合评价HDAC3敲除后对口蹄疫病毒复制速率的影响。如图2A所示，口蹄疫病毒感染后，病毒RNA在HDAC3敲除细胞系(HDAC3-KO-1，HDAC3-KO-2)中的复制水平显著高于对照细胞系(WT)。如图2B所示，细胞感染口蹄疫病毒，用Western blot检测VP1的蛋白水平，以β-Actin作为内参对照，可以判断HDAC3敲除细胞系(HDAC3 KO-1、HDAC3-KO-2)与对照组细胞系(WT)相比，病毒结构蛋白VP1的表达量明显增加。病毒滴度结果表明，口蹄疫病毒感染后HDAC3敲除细胞系相比对照组细胞病毒滴度明显增加(图2C)。这些结果充分证明HDAC3敲除细胞能使口蹄疫病毒的复制速率明显加快。
试验例2
HDAC3敲除细胞系与对照细胞系在生长速率方面无显著差异
HDAC3敲除细胞(HDAC3-KO-1、HDAC3 KO-2)与对照组细胞，通过细胞计数，以每孔10000个细胞，接种于96孔板中正常培养。分别在铺板后12h、24h、36h，每孔加入10ul MTT，培养4h，弃掉培养基，每孔加入150ul DMSO，震荡10min后，测定595nm的吸光度值。以时间与OD值为横坐标与纵坐标做生长曲线。从结果看，HDAC3敲出细胞系与对照组相比，生长速率没有显著差异(图3)。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002934447880000081
Figure BDA0002934447880000091
Figure BDA0002934447880000101
Figure BDA0002934447880000111
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用
<130> 2021
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggtcgtag aaatacgcca 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctaggaagga tgtcgcggtc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtccagcc cacctatcct 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacaacacca ccaaccca 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccttctgagc cagcactt 18
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gctggccggg acctgacaga ctacc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tctccaggga ggaagaggat gcggc 25

Claims (10)

1.HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：根据NCBI中金仓鼠的HDAC3基因序列，利用CRISPOR软件在HDAC3的第1个外显子区域设计gRNA序列：GGGGTCGTAGAAATACGCCA；设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒；测序正确的CRISPR质粒中抽备用；根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养；收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：细胞培养在5％CO2培养箱中，温度为37℃，DMEM培养基中添加有10％胎牛血清和1％抗生素(penicilin-streptomycin)。
3.根据权利要求1所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：DNA水平鉴定时用以下引物扩增：GT-FP(CTAGGAAGGATGTCGCGGTC)，GT-RP(ATGTCCAGCCCACCTATCCT)，扩增产物进行Sanger测序；蛋白水平鉴定时用HDAC3的抗体(CST，85057)，利用Westernblot检测HDAC3的蛋白表达水平。
4.根据权利要求1所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：得到HDAC3敲除细胞HDAC3-KO-1、HDAC3 KO-2，HDAC3-KO-1在Cas9预定切割位置处(距离PAM基序第3和第4个碱基之间切割)有4个碱基的缺失，HDAC3-KO-2在该位置有1个碱基的插入；用Western blot检测内源HDAC3的蛋白表达水平，HDAC3-KO-1、HDAC3 KO-2细胞系不能检测到HDAC3的蛋白表达。
5.权利要求1-4中任一项所述方法构建的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系。
6.权利要求4所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系中口蹄疫病毒的复制速率评价方法，其特征在于：
HDAC3敲除的BHK-21细胞系及对照细胞系(转染PX459空质粒的BHK-21细胞系)在60mm的细胞培养皿中培养到大约80％的汇合度时，吸掉培养基，加入2mL PBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入1mLDMEM(对照)或稀释至MOI＝0.1的口蹄疫病毒，在培养箱中孵育1h，吸掉病毒液，加入2mLPBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入3mL DMEM培养基；分别在感染不同时间收集上清及细胞样品，利用RT-qPCR、Western blot、病毒滴度测定方法综合评价口蹄疫病毒的复制情况；
RT-qPCR检测病毒RNA的相对表达量：
收集的细胞样品利用Trizol法提取总RNA，测定浓度后利用PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser(TaKaRa,RR047A)反转录试剂盒进行反转录，qPCR则是用SYBRGreen qPCR SuperMix(Takara)试剂完成；β-Actin作为内参基因，对VP1的相对表达水平进行定量；所用引物为：VP1-q-FP(GACAACACCACCAACCCA)，VP1-q-RP(CCTTCTGAGCCAGCACTT)；β-actin-q-FP(GCTGGCCGGGACCTGACAGACTACC)，β-actin-q-RP(TCTCCAGGGAGGAAGAGGATGCGGC)；
Westernblot检测口蹄疫病毒结构蛋白VP1的蛋白表达水平：
收集的细胞样品中加入170μl细胞裂解液(Pierce)，待细胞充分裂解之后离心除去细胞碎片收集上清液，用BCA蛋白定量试剂盒定量总蛋白；剩余部分加入四分之一体积的4×上样缓冲液混匀，煮沸5分钟，室温静置冷却；利用定量结果确定上样体积，上样量为20-40μg；蛋白样品经SDS-PAGE电泳后转PVDF膜，冰浴中90V恒压转膜2h；5％脱脂奶粉封闭1h；β-Actin抗体(Santa Cruz)1:6000倍稀释,VP1的抗体(由本所郑海学实验室提供)1:1000倍稀释，一抗4℃孵育过夜；辣根过氧化物酶(HRP)标记的对应二抗1:4000倍稀释，二抗室温孵育1h；蛋白检测用Thermo公司的显色试剂盒(PierceTMECL Western Blotting Substrate)，洗片时使用X光片自动洗片机；
病毒滴度的测定：
BHK-21细胞在96孔微量培养板中生长到汇合度大约为70％时备用；首先在1.5mL离心管中将待检测病毒液分别作连续10倍的梯度稀释，细胞用100μl PBS洗两遍之后，将稀释好的病毒液接种到96孔板中，每一稀释度接种一列共8孔，每孔接种100μl；在培养箱中孵育1h,吸掉病毒液，用100μlPBS洗两次细胞后吸干净PBS，加入含有1％FBS的维持培养基，培养箱中继续培养；逐日观察并记录细胞病变结果，连续观察5-7天后根据Reed-Muench两氏法计算TCID50值。
7.权利要求5所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的细胞生长速率的测定方法，其特征在于：
细胞消化后计数，以每孔10000个细胞，接种至96孔板，置细胞培养箱正常培养；为了测定特定时间的细胞活力，培养基中添加终浓度为0.5mg/ml的MTT，培养箱继续孵育培养4h，吸除培养基，每孔加150μl DMSO充分裂解后，在VarioskanTM LUX多功能酶标仪上测定595nm处的吸光值；根据测定的吸光值制作细胞的生长曲线。
8.权利要求5所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系在口蹄疫疫苗生产中的应用。
9.基于CRISPR/Cas9技术敲除HDAC3基因的方法，其特征在于：包括以下步骤：
根据NCBI中金仓鼠的HDAC3基因序列，利用CRISPOR软件在HDAC3的第1个外显子区域设计gRNA序列：GGGGTCGTAGAAATACGCCA；设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459(Addgene#62988)质粒；测序正确的CRISPR质粒中抽备用；根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染细胞系。
10.基于CRISPR/Cas9技术敲除HDAC3基因的方法得到的HDAC3基因敲除细胞系在口蹄疫疫苗生产中的应用。
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