CN107823198A - 北美圣草素在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及北美圣草素在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用,本发明采用Aβ25‑35损伤的PC‑12细胞作为AD的体外模型,以雌二醇作为阳性对照,从抗细胞凋亡角度出发,研究北美圣草素抗AD的效果及其产生效果的作用机制,从而为植物雌激素在分子水平治疗AD等中枢神经退行性疾病打下坚实的实验基础及理论依据,具有重要的实际应用价值。

Description

北美圣草素在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用
技术领域
本发明涉及制药领域,具体涉及北美圣草素在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,简称AD),又称原发性老年痴呆症,是一种神经系统退行性疾病。流行病学研究显示,AD是一种随着年龄的增长,发病率也会同时增加的增龄性疾病,65岁以上的人群约为5%,而在85岁以上的人群约为20%。
经研究,雌激素可以多途径、多环节的方式防治AD,但长时间服用雌激素易产生子宫出血、乳腺癌及子宫内膜癌等副作用。因此,人们希望寻找可以替代雌激素的药物。植物雌激素(Phytoestrogen)是一类能结合并激活哺乳动物及人的雌激素受体,从而发挥雌激素样或者抗雌激素活性的成分。植物雌激素具有双酚结构,其化学结构与内源性雌激素非常接近,既有雌激素特性,又能根据内源性雌激素的含量和雌激素受体结合,发挥抗雌激素效应。植物雌激素也是“选择性雌激素受体调节剂”(SERMs),它对绝经后妇女有一定的保健作用,且植物雌激素毒副作用小,故我们认为它是一种很好的替代雌激素的药物。Pan等通过对病例统计及对照发现,植物雌激素能显著提高人的记忆力,增加人反应的灵活性。Lephart等选用植物雌激素-异黄酮作为目标药物,研究其对大鼠脑部的作用,并对其血浆中异黄酮的浓度进行了测定,结果显示,血浆中异黄酮含量高可对大脑内部的结构、形态及功能造成一定影响。郭安臣等发现植物雌激素可以通过促进小鼠脑内突触素的表达对抗Aβ25-35的毒性作用,从而提高动物的学习记忆能力。提示植物雌激素可改善大脑功能,预防AD的发生。
北美圣草素属黄酮类化合物,具有抗菌、抗炎、清除氧自由基、抗癌等多种药理作用。北美圣草素显著的抗炎,抗氧化,清除自由基,抗凋亡作用已经得到证实,但北美圣草素神经保护方面的相关研究较少。本发明采用Aβ25-35损伤的PC-12细胞作为AD的体外模型,以雌二醇作为阳性对照,从抗细胞凋亡角度出发,研究北美圣草素抗AD的效果及其产生效果的作用机制,从而为植物雌激素在分子水平治疗AD等中枢神经退行性疾病打下坚实的实验基础及理论依据。
发明内容
本发明的目的在于提供含北美圣草素的中药材在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
含北美圣草素的中药材包括绿茎槲寄生、岩青兰、补血草、火棘果、黄花叽松、兔毛蒿、金花忍冬、艾纳香、骨碎补、流苏花、桑黄、白花泡桐、川楝子、降香、毛泡桐、小叶买麻藤、复叶耳蕨、秀雅杜鹃、山绿茶、地板藤、掌叶大黄、黄花补血草、火棘大叶白麻中的一种或几种。
绿茎槲寄生是桑寄生科槲寄生属的绿茎槲寄生(Viscum Nudum Danser.)的全株。
岩青兰为唇形科植物毛建草Dracocephalum rupestre Hance的全草。
补血草学名:Limonium sinense(Girard)Kuntze),别称:补血草、海赤芍、鲂仔草、白花玉钱香、海菠菜、海蔓、海蔓荆、匙叶草、华蔓荆、盐云草、匙叶矶松、中华补血草。
兔毛蒿为菊科线叶菊属植物线叶菊Filifolium sibiricum(L.)Kitam.[Tanacetum sibiricum L.]的全草。
金花忍冬学名Lonicera chrysantha Turcz.ex Ledeb。
艾纳香学名Blumea balsamifera(L.)DC.),是菊科艾纳香属多年生草本或亚灌木植物。
骨碎补为硕龙骨科植物槲蕨Drynaria fortune(Kunze)J.Sm.的干燥根茎。
桑黄为多孔菌科真菌火木层孔菌Phellinus igniarius(L.ex Fr.)Quel.[Fomesigniarius(L.)Fr.;Boletus igniarius L.;Polyporus igniarius Fr.]的子实体。
白花泡桐别名白花桐,泡桐,大果泡桐,华桐,火筒木,沙桐彭,拉丁文名:Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl.。
川楝子为楝科植物川楝MeLia toosendan Sieb.et Zucc.的干燥成熟果实。
降香学名Dalbergia odorifera。
毛泡桐学名:Paulownia tomentosa,为玄参科泡桐属的植物。
复叶耳蕨Arachniodes exilis(Hance)Ching,鳞毛蕨科复叶耳蕨属植物。
秀雅杜鹃学名Rhododendron concinnum Hemsl.。
山绿茶为冬青科冬青属植物海南冬青Ilex hainanensis Merr.的叶。
掌叶大黄(Rheum palmatum L.),蓼科,大黄属高大粗壮草本植物。
进一步,优选的,北美圣草素在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
优选的,北美圣草素浓度为10-2μmol/L—10-6μmol/L,更优选的,北美圣草素浓度为10-3μmol/L—10-4μmol/L。
进一步,上述含北美圣草素的中药材在制备Bax和/或Caspase-3基因或蛋白抑制剂中的应用。
优选的,北美圣草素在制备Bax和/或Caspase-3基因或蛋白抑制剂中的应用。
进一步,上述含北美圣草素的中药材在制备Bcl-2和/或ERβ和/或p-ERK1/2基因或蛋白促进剂中的应用。
优选的,北美圣草素在制备Bcl-2和/或ERβ和/或p-ERK1/2基因或蛋白促进剂中的应用。
优选的,北美圣草素浓度为10-3μmol/L—10-4μmol/L。
优选的,北美圣草素的浓度为10-4μmol/L。
附图说明
图1是拮抗ER或阻断MAPK途径对药物作用的影响图
图2是拮抗ER途径PC-12细胞p-ERK1/2蛋白的表达
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例
1.实验材料:
细胞株:大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12细胞系,购自中国科学院细胞库。
药品及与试剂:Aβ25-35,购自武汉博士德生物工程有限公司;β-雌二醇(纯度98%,生产批号L750N46),购自北京百灵威科技有限公司;北美圣草素(纯度99.8%,生产批号生产批号MUST-15052807),购自成都曼思特生物技术有限公司;胎牛血清(FBS)、高糖培养液(DMEM)、双抗、胰蛋白酶,购自Hyclone公司;AMV逆转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、RT-PCR引物,购自上海生物工程有限公司;RT-PCR试剂盒,购自Fermentas公司;四甲基噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO),购自Sigma公司;Tween-20、TEMED,购自Sigma公司;超敏ECL化学发光试剂盒,购自碧云天生物技术研究所;Western及IP细胞裂解液、TRIZOL,购自Invitrogen公司。
2.实验方法:
2.1 MTT法检测北美圣草素对Aβ25-35损伤PC-12细胞增殖率的影响
取对数生长期的细胞接种于培养瓶中,放置培养箱中培养,控制培养箱温度为37℃,CO2含量为5%,24h后细胞贴壁,弃掉旧培养液,将细胞分为空白组、模型组、雌二醇组、北美圣草素组。空白对照组:不含任何药物,仅用DMEM完全培养液培养。模型组:细胞于DMEM完全培养液培养4h后,加入适量Aβ25-35,控制Aβ25-35终浓度为20μmol/L,继续培养24h。雌二醇组:给予浓度为10-3μmol/L的雌二醇完全培养液培养4h后,加入适量Aβ25-35,控制Aβ25-35终浓度为20μmol/L,继续培养24h。北美圣草素组:给予浓度为10-2μmol/L的北美圣草素完全培养液培养培养4h后,加入Aβ25-35适量,控制Aβ25-35终浓度恰好为20μmol/L,继续培养24h。每组设置5个复孔,加入MTT溶液(5g/L)20μL,37℃继续孵育4h后,弃掉废液,再分别加入DMSO200μL,恒温振荡器上振荡10min后,酶标仪570nm处检测各孔吸光度值。
2.2实时荧光定量PCR法检测PC-12细胞Caspase-3、Bcl-2、bax、及ER亚型mRNA表达水平
实验分为空白组、模型组、雌二醇组、北美圣草素组、北美圣草素+Fulvestrant组和北美圣草素+U0126组。空白组、模型组、雌二醇组、北美圣草素组处理方式同2.1。北美圣草素+Fulvestrant组:预先给予浓度为1μmol/L的Fulvestrant完全培养液处理细胞1h后,弃掉废液,加入相应北美圣草素储存液,孵育4h后,加入适量Aβ25-35,控制Aβ25-35终浓度为20μmol/L,继续培养24h。北美圣草素+U0126组:预先给予浓度为10μmol/L的U0126完全培养液1mL处理细胞20min后,弃掉废液,加入相应北美圣草素储存液,孵育4h后,加入Aβ25-35适量,控制Aβ25-35终浓度为20μmol/L,继续培养24h。应用实时荧光定量PCR法,以β-actin为内参,检测bax、Bcl-2、Caspase-3mRNA表达,按照以下公式可算出各组目的基因相对于对照组表达量:
ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组,目的基因相对表达量=2-ΔΔCt
引物见表1。
表1目的基因和内参基因的引物序列
2.3 Western blot检测PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-ERK1/2及ER亚型蛋白表达
实验分组及处理情况同2.2,Western blot法检测bax、Bcl-2、Caspase-3、ERβ蛋白的表达,采用Lane ID凝胶分析系统分析条带灰度(IOD),分析并获得各条带的灰度值,目的蛋白的表达水平根据靶条带的灰度值与内参的灰度值的比值来反映。
2.4统计学处理
所有得出的数据结果均表示为平均值±标准差(±SD),使用SPASS 18.0软件对各组数据进行单因素方差分析,通过Tukey检验进行组间比较分析显著性,P<0.05为显著性水平,P<0.01为极显著性水平。
3.实验结果
3.1 MTT检测结果
3.1.1 E2(雌二醇)对Aβ25-35损伤PC-12细胞活力的影响
结果见表2:与空白组相比,Aβ25-35组细胞增殖率显著降低(P<0.01);与模型组比较,除10μmol/L剂量组外各剂量E2组细胞增殖率显著升高(P<0.01);其中10-3μmol/L和10-4μmol/L E2组的细胞增殖率较高。根据实验结果,10-3μmol/L的E2对Aβ25-35损伤PC-12细胞的保护作用明确,是对细胞无毒性作用的最大药物浓度,因此选择10-3μmol/L作为阳性药物浓度进行后续实验。
表2 E2对Aβ25-35损伤PC-12细胞活性的影响(n=6)
注:与空白组比较,*为P<0.05**为P<0.01;与Aβ25-35组比较,##为P<0.01。
3.1.2北美圣草素对Aβ25-35损伤PC-12细胞活力的影响
结果见表3与空白组相比,Aβ25-35组细胞增殖率显著降低(P<0.01);与模型组比较,除10μmol/L—10-1μmol/L剂量组外各剂量北美圣草素组细胞增殖率显著升高(P<0.01),其中10-4μmol/L北美圣草素组的细胞增殖率与空白组无显著差异。根据实验结果,10-4μmol/L北美圣草素对Aβ25-35损伤PC-12细胞保护作用最强,故选用该药物浓度进行后续实验。
表3北美圣草素对Aβ25-35损伤PC-12细胞活性的影响(n=6)
注:与空白组比较,*为P<0.05**为P<0.01;与Aβ25-35组比较,##为P<0.01。
3.2北美圣草素对Aβ25-35损伤PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3mRNA表达的影响
结果见表4:与空白组比较,Aβ25-35组PC-12细胞中促凋亡基因Bax mRNA的表达显著升高(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2和Caspase-3mRNA的表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,雌二醇和北美圣草素组PC-12细胞中促凋亡基因Bax mRNA的表达显著降低(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2和Caspase-3mRNA的表达显著升高(P<0.01);与北美圣草素组比较,北美圣草素+Fulvestrant、北美圣草素+U0126组促凋亡基因Bax和Caspase-3mRNA的表达显著增加(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表达显著降低(P<0.01)。由此可知,北美圣草素能够抑制Aβ25-35损伤PC-12细胞促凋亡基因mRNA的表达,促进抑凋亡基因mRNA的表达,拮抗ER或阻断ERK途径,北美圣草素对促凋亡基因mRNA表达的抑制作用和对抑凋亡基因mRNA表达的促进作用明显减弱。
表4各组PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3mRNA的表达(n=3)
3.3北美圣草素对Aβ25-35损伤的PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3及ER亚型蛋白表达的影响。
3.3.1 PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3、ERβ蛋白的表达
结果见表5;与空白组比较,模型组促凋亡基因Bax和Caspase-3蛋白的表达显著增加(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2、ERβ蛋白的表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,雌二醇和北美圣草素组促凋亡基因Bax和Caspase-3蛋白的表达显著降低(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2、ERβ蛋白的表达显著增加(P<0.01)。由此可知,雌二醇和北美圣草素能够抑制Aβ25-35损伤PC-12细胞促凋亡基因蛋白的表达,增加ERβ和抑凋亡基因蛋白的表达。
表5 PC-12细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达(n=3)
组别 bax/β-actin Bcl-2/β-actin Caspase-3/β-actin
空白组 0.238±0.003 0.839±0.006 0.106±0.007
模型组 0.845±0.013** 0.508±0.024** 0.886±0.007**
雌二醇组 0.270±0.061## 0.685±0.082## 0.572±0.034##
北美圣草素组 0.236±0.006## 0.820±0.017## 0.607±0.016##
注:与空白组比较,**为P<0.01;与模型组比较,##为P<0.01。
3.3.2 PC-12细胞ERβ和p-ERKI/2蛋白的表达
结果见表6:经检测各组均未能测出ERα蛋白条带。与空白组比较,模型组ERβ和p-ERK1/2蛋白的表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,北美圣草素和雌二醇组ERβ和p-ERKI/2蛋白的表达显著升高(P<0.01)。由此可知,雌二醇和北美圣草素能够促进Aβ25-35损伤PC-12细胞ERβ和p-ERK1/2蛋白的表达。
表6 PC-12细胞ERβ、p-ERK1/2蛋白的表达(n=3)
组别 ERβ/β-actin p-ERK1/2/β-actin
空白组 0.043±0.001 0.576±0.006
模型组 0.025±0.003* 0.259±0.030**
雌二醇组 0.057±0.006## 0.349±0.013##
北美圣草素组 0.059±0.002## 0.590±0.001##
注:与空白组比较,**为P<0.01;与模型组比较,##为P<0.01。
3.3.3拮抗ER或阻断MAPK途径对药物作用的影响
结果见表7和图1:与模型组比较,北美圣草素组PC-12细胞中促凋亡基因Bax蛋白的表达显著降低(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达显著升高(P<0.01);与北美圣草素组比较,北美圣草素+Fulvestrant、北美圣草素+U0126组促凋亡基因Bax和Caspase-3蛋白的表达显著增加(P<0.01),抑凋亡基因Bcl-2蛋白的表达显著降低(P<0.01)。由此可知,北美圣草素能够抑制Aβ25-35损伤PC-12细胞促凋亡基因蛋白的表达,促进抑凋亡基因蛋白的表达,拮抗ER或阻断ERK途径,北美圣草素对促凋亡基因蛋白表达的抑制作用和对抑凋亡基因蛋白表达的促进作用明显减弱。
表7拮抗ER或阻断MAPK途径对药物作用的影响(n=3)
3.3.4拮抗ER对北美圣草素促进PC-12细胞p-ERK1/2产生的影响
结果见图2:未予ER拮抗剂处理的北美圣草素组的PC-12细胞经Aβ25-35处理后仍能产生一定量的p-ERK1/2,加入ER拮抗剂后未测出p-ERK1/2。由此结果可知,ER参与了北美圣草素上调p-ERK1/2表达的过程。

Claims (10)

1.含北美圣草素的中药材在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,含北美圣草素的中药材包括绿茎槲寄生、岩青兰、补血草、火棘果、黄花叽松、兔毛蒿、金花忍冬、艾纳香、骨碎补、流苏花、桑黄、白花泡桐、川楝子、降香、毛泡桐、小叶买麻藤、复叶耳蕨、秀雅杜鹃、山绿茶、地板藤、掌叶大黄、黄花补血草、火棘大叶白麻中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,北美圣草素浓度为10-2μmol/L—10-6μmol/L。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,北美圣草素浓度为10-3μmol/L—10-4μmol/L。
5.含北美圣草素的中药材在制备Bax和/或Caspase-3基因或蛋白抑制剂中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,北美圣草素在制备Bax和/或Caspase-3基因或蛋白抑制剂中的应用。
7.含北美圣草素的中药材在制备Bcl-2和/或ERβ和/或p-ERK1/2基因或蛋白促进剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,北美圣草素在制备Bcl-2和/或ERβ和/或p-ERK1/2基因或蛋白促进剂中的应用。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的应用,其特征在于,北美圣草素浓度为10-3μmol/L—10-4μmol/L。
10.根据权利要求5-8任意一项所述的应用,其特征在于,北美圣草素浓度为10-4μmol/L。
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