CN111876417A - 用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因抑制剂技术领域，公开了一种用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物，miRNA抑制剂为减少microRNA介导抑制Igfbp3或GAP43水平序列SEQ ID NO：1或一个microRNA的组成序列设置在序列SEQ ID NO：2。本发明将miR‑185‑5p作为治疗HIE和SCI的新药物靶点，研发出了一种可改善神经系统疾病恢复的miR‑185‑5p抑制剂，直接靶向抑制miRNAs小分子，抑制导致该疾病的蛋白质的合成，从安全性和有效性都是一种全新的治疗方案。损伤后miR‑185‑5p活性减少，而miR‑185‑5p活性升高已被发现可抑制缺氧缺血性脑病和脊髓损伤的恢复，抑制miR‑185‑5p活性均可显著改善恢复。

Description

用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物

技术领域

本发明属于基因抑制剂技术领域，尤其涉及一种用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物。

背景技术

目前，脊髓损伤是神经功能障碍的另一个常见原因。脊髓损伤通常导致永久性残疾，其特征是周围刺激瘫痪和感觉丧失，多种代谢和全身改变与自主神经系统功能障碍有关。这种情况包括几种类型，其中脊髓横断(SCT)是最严重的类型。SCT后，成年哺乳动物受损的下行轴突最终无法再生，导致严重的急性功能缺陷。近几十年来，神经与非神经组织移植、基因治疗、细胞移植、神经营养因子联合移植等一直是SCI临床前研究的热点。然而，目前由于有限的临床治疗，SCI仍是一个未解决的医学问题。新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)是新生儿因出生时发生窒息而导致的一种相对常见的死亡和残疾原因，其中，在损伤三天后细胞死亡更加明显，随后几个月中出现组织重构，星形胶质细胞化。这一系列的反应最终导致神经功能的长期损伤，导致严重的长期后遗症，包括行为和认知功能障碍、学习困难、脑瘫和癫痫。长期以来，对NHIE损伤中细胞凋亡发生的分子机制知之甚少，导致相关疾病的诊治滞后，严重危害了患儿的智力发育，给家庭和社会造成巨大负担。因此，寻求新的NHIE治疗靶点或治疗手段具有十分重要的意义。

MicroRNAs(或miRNAs)是小的、自然发生的、参与基因调控的双链RNAs分子，是21～24个核苷酸的一种短小非编码RNA，但可针对蛋白编码基因的mRNA进行裂解或抑制翻译。可在转录后水平介导SCT和HIE损伤诸多基因的沉默或表达而调控细胞状态和功能。部分由miRNAs调控的基因中，许多都与影响中枢神经系统的疾病有关。例如，已知miRNAs在许多疾病中通过抑制重要蛋白的表达而过度表达，从而导致发病。由于单个miRNA即可影响参与单一通路的若干基因，而这些基因可构成SCT和NHIE损伤反应的信号网络。因此，目前需要新的成分和方法来抑制miRNAs，特别是那些涉及疾病发病机制的miRNAs，从分子水平来抑制或减轻SCT和NHIE损伤的发生发展，进而促进神经功能的恢复。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：脊髓损伤通常会导致患者永久性残疾，造成生活不能自理和严重并发症等问题造成的生活不能自理和严重并发症等问题，不仅给病患及家属带来巨大伤害，也对医疗卫生事业带来了沉重的经济负担。NHIE发生永久性神经功能缺陷的风险很高，严重影响患者的健康和生活质量。已知miRNAs在许多疾病中通过抑制重要蛋白的表达而过度表达，从而导致发病，尤其是中枢神经系统的疾病。由于单个miRNA即可影响参与单一通路的若干基因，而这些基因可构成SCT和HIE损伤反应的信号网络。

解决以上问题及缺陷的难度为：虽然目前有很多治疗SCT和NHIE的方法，但是对于长期的神经功能损伤导致的并发症、后遗症并没有有效解决。SCT和NHIE对神经功能的影响是一个极其复杂的过程，存在着复杂的调控网络，miRNAs在中枢神经系统的病理生理调控网络中扮演重要角色，包括细胞凋亡、线粒体损伤等。研究筛选特定的miRNA在SCT和NHIE后分子调控网络中的作用，能够为促进SCT和NHIE患者的神经功能恢复提供新的治疗策略。

解决以上问题及缺陷的意义为：从机制出发，新药中含有抑制剂，能直接靶向抑制miRNAs小分子，从而抑制导致该疾病的蛋白质的合成，从安全性和有效性都是一种全新的治疗方案。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物。

本发明是这样实现的，一种用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂通过miR-185-5p(SEQ ID NO.1)或包含SEQ ID NO.2序列的miRNA来降低miRNA对Igfbp3或GAP43的抑制作用。

进一步，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂包含一个核酸。

进一步，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂包括一个由miR-185-5p或一个由miR-185-5p的靶序列SEQ ID NO：2中列出的序列组成的miRNA结合区域。

进一步，所述miRNA结合区域由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中的核酸序列组成。

进一步，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂的结合区域，包括miR-185-5-p结合的miRNA结合区域，其中microRNA的结合区域包括核酸序列设置在序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。

进一步，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂是一个长链非编码RNA。

进一步，所述长链非编码RNA包含在序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：8的任何一个序列中。

本发明的另一目的在于提供一种表达结构，所述表达结构包含编码所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂编码的核酸序列。

进一步，所述表达结构表达编码抑制剂的核酸序列的分离或重组细胞。

进一步，由表达结构或权利要求分离或重组细胞组成的miRNA抑制剂。

进一步包括黄芩苷。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂的核酸的药物组合物，所述核酸包含一个或多个SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7序列。

进一步，所述核酸由SEQ ID NO：4中规定的序列组成。

本发明的另一目的在于提供一种所述药物组合物在增加Igfbp3水平中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种所述药物组合物在治疗脊髓损伤药物中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种所述药物组合物在治疗新生儿缺氧缺血性损伤药物中的用途。

本发明的另一目的在于提供一种筛选抑制miR-185-5p介导的对Igfbp3或GAP43的一个或两个抑制的化合物的方法，所述筛选抑制miR-185-5p介导的对Igfbp3或GAP43的一个或两个抑制的化合物的方法包括：

(1)在miRNA抑制剂存在的情况下，将表达miR-185-5p和Igfbp3或GAP43的一个或两个细胞与候选化合物接触；

(2)确定候选化合物是否改变了miRNA抑制剂抑制miRNA介导的Igfbp3或GAP43的能力。

进一步，所述候选化合物是黄酮；miRNA抑制剂为Vi4、Vof16或Scu。

本发明的另一目的在于提供一种所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂在抑制绑定miR-185-5p胰岛素样生长因子结合蛋白3或GAP43中的用途。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：人类和实验动物的脊髓损伤往往与损伤后不同程度的自发功能恢复有关，这种恢复被广泛认为是由于神经可塑性，以及miR-185-5p的调节机制。本发明实验证实了miR-185-5p沉默对缺氧缺血性脑瘫和脊髓损伤的治疗潜力，使用CRIPSPER/Cas9和抑制剂对动物和人类胎儿组织的治疗作用是明显的。基于此，本发明将miR-185-5p作为治疗HIE和SCI的新药物靶点。从机制出发，本发明的新药中含有抑制剂，直接靶向抑制miRNAs小分子，从而抑制导致该疾病的蛋白质的合成，从安全性和有效性都是一种全新的治疗方案。损伤后miR-185-5p活性的增加会抑制损伤的恢复。例如，miR-185-5p活性升高已被发现可抑制新生儿缺氧缺血性脑病(NHIE)和脊髓损伤的恢复，在这两种情况下抑制miR-185-5p活性均可显著改善恢复。本发明的抑制剂降低了miR-185-5p在大脑或中枢神经系统中的水平，降低了皮质、海马或脊髓的miR-185-5p水平，降低了神经元中的miR-185-5p水平；miRNA抑制剂介导以下一种或多种：神经元Igfbp3或GAP43水平升高；神经元生长增加，增加神经突长度，减少神经元凋亡，减少脑梗死面积。

附图说明

图1是本发明实施例提供的用筛选抑制miR-185-5p介导的对Igfbp3或GAP43的一个或两个抑制的化合物的方法流程图。

图2-图12是本发明实施例提供的实验1-实验11的结果示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明提供的用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂抑制绑定miR-185-5p胰岛素样生长因子结合蛋白3(Igfbp3)或GAP43，其中microRNA的抑制剂减少microRNA介导抑制Igfbp3或GAP43水平miR-185-5 p(SEQ ID NO：1)或一个microRNA的组成序列设置在SEQ IDNO：2(预测目标序列miR-185-5p)。

本发明提供的用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂包含一个核酸。

本发明提供的用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂包括一个由miR-185-5p或一个由SEQ ID NO：2[miR-185-5p的靶序列]中列出的序列组成的miRNA结合区域；其中miRNA结合区域由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中的核酸序列组成。[确认Vof16和TCONS00044054中miR-185-5p结合的序列]。

TCONS00044054中miR-185-5p结合的序列如下：

Vof16中miR-185-5p结合的序列如下：

本发明提供的用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂microRNA的结合区域，包括miR-185-5-p结合的miRNA结合区域，其中microRNA的结合区域包括核酸序列设置在SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：：9或SEQ ID NO：10(序列受miR-185-5p)，其中microRNA的抑制剂减少microRNA介导抑制Igfbp3或GAP43水平。

本发明提供的用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂与miR-185-5p竞争与Igfbp3或GAP43的结合，并且，该抑制剂通过miR-185-5p或SEQ ID NO：2中列出的序列来减少miRNA对Igfbp3或GAP43的介导性抑制。抑制剂是一个长非编码RNA；其中长链非编码RNA包含在任何一个SEQ ID NO 4-8中设定的序列。[确认Vi1、Vi2、Vi3的序列]。

本发明提供的表达结构包括一个编码抑制剂的核酸序列；表达编码抑制剂的核酸序列的分离或重组细胞。

本发明表达结构或分离或重组细胞组成的miRNA抑制剂；包括黄芩苷(Scu；4、5、6-trihydroxyflavone-7-glucuronide)。

本发明提供的包含核酸的药物组合物，该核酸包含一个或多个SEQ ID NO：4[Vi4]、SEQ ID NO：5[Vi1]、SEQ ID NO：6[Vi2]、SEQ ID NO：7[Vi3]序列。其中核酸由SEQ IDNO：4中规定的序列组成。用于增加受试者体内Igfbp3水平的药物成分。；药物组合物用于治疗新生儿缺氧缺血性损伤。

本发明包括对需要该方法的受试者给予miR-185-5p抑制剂用于治疗缺血性损伤；治疗脊髓损伤；缺血性损伤为新生儿缺氧缺血性损伤。

如图1所示，本发明提供的筛选抑制miR-185-5p介导的对Igfbp3或GAP43的一个或两个抑制的化合物的方法包括：

S101：在miRNA抑制剂存在的情况下，将表达miR-185-5p和Igfbp3或GAP43的一个或两个细胞与候选化合物接触；

S102：确定候选化合物是否改变了miRNA抑制剂抑制miRNA介导的Igfbp3或GAP43的能力。

在本发明中，其中候选化合物是黄酮。

在本发明中，miRNA抑制剂为Vi4、Vof16或Scu。

在本发明中，细胞是一个神经元。

在本发明中，神经元是初级皮层神经元或海马神经元。

在本发明中，神经元是一个感觉神经元或运动神经元。

在本发明中，神经元是PC12细胞。

在本发明中，miRNA的抑制对Igfbp3或GAP43的抑制是基于Igfbp3或GAP43 mRNA水平、蛋白水平或其组合的降低来确定的。

在本发明中，miRNA的抑制介导了对Igfbp3或GAP43的抑制，其基础是Igfbp3或GAP43蛋白水平的降低。

本发明的适用载体：“载体”和“赋形剂”指的是在本发明中用于促进活性化合物的储存、管理和/或生物活性的物质成分(参见，例如，Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Mack出版公司(1991))。载体还可以减少活性化合物的任何不良副作用。例如，合适的载体是稳定的，例如，不能与载体中的其他成分发生反应。例如，在治疗中使用的剂量和浓度不会对受体产生明显的局部或全身不良反应。

适用于本发明的载体包括那些传统使用的载体，例如：水、生理盐水、含水葡萄糖、乳糖、林格氏液、缓冲液、透明质酸和糖醇，特别是(等渗)溶液的典型液体载体。合适的药物载体和辅料包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、粉笔、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇等。

本发明经过了大量的实验进行验证，包括建立脊髓横断(SCT)模型，免疫荧光染色，磁共振成像(MRI)，免疫组织化学，BBB行为学评分，基因分析，LncRNA分析，层次聚类分析，原代脊髓和皮质神经元培养，RNA干扰，TUNEL染色，实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)，划痕实验，压爪机械痛(PWT)，尾热刺痛(TFL)，新生大鼠缺血缺氧性脑损伤(NHIE)模型建立，体外糖氧剥夺(OGD)模型建立，基因测序，MiR-185-5p敲除(KO)大鼠构建，通过5项行为测试：神经系统严重程度评分(NSS评分)、Morris水迷宫测试、转棒实验、Y-maze和旷场实验来评估大鼠神经损伤、运动、学习和记忆功能，正电子发射断层扫描(PET-CT)，对神经元进行免疫细胞化学分析，收集人类血清样本，2，3，5－三苯基氯化四氮唑(TTC)染色及梗死体积评估，苏木素-伊红染色(HE)和尼氏染色，生物信息学分析，荧光素酶分析报告，Scu治疗，原代皮质和海马神经元培养，CCK-8检测神经元活力，免疫蛋白印迹，统计学分析。

下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。

实验方法：

1大鼠脊髓全横断模型建立

用2％戊巴比妥钠(50mg/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，麻醉生效后将大鼠俯卧位固定，备皮，消毒，以胸10节段为中心沿后正中线作2cm纵形切口，钝性分离筋膜与肌肉，用咬骨钳咬除T9～11棘突及椎板，暴露脊髓T10节段，用神经拉钩将脊髓挑起，用显微剪将T10脊髓完全横断，遗留1-2mm间隙，损伤组织未取出。充分止血，逐层缝合肌肉与皮肤。术后连续3天腹腔注射青霉素(16万IU/kg﹒d)，每天早中晚按摩膀胱协助排尿直至自主排尿功能恢复。同时，积极防治肠粘连、肠梗阻、尿路感染等并发症。

2 Basso，Beatlie and Bresnahan(BBB)运动功能评分

采用三人独立观察记录，术后每7天(d)对大鼠双侧后肢运动功能分别进行评分。将大鼠置于宽阔的平台上，任其爬行，观察5分钟(min)内其后肢运动，参见表1，评定其得分并作记录。

表1 BBB运动功能评分

3脊髓核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)

利用7.0T磁共振扫描仪(Bruker Biospec 70/30，Ettlingen，Germany)采集大鼠脊髓磁共振图像。流程如下：采用内径16cm水平扫描架和38mm大鼠用线圈。4％异氟烷麻醉满意后，将大鼠置于有机玻璃扫描床内，牙套及耳杆固定鼠脑。以混合气体(2％异氟烷-氧/氮(30:70))持续麻醉，并连续监护体温、心率、呼吸。使用加温毯保持大鼠体温在37℃左右。采用弛豫增强快速采集(rapid acquisition with relaxation enhancement，RARE)T1WI序列及3D MDEFT(modified driven-equilibrium Fourier transform，MDEFT)序列扫描。扫描参数：RARE T1WI：TR/TE 957.6ms/7.5ms，层厚1mm，层间距0.2mm，FOV 35mm×35mm，矩阵256×256，NEX 4，空间最小分辨率约160μm×120μm/像素，扫描时间约3min 3s；3DMDEFT：轴位扫描，TR/T E 15ms/5ms，层厚0.3mm，层间距0，FOV35mm×35mm×27mm，NEX 4，矩阵256×256×90，扫描时间约21min 36s。取8片矢状面切片，每片厚0.75mm。

4样本获取

造模第21天后，行灌注取材。大鼠在超量3.6％水合氯醛麻醉后，被仰卧位固定于手术板上。用手术剪在剑突下暴露腹腔，剪开膈肌，分别从两侧肋弓向头端剪断肋骨并将胸骨向头端掀起暴露胸腔。剪开心包，暴露心脏，用灌注针头从左心室心尖部插入左心室，并轻柔地将针尖插至升主动脉内(肉眼可见)，剪开右心房，用0.9％生理盐水缓慢灌注。当肝脏变黄或右心房流出液体无血色后停止灌注。大鼠置于俯卧位，沿后正中线剪开皮肤，逐层分离筋膜及椎旁肉。用咬骨钳咬开椎板暴露脊髓。取约1cm长脊髓(脊髓横断处上下各0.5cm)并立即浸泡在0.1M冷PBS溶液(pH7.4)中，充分剥离脊髓蛛网膜和软脊膜，于-80℃冰箱中保存。同时，取心脏、肝脏和肺-80℃保存备用。

5免疫荧光染色

免疫荧光染色分析生长相关蛋白43(GAP43)或神经第三类β-Tubulin(Tuj1)进行检测SCT后表达的变化。组织依次用15％和30％蔗糖脱水，然后放在载物托上用OTC包埋剂包埋、切片(德国徕卡CM1900)，厚度为10μm。切片用0.01MPBS冲洗3次，然后与5％山羊血清在37℃孵育30min，以去除非特异性结合。接下来，用抗GAP43抗体(1:50，mouse，SantaCruz)或抗Tuj1(1:100，rabbit，Abclonal)在4℃孵育18小时(h)以上。PBS冲洗3次，5min后，使用二抗GAP43(goat anti-mouse，ZSGB-BIO)或Tuj1(1:100，anti-Rabbit IgG，ZSGB-BIO)，室温避光孵育1h。用0.01MPBS漂洗3次，5min/次；滴加含抗荧光淬灭剂(碧云天)的DAPI(碧云天)进行细胞核染色封片。于荧光显微镜(Leica)观察并拍照。荧光强度采用Image-Pro Plus6.0软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD，USA)计算。

6脊髓损伤大鼠脊髓的miRNA、lncRNA芯片分析

实验所用microRNA芯片(大鼠Affymetrix microRNA4.0 Array芯片)由Agilent公司生产，由上海其明生物芯片有限责任公司代理检测。设计探针能检测来源于miRBase数据库里中的miRNA，包含大鼠728个miRNA。使用miRNA Complete Labeling and Hyb Kit将100ng Cy3标记的RNA与芯片在滚动杂交炉中杂交20个小时，然后在洗缸中用GeneExpression Wash Buffer Kit进行洗片。杂交完成的芯片运用Affymetrix MicroarrayScanner进行扫描miRNA信号强度，通过荧光扫描值定量获得原始信号值，然后采用FeatureExtraction Software 10.7读取数据，最后采用Gene Spring Software 11.0通过减去Axon扫描仪测得的背景值做修正进行归一化处理，所用算法为Quantile。通过归一化数值的组间比较得到差异表达的miRNAs，其中上下调2倍作为差异miRNAs。

实验所用lncRNA芯片(大鼠Affymetrix GeneChip Rat Gene 2.0 ST Array芯片)由Affymetrix公司生产，由上海其明生物芯片有限责任公司代理检测。使用GeneChipHybridization，Wash，and Stain Kit将100ng Cy3标记的RNA与芯片在滚动杂交炉中杂交20个小时，然后在洗缸中用GeneChip Hybridization，Wash，and Stain Kit进行洗片。杂交完成的芯片运用GeneChip Scanner 3000 7G进行扫描RNA信号强度，通过荧光扫描值定量获得原始信号值，然后采用GeneChip GCOS软件读取数据，最后采用Affymetrix GeneChipOperating Software通过减去扫描仪测得的背景值做修正进行归一化处理，所用算法为Quantile。通过归一化数值的组间比较得到差异表达的基因，其中上下调2倍作为差异基因。

7差异基因表达谱聚类分析

聚类分析通过建立各种不同的研究模型，可以得到多种统计分析结果，确定不同基因在表达上的相关性，从而预测特定已知基因的未知功能或未知基因的可能功能信息。本研究采用MeV4.9.0进行聚类分析。

8差异基因GO及KEGG通路分析

选出的基因采用基因本体论(gene ontology，GO)分析来确定这些上调或下调基因的功能定位与通路。利用DAVID(The Database for Annotation，Visualization andIntegrated Discovery，DAVID)在线分析工具行GO分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析。

9 qRT-PCR验证基因

加入TRIzol试剂(Invitrogen，USA)裂解匀浆，根据试剂盒说明书提取总RNA。通过NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc，USA)进行定量后，用200ng总RNA通过ReverTra Ace qPCR RT Kit(Toyobo，Japan)，根据说明书进行逆转录操作。逆转录所得产物采用THUNDERBIRD

qPCR Mix(Toyobo，Japan)进行qRT-PCR分析。qRT-PCR所用仪器为CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad)。引物信息：vof16 sense：5’TGCTTGGCCTCAGAACATCT 3’；antisense：5’GTCAGGAAAACCTAGTCACAT 3’；GAP43 sense：5’TGAGAAGAACCAAACAGGTTG 3’；antisense：5’CTTTGAGCTTTTTCCTTGTT 3’；SYP sense：5’TTCAGGCTGCACCAAGTGT 3’；antisense：5’GCCACGGTGACAAAGAAT 3’；miR330-3p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP0970)；miR351-5p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP1250)；miR28-5p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP0362)；miR30C-1-3p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP0394)；miR185-5p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP0247)；miR451-5p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP0509)；miR434-3p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP1002)；miR6318-5p(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP2815)；U6(GeneCopoeia，Lnc.HmiRQP9003)。反应体系总体积为20μl，每管其他试剂用量为：2×SYBRGREEN：10μl(Thermo DBI Bioscience)，上游引物：0.6μl，下游引物：0.6μl，cDNA：1μl，水：7.8μl，预变性95℃5min，变性95℃10s，退火10s，延伸72℃20s，循环40次。反应体系在实时荧光定量PCR仪上进行，参照(GAPDH)控制水平，通过计算2^-△△Ct值，对PCR扩增产物进行分析。

10生物信息学预测与检测

根据特异性表达lncRNA和miRNA的归一化信号强度，在上海康晨生物科技有限公司建立了基因共表达网络。使用MiRanda和TargetScan预测Vof16的靶miRNA。TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)和miRDB被用来预测GAP43的靶miRNA。此外，本发明使用RNA22预测lncRNA与miRNA的结合位点，网址为https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/.venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)来筛选最有效的靶miRNA。

11荧光素酶检测

荧光素酶可以作为报告基因来检测启动子的活性和/或转染效率。Gap433’UTR荧光素酶质粒和相应的突变质粒由RiboBio(中国广州)产生。vof16突变体由广州GeneCopeia公司构建。pmiR-RB-REPORT^TM双荧光素酶表达载体包含以Renilla荧光素酶为报告基因的hRlucc DNA和以萤火虫荧光素酶为内控基因的hLucc DNA。构建WT荧光素酶质粒包含全长3’-UTR的GAP43 mRNA。突变质粒包含一个3'UTR突变(从“TCTCTCC”突变为“AGAGAGG”)和一个vof16突变(从“CCTTTCTCTC”突变为“GGAAAGAGAG”)，以消除GAP43和vof16与miR-185-5p的结合。构建物经XhoI和NotI酶切测序证实。接种细胞293T细胞。将细胞悬浮、计数后，以4x10³/孔均匀接种至96孔板中。96孔板外侧一圈加PBS以减少边缘效应。正式转染前配置质粒和miR mimic。将5％FBS培养基预热。25μl5％FBS培养基稀释0.5μl Reagent，颠倒混匀后得到A液。25μl5％FBS培养基稀释1μl质粒(100ng)和0.4ul mimic(终浓度80nm)，颠倒混匀后得到B液。将A液加入B液中混匀，反应15min后，加入培养孔中，每孔50μl。加入到细胞时应逐滴加入。加入混合后的转染试剂、质粒和mimic后细胞在CO2培养箱中继续培养6h进行转染。在6h后，每孔加100μl的10％FBS培养基，使每孔达到150μl培养基体积。正常培养48小时后进行luciferase检测。荧光测定前每孔换70μl的基础培养基。检测前，Dual GloLuciferase Assay System(promega，USA)在室温平衡。每孔加入70μl firefly萤火虫荧光反应底物，摇晃10min后在biotek酶标仪中检测萤火虫荧光值。按1:100配制Renilla海肾荧光反应底物和Dual-Glo stop混合试剂(现配现用)。加入70μl混合液，摇晃10min后，继续在biotek酶标仪中检测海肾荧光值。海肾荧光值/萤火虫荧光值即为检测值。

12原代脊髓神经元培养

取新生1天SD大鼠置于75％酒精中浸泡消毒2min，放入无菌玻璃培养皿冰上断头，从背部拨开皮肤，暴露脊柱及肋骨，剪断两侧肋骨(注意保留一部分在脊柱上)取出完整的脊柱。左手持镊固定脊柱，右手用眼科剪从脊髓腔两侧剪开脊柱，注意尽量不要破坏脊髓，暴露脊髓后，用镊子小心取出脊髓。将其转入另一含双抗的DMEM的培养皿中洗去血污。在解剖显微镜下用显微镊剥离脊髓的脊膜及附着血管，将脊髓转入另一含双抗的DMEM的培养皿中。尽可能吸取多余的PBS液体，后用剪刀反复剪脊髓组织，剪成1mm3大小时停止；加入0.25％胰蛋白酶(约1ml/只鼠)，37℃孵箱，10-15min，晃动消化，使得组织和消化液充分接触，保证脊髓组织消化完全且不过度；从37℃培养箱中取出培养皿，放入超净台中。加入等量完全培养基，中止消化。轻柔吹打数次，一次性细胞滤网过滤后用15ml离心管收集，1000rpm离心10min；吹打重悬细胞：弃上清液。重新加入新鲜的完全培养基，轻柔缓慢吹打细胞约60次，制备单细胞悬液。将密度约为5×105个/ml细胞接种于0.01g/ml多聚赖氨酸室温包被30min的6孔板内，2ml/孔，采用完全培养基，培养板上下左右轻柔的晃动。板上标记接种时间和细胞名称，37℃，5％CO2培养箱培养。4h后全量换液，将完全培养基换为神经元专用培养基，以后每3天半量换液。

13 GAP43-si和miRNA模拟物/抑制剂转染原代脊髓神经元

转染前一天，接种1×10⁵细胞至6孔板中，使转染时的细胞密度能够达到50～80％。脊髓神经元培养第10d的时候状态最佳，是转染的最佳时机。紫外灯照射30min，关闭紫外灯，打开超净台风机，从培养箱内拿出原代神经元于倒置显微镜下照相，每孔5个视野，放大倍数为200X；转染前1h，取出6-孔板，换成2ml新鲜完全培养基，37℃孵育60min；转染混合液配制：将ribo FECT^TM CP Transfection Buffer(1×)按每组用量分装在7个无菌1.5mlEP管中，再将GAP43-si、miRNA按相应剂量加入EP管中，吹打混匀，室温孵育5min；每管中再加入ribo FECT^TM CP reagent，吹打混匀，室温孵育10～15min，不要超过30min。培养24h后，将培养基补充至2ml，37℃，5％CO₂的培养箱继续培养，并分别于转染后3d在倒置显微镜下进行拍照，每孔5个视野。利用Leica DMI6000(LAS AF system)测量神经元的数目及突起长度，导出数据，统计分析。

14 TUNEL分析

在培养的脊髓神经元中进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的刻痕末端标记(TUNEL)染色。将培养的神经元在室温下用4％多聚甲醛固定20min，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗20min，然后用TUNEL反应混合物孵育细胞37℃，1h，PBS冲洗3次。细胞与DAPI(BeyotimeBiotechnology)孵育5min，获得5个视野，采用Leica AF6000 DMI6000B(LAS AF system)测定TUNEL/DAPI的百分比，定量凋亡。

15 MiR-185-5p转基因鼠鉴定

先在冰上使用全式金(Transgen)公司的基因组DNA提取试剂盒(EE101-12)提取大鼠基因组DNA。根据miR-185-5p序列信息设计检测引物：Rat miR-185-F：5’-CTGATGTGCTCAGGGTGTTGACC-3’；Rat miR-185-R：5’-GCTGCTGATGTTAGGGAGGAGGC-3’。ProductSize：WT：750bp；MT：～520bp，delete～230bp，Annealing Temp：59℃。鼠尾鉴定PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，72℃充分延伸5min，保存温度12℃，35个循环。配制琼脂糖凝胶，跑胶，显影。

16划痕实验

划痕实验用于测量脊髓和皮层神经元的细胞迁移。简单地说，神经元以每毫升1x10⁶个细胞的密度被镀在孔中。第二天，用p200的移液管在60mm的培养皿上模拟出了一道划痕。然后用培养基洗涤细胞3次，加入新鲜培养基，37℃，5％CO₂孵育。分别于0、12、24、36h在荧光显微镜下随机观察5个划痕区域，获得图像。细胞迁移距离等于0小时的最短距离与12、24、36h的最短距离之差。

17鼠压爪机械痛(paw withdrawal threshold，PWT)

术后测定鼠压爪机械痛。流程如下：在25℃安静的环境中，将大鼠放入透明有机玻璃检测箱(25cm×35cm×45cm)中适应20-30分钟，箱底为金属丝网格(5mm×5mm)。待其安静后，用生物信号采集处理系统测定大鼠后足的缩足阈。在生物信号处理系统中标记此时的缩足阈值，每次持续时间不超过8s，测试相邻间隔时间为10s。每只大鼠重复10次。测量完成后，读数保存。

18鼠尾热刺痛(tail-flick latency，TFL)

利用YLS-12A鼠尾光照测痛仪，测量大鼠TFL。当大鼠适应周围环境后，依次把大鼠放到鼠尾光照测痛仪操作平台上，尾部放于发光源和感应器之上，用发光热源进行照射。照射部位为鼠尾近端1/3处。从发光源照射至鼠尾甩开这段时间，为大鼠甩尾潜伏期。发热功率23W，保护值16s，保持发光热源的照射强度不变。每只大鼠重复测定3次，间隔至少30min，记录测量值。

19新生大鼠缺血缺氧(Hypoxic-ischemic，HI)模型建立

在本次实验中采用改良的Rice-Vannucci法建立HI模型。给乳鼠称重12-15g并用异氟烷麻醉，用碘伏对颈部进行常规消毒。将大鼠仰卧位放置在泡沫板上，使用胶带将其固定住，在新生鼠颈部正中切0.5cm的切口，用镊子对颈部皮肤进行钝性分离，将肌肉逐层剥开，暴露出气管，在气管右侧找到右侧颈总动脉，使用单极电凝器凝断动脉。然后，缝合伤口，放于母鼠身旁恢复1h后再放于缺氧箱缺氧2h(8％O₂，92％N₂)。假手术组(Sham)仅暴露出右侧颈总动脉，不电凝，不缺氧，其余的手术过程均和前面一致。

202，3，5－三苯基氯化四氮唑(Triphenyte-trazoliumchloride，TTC)染色

为了评估HI损伤后脑的梗死体积，采用TTC染色。简言之，术后12h和24h将Sham组和HI组大鼠用异氟烷麻醉后，采用颈椎脱臼法，小心快速的取出大脑，在-20℃保存10min左右，将大脑放入脑片模具中切成5片厚度为2mm的冠状位切片。然后，将切片放置于1％TTC染液中，用锡箔纸包住以避光，放入37℃恒温箱中染色15min，期间不时翻动脑片，使脑片均匀接触到染色液。染色后用照相机进行拍照，观察脑组织：若为淡红色则为未缺血坏死，白色则为已缺血坏死组织。然后通过Image J软件(National Institutes of Health，Bethesda，MD，USA)分析梗死体积。梗死体积的百分比＝(左侧脑体积-右侧缺血梗死体积)/左侧脑体积×100％。

21大鼠缺血缺氧性脑皮质组织lncRNA/基因测序

HI后24h取皮质，包括梗死周围组织(距梗死区约3毫米的同侧半球)，在生物标记技术有限公司(北京，中国)进行基因测序，以发现差异表达的lncRNA、miRNA和mRNA。

22差异基因表达筛选

本实验采用EBSeq进行差异表达分析，获得两个样品之间的差异表达基因集。在差异表达基因检测过程中，将Fold Change≥2且FDR<0.05作为筛选标准。差异倍数(FoldChange)表示两样品(组)间表达量的比值。错误发现率(False Discovery Rate，FDR)是通过对差异显著性p值(p-value)进行校正得到的。由于长链非编码测序的差异表达分析是对大量的基因表达值进行独立的统计假设检验，会存在假阳性问题，因此在进行差异表达分析过程中，采用了公认的Benjamini-Hochberg校正方法对原有假设检验得到的显著性p值(p-value)进行校正，并最终采用FDR作为差异表达基因筛选的关键指标。

23 lncRNA预测筛选

基本筛选主要由4个部分组成：1)去除基因组数据库中的mRNA(转录本及其剪接体)；2)选择长度≥200bp，Exon个数≥2的转录本；利用cufflinks计算每个转录本的reads覆盖度，选择最小覆盖度≥3的转录本；3)同时被两个拼接软件拼接得到的lncRNA也筛选出来，得到最终的新预测lncRNA集进行后续分析；4)利用cuffcompare信息筛选lincRNA，intronic lncRNA，anti-sense lncRNA等不同类型的lncRNA。

在差异表达lncRNA检测过程中，将Fold Change≥2且FDR<0.05作为筛选标准。差异倍数(Fold Change)表示两样品(组)间表达量的比值。

24差异表达基因GO分类和通路分析

GO数据库是GO组织(Gene Ontology Consortium)于2000年构建的一个结构化的标准生物学注释系统，旨在建立基因及其产物知识的标准词汇体系，适用于各个物种。GO注释系统是一个有向无环图，包含三个主要分支，即：生物学过程(Biological Process)，分子功能(Molecular Function)和细胞组分(Cellular Component)。差异表达基因KEGG通路富集分析为分析差异表达基因在某一通路上是否过出现(over-presentation)。

25培养PC12细胞

根据“速溶慢冻”原则，将冻存的PC12细胞从-150℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴锅中摇动并使其快速融化。酒精擦拭管口后于超净台中将细胞悬液吸入到准备好的无菌15ml离心管中，并加入8ml预热的高糖DMEM完全培养基混匀。1500rpm离心4min后去除上清液体。获取细胞沉淀后向离心管中加入新鲜的含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基得到细胞悬液，混匀后将PC12细胞移入25cm²培养瓶中，放入37℃，5％CO₂培养箱培养。第二天更换一次高糖DMEM完全培养基。待PC12细胞长至铺满瓶底约80％时进行细胞传代。传代时将PC12细胞的培养基倒掉，加入预热的PBS2ml轻轻摇动使其流遍瓶底表面清洗细胞，尽可能弃掉原培养基中FBS。而后加入2ml胰酶，拍打培养瓶使PC12细胞呈单个分散状，镜下观察，发现细胞胞质回缩、细胞间质增大，细胞悬浮起来后立即用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中止消化。将收集到的细胞悬液移入15ml离心管内，1500r/min离心4min。弃上清后在细胞沉淀中加入培养基，而后将细胞悬液移入新的培养瓶或培养板中，放入培养箱进行培养以便后面的操作。可根据自身所需按照1：8到1：12的比例进行传代。

26原代皮质海马神经元培养

取新生大鼠酒精浴消毒2min后，快速剪刀断头放入培养皿内。在解剖显微镜下用显微镊剥离大鼠脑膜。然后用显微镊由额部逐渐向枕部夹取脑皮质，而后取出海马，将夹取的大鼠皮质，海马小块放入事先准备好的盛有2mL预冷DMEM(高糖)液的玻璃培养皿中。用无血清高糖DMEM培养基冲洗脑组织2-3次后，吸弃多余的培养基。然后用显微剪将皮质小块剪碎至1mm³左右，在培养皿中加入0.25％胰酶越3ml，并加入DNA酶约200μl(200μl/支，自配，-20℃保存)，用微量加样枪轻轻吹打。而后放入5％CO₂，37℃，95％湿度的培养箱中消化孵育10min，中间混匀1-2次，使得组织和消化液充分接触。取等体积含10％胎牛血清的高糖DMEM完全培养基于培养皿中止消化。巴氏管轻轻吹打40次，静置1min后吸取上清液于15ml离心管中，此步骤重复2次。将15ml离心管中收集的细胞悬液用200目细胞过滤器过滤转移至另一个15ml离心管中，并于1000rpm离心8min。弃上清重新加入新鲜培养基重悬细胞。将制好的单细胞悬液再次用200目细胞过滤器过滤后，用细胞计数板计数活细胞数量，按照所需接种密度调整细胞悬液密度后接种至包被好的6孔板(每孔2ml)中，轻柔晃动培养板，置于培养箱中培养。用于PCR检测的细胞接种密度为6x10⁵个/ml，用于免疫荧光检测的细胞接种密度为4x10⁵个/ml。4h后将培养板中的培养基全部吸出，换成神经元专用培养基。以后每3天半量换液。

27细胞氧糖剥夺(OGD)模型的制作

本发明在体外细胞上进行OGD模型构建。首先将三气培养箱参数设置成氧气为0％、氮气95％、二氧化碳5％、温度37℃。而后将细胞培养液轻柔吸弃，加入无糖DMEM培养基将细胞洗涤两遍后于96孔板/6孔板中每孔分别加入100μl/2ml无糖培养基。待箱内氧气浓度变为0％后将细胞置入培养箱中，一直通入氮气保持氧浓度为0％，缺氧1小时，之后将无糖DMEM培养基重新换成等量含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基或神经元专用培养基，放置于37℃细胞培养箱(含95％空气+5％二氧化碳混合气体)24小时。PC12细胞达到80％融合度时进行OGD，神经元培养至第七天时进行OGD。24h后进行细胞活力、细胞凋亡及细胞生长情况检测。

28 PC12及神经元中lncRNA过表达慢病毒转染

PC12中过表达慢病毒转染及稳定细胞株构建：实验前保证细胞的良好生长状态，实验前一天按照5X10⁴/ml接种目的细胞于6孔培养板中。接种2ml。不同种类的细胞生长速度有所差异，为保证有较好的实验结果，进行病毒感染时细胞的融合率约为30～50％。将病毒(NC-21317，Vi1-21317-70547，Vi2-21318-45572，Vi3-21316-41002，Vi4-21319-44054)分别加入6孔板，再加入0.5mg/ml polybrane 20μl。12h以后观察细胞状态，弃去细胞上清，更换为新鲜培养基。感染3d后，观察荧光表达情况，细胞长满后传代至T25培养瓶中获取更多转染有病毒的PC12细胞，待其在T25中基本长满时加入嘌呤霉素进行筛选(2μg/ml)，构建最终稳定过表达lncRNA的PC12细胞冻存。

原代皮质，海马神经元慢病毒转染：神经元培养至第3d时进行病毒转染，根据接种的细胞数量计算相应病毒体积，MOI＝1.25，半量换液时将病毒混入培养基加入细胞培养板中，神经元转染不加polybrane，8h后弃去细胞上清，更换为新鲜培养基继续培养4d后进行OGD处理。

29 CCK8神经元活力测定

培养于96孔板中的原代皮质神经元OGD后24h，于各组原代皮质神经元每孔加入10μl CCK8溶液(Engreen，CCK8：培养液为1:10)，注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。将培养板在37℃，5％CO₂培养箱内孵育3h。3h后96孔板置于振荡器上振荡2-5min，酶标仪450nm检测吸光度值(OD)值，从而计算细胞活力。

30免疫细胞化学染色

OGD后24h取出接种有皮质神经元的6-孔板，弃去培养基。用PBS液漂洗3次，1ml/孔，5min/次，每孔加入4％多聚甲醛溶液2ml，室温固定20min。弃去多聚甲醛，每孔加入1mlPBS溶液漂洗3次，5min/次；而后取出爬片放于载玻片上。每张切片加入5％羊血清3‰Triton混合液20μl，于37℃烤箱内孵育30min。弃去5％羊血清3‰Triton混合液，加入Tuj1一抗(1:200，用2％羊血清稀释)，4℃过夜。PBS洗3次，5min/次，避光加入二抗(1:100，用2％羊血清稀释)，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，5min/次。滴加含抗荧光淬灭剂的DAPI进行细胞核染色，室温孵育3min，于荧光显微镜下观察并照相。

31 TUNEL染色

OGD后24h，取出PC12细胞及神经元进行细胞凋亡检测染色，步骤如下:用移液枪吸尽培养基，用0.01mol/lPBS(pH7.6)溶液进行漂洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定细胞，室温，20min。0.01MpH7.6PBS缓冲液3遍，每遍5min，0.1％Triton-X100+0.1％柠檬酸钠(纯水配制)常温37℃30min。PBS缓冲液3遍，每遍5min。TUNEL染色：酶液：标记液＝1:9避光，4℃，16-18h150ul/每个标本(必须现配现用且在冰上配制使用时尽量避光)，避光PBS缓冲液3遍，每遍5min，DAPI复染细胞核，荧光显微镜下观察结果。

32生物信息学分析

为了预测lncRNA、miRNA和mRNA之间的关系，采用Biomarker Technologies进行ceRNA分析。此外，利用RNA22(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/)预测lncRNA与miRNA的结合位点，利用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)预测靶向Igfbp3的miRNA。采用Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)进行交集分析。

33荧光素酶报告分析

RiboBio(中国广州)合成Igfbp3 3’UTR荧光素酶质粒和相应的突变体质粒。Vi4-ORF-突变体由GeneCopeia公司(中国广州)提供。pmiR-RB-REPORT^TM双荧光素酶表达载体包含以Renilla荧光素酶为报告基因的hRlucc DNA和以萤火虫荧光素酶为内控基因的hLuccDNA。构建WT荧光素酶质粒包含全长3’-UTR的Igfbp3 mRNA，突变质粒包含3’-UTR突变(由“TCTCTCC”突变为“AGAGAGG”)，可以有效解除Igfbp3与miR-185-5p的结合。构建物经XhoI和NotI酶切测序证实。检测方法同脊髓损伤。

34收集人血清样本

收集脑损伤病人全血，将所有血清标本采集后2h内，均送回昆明医科大学神经科学研究所实验室。按照标准进行过滤处理后，将23人的血清在凝血管中离心1000x10min，分离血清。然后将收集的血清转移到1.5ml的EP管中。所有样品立即冷冻于液氮中，并于80℃保存。此外，对对照组获得的血清也进行了相同的处理。本实验获得2014-2年度伦理委员会批准。

此外，本发明还收集了一个29d的流产胎儿来培养原代皮质神经元，这已经在2015年9月30日由中国昆明医科大学道德委员会批准(批准号：2105-9)，已经从母亲那里获得了知情同意。流产胎儿是从昆明医科大学第一附属医院收集并且立即存放在冰上。然后将大脑解剖并置于75％酒精中2min。皮质神经元培养按照大鼠皮质神经元方法培养。

35 HE染色

挑选位置相同的脑片，进行石蜡切片预处理(脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；然后将切片依次置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液及蒸馏水中各3min进行水化)处理。之后用苏木素染液(无锡市江原事业技贸有限公司)染色2min，再用自来水冲洗，使细胞核着蓝色。盐酸乙醇分化15s，流水冲洗10min。之后分别在95％酒精2min；伊红染色(无锡市江原事业技贸有限公司)30s；85％酒精2min；95％酒精2min；100％酒精Ⅰ、Ⅱ2min使细胞质着粉红色。再放入二甲苯Ⅰ(天津市风船化学试剂有限公司)3min、二甲苯Ⅱ3min进行细胞透明，最后用中性树脂封片。在光学显微镜(Leica)下观察组织的形态学改变。

36尼氏染色

挑选位置相同的脑片，进行石蜡切片预处理(脱蜡：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min；然后将切片依次置于浓度梯度为100％、95％、90％、80％、70％的酒精溶液及蒸馏水中各2min进行水化)处理。之后将脑片置于湿盒上，在脑组织上滴加A液Cresyl violet Stain(北京索莱宝科技有限公司)，每个脑组织染30-40μl，室温避光放置9min。之后倾去A液，用蒸馏水冲洗。在脑组织上滴加B液Nissl Differentiation，染色2min。无水乙醇迅速脱水。再放入二甲苯Ⅰ(天津市风船化学试剂有限公司)3min、Ⅱ3min进行细胞透明，最后用中性树脂封片。在光学显微镜(Leica)下观察组织的形态学改变

37 Y迷宫检测

该试验用于检测大鼠术后30d记忆能力，大鼠禁食1-2天，不禁水，使其体重减至原体重的85％，此时动物才具有摄取食物的驱力或动机。大鼠禁食后，将动物置于Y迷宫宫体内，每次适应10分钟左右，每天可以适应2-3次，不需要放食物，一般适应1天。在Y迷宫某一臂放置大鼠饵料，另外一个臂的门关闭，将老鼠放入起始臂，训练大鼠找到食物，必要的时候进行引导。每次训练5min，每天训练10次，连续训练3天。最后，同时将Y迷宫三个臂的门都打开，不放入食物，将大鼠放入起始臂，记录大鼠5分钟内进入各个臂的次数以及逗留时间。其中进入食物壁的次数越多及时间越长代表老鼠的学习记忆功能更好。

38旷场实验

该检测主要用于测定本实验中大鼠脑缺血缺氧后30d在新异环境中的自主行为、探究行为与紧张度。实验装置由旷场反应箱和数据自动采集和处理系统两部分组成，由上海欣软信息科技有限公司提供。大鼠旷场反应箱高30～40cm，底边长100cm，内壁涂黑，底面平均分为25个4cm×4cm小方格，正上方2m处架一数码摄像头，其视野可覆盖整个旷场内部。旷场光照为全人工照明，可人为设定“白天”和“黑夜”，白天由两侧墙壁的4只节能灯发出约2001ux照度来模拟，夜晚由一侧墙的红外光源提供照明。实验室背景噪音控制在65dB以下。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察5min后停止摄像。清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息(如动物的大、小便、气味)影响下次测试结果。更换动物，继续实验。根据计算机软件设计不同可观察的参数不同，设置手动输入指标：A站立持续时间C，理毛持续时间。

39转棒实验

转棒实验是检测缺血缺氧性脑损伤后30d大鼠远期运动功能及协调能力的改变。在大鼠缺血缺氧性脑损伤后两月余进行转棒仪测试。各组大鼠在实验前3天进行适应性训练。正式试验时，将各组大鼠放在转动的棒上(直径cm)，转棒3分钟内由4rmp加速到40rmp，此后以40rmp匀速转动记录大鼠从放到棒上到掉落的时间，以秒为单位，连续测试3次，取最长时间纳入评分。所有试验都是由三位试验者双盲状态下完成。

40 Morris水迷宫

Morris水迷宫(Morris water maze，MWM)实验是一种强迫实验动物(大鼠、小鼠)游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感(空间定位)的学习记忆能力。由于没有任何可接近的线索以标志平台的位置，所以动物的有效定位能力需应用水箱外的结构作为线索。迷宫由圆形水池、自动摄像及分析系统两部分组成，图像自动采集和处理系统主要由摄像机、计算机、图像监视器组成，动物入水后启动监测装置，记录动物运动轨迹，试验完毕自动分析报告相关参数。分获得性训练、探查训练2个过程。(1)获得性训练(Acquisition phase)：将水池分为4个象限，平台置于其中一个象限区的中央，按如下步骤依次训练动物。1)将动物(大鼠或小鼠)头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果这个时间超过90s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s.2)将动物移开、擦干。必要时将动物(尤其是大鼠)放在150W的白炽灯下烤5min，放回笼内。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15～20min，连续训练5d。(2)探查训练(probetrial1)最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始90s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。实验步骤如下：1)向水迷宫的池子中注入水，水量没过小圆台1cm即可，向水池中加入墨汁，墨汁的量以水池中不能看见小圆台为准。2)准备好3个月大的SD大鼠，并在鼠尾编号标记。3)打开水迷宫摄像装置，链接电脑，按照步骤设置和完成水迷宫实验及分析。

41神经损伤严重程度评分(NSS)

于术后30d进行神经损伤严重程度评分，分值为0至18(正常评分:0；最大缺损评分:18)。NSS是运动、感觉、反射和平衡测试的组合。分数越高，受伤越严重。每只大鼠由三个实验人员进行盲评，且这三名成员不参与模型制作，对实验分组亦不知晓。

(1)评分细则

1)提鼠尾，离地约1M(正常＝0，最大＝3)

0分：四肢伸展，头部偏离中线不超过10度；1分：前肢屈曲；1分：后肢僵直；1分：30秒内头部偏离中线超过10度

2)运动功能(正常＝0，最大＝3)

0分：正常行走；1分：不能走直线；2分：偏瘫侧打圈；3分：向瘫侧跌倒无法走

3)感觉功能

1分：痛、温觉；2分：本体感觉

4)横梁实验(正常＝0，最大＝6)

0分稳定站在横梁上；1分：抱住横梁一侧；2分：一个肢体掉下；3分：两个肢体掉下；4分：横梁上40s后掉下；5分：横梁上20s后掉下；6分：横梁上20s内掉下

5)反射活动

1分：角膜反射；1分：耳廓反射；1分：惊吓反射；1分：肌张力障碍

(2)操作步骤

1)提起大鼠尾巴，离地约1米，观察评分表中A项内容进行评分。

2)把大鼠平放在地上，观察大鼠的行走路线和步态进行评分。

3)感觉功能检测见温痛觉检测表。

4)将大鼠放在横梁一侧，观察大鼠能否在横梁上站立，大鼠的前后肢运动状态，并进行评分。

5)用棉签轻触大鼠眼角角膜，观察大鼠是否能闭目，不能闭目记为1分；用棉签的木棒一头轻触大鼠耳廓内侧，观察大鼠是否能甩头，不能甩头记为1分；把大鼠放在地面上，突然在大鼠耳边拍手，观察大鼠是否眨眼睛，不能被惊吓到记为1分；抓起大鼠，牵拉大鼠的前后肢，观察大鼠能否能抓住物体，向外牵拉是否有阻力感，无阻力感记为1分。

42PET-CTCT检测

术后两月余对各组大鼠进行PET-CT扫描，观察脑内葡萄糖能量摄取情况。大鼠提前进行吸入麻醉，检查仪器PET/CT为美国GE公司的Discovery 690/Elite。先行螺旋CT扫描，参数为电压120kV，电流260mA，螺距0.561，转速0.5s/周，层厚3.75mm，间隔3.75mm，矩阵512×512，FOV 50cm×50cm；随后行PET扫描；参数为每只大鼠扫描两个床位，每个床位采集2.5min，用CT作衰减校正、迭代重建得到47帧PET横断面图像。每只大鼠腹膜内注射18F-FDG4.2MBq/kg，于注射18F-FDG后60min显像。将CT和PET图像数据分别传入AW VolumeShare5工作站，得到CT和PET显像的冠状面、矢状面、横断面和三维立体图像及其融合图像。由一位研究生和一位中级PET-CT报告医师通过双盲法分别阅读PET-CT图像，勾画脑实质区ROI，确定WB-SUVmax取其平均值。

43免疫蛋白印记(WB)

于损伤后24h获取大鼠脑皮质组织，检测P-AKT和AKT蛋白的表达变化，即加入RIPA裂解液与蛋白酶抑制剂鸡尾酒片混合后，匀浆、超声提取样品总蛋白。BCA法定量蛋白浓度后，加入上样缓冲液，煮沸变性。取60μg总蛋白上样，用10％的PAGE胶分离(80V，40min then120V，1.5h)。之后在20V，20min将蛋白转印到PVDF膜。将PVDF膜于5％胎牛血清中封闭2h。弃去封闭液，加入5％BSA稀释好的一抗(β-actin，Abbkine，A01010，Mouse，1:2000；Igfbp3，Ab6672，rabbit，1:500)4℃过夜。TBST漂洗后孵育二抗(HRP，Goat Anti-Rabbit IgG，A21020，1:5000；HRP，Goat Anti-Mouse IgG，A21010，1:5000)，室温轻摇1h。TBST漂洗后ECL发光法显影，使用Geldoc凝胶成像分析仪(BIO-RAD)采集图片，Image J测量灰度，β-actin作为内参对照。

44黄芩苷(Scu)治疗HIE

建立HIE后，选择最佳的Scu时间窗和浓度。先用833ml DMSO将1g Scu粉末溶解浓度为120mg/ml，再用0.9％生理盐水将Scu稀释成4mg/ml。然后，分别于HI后0h和24h腹腔注射20mg/kg和30mg/kg的Scu。最后，对20mg/kg和30mg/kg Scu的治疗效果进行神经行为功能评价，筛选出最佳给药浓度和给药时间。

45统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据统计，结果以均数±标准差表示，两组之间比较用t检验，三组及以上比较用单因素方差分析，*P＜0.05，表示差异有统计学意义。

实验结果

实验1：SCT大鼠有限的神经功能恢复与GAP43时间依赖性增加与lncRNA相关。SCT大鼠术后完全瘫痪，后肢运动和后肢反射能力丧失，MRI证实完全横断(图2A-a-c)。SCT大鼠后肢运动功能缺陷，恢复较差，但运动功能随时间逐渐改善，尤其在SCT后12周，BBB评分升高(图2A-h)。此外免疫荧光染色显示GAP43在12周时的荧光强度明显强于损伤后1周(图2A-i，P<0.05)，而且GAP43的荧光强度(图2A-d-g)与损伤后1～12周的BBB评分(图2A-h)密切相关(图2A-j)，这可以从第1周的极弱染色到第12周的强染色反映出来。GAP43免疫荧光染色结果表明SCT大鼠的神经功能恢复与GAP43的时间依赖性增加有关。层次聚类筛选出了四个lncRNA，qRT-PCR显示其中vof16 lncRNA在受损脊髓中的相对表达明显上调(图2B-a-d，P<0.05)。

实验2：GAP43通过调节vof16-miRNA-185-5p网络促进SCT后脊髓神经再生。利用ceRNA分析探讨lncRNA、miRNA和mRNA之间的关系，预测vof16的候选靶点。因此，本发明使用Miranda和TargetScan软件，发现vof16有31个潜在的miRNAs靶点(图3A)。此外，miRNA微阵列分析显示，185个miRNA在大鼠SCT和sham之间存在差异表达(图3B)。其中185个差异表达的miRNA中有9个被vof16调控(图3C)。此外，这些研究通过TargetScan和miRDB软件以及venny网站预测了调控GAP43的miRNA靶点，发现有3种miRNA可能调控GAP43的表达(图3D)。为了确认这些miRNA在SCT后的表达，本发明使用qRT-PCR来量化横断部位喙侧和尾侧miRNA在sham组和SCT组之间的表达。结果显示，与sham组相比，SCT可显著降低miR-185-5p在喙侧和尾侧的表达(图3E，P<0.05)。为了进一步证实vof16是否与miR-185-5p和GAP43存在调控关系，用RNA22和TargetScan预测vof16和miR-185-5p之间，GAP43和miR-185-5p之间的结合点。为了确定这种观察到的效应是否取决于它们对vof16和GAP433’UTR的调节，本发明构建了包含vof16(vof16-野生型，vof16-突变型)和GAP43 3’UTR(GAP43-野生型，GAP43-突变型)的荧光素酶报告基因(图3F，G)。双荧光素酶报告基因检测实验和划痕实验结果表明vof16通过竞争性结合SCT中的miR-185-5p调节GAP43的表达(图3H-J)

实验3：抑制miR-185-5p可增加脊髓神经元中GAP43调控的神经元突起生长。为了确定miR-185-5p-激活剂/抑制剂与GAP43-si处理后对脊髓神经元的影响，用Tuj1和GAP43进行免疫荧光双标染色。结果发现抑制miR-185-5p可增加脊髓神经元的生长和GAP43的表达，抵消GAP43-si诱导的神经元减少，进而减少了神经元细胞凋亡(图4A-E，P<0.05)。

实验4：MiR-185-5p KO在沉默GAP43后促进细胞生长和迁移，在SCT后改善运动和感觉功能。为了进一步研究miR-185-5p是否与GAP43共同调控细胞生长，本发明通过CRISPR/CAS9技术建立了miR-185-5p KO大鼠。通过PCR凝胶电泳验证基因型，包括野生型(WT+/+)，纯合子(KO-/-)，和杂合子(HE)。WT和KO用于此研究(图5A)。结果显示miR-185-5pKO组促进了脊髓神经元轴突的生长，提高了细胞迁移率，并减轻了SCT诱发的运动和感觉功能障碍(图5B，F-K，P<0.05)。用GAP43-si处理脊髓神经元后，与miR-185-5pWT组相比，miR-185-5p KO组的神经元轴突生长和细胞数量明显改善(图5C-E，P<0.05)。

实验5：基因测序筛选lncRNA和Igfbp3 mRNA。HIE后12和24小时能够引起新生大鼠右侧脑水肿以及严重的梗死(图6A-D，P<0.05)。然后取皮质进行基因测序，筛选出了四个差异表达的lncRNA和Igfbp3mRNA，并通过R软件将Igfbp3预测为TCONS00044054的靶基因(图6E-G)。

实验6：TCONS00044054过表达(Vi4-ORF)保护神经元。为了检测这四种lncRNA的功能，本发明构建了4种lncRNA的慢病毒介导过表达载体。这些载体被转染到原代皮层神经元和海马神经元中。4种lncRNA(Vi1、Vi2、Vi3、Vi4)的过表达均可提高PC12细胞和原代神经元在OGD条件下的存活率，降低凋亡细胞数量。Vi4(TCONS00044054)是OGD后最有效的神经元保护(图7A-G)。因此，后续的调查集中在lncRNA TCONS00044054，简称为Vi4。

实验7：miR-185-5p的负调控竞争性地抑制了HI中Vi4上调Igfbp3的作用。通过对Vi4的生物信息学分析和基因测序的联合分析，Igfbp3被确定为Vi4的靶点(图8A，B)，在转染Vi4-ORF后，通过qRT-PCR对OGD皮层神经元进一步验证，发现Igfbp3的表达明显上调(图8C，P<0.05)。此外，本发明还调查了Vi4是否与Igfbp3共同调节miRNAs。使用RNA22、targetscan和miRNA测序交叉分析发现，miR-185-5p和miR-380-5p最有可能沉默Vi4和Igfbp3(图8D，E)，并且HIE导致皮质和海马中Igfbp3表达显著升高，而miR-185-5p和miR-380-5p表达下降(图8F，G，P<0.05)。本发明还发现OGD后miR-185-5p明显下调，而Vi4-ORF处理可进一步增强这一效应。但miR-380-5p的表达无明显差异，因此本发明将miR-185-5p作为进一步研究的重点(图8H，P<0.05)。构建miR-185-5p激活剂和抑制剂转染神经元。研究表明，miR-185-5p激活剂可引起Igfbp3的下调，而miR-185-5p抑制剂或Vi4-ORF可抵消OGD诱导的Igfbp3的下调，说明ODG后miR-185-5p和Vi4-ORF均可竞争性调控Igfbp3的表达(图8I，P<0.05)。随后，使用RNA22和Targetscan预测Vi4与miR-185-5p、miR-185-5p和Igfbp3之间的结合位点。为了确定这种观察到的效应是否取决于它们对Igfbp33’UTR的调控，本发明构建了包含Igfbp3 3’UTR的荧光素酶报告基因(Igfbp3野生型、Igfbp3突变型)和Vi4-ORF野生型和Vi4-ORF突变型(图8J)。双荧光素酶报告基因检测实验结果表明miR-185-5p和Igfbp3在预测的结合位点结合，并且Vi4的过表达可以克服Igfbp3的荧光素酶活性降低(图8K，L，P<0.05)。此外在脑损伤病人血清样本中也发现Igfbp3的表达是升高的，然后miR-185-5p的表达是明显下降的与正常人比较(图8M，P<0.05)。

实验8：敲除miR-185-5p后，新生儿HIE引起的神经功能缺陷得到改善。为了研究miR-185-5p在HIE大鼠中的作用，本发明利用CRISPR/CAS9技术培养了miR-185-5p KO大鼠(图9A)。通过PCR凝胶电泳检测WT、KO和HE的基因修饰。实验采用WT和KO(图9B)。如图8C所示，miR185-5p-WT组TTC染色显示右侧脑梗死明显，而miR185-5p-KO组脑梗死明显减少，梗死灶率降低(％对侧)(图9C，D，P<0.05)。此外HE染色进一步显示miR185-5p-KO组皮质和海马的细胞明显比miR185-5p-WT组小，更趋于正常(图9E，F，P<0.05)。尼氏染色发现miR185-5p-KO组皮质和海马总神经元明显增多，而凋亡神经元细胞数量明显减少(图9G-I，P<0.05)。NSS评分、转棒实验、Y迷宫、水迷宫和旷场实验等行为学检测表明miR185-5p-KO大鼠在HIE后具有更好的运动功能、协调能力、学习能力和空间记忆能力，证明敲除miR-185-5p可以减轻HIE引起的运动，学习和记忆功能障碍(图9J-P，P<0.05)

实验9：MiR-185-5p KO可降低OGD后原代皮层神经元和海马神经元的细胞凋亡，提高细胞活力。用PET-CT观察脑内葡萄糖摄入量，用SUV-max定量。miR-185-5p-KO与WT相比，葡萄糖摄入量增加(图10A，P<0.05)。在营救实验中，本发明将Vi4-shRNA(Vi4sh)或Igfbp3-shRNA(Igfbp3sh)加入miR-185-5p KO细胞中。OGD可诱导细胞凋亡、轴突损伤等严重的神经元损伤，而miR-185-5p KO表现出较好的细胞表型。这种保护作用通过抑制Vi4或Igfbp3而被消除(图10B、C)，这可以从较短的神经元突起、较多的细胞凋亡以及皮质和海马神经元中较小的CCK8值得到证明(图10D，P<0.05)。这些发现进一步支持了miR-185-5p KO通过调节Igfbp3和Vi4来保护OGD神经元。

实验10：MiR-185-5p KO可增加Igfbp3的表达。如图10A所示，敲除miR-185-5p后，大鼠皮质和海马中Igfbp3蛋白水平与WT相比显著上调(图11A，P<0.05)。此外，使用流产胎儿的皮质神经元进一步验证发现OGD后Igfbp3的表达明显上升，而miR-185-5p的表达明显下降与正常神经元相比(图11B，C，P<0.05)。

实验11：HI后立即给予20mg/kg Scu可通过调节Vi4-miR-185-5p-Igfbp3网络改善长期神经功能障碍。为了进一步验证Vi4-miR-185-5p-Igfbp3网络在HI中的作用，HIE后立即给予20mg/kg Scu后进行水迷宫实验、NSS评分、转棒实验和Y迷宫测试等行为学实验检测，结果表明，在HIE后立即使用SCU处理的大鼠可以更好的减轻HIE引起的运动，学习和记忆功能障碍(图12A-I，P<0.05)。qRT-PCR检测结果表明与假手术组相比，HIE后24h Igfbp3和Vi4的表达增加，但2周后下降；miR-185-5p的表达降低，但2周后有所恢复。在HIE后立即给予SCU可以进一步增加Igfbp3和Vi4表达，降低miR-185-5p的表达。所有这些变化在皮质中比在海马中更明显(图12J，K，P<0.05)。这些结果表明，HI后立即给予Scu-20mg/kg具有有效的神经治疗作用，Vi4-miR-185-5p-Igfbp3网络参与了这些作用的介导。

本发明涉及miRNA抑制剂及其组成成分。miRNA抑制剂和组合物可能对治疗神经系统疾病如影响中枢神经系统的疾病有用。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

实施例1 miR-185-5p抑制剂用于治疗脊髓损伤

1.实验方法

①构建脊髓横断(SCT)大鼠，进行BBB行为学评分和GAP43免疫荧光染色。

②层次聚类筛选假手术组和SCT组之间差异表达的lncRNA，并用qRT-PCR验证。

③生物信息学分析预测vof16的靶标候选物，用qRT-PCR、双荧光素酶报告基因检测实验和划痕实验验证候选物。

④构建miR-185-5p-mimic和miR-185-5p KO大鼠抑制miR-185-5p，检测抑制miR-185-5p后对GAP43的表达、脊髓神经轴突的生长、细胞的迁移以及大鼠运动和感觉功能的影响。

2.实验结果

①BBB行为学评分和GAP43免疫荧光染色结果表明SCT大鼠的神经功能恢复与GAP43的时间依赖性增加有关(图2A)。层次聚类筛选出了四个lncRNA，qRT-PCR显示其中vof16 lncRNA在受损脊髓中的相对表达明显上调(图2B)。

②生物信息学分析表明185个差异表达的miRNA中的9个miRNA受vof16调控(图3A-C)，三种可能调控GAP43表达(图3D)，qRT-PCR检测筛选出miR-185-5p(图3E)，双荧光素酶报告基因检测实验和划痕实验结果表明vof16通过竞争性结合SCT中的miR-185-5p调节GAP43的表达(图3F-J)。

③通过miR-185-5p-mimic抑制miR-185-5p后，增加神经元的生长和GAP43的表达，抵消GAP43-si诱导的神经元减少，并减少神经元细胞凋亡(图4)。

④通过KO敲除miR-185-5p后，改善了脊髓神经元的生长，提高了细胞迁移率，并减轻了SCT诱发的运动和感觉功能障碍(图5)。

实施例2 miR-185-5p抑制剂用于治疗缺氧缺血性脑病

1.实验方法

①在皮质组织中进行基因测序筛选新生儿HIE后24小时差异表达的lncRNA和mRNA。

②构建筛选出来的潜在的lncRNA的慢病毒介导的过表达载体，并验证了它们的过表达对OGD后神经元细胞生长和凋亡的影响。

③进行生物信息学和基因测序的联合分析，验证LncTCONS00044054(Vi4)的标靶。

④通过q-PCR和双荧光素酶报告基因检测实验检测miR-185-5p、Igfbp3和Vi4之间的关联。

⑤构建miR-185-5p KO大鼠抑制miR-185-5p，在体内通过TTC染色、行为学检测和PTE-CT检测miR-185-5p对大鼠运动和感觉功能的影响，在体外通过免疫荧光染色、TUNEL检测和CCK8检测Igfbp3和Vi4在miR-185-5p KO后对神经元轴突生长和凋亡的影响。

⑥通过WB检测miR-185-5p KO大鼠中Igfbp3的表达。PCR检测培养的胎儿神经元OGD后miR-185-5p和Igfbp3的表达。

2.实验结果

①基因测序结果筛选出了四个差异表达的lncRNA和Igfbp3 mRNA，并通过R软件将Igfbp3预测为TCONS00044054的靶基因(图6)。

②在氧气/葡萄糖剥夺(OGD)下，原代神经元中Vi4的过表达均提高了活力，并减少了凋亡细胞(图7)。

③生物信息学分析和基因测序联合结果表明Igfbp3是Vi4的靶标，PCR结果表明在OGD中过表达Vi4可显著上调Igfbp3(图8A-C)。同时生物信息学分析结果表明，miR-185-5p和miR-380-5p是最可能同时沉默Vi4和Igfbp3的miRNA(图8D-E)。

④体内实验q-PCR结果表明HIE诱导Igfbp3表达增加，miR-185-5p和miR-380-5p表达降低。OGD后miR-185-5p明显下调，Vi4-ORF处理可以进一步增强这种作用。但是，miR-380-5p的表达没有明显差异，因此miR-185-5p的研究重点是进一步的研究(图8F-H)。

⑤进一步体外实验中q-PCR结果表明过表达miR-185-5p导致Igfbp3的下调，而miR-185-5p抑制剂或Vi4-ORF可以抵消OGD诱导的Igfbp3下调，表明miR-185-5p和Vi4-ORF在OGD后表现出对Igfbp3表达的竞争性调节(图8I)。双荧光素酶报告基因检测实验结果表明miR-185-5p和Igfbp3在预测的结合位点结合，并且Vi4的过表达可以克服Igfbp3的荧光素酶活性降低(图8J-L)。此外在脑损伤病人血清样本中也发现Igfbp3的表达是升高的，然后miR-185-5p的表达是明显下降的与正常人比较(图8M)。

⑥miR-185-5p KO大鼠抑制miR-185-5p后，TTC染色中明显减少脑梗塞(图9A-C)。NSS评分、转棒实验、Y迷宫、水迷宫和旷场实验等行为学检测表明KO大鼠在HIE后具有更好的运动功能、协调能力、学习能力和空间记忆能力，证明敲除miR-185-5p可以减轻HIE引起的运动，学习和记忆功能障碍(图9D-P)。

⑦PET-CT结果表明与WT大鼠比，miR-185-5p-KO大鼠的葡萄糖摄入量增加(图10A)。免疫荧光染色、CCK8检测和TUNEL检测结果证明miR-185-5p KO降低了神经元的细胞凋亡并增强细胞活力，并且在干扰Vi4和Igfbp3后，消除了这种保护作用(图10B-D)。

⑧敲除大鼠中的miR-185-5p后，皮质和海马中的western blot检测表明，与WT相比，Igfbp3的蛋白水平显着上调(图11A)。PCR检测结果表明OGD后流产胎儿神经元的Igfbp3表达上调，miR-185-5p表达下调(图11B-C)，证明在人中这一发现也有意义。

实施例3 HIE后通过给予20mg/kg黄芩苷(Scu)来减轻远期神经功能损伤

1.实验方法

①通过水迷宫实验、NSS评分、转棒实验和Y迷宫测试等行为学实验检测不同剂量和时间给予SCU用药对HIE大鼠的影响。

②通过PCR在动态时间点检测皮质和海马中的Vi4，miR-185-5p和Igfbp3的表达。

2.实验结果

①水迷宫实验、NSS评分、转棒实验和Y迷宫测试等行为学实验检测结果表明，在HIE后立即用20mg/kg SCU处理的大鼠可以最好的减轻HIE引起的运动，学习和记忆功能障碍(图12A-H)。

②PCR检测结果表明与假手术组相比，HIE后24h Igfbp3和Vi4的表达增加，但2周后下降；miR-185-5p的表达降低，但2周后有所回复。在HIE后立即给予SCU可以进一步增加Igfbp3和Vi4表达，降低miR-185-5p的表达。所有这些变化在皮质中比在海马中更明显(图12J，K)。这些结果表明，HI后立即给予Scu-20mg/kg具有有效的神经治疗作用，Vi4-miR-185-5p-Igfbp3网络参与了这些作用的介导。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本发明领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂及其组合物

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 鼠种(Rattus)

<400> 1

uggagagaaa ggcaguuccu ga 22

<210> 2

<211> 5

<212> DNA

<213> 鼠种(Rattus)

<400> 2

agaga 5

<210> 3

<211> 6

<212> DNA

<213> 鼠种(Rattus)

<400> 3

tctctc 6

<210> 4

<211> 1197

<212> DNA

<213> 大鼠(Rattus)

<400> 4

ctgtttctcc ggctggtgat gaccctgtct actccgagga agtaagcgga gcgcatcaca 60

gccccaagat tgcggggatc ctggatcccc tcaaggacga gccacagttg ctgagggtcg 120

tcgcctgagc tcgtgtctgc cgcctcatcg caaggccgag gtcgcagccg gctgacctcc 180

atgcacacgc cctggtgcac ctggtagcca cacaaggcat ccagtttctg ccgcctgggc 240

ctcaagacag ggatgccccg agcctcggcc acccggagca gctcggcccg ctccccctgc 300

agtccagcct taccggcctg gagcaggagc cgggccacgt gccggcgggc ggcccgcaag 360

gccaggaggc atggggacac gccaaacaga cgttccagcc tctgggctgg cgccaggtca 420

tcaagaagca agcgactcag ctcctccccg ccaggccgct ccccgggccg agccacggag 480

gagaaatggc gggcaacgag gcgattgaag catccgaccg tccagaggag tagcattgct 540

ccagcagcgc ccggaactct gtaacagact gctggggaga acacgttagc ctcccacacc 600

tcgtccccgc tcaaagactg cccacgacct gacactcgag cctagacagt cgcctcccag 660

actcccacgt gggtccccag cttccgggtt ctggaggccc agccccctgt ccgatgacgc 720

acgcgtgggc ttggcggcaa ccatgtctcc acagcacccc caacaggact ggctcgcact 780

gcctccactg acgctggcga gctgagaggc tgtgcagatg ctgagctaac ctccctacct 840

tggactgctc tgggtaaagg gagaagtcag gagactggga tagccgcatt caagaactca 900

tctgcaaaaa ccaacttatg acaatggttc ggccacctgt tcaattgtcg gtcttggtgg 960

cttcctacat ccaggcacaa tgtcatagtt gggactttat ctcagaagct tatcctgtca 1020

gaccctcagc actagccagc agaactccaa gaacatttcc catcttccca cgactgaaat 1080

gaaaagcccc aatgagccta tcaagcgacc gatgccctta gcccacaata atgctgggac 1140

tcctttgctc actgctcaga ctctactaat tcttttcagc ccagtctttt ttttttt 1197

<210> 5

<211> 654

<212> DNA

<213> 种鼠(Rattus)

<400> 5

tggggattta gctcagtggt agagcgcttg cctaggaagc gcaaggccct gggttcggtc 60

cccagctctg aaaaaaaaaa gaaaaaagga aaaaaaaaga catgctgtca atacaacatg 120

tatatgaaac taaaatgaga ctgaagcaac ctgaattctg atcccttctg taagaatctt 180

tgaaatcctg tacaagccag attgactgtt gtctgttctg ttacaaagtt aactatggtg 240

cactgctaca aacttaacta tgggaccagt tctgtgctct tttctcatta aagactaaca 300

cagtgagctg ggctggctgc taacagaatg agcctattgg tgaagctgag aaacgggtag 360

gcttgaatac tggacggaag attttccacc tgtggatggg gttatggagt atgcattcag 420

ccatggattt taacagtaag ttcgggggtc accctaccca gctctctcac tcacaaaagg 480

agatcctgaa accaagcagg caagtgatct ctctatctct gtgtgtctgt ctctgtctct 540

gtctctcttt caataggatc tcactacgaa gccttagcta gcctgtaaca ccctaagcag 600

tctgaccagc ctagaactca catagaccca cctgcctctc cctccagtac tggg 654

<210> 6

<211> 2112

<212> DNA

<213> 种鼠(Rattus)

<400> 6

cggagtagta gcgtaaggcc cgtggcggtg ggggaaacca ggctccctcg gctccatgat 60

gggtgtgtcc cctttggccc agctcgggga gggaccgtca tacaccccca tacaccacgg 120

ggctgcatgt gactagcgtt ctggcacggc gtctgcgccc ccgcctaacc ccgtctacat 180

agcttctcaa agctccgtct ggagggaaag ggggagctag ccaccaccca gagtcacaga 240

ccacaactgc cccgggagtg tttagtgggc aggggtacag gtgtggtttt actaggggag 300

ggggacgagt aggtcattct gcgcatgcgc ctggcagcct tattgttttc cccccaactc 360

ctcttggggc ggcggccact actaaaaaat gctttgggaa ggggcaataa cattgttgcc 420

agttctcagt aaatccttta cccaggagcc tcaagaccta aattgctttc catgtgttcc 480

atgtttagtc caccgcgtcc ctgctggctt cccggcccgg ccacaccccc ggcacgcgcc 540

cactcctgcc ctgctgccgc tcaccttacg gtcgctgaca ccctcgccca cggccaccac 600

cacgcccgcg ccctccatgc cgggggtgac cggcagaggc ggcagccggt cgtacagccc 660

ctggcggccc atgaggtcgg caaagttgag cccgcaggct cgcacccgca gcgtcacctg 720

accgggaccc ggggccgggg gcaccgccgg tcggctctgc agcttcactt tatcgtagcc 780

accgaagccg gtgagtacca ggcagcgaag tggcggagcc gaggcggatg ccgacgcttc 840

gggggccggt ggcggctgcg ggtcgctcgc cacctcgacg gtcgggggtt gcgaaggcgc 900

accctcccct gctccggtct ccgcccgggc ctcggctgcc gccgccacag tagccgcctc 960

ggttgcctcc ctctccgccg acatggctag actcccgacg tgcgttccca gctgtaccga 1020

accggtgcac agctggggag ggcgggacac gcgtcaggaa gagcgcaggc tgtggacacc 1080

agtgggtggg gcggagccct tgctcggtgg gtggagcttc gcgggcagac ttaaagggct 1140

aggccctctg ctgacccagc tgcgagggcg cgaaaagact agcggtgcag gtggagggtg 1200

atggtgtatg tgcgtgtgac tgataagcat aagaagattc tggggcgtgc cgagtctaag 1260

atttgattta ttcctagaaa tccttatacg aattaaaagt tgtcgtggcg gggctgggga 1320

tttagctcag tggtagagcg cttacctagg aagcgcaagg ccctgggttc ggtccccagc 1380

tccgaaaaaa aaagaaccaa aaaaaaaaaa aaaaaagttg tcgtggcaca gtctgaagga 1440

taatttaaaa atctgagttt atatcagatt tggggagcta gtcacctgtg gatcagaacc 1500

tggtgaaatt gtgcctcagg ttgaactcta ccatttagta ataagcagac tgcgttcacc 1560

gtgttctcgg aatggcaaac tacaagcctg tgaacctcta aggcaggatc tcactatgta 1620

gccatgtctg gcctggagcc tggaacctgc catgaataca aggccagcct tgaactcgca 1680

gagatttgcc tgtcttggct tccagagtgc tgtggttaaa ggcatgcacc atcaccctac 1740

cctctctttt ctttctcaat ctcctttaga acccagagcc tcatgaatgt agttttactc 1800

ttgagtttca tatctgactt aaactgaacc gtcttgggtg ttaatgctgt gtgtctgttt 1860

actttctgaa aagtagtgat gatgttgtgt tttagttaac cattacacgg ttattcaaaa 1920

ccagataaaa ttaaaacgaa catcctggac ttaaggaaaa gttttgtttg ctttgagaca 1980

tagatttctc tatttagacc tggctatcct ggaactcatt ctgtagacca ggtgggcctc 2040

aaactcagac agatctgcct gcctctgcct cctgagtgct gtgattaaag acgtgcagca 2100

ccatgcctgg ct 2112

<210> 7

<211> 3294

<212> DNA

<213> 鼠种(Rattus)

<400> 7

aacaatgatt ttacacaaga aaaagcacac acaccgagcc aatacaacag cactcaggtt 60

cacatggtgt ggggcgctca ggtagtgccc agctcgaggg gggcttccgg gatgaagaga 120

ggtatcgcag gtcccaccta acaccttaat ctctcactga ggacactgga agagggctcc 180

ctccctctcc tgtgcagctg atgccagcag tatatgaagt ctgctcactg ctccagacga 240

ggggtgggca aagccaccct gtggcgagat gcacttcgtg accatctgag cacacacact 300

atgtgggtct tggatgggaa acccttttcc tgcctagctg tccagaggag gaactgagag 360

aacttcccaa gcccactgct caaatatggc cttccttagt catccacata tgcctgtcta 420

gtggagacat catgctgtgg actccaggac agagaggtaa ggccagatgg acgcgtggca 480

gtcatggagt tggctgacct tgccataggt acagagtgaa tgctttggga tagaaaaggt 540

cagtcatgtg ccccgaatac aggaggaaac gggctgtgtg ctgtggggac agaggagcag 600

gcctggccag cacacctgct cgtcccccgc tctggcccca ccctgctctg acgccatcca 660

ctgcagtgcc aaggaggcag acccccagga gctgcaggga ggcttcctgt aggcttgttc 720

acaagcccga tgtgctgccc cagggcatct ccacagccga gtcccacaaa catggctcca 780

tgccggagag tctaggctgt catactgaaa ggatttttct aaaacatgct tcgagtctgt 840

tctttacttt aaatgcagaa agagaaacac accagagaag aacagggcaa gtgtcaccac 900

acgaggtggc ttttgttgcc tctgacgtcg ggtgactttt acatcaattg agcagcagtc 960

acttaattct gccacagcta cctcattcca tcacaactag ctaaggagct gggctggacc 1020

ctgtactgct ctttatagcc tgtacgtgaa aaaaaaatct tattttcaaa tagttaaaaa 1080

aaaaaaatct gtacaaaatc tgtagttatc tgtaatgtaa atcacaggcg tacttgctat 1140

gcaaacatga tgcacgtgtt acttgctatg gacctacggc tcagagcctg gctcttagga 1200

aacacttgcc ggtcctgaaa ctcctggggt gggtgccaat aggctcccag acaagcacca 1260

ctgaaaaggc agtggtgaaa ggagaaaaca ccaagacttt agatttcaat ctcttagaag 1320

cgagcaacct aggccttgtc cagagataca tgcaaaatat cttacaataa acttcatgat 1380

tgaccctgcc aacagaactg gtgatggagt cttcttattc tggctgtgac tgaaactgta 1440

gtgaacacag agcagaggca agcgggtgac actatgcaat gcagtctcca cctggaccac 1500

tcagcttcaa atctcacgca gccactcacc caccctcgca ggtaaaaaga ccagagacca 1560

ataagaaaca tggaggattg ggtcaatggg accatgaagg aatctactgc aaagatcaag 1620

atactaggcc ccgatccctg gccaccagcc gtgtgggaag gaagtcaggg cacagggcaa 1680

ggaaacaaca ctgatcaaca agccagacac ttgctctcag ggggaagagg ctcatctaga 1740

atcccgtaca aactcaataa tccttcacct cactatcatc acgtttatga acatcaccac 1800

cgtggaaagg agcaatgggg tacagggaag aagatgccta cttctagaca acaaagggaa 1860

cctctgggct gatgtttcca catgcagttg atgctaagtt atctgtagga cagttgtatc 1920

tgtagcctgt gggtggcctc gccctgggcc cagggctacc ttacaacttt agaaaggaca 1980

agccccccgc ccttcatgcc agagggctgc tgcaagcact ctgccctctg gcatcatctt 2040

tgcccactct acagctttga tgggctcatt ttcaaggagg caggtgcttt ttaccatgtg 2100

ggatggcagg gtgaagcacc aggcagacag atggtctgct ctgaagacac ccatccctag 2160

cttacaaggt tgaaaagaca ggtgctggag agggagctcc tttccaccaa gggcgcaccc 2220

cactcagctc ttacgctcat cccacctgac acatccccta gtgcaggggg gccacatgtg 2280

aggctcgcct gcacaggagg aatgccatgt tctgattcgg gggaagcagg gatcatgtca 2340

ggaagtttgc caacttgttc tctctcgatt tttctggcct gcaaggcagg aggctactca 2400

tattccagga actgtttgtg gtagaagagc aggtacctgt ggaggcaaag aggaagtgag 2460

cttagtccta acatccaaga tggcctatgc cagtcgagaa tggttcacat gcctgaattc 2520

ttgaatggct actgtaggcc ctcaagaaag aaagacgctg cctgcctacc atcacccaac 2580

ttgactacta agcttactag agagtaagtc actgcagccc tggtgacttc ctgtagtcac 2640

tacctctcct gttcacagtg gtgctaccct catgcagggt ccatacccct ggcccagcag 2700

tgcactcttt tctctatggc ttctcttctg aggatcccag ggccccaagc ctctcataca 2760

ccatctgcat ctaccgtggg tagcctgccc accttgtccc tggggctggg aatcctaagg 2820

aggctcggga tgaaaaatgg atcacaagta acaaaagcag cagagaagtt gacccagaat 2880

ctgcacagca tggttaggac aaatgctgag cacagtggtc tctgatttaa aaggcaactc 2940

tgttcagcaa cactcctgcc ctgtaatcat gacctacagg caacttctga tcaaaggaac 3000

cactgtcctt tcagcaacaa agccaaacta aattaaggtg aacgtgccta gtgtggcgga 3060

tgcagccaag ccactggctc tggtcagaca ggagggctgg acaagcatca gcacagggtt 3120

cctccagccc taccccagcc atacccttcg ctgtccagca catctttgat gctggccttg 3180

gtgatgatgg cgtcatcaca cttgaaccac tggtctttgt gctgccggat gaagctggtg 3240

tagtggccac tctccaaggt cccttggtgg ttaacgacag caaacaagga gtat 3294

<210> 8

<211> 2107

<212> DNA

<213> 鼠种 (Rattus norvegicus)

<400> 8

gctgaaggaa ctttttgtct tttaaggaag gaaggaagga aggaaggaag gaaggaagaa 60

agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa aggaaggaag gaagaaagaa 120

aagtttgtcc gagtgatggg aatacacctc tgaggcttcc attgttaggt gggatcaggt 180

gaccagagtg tggcagctcc tggattctgt gaaagtaggc acaggatgtt agcatcccat 240

gttcactgct atggatgcct gtgtatatgg ctaatacgga ggctgctgga tctattcctt 300

gagagcaaca cacagtacta tcggagcgta ataccaacag ctcagtgcct ggtgcttggc 360

ctcagaacat ctcagctgaa gtcccagcat gccccatgcc tccaactttt aagctcaaca 420

gttaatctca aaattgtgcc caattaaaat gggcaggaga atgtatttcc ctctgcattg 480

tctacacgtg tgttctatgt gactaggttt tcctgacgta gttcctcgaa caccactagt 540

ctggactaaa tggagaggtt aaatattcaa ctcttaatat tcaatacaaa aggagggaat 600

caagagatca ggaaagataa aatatgtgtt actttgcaag attttgtgag aacaaaaaaa 660

aaatggaagg aagagttctc cctccttggt ttggtacctc tttaaaaatg ttatacacaa 720

tgggttttta aatgaaggag atagatatat attttctaaa tattatggaa tgaaagaagc 780

aactgggcac atttggtatt agcgcattct tggggcggag aggggggggt caatcaatgt 840

ccatgacttt gctttagaaa ttagaaagat tgctatcagg attttaattc accccgacaa 900

agttattggt catagcaaac caaatttcaa aatgatcctc tctcagggca attgttagca 960

ttttccccac tttgtagttt tctgagattg taacttttca cggcagggta gctgcagtgt 1020

ctcaggtctg cctcacatag gagagaagga ctgggaggct tacctttcct ttgttgtaga 1080

aaactccggg cgcacggttc cctttaaaca gtttcactct tctcagccca acctttctct 1140

ccatttttgg aaaataccta aatcaaccca gacacccaac accttcatct ctgaaagatt 1200

ttggaatggc ttgtagtctc attgtgacac ggagtgaaag gtgaaggaaa cggttgccta 1260

ttttttaagc attccttgca attttactca ttttactcca aactgcagtc aaggaagcat 1320

tttttttttt tttgcaccag cacgctgagc tgagaagtgt acaacaactg tactatgtct 1380

tttgttgaag cctcccgtgc ggctgtaatt taactgttac ttggcaccac ttggtagaag 1440

acgcttcaaa gcgtacagtt ctgtaagagg ttgcccgcga gtttatataa agtaattaat 1500

gattccccac cccagcccag ccaatgtgta tgtatggcta tgtggaaatg atggcggtac 1560

atcagcttaa cttatgggta atatatattt acatcatgca tttgatagaa tggcagacat 1620

tcggtgcttt tgaaggcaag atatgtacac agcctaatag aagaaacgtg ggcaggatca 1680

ataaagctag gatagctgta atttctctgt gatttcgaat gatcgggcaa cgccatacaa 1740

atgcttctgt ttgtactctg agtccctatg ctttcgagtg gattcctcct gtttctcgga 1800

tgtaaaaccg ggcgcccagg cattcagagt gcctgtgaca cccaggtttt tatatattag 1860

caggcaactt cttcatcaca agggcaggtt tctcaacact cccctcttcc tcgtggagcc 1920

catcagcgaa gttcagtgaa atgaataaca taattggtgg ttggttcaat cactaccagt 1980

ctagactagc ccagacgcat caattagagg ggactgtctt ttagagggag agtgtaaccg 2040

aaacaagcag ggtattattg atactgatct ttaaaagcga aaatccagcc tggcagataa 2100

aaaaaaa 2107

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 鼠种(Rattus)

<400> 9

tcagncccag tctttttttt tt 22

<210> 10

<211> 7

<212> RNA

<213> 鼠种(Rattus)

<400> 10

ucucucc 7

Claims (10)

1.一种用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂，其特征在于，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂为减少microRNA介导抑制Igfbp3或GAP43水平序列SEQ ID NO：1或一个microRNA的组成序列设置在序列SEQ ID NO：2。

2.如权利要求1所述的用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂，其特征在于，所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂包含一个核酸；

所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂包括一个由miR-185-5p或一个由miR-185-5p的靶序列SEQ ID NO：2中列出的序列组成的miRNA结合区域；所述miRNA结合区域由SEQID NO：3、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中的核酸序列组成；

所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂的结合区域，包括miR-185-5-p结合的miRNA结合区域，其中microRNA的绑定地区包括核酸序列设置在序列SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：10；

所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂是一个长链非编码RNA；

所述长链非编码RNA包含在序列SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：8任何一个中设定的序列。

3.一种表达结构，其特征在于，所述表达结构包含权利要求1～7任意一项编码所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂编码的核酸序列；

所述表达结构表达编码抑制剂的核酸序列的分离或重组细胞。

4.如权利要求2所述的表达结构，其特征在于，由表达结构或分离或重组细胞组成的miRNA抑制剂。

5.如权利要求4所述的表达结构，其特征在于，进一步包括黄芩苷。

6.一种包含权利要求1所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂的核酸的药物组合物，其特征在于，所述核酸包含一个或多个SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7和药学上可接受的载体中的序列。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述核酸由SEQ ID NO：4中规定的序列组成。

8.一种如权利要求6所述药物组合物在增加Igfbp3水平中的用途。

9.一种筛选抑制miR-185-5p介导的对Igfbp3或GAP43的一个或两个抑制的化合物的方法，其特征在于，所述筛选抑制miR-185-5p介导的对Igfbp3或GAP43的一个或两个抑制的化合物的方法包括：

(1)在miRNA抑制剂存在的情况下，将表达miR-185-5p和Igfbp3或GAP43的一个或两个细胞与候选化合物接触；

(2)确定候选化合物是否改变了miRNA抑制剂抑制miRNA介导的Igfbp3或GAP43的能力；

所述候选化合物是黄酮；miRNA抑制剂为Vi4、Vof16或Scu。

10.一种如权利要求1所述用于治疗神经系统疾病的miRNA抑制剂在抑制绑定miR-185-5p胰岛素样生长因子结合蛋白3或GAP43中的用途。

Images