CN100502858C - 柚皮素及其衍生物用于制备抗心脑系统疾病产品的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及柚皮素及其衍生物在制备抗心脑系统疾病方面的新用途，该类化合物包括单体柚皮素及其衍生物、橙皮素及其衍生物、异樱花素及其衍生物或圣草酚及其衍生物等，具有预防、诊断、检测、保护、治疗和研究脑梗死、心肌梗死、脑缺血——再灌注损伤、心肌缺血——再灌注损伤、卒中后遗症或血管性痴呆等心脑血管疾病，阿尔茨海默氏症及其相关疾病的活性。该类化合物安全低毒，药理作用较强；其原料来源丰富、广泛、价廉，制备成本低廉、工艺简单，得率高；且临床疗效确切，有效剂量低。本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

Description

柚皮素及其衍生物用于制备抗心脑系统疾病产品的用途

技术领域

本发明涉及医药、食品和饮料等技术领域，具体地说是涉及柚皮素及其衍生物的用途，更具体地说是涉及柚皮素及其衍生物用于制备抗心脑系统疾病产品的用途。

背景技术

(一)柚皮素及其衍生物的研究进展

1、概况

柚皮素的植物来源是蔷薇科植物樱花Prunus yedoensisMats.的花蕾，梅P.mumeSieb.etZucc.的花蕾等，柚皮素英文名称是naringenin，分子式及分子量C₁₅H₁₂O₅、272.25，结构

柚皮素及其衍生物含量越高，如柚皮苷、橙皮苷等(参见赵雪梅，朱大元，叶兴乾等，柑桔属中类黄酮的研究进展，天然产物研究与开发，2002，14(1)：89—92)，其它衍生物亦可以由上述柑桔属植物的果实及果皮中存在的物质通过相应物理或化学方法制得。

2、柚皮素药理作用

柚皮素是柚皮甙(narigen)的甙元，具有抗菌、抗炎、抗癌、解痉和利胆作用。

①抗菌：对金黄色葡萄球菌、大肠、痢疾和伤寒杆菌都有较强的抗菌作用。柚皮素对真菌亦有作用，1000ppm喷于大米上能降低稻瘟菌感染40-90％，且对人和家畜没有毒性。

②抗炎：大鼠腹腔每天注射20mg/kg，明显抑制植入羊毛球所引起的发炎过程。

③抗癌：对大鼠白血病L1210和肉瘤均有活性。

④解痉和利胆：为黄酮类化合物中具有较强作用者。柚皮素并有较强的增加实验动物胆汁分泌的作用。

另有研究资料表明，柚皮素及其衍生物有防治高血脂症、防治动脉粥样硬化、止咳、化痰、抗癌、抗炎及抗感染引起的内毒素休克等作用(参见WO98/16220；WO98/16221；WO98/16239；WO99/21549；WO99/21570；CN1430967A；CN1555793A；WO01/14396；Kawaguchi K，Kikuchi S，Hasunuma R et al.Suppression of infection-induced endotoxin shockin mice by a citrus flavanone naringin.Planta Med.2004；70(1)：17-22)。

有报道柚皮素抑制花生四烯酸诱导的血小板聚集(参见Corvazier E，Maclouf J.Interference of some flavonoids and non-steroidal anti-inflammatory drugs withoxidativcmetabolism of arachidonic acid by human platelets and neutrophils.Biochim Biophys Acta.1985：835(2)：315-21)及柑桔属果皮衍生的类黄酮化合物可作为胶原诱导的血小板聚集抑制剂(参见WO01/14396)，但是血小板聚集抑制剂仅作为脑梗死或心肌梗死发生的预防药(参见H.Darius，R.Erbel，G.G.Belz et al.血小板聚集抑制剂、抗凝剂和溶栓剂在心脏病治疗中的应用，德国医学，1994；11(2)：75—77；佐藤美佳等，抗血小板药物对脑梗塞复发的预防，日本医学介绍，2001；22(5)：202—203)，对于已经发生的脑梗死或心肌梗死，目前普遍使用心、脑微循环改善剂(如：硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、尼莫地平、长春胺、丁咯地尔等)；神经细胞代谢改善剂(如：茴拉西坦、胞磷胆碱、乙酰谷酰胺等)；神经修复剂(如：单唾液酸四己糖神经节苷脂)等，目前还没有关于抑制血小板聚集可以减轻缺血造成的组织损伤、减轻缺血——再灌注损伤、防治脑卒中后遗症和血管性痴呆的确切结论。

专利CN1401326A报道植物岩青兰地上干燥全草经提取、层析分离得到的总黄酮具有显著的PAF拮抗作用，可抑制PAF诱导的血小板聚集，可扩张冠状动脉，增加冠脉流量，做成口服或注射剂，用于治疗缺血性心脑血管疾病，心绞痛、心肌梗塞、脑梗塞。其总黄???酮主要成分为柚皮素-7-O-葡萄糖苷和北美圣草素-7-O-葡萄糖苷。但该专利仅说明了柚皮素-7-O-葡萄糖苷和北美圣草素-7-O-葡萄糖苷约占总黄酮的70％，尚未将柚皮素-7-O-葡萄糖苷或北美圣草素-7-O-葡萄糖与总黄酮的活性关系明确或直接地阐明。

(二)心脑血管疾病的研究进展

1、概述

心脑血管疾病一直以来都是威胁人类健康的大敌，在我国随着物质生活水平的逐年提高，生活方式的改变，以及我国逐渐步入老年社会，心脑血管疾患的威胁日益严重。心脑血管疾病是危害中国人群健康的第一位死因，其中脑梗死和心肌梗死的死亡率占相当大的比例且呈明显的上升趋势，其危害日益严重，对该类疾病的预防和控制日益受到广泛的关注。

2、流行病学情况

目前的流行病调查结果表明，心脑血管疾病已是威胁中国人群健康的首要疾病，而随着经济的发展和生活方式、饮食习惯的改变，该类疾病的死亡率逐年上升。1998年监测地区共报告心脑血管疾病15405例，报告死亡率为173.66/10万，较1997年上升了9％。研究表明，目前中国人此类疾病患者群的主要死亡因素为冠心病和脑卒中，此2种心脑血管疾患也是造成中青年人早死或残疾的主要原因，对我国人民潜在寿命损失很高。

3、主要的治疗药物

目前对于脑梗死和心肌梗死的最有效治疗是溶栓治疗，但是溶栓后造成的缺血——-再灌注损伤，目前其机制还没有完全阐明，临床上也缺乏有效的防治药物。另外在发生脑梗死或心肌梗死的病人中有相当一部分因为身体状况或错过适当的时间而不能得到有效的溶栓治疗，因此减少缺血造成的组织损伤，防治脑卒中后遗症、血管性痴呆的药物仍然占据重要地位，但是目前也没有十分有效的药物。目前普遍使用的心、脑微循环改善剂(如：硝酸甘油、单硝酸异山梨酯、尼莫地平、长春胺、丁咯地尔等)；神经细胞代谢改善剂(如：茴拉西坦、胞磷胆碱、乙酰谷酰胺等)对减少缺血造成的组织损伤，防治脑卒中后遗症、血管性痴呆有一定的效果，但疗效不明显，并且没有再灌注损伤保护作用的明确结论。神经修复剂——单唾液酸四己糖神经节苷脂(简称：GM-1)能促进中枢神经系统在遭受各种原因损害后进行功能恢复，其作用机制是促进“神经重塑”(包括神经细胞的生存、轴突生长和突触生成)，其对脑卒中后遗症、血管性痴呆有一定的效果，但远期疗效还在观察当中，另外该药价格十分昂贵，很多病人无法承受长期治疗的经济负担。

(三)老年痴呆症的研究进展

1、概述

痴呆症包括阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease，或称阿尔兹海默症，简称：AD)、多重梗塞型痴呆(Multimfarct Dementia)、酒精性痴呆(Alcoholic Dementia)及正常脑压水脑症(Normal Pressure Hychocephalus)。

AD是一种慢性原发、进行性脑变性的老年中枢神经系统退行性疾病，是发生于老年期或老年前期的一种进行性的神经退行性疾病，是进入暮年后的一种常见病态反应，属于非正常衰老状态的早老性痴呆病症。由于AD好发病于60岁以上老年人，所以习惯被称为老年痴呆症或早老性痴呆症。

AD以记忆减退、认知障碍、人格改变，行为异常和语言能力丧失为特征，主要表现为大脑皮层获得性高级功能的全面障碍和认知功能明显受损，脑功能退化衰亡，即记忆功能迅速衰减及识别能力障碍，并伴有行为或人格方面的改变。

随着全球人口老龄化，AD的防治已经成为一个突出的、亟待解决的医疗和社会问题。该类疾病病程一般较长，约为3～20年。对AD患者常年的护理费用是巨大的，不仅对整个社会的医疗保障系统有极大影响，对中国未来社会的小家庭模式也是极大的挑战。因此，其发生给社会、家庭均带来了沉重的经济负担和精神负担，也给患者自身带来极大的痛苦。

据不完全统计，目前65岁以上人群中患重度AD的比率达5％以上，到80岁此比率就上升到15％到20％。而老年痴呆病人的平均生存期为5.5年，使该病成为现代社会老年人的主要致死疾病之一。但由于AD的病因不完全明确，迄今尚无有效的防治药物，目前该疾病仍是全球较为棘手的病症之一，积极研究开发新的治疗方法是一件刻不容缓的事情。

2、病理表现及发病机制

AD的主要病理表现是在前脑基底、海马和大脑皮层细胞外神经炎斑的形成，细胞内神经纤维缠结的出现以及神经细胞和突触数目的减少。斑点主要由淀粉样前体蛋白(简称：APP)的蛋白水解产物β-淀粉样蛋白(Beta-Amyloid Protein，简称：Aβ)聚集组成。在正常情况下，APP水解产物是可溶性的Aβ₄₀，而在病理条件下，APP水解产物是长的易形成纤维的Aβ_1-42，它先以一种未成熟的、非纤维状的分散的斑点形式存在，最终经过构象改变，聚合成一种有毒的纤维状物质，即形成斑点。神经纤维缠结主要存在于锥状神经元的胞内和异常的神经轴突中，为一非水溶性结构，其主要组成为直径10nm的双螺旋纤维结构(简称：PHF)，主要成分是一种微管结合蛋白，即tau蛋白，正常的tau蛋白能稳定微管蛋白的相互作用，而PHFs中的tau蛋白则以超磷酸化的形式存在。

AD的病因学复杂，目前主要有两种假说：tau蛋白假说和淀粉样蛋白假说。tau蛋白假说的主要论点是：由于tau蛋白的超磷酸化导致微管蛋白的不稳定，引起高尔基体结构发生改变，从而影响APP的代谢，产生过量的Aβ。该假说还未在细胞或者动物个体水平得到证实。淀粉样蛋白假说的主要论点是：在细胞外神经病变发生的周围淀粉样蛋白的聚集，导致神经炎斑的形成和随后神经纤维缠结的形成。因此，淀粉样蛋白是AD病理链形成的起因。支持淀粉样蛋白假说的证据很广泛。

β-淀粉样蛋白异常沉积形成的老年斑是AD典型的病理特征。斑块周围显著的神经退行性改变和胶质细胞的活化提示Aβ可能是引起AD中神经元丢失和炎症反应的原因。在神经退行性病变中，胶质细胞的活化与神经元的死亡具有同等重要的作用，且两者之间存在一定联系(参见Bales KR，DuY，et al.The NF-kappaB/Relfamily of proteins mediatcsAbeta-induced neurotoxicity and glial activation.Brain Res Mol Brain Res.1998；57(1)：63-72.)。通过免疫注射清除β-淀粉样蛋白斑块后，与AD相关的神经系统病变可以修复。这一事实为β-淀粉样蛋白学说提供了有力的证据。β-淀粉样蛋白学说的其他证据包括：21三体综合症患者由于Aβ产生过多，早期即可出现AD样神经系统病变，其年轻患者惟的神经系统病变为弥漫性Aβ沉积，说明淀粉样蛋白沉积可能是最早的神经病理学改变；通过一些措施清除淀粉样蛋白后，神经系统病变如神经元皱缩、小胶质细胞激活可以逆转。这些证据说明淀粉样蛋白沉积是AD发病的中心环节(参见周慧芳，薛冰，王晓民，Alzheimer病研究进展——β-淀粉样蛋白学说与主要防治策略，自然科学进展，2003，13(2)：121—125.)。

3、流行病学情况

随着发达国家和发展中国家人均寿命的提高，患痴呆症的老年人数迅速增加。在所有的痴呆症中，以AD所占的比例最高(约50％～60％)。

据资料报道，随着年龄的增长，在人体组织老化和基因的影响下，痴呆现象的发生率不断升高；其中，AD随年老急剧上升，从60岁起，每4年～5年上升一倍；AD的发病率在65岁左右的老年人中约占10％，在85岁以上的老年人中约占47％，已经成为人类的第???四号杀手。

过去学术界曾认为中国是AD低危险性国家，然而，早前于安徽屯溪召开的第二届中国老年人痴呆症和抑郁症学术研讨会暨国际老年痴呆学术研讨会上，这一观点受到挑战。有5份研究报告表明，中国也是AD高危国家，这次会议报道的大量研究成果还表明，中国对AD的研究正在迅速接近国际先进水平。

目前全球的AD病人估计在1200万左右，中国现有老年痴呆患者大约为300万～400万，且呈迅速上升趋势，确诊后一般约7年～9年内死亡。有资料表明，中国60岁以上人口早在1998年已达1.2亿，并以年均3.2％的速度递增，大大高于入口增长速度。75岁以上的老人有2000万，80岁以上老人有800万，并以年均5.4％的速度增加，下世纪中叶可达4亿左右，将成为世界上老龄人口最多的国家。

1988年中美上海调查研究表明，中国65岁以上老年人的痴呆发生率为4.6％，其中AD的比重为63％，多发梗塞性痴呆为28％，脑组织损伤后遗症、化学药物中毒以及神经系统失调或营养缺乏导致的痴呆约占10％。

上海的流行病学调查显示，中国55岁、65岁以上痴呆的患病率分别为2.57％和4.6％。北京老年病医疗研究中心对北京地区2788名60岁以上老人的调查发现，有208名老人患有痴呆症，患病率达7.5％。其中女性病人139人，患病率达9.7％，显著高于男性的5.8％。他们的研究还表明，高龄、低教育水平、居住在农村是老年痴呆症的高危因素。而解放军总医院对1728名离退休老干部的调查表明，有痴呆家庭史、“文革”中受迫害、电磁场暴露、脑外伤亦是老年痴呆症的危险因素。在广州城区75岁以上老年人痴呆患病率的调查中，AD患病率为7.49％。

4、老年痴呆症的治疗药物

AD是老年人的常见病之一，是一种渐进性的神经功能退化性失调症，目前本病的病因尚未得到充分阐明，一直是治疗上的一个棘手问题。

抗痴呆药物的研究和开发已引起世界各国医药界的高度重视。近年来，随着对老年人神经生理、生化、药理等方面研究的不断深入，导致相关药物的开发研究不断取得进展。2001年有1270多种产品投放市场，这些产品中90％是80年代发现、90年代研究与开发成功的，此类药物开发的新产品数目超过了任何其它治疗类药物开发的数目。

经过近10年的临床表明，乙酰胆碱酯酶(简称：AChE)抑制剂对AD具有一定的治疗作用，其主要药物他克林、利斯的明、多奈哌齐、加兰他敏已是这一领域中的代表性品种，从而也推动了痴呆治疗药品市场的发展进程。

(1)脑代谢激动剂

研究发现，老年痴呆症患者存在有糖代谢及核酸、蛋白质、脂质等代谢系统障碍，同时其脑血流量及耗氧量明显低于同龄正常人。因此，脑代谢激动剂和脑循环改善剂，特别是具有脑血管扩张作用的脑代谢激动剂就成为治疗本病可供选用的药物。此类药物有吡拉西坦、吡硫醇、氢化麦角碱、都可喜、长春胺、长效长春胺、长春乙酯、尼莫地平、桂利嗪、环扁桃酯、氯酯醒、己酮可可碱、麦角溴烟酯等。这些药物对老年痴呆症的某些症状如记忆力减退、适应环境能力降低等，有程度不同的改善作用。

(2)拟胆碱药

现已知脑内乙酰胆碱含量与记忆密切相关，老年或痴呆病人脑内乙酰胆碱量减少，补充胆碱类药物能改善其记忆和思维能力。但直接给予胆碱或卵磷脂并不能使乙酰胆碱增加。有人试以胆碱或卵磷脂与能通过血脑屏障的胆碱酯酶抑制剂毒扁豆碱合用于本病患者，可使其记忆力有提高，而单独给予卵磷脂效果不明显。另有人单用毒扁豆碱给本病患者静注，记忆测定成绩较安慰剂提高约20％，并发现对行为障碍也有效。研究认为，胆碱酯酶抑制剂可延迟乙酰胆碱的代谢分解，从而延长突触后受体的兴奋。另外，国内研制的哈伯因(石杉碱甲)，系中国学者从石杉属植物千层塔中分离到的一种新生物碱，药理实验证明，木品具有很强的拟胆碱活性，是一种高效、可逆的胆碱酯酶抑制剂。

(3)乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase Inhibitors)

乙酰胆碱酯酶抑制剂包括毒扁豆碱(商品名Synapton，Forest实验室生产)、四氢氨基吖啶(他克林，商品名Cognex，Parke-Davis公司生产)、donepezil.(商品名Aricept，辉瑞/卫材公司生产)、metrifonate(拜耳公司生产)和rivastigmine(商品名Exelon，诺华公司生产)。这些化合物通过抑制乙酰胆碱酯酶在神经腱内浓缩乙酰胆碱，并能持续更长的作用时间。

四氢氨基吖啶是第一个通过FDA并在临床上治疗阿尔茨海默氏症的胆碱酯酶抑制剂，但规定仍需作改进。该品生物利用度要低于rivastigmine和donepezil，并有较大的副作用。多奈哌齐(Donopozil)是第二代也是第二个被美国FDA特许用于治疗阿尔默海茨病(老年痴呆)的胆碱酯酶抑制剂，于1997年被FDA批准用于临床，可促进轻、中度老年痴呆病人的认知能力以及改善病人的精神状态和保持脑功能活性等作用。与第一代胆碱酯酶抑制剂相比，该品有多项优点：①作用时间长，每日只须口服一次；②药效强、疗效高；③安全性高、选择性高，药物不良反应小。目前该品已进入中国销售，国内也有厂家生产。

Sanochemia Pharmazeutika AG公司(维也纳、奥地利)宣布第一个在欧洲上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂-Reminyl(加兰他敏)。该品被批准在瑞典上市，并报送欧盟以期获准进入欧洲其它市场。

丹麦的NeuroSearch公司最近利用NS2330进行临床研究开发。NS2330增加多巴胺和去甲肾上腺素的活性，同时也激活其抑制机制以刺激乙酰胆碱在大脑皮层(包括感知部位)的释放。这样所有三个神经传递素的功能都将受到阿尔茨海默氏症的影响。该公司希望NS2330能够具有较好的治疗效果，目前该药的I期临床工作已经完成，FDA也同意该公司继续II期临床工作。

其它用来研究的化合物还包括xanomeline(诺和诺德/礼来公司生产)、bcsperidine(赫司特公司生产)和talsaclidine(勃林格殷格翰/法玛西亚普强公司)。

①他克林(简称：THA)

他克林的化学名为四氢氨基吖啶，商品名Cognex，该药是美国华纳—兰伯特公司开发并第一个上市的中枢系统的非竞争、可逆性胆碱酯酶抑制剂，1993年获得FDA批准后首先在美国上市，是改善AD认知症新药和老年益智药物，同年在英国、法国、加拿大等国上市，其化合物专利于1996年到期，目前市场上主要是美国派德—戴维斯的产品。

他克林尤其对女性AD症具有显著的疗效，与卵磷脂合用可获得理想的效果，能明显改善患者的记忆力，因此他克林已被认为是治疗、预防早老性痴呆仅有的几种药物之。

他克林的不足之处是对肝功能及转氨酶指数有较大影响，制约了市场的开发，其销售额的增长也远不如其它AD药物。经过进一步的研究，在他克林母核的基础上加成筛选，由德国赫斯特鲁塞尔公司研制出维那克林。该药是他克林1位羟基衍生物，其药物作用机制得到相应的改善，但仍有一些不良反应，随着医学的发展，将被新一代乙酰胆碱酯酶抑制剂所替代。

②多奈哌齐

多奈哌齐是具有高度选择性、可逆性治疗AD的药物，为第二代中枢性乙酰胆碱酯酶抑制剂，是日本卫材制药公司开发的药物，1996年11月25日获得FDA的特许批准用于临床，商品名安理申。1997年初首先在美国上市，由卫材/辉瑞共同开发全球市场，1999年10月安理申在中国上市，目前已形成了世界50多个国家地区的销售网络。

多奈哌齐是第二个获准治疗老年痴呆症的药物，其最大优势是治疗达标剂量小、毒副作用低，耐受性好。专家普遍认为，该药在AD治疗药物中处于领先地位，在四个主要品种中占据了60％的市场份额，预计这一优势将延续到能够对疾病治疗产生重要影响的新药问世为止。

据Pharma Business杂志报道：在2000年全球最畅销500种药品中，日本卫材公司销售额为4.31亿美元，辉瑞公司的销售额为1.19亿美元，分别比上一年增长了27.3％和30.8％。2001年多奈哌齐在全球排第101名，销售额合计约6.83亿美元，2002年在全球超过了1100亿日元，已是AD市场中的佼佼者。

2001年中国医药研究开发中心、重庆桑田药业开发了多奈哌齐原料药及其片剂产品，国家药品监督管理局批准其以四类新药生产。

③利斯的明

利斯的明是氨基酸甲酸类脑选择性胆碱酯酶抑制剂，属于该类药的第二代产品，由瑞士诺华制药英国公司开发，商品名艾斯能，1997年12月首先在瑞士上市，次年在英国上市。2000年4月21日获得FDA批准，同年6月底在美国上市，从而扩展了阿尔茨海默症治疗药物市场的格局。

研究结果显示：该药虽然半衰期相对较短，但对胆碱酯酶抑制作用可达10小时，该药不经肝脏及P450代谢，对轻、中度早老性痴呆症耐受性较好，同时具有抑制脑内的丁酰胆碱酯酶作用，在欧洲、美国等45个国家进行的一项前瞻性、随机多中心双盲研究中获得较高的评价。

由于利斯的明在药物市场中获得越来越多的份额，2000年的销售额比上一年增长了83％，为1.195亿美元，2001年利斯的明在全球销售额增加101％，已达2.4亿美元。

④加兰他敏

加兰他敏属于第二代乙酰胆碱酯酶抑制剂药物，其药物成份与欧洲山区水仙花鳞茎提取的生物碱相同，该植物药在一些国家、地区已经有过30多年的临床应用，用于治疗逆转神经肌肉阻滞、重症肌无力和幼儿脑型麻痹症等。

加兰他敏是希雷与强生公司合作开发的化学合成药物，制剂有片剂、胶囊、口服液等，临床用于改善AD患者总体功能。该药具有双重作用机制，能较好的刺激和抑制乙酰胆碱酯酶，并且能够调节脑内的烟碱受体位点，可显著改善轻、中度早老性痴呆病人的认知功能，延缓脑细胞功能减退的进程。

加兰他敏于2000年7月被欧盟批准后在英国、爱尔兰首次上市，2001年获美国FDA许可用于治疗阿尔茨海默症，现已在25个国家上市。希雷公司负责在英国、爱尔兰的销售，强生公司负责美国和其它欧洲国家的销售。国外报道2001年加兰他敏销售额为1.36亿美元。

1998年上海申兴制药厂己生产加兰他敏原料药，1999年国家药品监督管理局批准苏州第六制药厂生产四类新药氢溴酸加兰他敏胶囊，2001年上海申兴产量同比增长3倍，年产量达到30kg。该药进入市场后，临床推广长足迈进，2000年已在我国主要城市重点医院抗痴呆药品中崭露头角。

近几年，乙酰胆碱脂酶抑制剂已成为AD的一线治疗药物，确认了其有效缓解认知功能障碍的地位，产品销售量占据了抗痴呆药物中的最大份额，研究表明石杉碱甲、毒扁豆碱、美曲磷脂对阿尔茨海默症也有一定的治疗作用，中科院上海药物所开发的石???杉碱甲化合物已申请了国际专利，其作用机制正在进行深入的研究，北京四环制药、宁波立华制药、上海汉殷药业和上海医科大学红旗药厂获得了新药证书和生产文号。

(4)钾通道阻滞剂

研究表明，非选择性的钾通道阻滞剂通过延迟去极化和延长突触前神经末梢的钙流入引起神经递质(包括Ach)释放增加。若要想这类药物用于治疗老年痴呆，则所用药物应具备能增加乙酰胆碱的释放而不减少膜磷脂酰胆碱组成的优点，而减少膜磷脂酰胆碱的组成可能是AchE抑制剂存在的副作用。磷脂酰胆碱是胆碱的贮存库，被神经元用来合成Ach。膜磷脂酰胆碱的损失使乙酰胆碱的合成受到限制，导致胆碱输出量减少。临床研究已表明非选择性钾通道阻滞剂对改善患者的识别能力仅有中度作用，其作用不强可能是这些药物的中枢神经系统穿透力低，选择性差或活性不够等，有待于进一步研究加以完善。

(5)谷氨酸受体调控剂

在老年疾呆症患者的大脑中，皮质皮层和离皮层途径的锥体细胞发生了神经纤维混乱和退化。据报道，这些锥体细胞以谷氨酸为兴奋递质。这些神经元受损，功能丧失时会导致老年痴呆症；但若功能过强，则会产生兴奋性毒性，引起神经元死亡，造成多种神经退化性疾病。因此，调控退化的谷氨酸神经元的突触活性有望治疗老年痴呆症。研究表明，直接活化突触后受体将有利于谷氨酸的传递，其部分激动剂具有这样的优点，即当内源性谷氨酸低于正常水平时起激动剂作用，而当谷氨酸释放过量时起拮抗剂作用，因此，部分激动剂会对兴奋毒性情况产生神经保护作用。已有报道的药物如美金刚胺(memantine)，当谷氨酸以病理量释放时，美金刚胺会减少谷氨酸的神经毒性作用；当谷氨酸释放过少时，美金刚胺可以改善记忆过程所需谷氨酸的传递，临床研究表明，美金刚胺用于老年痴呆症患者具有较好的耐受性，在精神病理学和行为测定中产生温和的有统计学意义的显著改善。

(6)5-羟色胺3受体拮抗剂

5-羟色胺3(简称：5-HT3)受体拮抗剂原用于止吐，现有研究根据5-HT3受体在大脑中的分布状态，推测此类拮抗剂应有其它中枢神经系统的作用。如5-HT3拮抗剂昂丹司琼???

枢复宁能改善胆碱能神经功能正常和不足的动物如鼠、狨等的识别能力；在50岁以上与老年有关的记忆力受损(AAMI)病人的临床试验中，昂丹司琼能使相当于丧失6年的记忆力得到改善。因此，昂丹司琼及其他5-HT3受体拮抗剂(托烷司琼、格拉司琼等有可能给老年痴呆患者带来福音。

(7)天然药物方面的研究

现今很多医药公司还把目光移向天然药物，试图从中开发出有效的治疗药物。在这方面同样也取得了一定的进展。

①阿朴脂蛋白E4(ApoE4)

我们知道，阿尔茨海默氏症的发病情况与遗传基因有着较为紧密的联系，阿朴脂蛋白E4ApoE4是特别值得让我们去注意并朝着治疗和预防阿尔茨海默氏症的方向进行研究。在药物开发中，ApoE4已经进行过人体药物临床试验，并极有可能成为疗效比较确切的药品。

②β-淀粉素(体)(Beta-amyloid)

β-淀粉素是一种不能溶解的多肽。该种物质能够有效防止激烈氧化过程中导致的二乙基溴乙酰胺的破坏。在从事阿尔茨海默氏症研究理论中就是利用β-淀粉素限制自由基的产生以及清除自由基，以防止自由基所带来的损害。这种类型的化合物包括idebenone(武田公司、Osaka日本)，该化合物既是一种自由基的清道夫也是某种神经增长因子的刺激物。早期研究表明，idebenone能有效治疗中度痴呆症。尽管葛兰素威康公司(英国)和美国家用产品公司已经在少数一些国家上市，但它已经从日本退出市场，而且其III期临床试验已经被停止。

(8)其它类型药物的研究进展

2000年上半年，一些研究表明，雌激素替代疗法可以较明显地延缓妇女阿尔茨海默氏症的发作，并能降低阿尔茨海默氏症的病情严重化。个别临床研究也发现雌激素治疗能够提高感知度。雌激素对抗氧剂和抗炎药的作用能力可以减少发病的机率，推动乙酰胆碱的产生、促进神经细胞的生长和存活。

2000年年中，日本的Toyama Chemical公司期望开始在英国进行T-588的II期临床研究，并能在美国进行较早的试验。在纽约大学的合作下，公司发现T-588可以保护大脑神经细胞。

日本藤泽制药公司的FK-960在日本和美国进行。该药能够提高感知度，具有新的作用机制。在最近有关研究报道是表明，咀嚼可以防止上年纪的人记忆力衰退，但其作用机制现在仍然没有明确。研究人员通过研究小鼠的遗传改变来研究人体老化的迹象。实验表明，拔除牙齿以防止咀嚼的小鼠的记忆力要逊于正常对照小组。此外，研究人员还研究了咀嚼时大脑的活动情况，并发现下巴的活动可以增强脑部海马区的信号。

来自肯塔基州立大学的研究人员发现减少食用量可以保护大脑避免因年龄引起紊乱，这种紊乱类似于阿尔茨海默氏症。最近出版的研究论文表明，通过喂养减少食物量的小鼠，研究人员发现它们大脑的损伤能减少。对热量摄入量和人体神经变性疾病的研究还没有开始，但有一些相关性研究显示，相比于美国和加拿大，中国和日本由于摄入较少的热量，因此相应的阿尔茨海默氏症的发病率也减少。

加拿大的神经生物技术公司在2000年上半年宣布了一个较为确切的产品memantine。该产品是一种非竞争性N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)阻断剂，在美国进行了III期临床试验，主要用于治疗阿尔茨海默氏症。

5、老年痴呆症的市场发展前景

2000年世界七大药品市场表明，AD药品市场已从90年代中期的4亿多美元增长了近一倍，2001年全球AD市场价值已近12亿美元；国外分析家预测在未来十年内AD患者将会增加到20％左右，AD药品市场的增长速度将有较大幅度的上升。

由于患者的不断增多，AD治疗药物的市场销售额也一直在稳步增长。90年代该类药物已成为畅销药物，1995年世界销售额已达50亿美元。21世纪初，该类药物的销售额超过了排列在前三位的治疗心血管病药物、治疗胃肠道病药物和抗感染药物市场的份额，其发展势头看好。

目前，该类疾病已越来越受到中国国家和社会的高度重视，而且由于该类疾病类似于糖尿病等富贵病，一样需要长期服用治疗药物，因此其用药市场随着人口老龄化而逐渐扩大，市场前景看好。基于此，为及时了解中国治疗AD药物的市场状况，中国国家食品药品监督管理局南方医药经济研究所信息中心选取中国六个主要用药城市(北京、上海、广州、南京、杭州、成都)的百家抽样医院、60名医生专家和120名消费者，对中国国内老年痴呆症用药市场(1999年及2000年)及其主要竞争品种进行了全面的市场调研活动。

(1)1999年～2000年中国治疗老年痴呆药物医院用药金额情况分析

从1999年～2000年六城市(北京、上海、广州、南京、杭州、成都)抽样医院治疗老年痴呆症用药金额构成情况来看，2000年六城市抽样医院销售总金额较1999年同比增长28.49％。而在治疗老年痴呆药主要品种中，使用金额百分比较大的品种排名依次为吡拉西坦、银杏叶制剂、氢化麦角碱、阿米三嗪/萝巴新、阿尼西坦、尼麦角林、胞磷胆碱、石杉碱甲、多奈哌齐、吡硫醇、长春西汀、加兰他敏、氯酯醒、艾地苯醌。其中前四位品种市场份额(金额百分比)较大。

具体品种中，吡拉西坦的市场份额(金额百分比)2000年较1999年上升了8个百分点仍居首位，金额增长率达55.59％。银杏叶制剂、氢化麦角碱保持较稳定的市场份额，使用金额都保持一定的增长。使用金额增长较快的品种有石杉碱甲、加兰他敏，其中加兰他敏增长幅度最高。阿米三嗪/萝巴新、阿尼西坦、尼麦角林、胞磷胆碱、长春西汀和吡硫醇总体市场出现萎缩，而艾地苯醌基本退出市场竞争。多奈哌齐由于是较新的品种，在1999年未见销售，但在2000年市场份额(使用金额百分比)占0.45％，显示出一定的市场潜力。

(2)1999年～2000年中国治疗老年痴呆药物医院用药金额走势分析

从1999年～2000年六城市老年痴呆用药金额走势情况来看，2000年整体用药水平要明显高于1999年整体用药水平，出现上升趋势。其中1999年用药金额高峰期和2000年用药金额高峰期均出现在二季度(2000年用药量高峰期是第三季度)，表明在2000年二季度高价品种的使用量相对要高。从六城市用药情况中可以反映出中国城市的一个用药趋势。

(3)主要用药城市医院用药情况分析

从各品种在各城市的用药金额排序情况来看，其销售情况表现得较好的品种主要有银杏叶制剂、吡拉西坦、氢化麦角碱和阿米三嗪/萝巴新。其中银杏叶制剂2000年在上海、广州、杭州和成都地区排在第一位，在北京地区排名第二，南京地区排名第三，表现得相当好，较1999年有所增长，其几个主打品牌达纳康、银杏天保、活血宁胶囊、百路达胶囊、天保宁、银可络的市场反应有口皆碑；其次表现较好的则为吡拉西坦，该品2000年在北京和南京地区占据第一的位置，在其它几个城市也是前三名之列，只有在杭州地区较弱(排名第5)；氢化麦角碱总体情况排在第三位，不过2000年排名较1999年排名有所提高。氢化麦角碱在各城市的排名基本保持不变，并在个别城市如上海和成都地区排名上升，而在南京地区排名下降一个位置。

(4)其它方面的市场评价

随着治疗AD药物临床推广的普及，AD已越来越受到社会和家庭的重视，从调查的医生信息反馈来看，68％的医生认为社会大众已经开始关心和重视AD，与此同时，8.16％的医生认为市场供给严重不足，63.2％的医生认为市场供给不足。可见，AD用药市场供给不足，市场仍有空间，有近八成医生认可市场前景较好。

同样，随着近年来OT℃市场的蓬勃发展，有相当部份品种(口服剂型)也在零售药店中进行销售，由于长期服药的特点，越来越多的患者选择直接从药店进行购药治疗。从中国国家药品监督管理局南方医药经济研究所零售研究部对这类药品的监测结果显示，银杏叶制剂的市场份额(销售金额百分比)约占市场的4成左右，中成药较受零售市场的青睐，都可喜(阿米三嗪/萝巴新)的市场份额约占3成左右，其余品种则占据余下的市场份额。从所调查的消费者情况反映，有67.80％的消费者是从医院药房获得所需药品的；而有27.97％的消费者直接到药店购买；4.24％的病患者从所在单位门诊部获得；还有0.85％的病患者到批发商处购买。这表明，目前来说，医院虽然是老年人用药的主要销售渠道，但也可以看出，零售渠道也占有不可忽视的比例。

AD的治疗占世界药品市场的第七位，到2005年底价值61亿美元。而目前抗AI)药物主要是缓解症状，并不遏制病情的发展。因此，研究出一种有效的治疗方法来阻止潜在的发病过程是很必要的，所以本发明认为研制用于预防、诊断、检测、保护和治疗AD等方面的产品特别是药物能够具有显著的社会效益和经济效益。

但是经文献检索等，到目前为止，尚未发现将柚皮素及其衍生物作为抗心脑系统疾病产品应用方面的报道；也就是说，迄今为止，尚未见柚皮素及其衍生物用于制备抗脑梗死、心肌梗死方面的产品，用于制备抗脑缺血——再灌注损伤、心肌缺血——再灌注损伤方面的产品，用于制备抗脑卒中后遗症、血管性痴呆方面的产品和用于制备抗阿尔茨海默氏症方面的产品的报道。

发明内容

本发明所需要解决的技术问题是公开了一种柚皮素及其衍生物的新用途，以克服现有技术存在的上述缺陷。

也就是说，本发明意在明确柚皮素及其衍生物在心脑血管疾病、阿尔茨海默氏症等方面的具体应用，进而将柚皮素及其衍生物用于制备抗心脑系统疾病产品；

所述的心脑系统疾病包括心脑血管疾病及其相关疾病、阿尔茨海默氏症及其相关疾病等中的一种或多种，其中心脑血管疾病及其相关疾病包括脑梗死、心肌梗死、脑缺血——再灌注损伤、心肌缺血——再灌注损伤、卒中后遗症或血管性痴呆等中的一种或多种，阿尔茨海默氏症及其相关疾病包括阿尔茨海默氏症等中的一种或多种。

所述的抗心脑系统疾病产品是指用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的产品，是包括医药、食品或饮料等领域产品中的一种或多种，例如包括药物、试剂、食品、保健食品、添加剂或饮料等中的一种或多种，优选药物、保健食品或添加剂等中的一种或多种，进一步优选药物。

(一)技术构思

自主开发创新药物是中国目前的一项紧迫任务，中国医药行业具有悠久的发展历史，在预防和治疗疾病等方面也积累了丰富的经验，从中药中寻找有效的活性成分是一条有效的途径，也是中国创新药物研制的优势之所在。

在筛选具心脑血管活性的天然成分过程中，发明人发现中药枳实(fruit of Citrusaurantium.L)的乙醇浸膏具较强的心脑血管活性，通过对其进行活性指导的分离，发现活性部位是包括柚皮素和其衍生物一系列黄酮的混合物，进一步分离得到柚皮苷(naringin)、橙皮苷(hesperidin)等各单体，各单体均显示强心脑血管活性。利用分离得到的柚皮苷、橙皮苷制备其它柚皮素的衍生物，进一步研究柚皮素相关衍生物的心脑血管活性，结果发现柚皮素及其衍生物均具有较强的心脑血管活性。

所述的心脑血管活性具体地是指柚皮素及其衍生物在制备抗心脑系统疾病产品的应用，例如，柚皮素及其衍生物在制备治疗脑梗死、心肌梗死的药物中的应用，柚皮素及其衍生物在制备预防或治疗脑缺血——再灌注损伤、心肌缺血——再灌注损伤的药物中的应用，柚皮素及其衍生物在制备预防或治疗脑卒中后遗症、血管性痴呆的药物中的应用。

所述的缺血——再灌注损伤是指组织器官缺血的基础上恢复血流后，组织器官的损伤反而加重；

所述的防治脑卒中后遗症是指对已经发生的脑血管事件减少其后遗症(如：偏瘫，大、小便失禁，语言障碍等)的发生，并治疗已经产生的后遗症。

柚皮素及其衍生物尤其在防治血管性痴呆方面表现出了相当强的活性，鉴于此又研究了其对阿尔茨海默氏症的作用，结果发现柚皮素及其衍生物对防治阿尔茨海默氏症同样具有相当强的活性。

目前抗AD药物的作用主要是缓解症状，并不遏制病情的发展。因此，研究出一种有效的预防、诊断、治疗和研究方法来阻止潜在的发病过程是很必要的。

根据所检索的有关文献资料，发明人通过实验研究，发现柚皮素及其衍生物具有多种显著的药理活性。而进一步的实验和研究结果，也证明和证实了柚皮素及其衍生物在预防、诊断、检测、保护和治疗AD等方面具有显著的活性。

(二)柚皮素及其衍生物

所述的柚皮素及其衍生物的化学结构通式如下：

其中，R₁是包括氢(H)或烷基等中的一种或多种，优选包括氢、甲基(CH₃)或乙基(C₂H₅)等中的一种或多种；

R₂是包括氢(H)、羟基或烷氧基等中的一种或多种，优选包括氢、羟基、甲氧基或乙氧基等中的一种或多种；

R₃是包括氢、烷基或糖基等中的一种或多种，优选包括氢、具有1～6个碳原子的烷基或者含1～6个单糖的糖基等中的一种或多种，进一步优选包括氢、甲基、乙基或含3个单糖的糖基等中的一种或多种。

所述的烷基是包括具有1～6个碳原子的直链烷基、支链烷基或环状烷基等中的一种或多种，是包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、叔戊基、已基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基等中的一种或多种，优选包括具有1～3个碳原子的烷基等中的一种或多种，特别优选包括甲基或乙基等中的一种或多种；

所述的烷氧基中的烷基是包括具有1～6个碳原子的直链烷基、支链烷基或环状烷基等中的一种或多种，是包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、叔戊基、己基、环丙基、环丁基、环戊基或环己基等中的一种或多种，优选包括具有1～3个碳原子的烷基等中的一种或多种，特别优选包括甲基或乙基等中的一种或多种；

所述的单糖是指吡喃葡萄糖、吡喃木糖、吡喃阿拉伯糖、吡喃鼠李糖，糖链可为直链或支链，连接方式可为(1-2)、(1-3)、(1-4)或(1-6)连接。

所述的柚皮素及其衍生物优选包括单体柚皮素及其衍生物、橙皮素及其衍生物、异樱花素及其衍生物或圣草酚及其衍生物等中的一种或多种，进一步优选单体柚皮素及其衍生物。

当R₁为氢且R₂为氢时，表示单体柚皮素及其衍生物；

当R₁为甲基且R₂为羟基时，表示橙皮素及其衍生物；

当R₁为甲基且R₂为氢时，表示异樱花素及其衍生物；

当R₁为氢且R₂为羟基时，表示圣草酚及其衍生物。

再进一步优选的具体化合物是包括单体柚皮素、柚皮苷、柚皮素-7-O-β-芸香糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-鼠李糖苷、橙皮素、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-鼠李糖苷、异樱花素、樱花素、枸桔苷、异樱花素-7-O-β-芸香糖苷、异樱花素-7-O-葡萄糖苷、异樱花素-7-O-鼠李糖苷、圣草酚、圣草枸橼苷、新圣草枸橼苷、圣草酚-7-O-葡萄糖苷或圣草酚-7-O-鼠李糖苷等中的一种或多种。上述化合物的基团如表1。

表1、柚皮素及其相关的衍生物

 

序号	R<sub>1</sub>	R<sub>2</sub>	R<sub>3</sub>	化合物名称
					1	羟基	氢	氢	单体柚皮素
2	羟基	氢	α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖	柚皮苷
					3	羟基	氢	α-L-吡喃鼠李糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖	柚皮素-7-O-β-芸香糖苷
4	羟基	氢	葡萄糖	柚皮素-7-O-葡萄糖苷
					5	羟基	氢	鼠李糖	柚皮素-7-O-鼠李糖苷
6	甲氧基	羟基	氢	橙皮素
					7	甲氧基	羟基	α-L-吡喃鼠李糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖	橙皮苷
8	甲氧基	羟基	α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖	新橙皮苷

 

9	甲氧基	羟基	葡萄糖	橙皮素-7-O-葡萄糖苷
					10	甲氧基	羟基	鼠李糖	橙皮素-7-O-鼠李糖苷
11	甲氧基	氢	氢	异樱花素
					12	甲氧基	氢	甲基	樱花素
13	甲氧基	氢	α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖	枸桔苷
					14	甲氧基	氢	α-L-吡喃鼠李糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖	异樱花素-7-O-β-芸香糖苷
15	甲氧基	氢	葡萄糖	异樱花素-7-O-葡萄糖苷
					16	甲氧基	氢	鼠李糖	异樱花素-7-O-鼠李糖苷
17	羟基	羟基	氢	圣草酚(北美圣草素)
					18	羟基	羟基	α-L-吡喃鼠李糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖	圣草枸橼苷
19	羟基	羟基	α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖	新圣草枸橼苷
					20	羟基	羟基	葡萄糖	圣草酚-7-O-葡萄糖苷
21	羟基	羟基	鼠李糖	圣草酚-7-O-鼠李糖苷

本发明所说的柚皮素及其衍生物大部分是从柑桔属植物(Citrus)果实及果皮甲提取分离的，相关文献报道了柚皮素及其衍生物的提取分离方法，并对柚皮素及其衍生物的理化数据进行了详细的报道，本发明不再赘述。

另外还有部分柚皮素及其衍生物可以通过提取的天然柚皮素衍生物水解或其它理化方法转化制备，相关文献也有报道，本发明不再赘述。

(三)柚皮素及其衍生物的药理活性

本发明对柚皮素及其衍生物的心脑血管活性进行了多方面的试验。通过实验证明，①柚皮素及其衍生物对采用结扎两侧颈总动脉的小鼠急性脑缺血模型有明显延长小鼠平均存活时间的作用；②对采用栓线法制备的大鼠局灶性脑缺血—再灌注模型有明显降低脑含水量，缩小梗死面积的作用；③对大鼠脑缺血—再灌注损伤致血管性痴呆模型有明显改善学习记忆功能的作用；④对犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型有明显降低心肌缺血程度和范围，减少心肌梗塞范围的作用；⑤对大鼠心肌缺血—再灌注损伤模型有明显减少心肌梗塞范围的作用。

本发明通过实验还证明了柚皮素及其衍生物对β-淀粉样肽诱导的阿尔茨海默病模型大鼠有明显的改善其学习记忆功能的作用。

(四)柚皮素及其衍生物的用途

1、概述

本发明的目的是提供一种用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究抗心脑系统疾病的产品，是包括医药、食品和饮料等领域产品中的一种或多种，例如包括药物、试剂、食品、保健食品、添加剂、饮料等中的一种或多种，优选药物、保健食品、添加剂，进一步优选药物。

通过药理活性筛选证明，柚皮素及其衍生物具有预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的活性。已完成的急性毒性实验证明，小鼠灌胃给药对该活性部位的最大耐受量超过2.0g/kg，相当于临床推荐用药剂量的440倍，表明该柚皮素及其衍生物安全可靠。

综上所述，发明人对柚皮素及其衍生物进行了理论探索，经过大量的实验研究特别是长期的药理学试验，发现所述及的柚皮素及其衍生物有显著的预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的活性。因此，柚皮素及其衍生物及其组合物可用于制备抗心脑系统疾病产品，优选以本发明柚皮素及其衍生物为原料制备而成的药物。

2、柚皮素及其衍生物及其组合物的使用方法与要求

本发明所述及的柚皮素及其衍生物可以单独或与其它活性组分联合使用，包括用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的产品，是包括医药、食品和饮料等领域产品中的一种或多种，例如包括药物、试剂、食品、保健食品、添加剂、饮料等中的一种或多种，优选药物、保健食品、添加剂，进一步优选药物。

在具体使用方面，本发明所述的柚皮素及其衍生物能够单独使用，还能够与其他许多化学物质一起使用。无论这些化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，包括辅助功能如协同放大作用、拮抗或缓解柚皮素及其衍生物的副作用等，这些化学物质是包括医药学上可接受的载体、食品、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种或多种；优选包括医药学上可接受的载体或者食品等中的一种或多种；进一步优选医药学上可接受的载体。

本文使用的“医药学上可接受的载体”是包括任何和所有的生理适用的溶剂、分散介质、胞衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等中的一种或多种。医药学上可接受载体的例子包括一种或多种的水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油或乙醇等及其组合物中的一种或多种。在许多情况下，在该组合物中最好包括等渗剂，例如，糖、诸如甘露醇、山梨醇、山梨醇的多元醇或氯化钠等中的一种或多种。医药学上可接受载体还可以包含少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液等中的一种或多种，它们增强了该柚皮素及其衍生物的有效期或效力。

从具体的分类上看，所说的医药学上可接受的载体是指医药学领域常规的药物载体，包括赋形剂，如淀粉或水等中的一种或多种；润滑剂，如甘油或硬脂酸镁等中的一种或多种；崩解剂，如微晶纤维素、琼脂、碳酸钙或碳酸氢钠等中的一种或多种；填充剂，如淀粉或乳糖等中的一种或多种；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶或聚乙烯吡咯烷酮等中的一种或多种；渗透压调节剂，如葡萄糖、蔗糖、山梨醇或甘露醇等中的一种或多种；稀释剂，如水等；吸收促进剂，如季铵化合物等；表面活性剂，如十六烷醇等；吸附载体，如高岭土或皂粘土等中的一种或多种；润滑剂，如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁或聚乙二醇等中的一种或多种；另外，还可以在组合物中加入其它辅剂，如香味剂或甜味剂等中的一种或多种。

例如，将活性组分柚皮素及其衍生物溶解、混悬或乳化于适宜的水性溶剂中(例如，蒸馏水、生理盐水或格林溶液等中的一种或多种)或油性溶剂中(例如，植物油例如橄榄油、芝麻油、棉籽油、玉米油或丙二醇等中的一种或多种)中，即可制得注射制剂，其中溶剂中可含有分散剂(例如，聚山梨酯80、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、聚乙二醇、苯甲醇、氯代丁醇或苯酚等中的一种或多种)、渗透压调节剂(例如，氯化钠、甘油、D9—甘露糖、D—山梨醇或葡萄糖等中的一种或多种)。在这种情况下，如有必要，可加入添加剂，例如增溶剂(例如，水杨酸钠或醋酸钠等中的一种或多种)、稳定剂(例如，人血清白蛋白等)、止痛剂(例如，苯甲醇等)等。

本发明所述及的柚皮素及其衍生物还可以以组合物的形式联合使用，特别是与用其它化学物质如药物对动物尤其是哺乳动物包括人或其他动物进行治疗所用的组合物或者是类似的组合物。所述哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、羊、猴、牛、猪、马、兔、犬、黑猩猩、狒狒、狨、猕猴或恒河猴等中的一种或多种，优选人、小鼠、大鼠、猴、猪、兔或犬等中的一种或多种，进一步优选人、大鼠或猴等中的一种或多种。例如，可以将本发明柚皮素及其衍生物加入适于给与受治疗者的药用组合物中。通常，该药用组合物包含本发明柚皮素及其衍生物和药学上可接受的载体。

柚皮素及其衍生物的组合物特别是药物组合物可以有各种形式，包括例如液体、半固体和固体等剂量形式中的一种或多种；其中所说的药物组合物包括治疗有效量的柚皮素及其衍生物为活性成分，以及一种或多种医药学上可接受的载体。

柚皮素及其衍生物的药物组合物可以采用本领域公知的常规生产方法制成各种剂型，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种)、粘膜透析等中的一种或多种给药途径进行抗AD及其相关病症的治疗或科学研究。

药物组合物优选含有重量比为0.1～99.9％的活性成分柚皮素及其衍生物，进一步优选含有重量比为1％～95％的活性成分柚皮素及其衍生物，再优选含有重量比为5％～90％的活性成分柚皮素及其衍生物，最优选含有重量比为10％～40％的活性成分柚皮素及其衍生物。

柚皮素及其衍生物的药物组合物一般必须无菌且在生产储存条件下稳定。可以将该组合物配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高药物浓度的有序结构。通过将所需量的该柚皮素及其衍生物与所需上述成分的一种或组合一起加入适当的溶剂中并接着进行除菌过滤制备无菌注射液。一般而言，通过将该柚皮素及其衍生物加入含有基本分散介质和所需的上述其它成分的无菌溶媒中制备分散液。在用于制备无菌注射液的无菌粉剂的情况下，推荐的制备方法是真空干燥和冷冻干燥剂。例如，通过诸如卵磷脂的包衣、在分散液的情况下通过保持所需颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持溶液的适当流动性。通过在该组合物中包括延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐或明胶)可以达到注射组合物的延长吸收。

用于患者时，本发明所述的柚皮素及其衍生物剂量为1～500mg/kg·天(d)，该剂量或用量通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定，优选5～20mg/kg·d。也就是说，以下的剂量范围均是安全可靠的，柚皮素及其衍生物剂量为1～3600mg/d(以70kg体重计算)；口服1～2000mg，优选50～1000mg；注射2～400mg，优选50～200mg；膏剂(lotion)0.5～5％，优选1～2％。

本发明柚皮素及其衍生物及其药用组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明柚皮素及其衍生物。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下有效达到所需治疗效果的量。柚皮素及其衍生物的治疗有效量可以根据诸如个体的病况、年龄、性别和体重以及该柚皮素及其衍生物在该个体引起所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量亦指该柚皮素及其衍生物的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。“预防有效量”是指在必要剂量和时间下有效达到所需预防效果的量。因为预防剂量用于患病前或疾病早期的受治疗者，预防有效量通常小于治疗有效量。本发明柚皮素及其衍生物的治疗或预防有效量的典型的非限制性范围是5～20mg/kg，更优选为5～10mg/kg。应注意，剂量值将根据欲减轻的疾病类型和严重性变化，也就是说用于患者时，本发明所述的柚皮素及其衍生物剂量或用量，通常根据患者或使用者的年龄和体重以及身体状况或患者症状的状况来决定。另外，应理解，对于任何特定受治疗者，应随着时间根据个体需要和给与或监督给与所述组合物的人的专业判断调整特定剂量制度，并且本文设定的剂量范围仅为例证性的，并不会限制要求保护的组合物的范围或实践。

也就是说，需要根据治疗的对象、给药途径、所治疗疾病和状况等，变化本发明柚皮素及其衍生物的每次和/或每日的剂量或用量。例如，经静脉给予哺乳动物，尤其是成年人(如体重60kg)，所述柚皮素及其衍生物的单剂量约为5～10mg，优选约10mg，优选每日给药1～3次。可以调整剂量单位，以提拱最佳所需反应(例如，治疗或预防应答)。例如，可以单次大剂量给药，可以在一段时间内给予几个均分量或根据治疗情况的迫切性按比例降低或增加剂量。配制易于给药和剂量统一的剂量单位形式的非肠道组合物尤其有利。本文使用的剂量单位形式，指适于欲治疗的哺乳动物受治疗者的单元剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的计算用于与所需药用载体一同产生所需治疗效果的活性物柚皮素及其衍生物。本发明的剂量单位形式的规格，由以下确定并直接取决于以下(a)该柚皮素及其衍生物的独特特征和欲达到的特定治疗或预防效果，和(b)在混合这种用于治疗个体敏感性柚皮素及其衍生物的技术中的内在限制。

3、柚皮素及其衍生物及其组合物的药物剂型和给???药途径

本发明所述的柚皮素及其衍生物及其组合物制备的用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的产品，其中按照饮料、食品技术领域的要求制备的产品能够用于预防、保护和治疗心脑系统疾病；按照医药技术领域的要求制备的产品能够用于患者的治疗或保健，既能够单独直接用于制备治疗或保健的药物，也能够与许多化学物质进行混合或组合，直接或间接用于制备治疗或保健的药物。这里所述的化学物质与本节上文中所述的相同。

在本发明中，所需物料包括本发明的原料、上述配套使用的化学物质等，均应根据实际情况和需要，采用食品级或药用级的物料。

本发明所述的柚皮素及其衍生物及其组合物，可以用本领域已知的各种方法给药，尽管在许多治疗用途中推荐的给药途径/给药方式是喷雾剂或口服给药。但是，技术人员会理解给药途径/给药方式随所需的结果而变化。在某些具体实施中，该活性化合物可以与保护该化合物免于快速释放的载体一同制备例如空释制剂，包括移植物传递系统、透皮贴传递系统或微囊传递系统等中的一种或多种。此外，还可以使用生物可降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原蛋白、聚正酯或聚乳酸等中的一种或多种。制备这种制剂的许多方法均已申请专利或一般为本领域技术人员所知(参见例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson编辑，Marcel DekkerInc.，纽约，1978)。

本发明所述的柚皮素及其衍生物及其组合物，通常通过口服、鼻吸入、直肠或肠胃外给药等中的一种或多种方式，施用于需要这种治疗的患者。

也就是说，柚皮素及其衍生物的药物组合物可以采用本领域公知的方法制成各种剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、注射剂等，采取口服或注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射等)、粘摸透析等给药途径进行心脑血管疾病或阿尔茨海默氏症的防治。

用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂或胶囊等中的一种或多种。在实施时，本发明柚皮素及其衍生物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一同口服。该柚皮素及其衍生物(和共它成分，如果需要)亦可以包于硬或软壳明胶胶囊、压制成片剂或直接加入受治疗者的膳食中。关于口服治疗给药，可以将所述柚皮素及其衍生物与赋形剂一起加入并以可食片剂、颊含片剂、锭剂、胶囊、悬液、糖浆或糯米纸囊剂等等中的一种或多种形式使用。

为了以非肠道给药之外给予本发明柚皮素及其衍生物，可能需要用防止其失活的材料对该柚皮素及其衍生物包衣或与该柚皮素及其衍生物一同给予。亦可以将补充的活性化合物加入该组合物中。在具体实施时，将本发明柚皮素及其衍生物与一种或多种可以用于治疗疾病的其它治疗药物共配制和/或共给予。这种联合使用，可以优越地利用较低剂量的该给予的治疗药物，因此避免可能的毒性或与各种单一疗法相关的并发症。

制成液体制剂如水剂、油悬浮剂或其它液体制剂中的一种或多种，如糖浆或酏剂等中的一种或多种；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液剂、水剂或油性悬浮剂等中的一种或多种。

以上所述的使用形式中，优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂或注射剂等中的一种或多种，进一步优选片剂、胶囊或注射剂等中的一种或多种，特别优选注射剂。

综上所述，本发明柚皮素及其衍生物及其组合物可用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的产品，是包括医药、食品和饮料等领域产品中的一种或多种，例如包括药物、试剂、食品、保健食品、添加剂、饮料等中的一种或多种，优选药物、保健食品、添加剂，进一步优选药物。

(五)技术特长

本发明对柚皮素及其衍生物拓展了新的医药用途，也为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病提供了一种新的药物来源。本发明的柚皮素及其衍生物安全低毒，药理作用较强，可用于制备预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的产品。

本发明有针对性地研究柚皮素及其衍生物，柚皮素及其衍生物药理作用较强，其原料来源丰富、广泛、价廉，制备工艺简单，得率高；且使用安全，而且使用范围特别广，能够最大限度发挥作用，易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

实验证明，本发明所述及的柚皮素及其衍生物，以及药物组合物是一种安全、高效、稳定、价廉的防治心脑血管疾病或阿尔茨海默氏症的药物。其制备成本低廉，如：柚皮苷在某些药材中含量高达12％，而且提取方法简单；活性成分明确；活性高，如：柚皮苷活性高于灯盏花素；毒性较低，柚皮苷口服的最大耐受量>5g/kg。

此外，柚皮素及其衍生物化学性质稳定，预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病的效果明显，故其更适于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病产品的工业化生产。

总之，本发明积极适应了现代医疗和科研领域的工作需要和人性化服务的需要，是用于预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心脑系统疾病等方面的安全原料。

具体实施方式

本发明研究了现有的柚皮素及其衍生物的新的药理作用和新的用途，提供了一种能够用于制备抗心脑系统疾病产品的原料，便于医疗行业和相关行业如食品、饮料等领域的安全使用。

本发明制备粉针剂一般采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取柚皮素及其衍生物，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一种或儿???种。每瓶含柚皮素及其衍生物10～100mg。

本发明制备粉针剂也可采用喷雾干燥法，以水作为溶媒，其步骤为：取柚皮素及其衍生物，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含柚皮素及其衍生物10～100mg。

本发明制备小针剂时，以注射用水作为溶媒配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每支含柚皮素及其衍生物10～100mg。

本发明制备葡萄糖输液或氯化钠输液，以注射用水作为溶媒，加入适量葡萄糖或氯化钠配制即可，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺中的一种或几种。每瓶含柚皮素及其衍生物10～100mg。

本发明制备片剂、胶囊、颗粒剂、口服液等口服制剂，辅料可以是乳糖、淀粉、糊精、硬脂酸盐等，按常规技术制备。

在本发明中，以上所述的具体实施方式和以下所述的实例均是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制发明的范围。

下面通过实施例对本发明作详细描述。

实施例1、柚皮素及其衍生物对小鼠急性脑缺血的影响

分组：

①空白对照组：给予与药物组等体积的生理盐水；

②阳性对照药组：给予药物灯盏花素片(上海雷允上药业有限公司，产品批号031111)，剂量200mg/kg；

③试验药物组：给予被检测药物，剂量为200mg/kg；

方法：

各组每天灌胃给药1次，连续给药7d。末次给药1h后，将麻醉小鼠仰位固定于手术合上，切开颈部皮肤，分离两侧颈总动脉，用4号手术线分别结扎带迷走神经的左右颈总动脉，记录小鼠死亡时间。

表2、对小鼠急性脑缺血的影响(x±S，n＝20)

P<0.01 vs生理盐水组

从表2看出，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷及阳性对照药灯盏花素均可明显延长小鼠因结扎两侧带迷走神经的颈总动脉造成急性脑缺血的存活时间，与生理盐水组比较差异非常显著(P<0.01)，提示柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷、灯盏花素对小鼠急性脑缺血有明显的保护作用。

实施例2、柚皮素及其衍生物对大鼠局灶性脑缺血—再灌注损伤的保护作用组别：

①空白对照组：给予与药物组等体积的生理盐水；

②阳性对照药组：给予药物灯盏花素片(上海雷允上药业有限公司，产品批号031111)，剂量50mg/kg；

③试验药物组：给予被检测药物，剂量为50mg/kg；

方法：

将SD大鼠，280～300g，用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分枝。在颈外动脉近端备线、颈内动脉远端及颈总动脉放置动脉夹，颈总动脉分叉处靠颈外动脉侧切口，插入4—0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。缺血同时灌胃给药或灌胃给生理盐水。继续缺血2小时后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈外动脉切口处，血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。再灌注24h后存活鼠，一部分每组8只)处死取大脑，称左右脑半球湿重，置160℃烤箱内24小时后称干重，按以下公式计算脑组织含水量：脑组织含水量(％)＝(湿重—干重)/湿重×100％；一部分(每组8只)快速断头取鼠大脑，切下厚约2mm冠状脑片，立刻置于2％TTC溶液中，37℃孵育30分钟。梗塞区呈现白色，非梗塞区呈现红色。数码相机拍摄记录，用Medbrain2.0软件(南京美易科技公司)测出脑片总体积及梗塞区体积，并计算梗塞区占整个脑组织的百分比(％)。

从表3看出，生理盐水组缺血侧(大脑右半球)的脑组织含水量显著高于假手术组(P<0.01)，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷及灯盏花素组缺血侧(大脑右半球)的脑组织含水量显著高于其大脑左半球(P<0.01)，与其大脑左半球无显著性差异。实验结果表明，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷均可降低缺血再灌注损伤脑组织的含水量，减轻缺血侧脑半球水肿程度，对大鼠缺血再灌注脑损伤有保护作用。

从表4看出，假手术组脑组织无梗塞，生理盐水组缺血侧脑组织有梗塞现象，梗塞区占整个脑组织的百分比为31.2±8.50％，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷及灯盏花素组均可显著缩小缺血侧脑组织梗塞体积，与生理盐水组相比有非常显著差异(P<0.01)。实验结果表明，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草构橼苷对大鼠脑缺血再灌注损伤引起的脑梗塞有显著保护作用。

表3、对大鼠缺血—再灌注脑组织含水量的影响(x±SD，n＝8)

^**P<0.01与生理盐水组比较；##P<0.01与大脑左半球比较

表4、对大鼠脑缺血再灌注的脑梗塞体积的影响(x±SD，n＝8)

与生理盐水组(模型组)比较，^**P<0.01

以上实验结果提示柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷对脑缺血再灌注损伤有保护作用。

实施例3、柚皮素及其衍生物对血管性痴呆大鼠学习记忆的影响

组别：

①空白对照组：给予与药物组等体积的生理盐水；

②阳性对照药组：给予药物灯盏花素片(上海雷允上药业有限公司，产品批号031111)，剂量100mg/kg；

③试验药物组：给予被检测药物，剂量为100mg/kg；

方法：

将SD大鼠，280～300g，用10％水合氯醛3ml/kg腹腔注射麻醉，颈正中切口，分离、结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉及其分支动脉。分离右侧颈内动脉，沿颈内动脉向下分离翼颚动脉，根部结扎该分枝。在颈外动脉近端备线、颈内动脉远端及颈总动脉放置动脉夹，颈总动脉分叉处靠颈外动脉侧切口，插入4—0尼龙线，其深度为17～20mm，栓线进入颈内动脉，入颅至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有血流来源。撤掉动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤。继续缺血2小时后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至有阻力时提示尼龙线头端已至颈外动脉切口处，血流再通。假手术组除不插线外，其余步骤同上。大鼠再灌注8h后灌胃给药，假手术组和模型组灌胃给予纯净水。大鼠灌胃1次/d，连续灌胃7d，然后进行Morris水迷宫试验评价大鼠的学习记忆的功能。定位航行试验：实验历时4d，将大鼠面向池壁从4个不同象限放入水中，记录大鼠寻找平台所需时间(逃避潜伏期)，超过2min者，按2min计算，将4次测试的平均值记作大鼠寻找平台的潜伏期，连续测试4d。每一象限结束后，让大鼠在平台上休息10s。在整个实验中保持操作者位置以及周围环境的相对稳定。

表5结果显示大鼠局灶性脑缺血2h再灌注7d后造成血管性痴呆大鼠模型，模型组大鼠学习记忆功能受损，受训第4天水迷宫逃避潜伏期时间与假手术组相比显著延长(P<0.01)，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷及灯盏花素均可改善血管性痴呆大鼠的学习记忆功能，显著减少血管性痴呆大鼠水迷宫逃避潜伏期的时间，受训第4天水迷宫逃避潜伏期时间与模型组相比，差异具有显著性意义(P<0.01)，结果表明柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷及灯盏花素对血管性痴呆具有治疗作用，改善其学习记忆功能。

表5、对术后7d实验性血管性痴呆大鼠水迷宫逃避潜伏期的影响(S，x±SD，n＝10)

与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较^**P<0.01

实施例4、柚皮素及其衍生物的对犬冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型的治疗作用

组别：

①空白对照组：给予与药物组等体积的生理盐水；

②阳性对照药组：给予药物灯盏花素片(上海雷允上药业有限公司，产品批号031111)，剂量50mg/kg；

③试验药物组：给予被检测药物，剂量为50mg/kg；

方法；

犬称重后以3％戊巴比妥钠30mg/kg静注麻醉。分离气管并插入气管插管，接SC—M5型麻醉呼吸机(上海医疗仪器厂)，待开胸后行机械通气，呼吸频率16～18次/分，潮气量350～550ml。沿胸骨左缘第4肋间开胸，暴露心脏，剪开心包并作心包吊床。在左冠状动脉前降支第二至第三分支间游离冠状动脉，并在其下穿二根丝线，备用于两步结扎。采用Harris两步结扎法：首次结扎前2分钟，从股动脉静注利多卡因5mg/kg预防心律失常。在结扎时将一段直径1mm的钢丝插入第一松结内，将钢丝与冠状动脉一起结扎，而后抽出钢丝。30分钟后完全结扎第二结。

结扎2小时后取心脏，称取全心重量；切去心房及右心室，称出左心室重量，并在冠脉结扎线下，平行于冠状沟将左心室切成等厚的5片，用生理盐水洗净，置0.05％氯化硝基四氮唑蓝(N-BT)液37℃染色30分钟。染色过程中不时摇动染色液使之与心肌充分接触。染色后立即用水冲去多余染料。梗死区不着色，非梗死区着暗蓝色，剪去着色部分，将未着色的梗死区称重，计算出梗塞区重量占全心及左心室重量的百分比。

结果：

1、对心肌梗塞范围的定量组织学检测的影响

用定量组织学检测心肌梗塞范围即用N—BT染色显示灯盏花素、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷对心肌梗塞范围的影响与心外膜电图测定的结果一致。灯盏花素、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷减少心肌梗塞范围，心肌梗塞区与全心重量的比值和梗塞区与左心室重量的比值与生理盐水组比较具有非常显著性差异(P<0.01)。结果见表6。

表6、对N—BT染色测定心肌梗塞范围的影响(x±s，n＝5只/组)

^**P<0.01与生理盐水组比较

以上实验结果证明，灯盏花素、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷能显著降低冠脉结扎犬的心肌缺血程度，缩小心肌缺血范围，对心肌缺血有治疗作用。

实施例5、柚皮素及其衍生物的对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用

1、造模：SD大鼠，2％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，仰卧位固定。以心电图机记录II导联心电图监测心脏情况。颈前正中切开，行气管插管，接人工呼吸机，频率为55次/分，潮气量1ml。分离一侧股静脉供给药用。在胸左侧第四五肋间处切开胸壁并沿胸骨左缘2mm处切断第四和第五肋骨，剪开心包膜，暴露心脏，于左冠状动脉前降支下穿1根0/3号缝合线，稳定10min(稳定后心电图不正常者弃去)，将两个线头穿过一小段细硅胶管，在另一小段细硅胶管上打结作为缺血结扎(无ST段及T波改变者淘汰)，缺血10min后从股静脉缓慢注射给药，30min后剪断结扎线，使前降支再灌注30min。

2、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)的测定：再灌注结束后，股动脉取血，紫外分光法测定血清LDH、CK活性。

3、心肌梗塞范围测定法；在冠脉结扎线下，平行于冠状沟，等厚地将心室肌横切成5片，将5片心肌置于硝基四氮唑蓝(N—BT)染液中，37℃振摇染色15min后取出，正常心肌染为暗蓝色，梗塞区心肌则不着色。在解剖镜下分离梗塞区，分别称重，以梗塞区心肌重量占心肌重量的百分比(％)作为衡量梗塞范围的指标。

心肌缺血再灌注后，血清LDH、CK活性明显增加，心肌梗塞区重量明显增加，与假手术对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)；灯盏花素、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷降低血清LDH活性、CK活性、心肌梗塞区/全心重量百分比低于模型组，差异具有非常显著性意义(P<0.01)，提示灯盏花素、柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。结果见表7。

表7、对大鼠心脏缺血再灌注损伤的影响(x±s，n＝10)

^**P<0.01与生理盐水组比较；^△△P<0.01与生理盐水组比较

实施例6、柚皮素及其衍生物的对(β-淀粉样肽)Aβ1-40诱导的阿尔茨海默病???模型大鼠的影响

1、分组：

①空白对照组：给予与药物组等体积的生理盐水；

②阳性对照药组：给予药物灯盏花素片(上海雷允上药业有限公司，产品批号031111)，剂量100mg/kg；

③试验药物组：给予被检测药物，剂量为100mg/kg；

2、方法：将Aβ1-40溶于无菌蒸馏水(10ug/ul)，用前37℃下孵育1周。SD大鼠、250～300g，采用腹腔注射10％水合氯醛(0.35g/kg)麻醉，头顶部去毛，消毒皮肤并切开。立体定向仪固定头部，暴露头骨，选双侧海马齿状回背侧细胞带为注射区。定位坐标为(AP-3.5mm，ML±2.0mm，DV2.7mm)，以钻头钻开颅骨，缓慢注射Aβ1-40，留针5min以保证溶液充分的扩散，然后缓慢撤针。造模24h后分别灌胃给药连续10d。对照组及模型组只以等量蒸馏水进行灌胃。连续灌胃10d，然后进行Morris水迷宫试验评价大鼠的学习记忆的功能。定位航行试验：实验历时4d，将大鼠面向池壁从4个不同象限放入水中，记录大鼠寻找平台所需时间(逃避潜伏期)，超过2min者，按2min计算，将4次测试的平均值记作大鼠寻找平台的潜伏期，连续测试4d。每一象限结束后，让大鼠在平台上休息10s。在整个实验中保持操作者位置以及周围环境的相对稳定。

表8、对术后10d实验性阿尔茨海默病大鼠水迷宫逃避潜伏期的影响(x±SD，n＝10，s)

与假手术组比较，##P<0.01；与模型组比较^*P<0.05

结果显示大鼠海马注射β-淀粉样肽制成阿尔茨海默病模型，模型组大鼠学习记忆功能受损，受训第4天水迷宫逃避潜伏期时间与假手术组相比显著延长(P<0.01)，柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷均可改善阿尔茨海默病大鼠的学习记忆功能，显著减少阿尔茨海默病大鼠水迷宫逃避潜伏期的时间，受训第4天水迷宫逃避潜伏期时间与模型组相比，差异具有显著性意义(P<0，01)，结果表明柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷对阿尔茨海默病具有治疗作用，改善其学习记忆功能。结果见表8。

实施例7、柚皮素及其衍生物粉针剂的制备

取柚皮素及其衍生物30g，加入右旋糖苷30g，加500ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至2000ml，加3.0g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；灌装到无菌的西林瓶中，每瓶2ml，半轧塞；冷冻干燥，再压塞轧盖即可。

实施例8、柚皮素及其衍生物粉针剂的制备

取柚皮素及其衍生物60g，加500ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；冷冻干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。

实施例9、柚皮素及其衍生物粉针剂的制备

取柚皮素及其衍生物40g，加入乳糖50g，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；喷雾干燥得无菌粉末，分装成1000瓶。

实施例10、柚皮素及其衍生物粉针剂的制备

(1)处方

(2)制备工艺

按以上处方称取处方量柚皮素及其衍生物，加入到适量注射用水中，搅拌使其溶解；加入处方量甘露醇，搅拌使完全溶解，加注射用水至全量；加入液体量的0.1％针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；灌装，半轧塞；冷冻干燥，压塞轧盖。共制得9735瓶，成品率为97.35％。

实施例11、柚皮苷注射剂的制备

处方：

柚皮苷                  20g

乙醇(95％)              2000g

丙二醇(C.P)             1000g

注射用水                加至10000ml

                        制成1000支

工艺：

取20℃乙醇(95％)2000g，加入活性炭5g搅拌，经砂芯组减压过滤，备用。取处方量柚皮苷加入上述乙醇2000g中，加热至约40℃，充分搅拌，使之溶解澄明，然后加入处方量丙二醇，再加入新鲜注射用水使全量成10000ml，充分搅拌，混匀，加入活性炭3g，经砂芯组减压过滤澄明，合并前后滤液，再以专用砂芯精滤澄明。检查含量及澄明度合格后灌封，100℃流通蒸气灭菌30min，即得每只10ml含柚皮苷20mg的注射剂。

实施例12、柚皮素及其衍生物小针剂的制备

取柚皮素及其衍生物5g，加100ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶10ml，灭菌即可。

实施例13、柚皮素及其衍生物小针剂的制备

取柚皮素及其衍生物10g，加入丙二醇30g，加200ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至1000ml，加1.5g针用活性炭，充分搅拌30分钟；脱炭过滤；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶5ml，灭菌即可。

实施例14、柚皮素及其衍生物葡萄糖输液的制备

取柚皮素及其衍生物2g，加入聚乙二醇10g，加入葡萄糖500g，加2000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶100ml，灭菌即可。

实施例15、柚皮素及其衍生物葡萄糖输液的制备

取柚皮素及其衍生物2g，加入葡萄糖250g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至5000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。

实施例16、柚皮素及其衍生物氯化钠输液的制备

取柚皮素及其衍生物1g，加入氯化钠90g，加1000ml注射用水，搅拌使其溶解；加注射用水至10000ml；用0.22μm微孔滤膜过滤；分装灌封，每瓶250ml，灭菌即可。

实施例17、柚皮素及其衍生物片剂的制备

(1)处方

(2)制备工艺

按以上处方分别称取处方量的主药与辅料，按等量递加法混合均匀后照处方工艺项下进行制软材、制颗粒，干燥，整粒等过程，计算好片重后用单冲压片机和10.5mm浅凹冲模压片，控制裸片硬度5～7kg，共制得片剂9698片，成品率为96.98％。采用滚转喷雾法包衣，包衣工艺如下：

包衣液的配制：胃溶薄膜衣料：85G61235，由上海卡乐康包衣技术有限公司提供

包衣工艺：将待包衣裸片(硬度5kg～7kg)放入包衣锅中，启动搅拌装置和鼓风加热装置，待裸片温度升至40℃时，开始打开喷枪对准片床的上1/3处喷入包衣液包衣，控制片床温度38℃～42℃，气磅压力6kg，包衣液流速为50mL/min，包衣膜重占包衣片重的3％。

实施例18、柚皮苷片剂的制备

处方：

柚皮苷              100g

淀粉                30g

乳糖                40g

羧甲基淀粉钠        5g

淀粉浆(7％)         适量

硬脂酸镁            1％(1.45g)

                制成1000片

工艺；

取处方量柚皮苷，粉碎过100目筛，再将处方量的淀粉、乳糖粉碎过100目筛，混匀。将柚皮苷加入混匀的淀粉和乳糖中，混匀。加入适量50％乙醇拌匀，经16目铁筛丝网制粒，60℃以下干燥，整粒，加入适量硬脂酸镁混匀，分析含量后压片。可制成1000片每片含100mg柚皮苷的片剂。

实施例19、柚皮素及其衍生物胶囊剂的制备

(1)处方

(2)制备工艺  按以上处方分别取原料药柚皮素及其衍生物及处方中其它辅料分别过100目筛，置60℃烘干，称取处方量柚皮素及其衍生物与微晶纤维素、羧甲基淀粉钠等量递加法混合均匀，用适量无水乙醇制软材，30目筛制粒，50～60℃干燥2小时，用30目筛整粒，加入处方量的滑石粉和羧甲基淀粉钠混合均匀。

实施例20、柚皮素胶囊剂的制备

处方：

柚皮素            50g

淀粉              140g

微粉硅胶          10g

              制成1000粒

工艺：

取处方量柚皮素，粉碎过100目筛，加入处方量的淀粉、微粉硅胶中，混匀，直接装入胶囊，可制成1000粒每粒含50mg柚皮素的胶囊剂。

实施例21、橙皮素胶囊剂的制备

处方：

橙皮素              50g

淀粉                140g

微粉硅胶            10g

                制成1000粒

工艺：

取处方量橙皮素，粉碎过100目筛，加入处方量的淀粉、微粉硅胶中，混匀，直接装入胶囊，可制成1000粒每粒含50mg橙皮素的胶囊剂。

Claims (2)

1.选自柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素、异樱花素、枸桔苷、圣草酚、圣草枸橼苷中的任意一种的化合物在制备抗阿尔茨海默氏症产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，该产品为药物，该药物还包含医药学上可接受的载体。