CN107137404B - 甲基莲心碱在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用 - Google Patents
甲基莲心碱在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了甲基莲心碱预防或治疗急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的应用。甲基莲心碱是从天然植物中提取的生物碱，具有抗氧化活性。在构建急性呼吸窘迫综合征的动物和细胞损伤模型的基础上，本发明通过HE、Evan blue染色、荧光探针、免疫荧光标记等验证甲基莲心碱能够降低活性氧(ROS)的产生与释放、减少血管内皮多糖包被(Glycocalyx)的降解，进而抑制ARDS的发生和发展，预防或治疗ARDS。
Description
技术领域
本发明涉及甲基莲心碱抑制急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生发展从而预防或治疗ARDS。本发明的具体机制涉及甲基莲心碱通过抑制活性氧产生与释放，减少因氧化损伤导致的血管内皮多糖包被的降解，进而降低血管通透性，以致于预防或治疗 ARDS。
背景技术
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指由严重感染、创伤、休克、误吸等多种非心源性致病因素导致，以进行性呼吸窘迫和难治性低氧血症为临床特征的急性呼吸衰竭综合症。ARDS发病急，发展迅速，临床上至今尚缺乏有效遏制病情进展的药物，因此ARDS预后差，死亡率高达41％，是严重危害人类健康的临床常见呼吸危重症之一。
ARDS尚无特效治疗药物，临床主要以机械通气支持治疗为主。其主要借助呼吸机建立口与肺泡间的压力差，可使因损伤而塌陷的肺泡重新复张，并通过调节吸入氧浓度有效改善缺氧症状，还可通过调节胸腔内压对血流动力学产生影响，从而改善ARDS患者呼吸窘迫症状和顽固性低氧血症。虽然其在ARDS的治疗中发挥了重要作用，但也存在着继发感染和呼吸机相关肺损伤的风险，因此开发ARDS有效治疗药物一直是人们关注的热点和研究的难点。近年来研究表明，氧化应激在ARDS的发生发展中作用复杂。进一步阐明ARDS中氧化损伤的机制，探寻有效抗氧化药物，对开辟预防或治疗ARDS 的新途径具有重要的理论指导意义。
甲基莲心碱(neferine,Nef)是从睡莲科植物莲成熟种子的绿色胚芽中提取分离的一种双苄基异喹啉类生物碱(C38H44N2O6)。已有研究表明其具有抗氧化、抗纤维化、抗血小板聚集、抗心律失常、降血压等广泛的药理作用。
目前尚未有甲基莲心碱预防或治疗急性呼吸窘迫综合征方面的相关报道。
发明内容
针对现有技术中的缺点，本发明的目的是提供通过甲基莲心碱来预防或治疗急性呼吸窘迫综合征。
根据本发明的一个方面，本发明提供了甲基莲心碱在制备预防或治疗ARDS的药物中的应用。
根据本发明的某些实施方式，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。
根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。
根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是LPS刺激。
根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱的给药浓度是5-20mg/kg。
根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱的给药浓度是20mg/kg。
术语
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是指非心源性的各种肺内和肺外因素所导致的急性缺氧性的呼吸衰竭。其主要的病理特征为，炎症反应所致的肺泡上皮细胞及肺微血管内皮细胞损伤，肺毛细血管通透性增高，导致富含蛋白质的液体大量渗出到肺泡腔和肺间质，进而引起弥漫性肺水肿和透明膜形成；其主要的病理生理改变为肺容积减少、严重的通气/血流比例失调、肺内分流增加和肺顺应性降低；其临床表现呼吸窘迫、顽固性低氧血症、进行性的呼吸困难、呼吸衰竭。肺部影像学特点为：双肺渗出样改变。目前对于ARDS的治疗是综合治疗，以呼吸支持治疗为主，包括治疗控制感染、合理液体管理、营养支持及心电监护支持治疗，预防深静脉血栓形成等多项辅助治疗。
ARDS的发病因素包括直接因素(肺内因素)和间接因素(肺外因素)。直接因素主要有严重的肺炎(病毒性或细菌性)、胃内容物的吸入、吸入性肺损伤、肺挫伤等；间接因素主要有：脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒等。本专利从造模方式(脂多糖腹腔注射)上可以归类为肺外因素(间接因素)。
内毒素是导致ARDS的重要因素之一，LPS(Lipopolysaccharide)是内毒素主要成分。 LPS(Lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞外膜成分，是病原菌主要的致病物质，进入机体后导致感染，引发ARDS，造成肺泡-毛细血管屏障损伤，毛细血管通透性增加、中性粒细胞浸润和氧自由基释放等病理生理学改变。本实验运用LPS刺激的 HUVECs细胞以及LPS腹腔注射诱导的小鼠ARDS模型。
内皮细胞多糖包被(Glycocalyx,GCX)为覆盖于血管内皮细胞表面，一层由糖蛋白和蛋白聚糖为主体相互交联形成带负电荷的被膜结构，是保护血管内皮细胞的第一道屏障。GCX骨架结构主要包括核心蛋白和侧链结构。核心蛋白主要有多配体聚糖(Syndecan,SDC)组成。侧链结构是氨基葡聚糖链(GAGs)，硫酸乙酰肝素(HS)含量最多，占GAGs 的50％以上，也是多糖包被的主要降解产物，其包含大量血浆蛋白的结合位点，并通过与核心蛋白的链接参与信号转导。内皮细胞表面的多糖包被作为重要的血管屏障，具有维持血管内皮细胞结构和功能、调节毛细血管通透性、抗凝血、抗炎症反应等作用。研究证明，感染性休克或手术后患者的血清中多糖包被标记物(多配体聚糖1(SDC-1),HS) 浓度明显升高。由肺毛细血管内皮细胞受损导致的血管通透性增加是ARDS的基本病理特点，因此，降低肺毛细血管多糖包被的降解或脱落成为治疗ARDS的关键。氧化损伤在多糖包被降解中发挥着重要的作用。肺是含氧量最多的器官，也是最易受内源性和外源性ROS损伤的器官。活性氧(ROS)的大量产生可以引起细胞的氧化应激反应。ROS 可以直接降解多糖包被HS GAGs，此外完整的多糖包被可以结合抗氧化酶如黄嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶，以清除氧自由基。多糖包被完整性破坏后，ROS直接损伤内皮细胞，中性粒等炎症细胞粘附，大量炎症因子释放，导致内皮细胞功能障碍,血管通透性增高，ARDS病情加剧。
甲基莲心碱是从睡莲科植物成熟种子的绿色胚芽中提取的一类双苄基异喹啉类的生物碱。研究表明其具有抗氧化、抗纤维化、抗心肌缺血、抗血小板聚集、抗心律失常、降血压等广泛的药理作用。甲基莲心碱抗氧化功能主要因为分子结构酚羟基上的氢易与氧自由基结合，可以有效清除细胞内氧自由基，同时减轻了细胞的氧化应激状态。
肺湿重/肺干重是指是反映肺组织水肿的直接指标，也是反映肺组织损伤的敏感指标。主要测量方法为：动物麻醉处死后，用眼科解剖剪仔细游离出右肺下叶，置于天平中称肺湿重(W)标号，然后将标好的肺组织置于60℃专用烤箱中烘干48小时(h) 至恒重，再次称重为肺干重(D)质量，肺组织的湿/干重比(wet/dry weight ratio，W/D) ＝肺湿重/干重。W/D比值升高，表明肺水含量增加，肺水肿程度加剧，肺血管通透性升高。
肺组织气血屏障通透性是指肺泡内的氧气与肺毛细血管内的进行气体交换的结构，其结构的完整性可以维持机体正常的通气/血流比例。当损伤因素导致气血屏障受损时，如肺泡及间质水肿，可导致通气/血流比例失调，临床表现为呼吸窘迫和顽固性的低氧血症。
肺水肿及肺血管通透性是指各种因素导致的肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞损伤，导致内皮细胞屏障功能障碍，引起肺血管通透性增高，富含蛋白质的液体渗出到肺泡和肺间质引起肺水肿。
活性氧(ROS)是指一类由氧衍生出来的、化学性质较基态氧活泼的含氧物质统称，包括氧自由基和一些非自由基的物质，其主要由线粒体产生。其过量积累可对细胞产生氧化损伤。
总抗氧化能力(T-AOC)是指机体在生理条件下，有清除产生过多的ROS从而使细胞内ROS保持一定水平的能力。
超氧化物歧化酶(SOD)是指机体内能有效清除过氧化物的抗氧化酶，其能催化超氧化物阴离子生成过氧化氢与氧气，其活性水平反映了机体清除氧自由基的能力。
丙二醛(MDA)是指生物体脂质过氧化产物中的一种，MDA的量反映了机体细胞细胞膜结构受氧自由基破坏程度。
脂质氧化是指机体受到损伤因素时，过量产生的活性氧作用于生物膜产生脂质过氧化损伤。
本申请所述药物组合物可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂。所述药物组合物可制成干粉形式，并且在给药前与无菌水或缓冲液混合以制成溶液形式。所述缓冲液的pH 通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。
本申请中术语“药盒”或“试剂盒”可互换使用。本申请公开了包含治疗有效量的所述治疗剂或药物组合物的药盒。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含一种或多种其他的治疗剂。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含使用说明书。
根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含用于相应给药方式的装置，例如但不限于针头。术语“给药”、“给予”或“施予”是指将一定剂量的化合物或药物组合物通过合适的给药方式给予对象。
所述“给药方式”包括但不限于口服给药、静脉内给药、呼吸道内给药、舌下给药、局部给药、肌肉内给药、眼内给药、透皮吸收、胃肠外给药、腹膜内给药、阴道给药、颊部给药、经直肠给药等本领域已知的任何给药方式。本领域技术人员应该了解对象的给药方式取决于多个因素，所述因素包括疾病的位置、对象的年龄、疾病的严重程度、以及药物组合物的成分等。
本申请所述化合物或药物组合物可以在任意时间给药。例如所述化合物或药物组合物可以在对象疾病发作前、发作时或者发作后给药，例如可以在疾病发作前或发作后的约1小时、约2小时、约4小时、约5小时、约8小时、约12小时、约24小时、约2天、约4天、约8天、约16天、约30天或1个月、约2个月、约4个月、约 6个月给药。
本申请所述化合物或药物组合物可以一次给药，也可以多次给药。当多次给药时，5可以以间隔任意时间的方式，例如后续剂量与前面剂量的间隔为约8周、约4周、约2周、约1周、约5天、约3天、约2天、约24小时、约12小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约30分钟或更少时间。
方法和用途
根据本发明的一个方面，本发明公开使用甲基莲心碱来预防或治疗急性呼吸窘迫综合征的方法。
根据本发明的某些实施方式，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。
根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。
根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是LPS刺激。
根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱的给药浓度是5-20mg/kg，例如 5-18mg/kg、5-15mg/kg、5-13mg/kg、5-10mg/kg、5-8mg/kg、8-20mg/kg、8-18mg/kg、 8-15mg/kg、8-13mg/kg、8-10mg/kg、10-20mg/kg、10-18mg/kg、10-15mg/kg、10-13mg/kg、 13-20mg/kg、13-18mg/kg、13-15mg/kg、15-20mg/kg、15-18mg/kg、或18-20mg/kg。根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱的给药浓度是5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、 8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、 16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、或20mg/kg。
根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱给予细胞的浓度是5-20μM，例如 5-18μM、5-15μM、5-13μM、5-10μM、5-8μM、8-20μM、8-18μM、8-15μM、8-13μM、 8-10μM、10-20μM、10-18μM、10-15μM、10-13μM、13-20μM、13-18μM、13-15μM、 15-20μM、15-18μM、或18-20μM。根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱给予细胞的浓度是5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、 15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、或20μM。
根据本发明的一个方面，本发明公开甲基莲心碱在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用。
根据本发明的某些实施方式，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。
根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。
根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是LPS刺激。
根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱的给药浓度是5-20mg/kg，例如 5-18mg/kg、5-15mg/kg、5-13mg/kg、5-10mg/kg、5-8mg/kg、8-20mg/kg、8-18mg/kg、 8-15mg/kg、8-13mg/kg、8-10mg/kg、10-20mg/kg、10-18mg/kg、10-15mg/kg、10-13mg/kg、 13-20mg/kg、13-18mg/kg、13-15mg/kg、15-20mg/kg、15-18mg/kg、或18-20mg/kg。根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱的给药浓度是5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、 8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、11mg/kg、12mg/kg、13mg/kg、14mg/kg、15mg/kg、 16mg/kg、17mg/kg、18mg/kg、19mg/kg、或20mg/kg。
根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱给予细胞的浓度是5-20μM，例如 5-18μM、5-15μM、5-13μM、5-10μM、5-8μM、8-20μM、8-18μM、8-15μM、8-13μM、 8-10μM、10-20μM、10-18μM、10-15μM、10-13μM、13-20μM、13-18μM、13-15μM、 15-20μM、15-18μM、或18-20μM。根据本发明的某些实施方式，所述甲基莲心碱给予细胞的浓度是5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、 15μM、16μM、17μM、18μM、19μM、或20μM。
除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。
在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的范围内。
除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。
附图说明
图1显示了甲基莲心碱对LPS(Lipopolysaccharide,革兰氏阴性杆菌细胞外膜中含有的主要致病物质)诱导的ARDS小鼠肺组织病理改变的HE染色结果、肺水肿及肺血管通透性结果(#表示与正常对照组相比，#p<0.05；*表示与LPS组相比，*p<0.05，下面的图片相同)；
图2显示了甲基莲心碱对LPS诱导的ARDS小鼠肺多糖包被SDC-1及HS表达的结果；
图3显示了甲基莲心碱对LPS诱导的ARDS小鼠肺组织中ROS含量的改变的结果；
图4显示了甲基莲心碱对LPS诱导的ARDS小鼠肺组织中总抗氧化能力(T-AOC) 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量改变的结果；
图5显示了甲基莲心碱对LPS刺激的HUVECs细胞多糖包被SDC-1表达的结果；
图6显示了甲基莲心碱对LPS刺激的HUVECs细胞多糖包被HS表达的结果；
图7显示了甲基莲心碱对LPS刺激的HUVECs细胞中ROS含量的改变的结果；
图8显示了甲基莲心碱对LPS刺激的HUVECs细胞中T-AOC、SOD及MDA含量的改变的结果。
具体实施方式
本发明通过构建急性呼吸窘迫综合征的动物和细胞损伤模型的基础上，本发明通过 HE、伊文思蓝(Evan blue)染色、荧光探针、免疫荧光标记等验证甲基莲心碱能够降低活性氧(ROS)的产生与释放、减少血管内皮多糖包被的降解，进而抑制急性呼吸窘迫综合征的发生和发展，预防或治疗ARDS。
实施例1：甲基莲心碱对于肺组织病理改变、肺水肿及肺血管通透性的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于肺组织病理改变、肺水肿及肺血管通透性的影响，本实施例中使用由肺外因素LPS诱导的ARDS小鼠损伤模型。
1.材料
C57BL/6小鼠，雄性，体重18-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司(产品号：SCXK(鲁)20140007)，适应性喂养3天(d)，给药期间自由饮水进食。甲基莲心碱(neferine,Nef)纯度98％，购自上海立根生物技术制药有限公司(产品号： Z118105)；脂多糖(LPS)、伊文思蓝(Evans blue)购自sigma公司(产品号：L2880， E2129)；总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、脂质氧化(MDA)试剂盒，购自碧云天生物技术公司(产品号：S0121,S0101,S0131)。
2.方法
2.1 ARDS小鼠动物模型建立与分组：
根据查阅文献及预实验结果筛选的优选的药物浓度是5-20mg/kg，更优选20mg/kg。把C57BL/6小鼠60只，随机分为4组，即正常对照组、LPS(20mg/kg)组、LPS+Nef (20mg/kg)给药组、Nef(20mg/kg)组。首先，对于Nef+LPS组和Nef组的小鼠，腹腔注射Nef(20mg/kg)预处理1周。此期间正常对照组和LPS组的小鼠给予相同剂量的生理盐水。一周后，LPS组、Nef+LPS组的小鼠腹腔注射20m/kg的LPS，正常对照组、Nef组的小鼠给予等量的生理盐水。
2.2病理学观察与相关实验检测：
各组实验小鼠分别取8只于LPS注射6小时(h)后处死，取肺组织。取左肺，称肺湿重(W)，60℃烘干48小时(h)，再次称重得肺干重(D)，测肺组织湿干重比 W/D值(wet/dryweight ratio，W/D)＝肺湿重/肺干重。
取右肺在4％多聚甲醛溶液中固定，然后使用病理学方法HE染色。
剩余每组实验小鼠，进行肺组织气血屏障通透性检测，经尾静脉注射伊文思蓝(Evans blue)染液(20mg/kg)，30分钟(min)后开胸取肺脏约0.1g，剪碎肺组织浸泡在1mL甲酰胺溶液中(100mg/mL)，置于37℃温箱中温育24小时(h)。待组织中的色素浸出后取出组织，12000g/分钟(min)离心10分钟(min)后取上清液，用分光光度计在波长620nm处进行比色，对照标准曲线计算出各组样本伊文思蓝的浓度。严格按照相应试剂盒说明书操作检测各组实验小鼠肺组织T-AOC、SOD、MDA的含量。
3.结果
如图1A所示，正常对照组小鼠肺组织无明显改变。与正常小鼠肺组织结构相比，LPS组小鼠的肺间质增宽，间质及肺泡腔有出血、水肿、渗出、大量炎性细胞浸润，肺损伤评分显著升高141.2％。与LPS组相比，Nef+LPS组小鼠的肺间质及肺泡出血、水肿，炎症渗出较LPS组减轻，肺损伤评分明显降低39.0％。Nef组与正常组的小鼠相比，肺组织结构无明显改变。
如图1B所示，与正常对照组相比，LPS组小鼠的肺组织湿干重比(wet/dry weightratio，W/D)＝肺湿重/肺干重)W/D值增加63.4％(#p<0.05)；与LPS组相比，Nef+LPS 组小鼠的肺组织W/D降低20.5％(*p<0.05)；Nef与正常组相比，未见明显改变。
如图1C所示，与正常对照组相比，LPS组小鼠肺组织伊文思蓝含量升高106.3％(#p<0.05)；与LPS组相比，Nef+LPS组小鼠的肺组织伊文思蓝含量降低29.0％(*p<0.05)。 Nef组与正常组相比，肺组织伊文思蓝含量未见明显改变。
实验结果说明甲基莲心碱可以改善LPS诱导的小鼠肺组织结构病理改变及损伤,减轻小鼠肺水肿及血管通透性改变。
实施例2：甲基莲心碱对肺多糖包被SDC-1及HS表达的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于肺多糖包被SDC-1及HS表达的影响，本实施例中使用由肺外因素LPS诱导的ARDS小鼠损伤模型。
1.材料
C57BL/6小鼠，雄性，体重18g-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司(产品号：SCXK(鲁)20140007)，适应性喂养3天(d)，给药期间自由饮水进食。甲基莲心碱(neferine,Nef)纯度98％，购自上海立根生物技术制药有限公司(产品号：Z118105)；脂多糖(LPS)；Syndecan-1抗体购自Abcam公司(产品号：ab128936)；血栓调节蛋白购自R&D公司(产品号：AF3894)；HS抗体购自Swampscott公司(产品号：10E4020216)；山羊血清封闭液、兔血清封闭液购自索莱宝公司(产品号：ZLI-9022， ZLI-9026)；罗丹明标记山羊抗鼠二抗、罗丹明标记山羊抗兔二抗、FITC标记兔抗羊二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司(产品号：ZF-0313，ZF-0316，ZF-0314)。
2.组织免疫荧光及相关实验检测：
各组实验小鼠分别取6只于LPS注射6小时(h)后，按5mL/kg给予腹腔注射4％水合氯醛，待小鼠进入麻醉状态后(无疼痛反应等)，将小鼠四肢外展固定于取材板上 (麻绳固定)，用预热好的生理盐水经左心室灌注，直至无血性液体流出，继而用4％多聚甲醛固定液灌注，待小鼠出现四肢抽出现象，在等待一段时间即可。用镊子轻轻固定剪取肺组织，将肺组织剪成0.5×1×1cm3大小，放入多聚甲醛固定液中，在4℃条件下固定48小时(h)。
待48小时(h)后，将固定好的肺组织进行梯度酒精脱水、石蜡包埋。石蜡切片经脱蜡、水化后，将切片放入盛有柠檬酸的染色盒内，置于微波炉中以百分之百火力加热五分钟至沸腾，后以百分之四十火力继续加热十五分钟，以进行抗原修复，取出染色盒，静置至室温。然后用PBS冲洗5分钟(min)×3次，将载玻片置于湿盒内，分别于各组织上滴加动物非免疫血清工作液封闭，室温孵育60分钟(分钟(min))。60分钟(min) 后，分别滴加抗SDC-1、HS一抗50μL 4℃过夜，PBS冲洗15分钟(min)×3次，滴加相应的荧光标记的二抗，37℃避光孵育2小时，PBS冲洗15分钟(min)×3次，除去PBS冲洗15分钟(min)×3次，甩干后用动物非免疫血清封闭60分钟。60分钟后，每张切片滴加50μL血栓调节蛋白抗体，4℃过夜，PBS冲洗15分钟(min)×3次。除去PBS液，每张切片滴加100μL DAPI染核溶液，37℃避光孵育15分钟(min)，PBS 冲洗10分钟(min)×3次，除去PBS液，切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察拍照。
3.结果
如图2A和2C所示，小鼠肺组织毛细血管内皮细胞有SDC-1的表达，与正常对照组相比，LPS组肺组织SDC-1的免疫荧光强度降低50.7％。与LPS组相比，Nef+LPS 组肺组织SDC-1荧光强度升高45％。Nef组与正常对照组相比，肺组织SDC-1荧光强度未见明显改变。
如图2B和2D所示，小鼠肺组织毛细血管内皮细胞有HS的表达，与正常对照组相比，LPS组肺组织HS的免疫荧光强度降低45.6％。与LPS组相比，Nef+LPS组肺组织HS荧光强度升高50.1％。Nef组与正常对照组相比，肺组织HS荧光强度未见明显改变。
实验结果说明甲基莲心碱可以通过减少LPS诱导的ARDS小鼠多糖包被SDC-1及 HS的降解来保护多糖包被的完整性。
实施例3：甲基莲心碱对肺组织中ROS含量的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于肺组织中ROS含量的影响，本实施例中使用LPS诱导的ARDS小鼠损伤模型。
材料和方法同实施例1。
各组实验小鼠分别取6只于LPS注射6小时(h)后处死，于4℃条件下取小鼠肺组织，称量60mg左右的小鼠肺组织，按1:5加入组织裂解液，经超声匀浆后，13800g/20 分钟(min)离心，20分钟(min)后，取200μL上清加入96孔板中，每孔加入10μL 2， 7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，37℃孵育30分钟(min)。在活性氧存在的条件下，DCFH-DA可被氧化生成氧化型二氯荧光素(DCF)。通过荧光酶标仪在激发波长 485nm，发射波长530nm进行组织检测DCF荧光，从而测定ROS水平。
如图3所示：与正常对照组相比，LPS组肺组织内ROS水平明显增高，荧光强度增加124.8％。与LPS组比Nef+LPS组肺组织ROS水平降低，荧光强度降低25.3％。 Nef组与正常对照组相比，ROS荧光强度未见明显改变。
实验结果说明甲基莲心碱可以降低LPS诱导的ARDS小鼠肺组织内ROS水平。
实施例4：甲基莲心碱对肺组织中T-AOC、SOD及MDA含量的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于肺组织中T-AOC、SOD及MDA含量的影响，本实施例中使用LPS诱导的ARDS小鼠损伤模型。
材料和方法同实施例1。
如图4所示：与正常对照组相比，LPS组小鼠肺组织T-AOC降低45.1％(图4A) (#p<0.05)、SOD含量降低45％(图4B)(#p<0.05)，而MDA(图4C)含量则有明显的升高66.6％(#p<0.05)。而与LPS组相比，Nef+LPS组小鼠的肺组织T-AOC升高45％(图4A)(*p<0.05)、SOD含量升高33.4％(图4B)(*p<0.05)，而MDA 含量降低22.3％(图4C)(*p<0.05)。Nef组与正常组相比，小鼠肺组织中T-AOC、 SOD及MDA含量未见明显改变(图4)。
实验结果说明甲基莲心碱可以增强LPS诱导的小鼠抗氧化能力和降低氧化损伤。
实施例5：甲基莲心碱对细胞多糖包被SDC-1表达的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于细胞多糖包被SDC-1表达的影响，本实施例中使用LPS刺激的HUVECs细胞损伤模型。
1.材料
原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)能代表人血管内皮细胞最主要的特点和性质，且来源相对容易、获取细胞方便、对机体无影响，所以选用原代脐静脉内皮细胞(HUVECs) 作为血管内皮细胞体外模型。原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)和内皮细胞培养基购自 Allcell公司(产品号：HUVEC-001F)；DCFH-DA购自sigma公司(产品号：D6883)；总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、脂质氧化(MDA) 试剂盒购自碧云天生物技术公司(产品号：S0121,S0101,S0131)；Syndecan-1抗体购自Abcam公司(产品号：ab128936)；血栓调节蛋白购自R&D公司(产品号：AF3894)； HS抗体购自Swampscott公司(产品号：10E4020216)；山羊血清封闭液、兔血清封闭液购自索莱宝公司(产品号：ZLI-9022，ZLI-9026)；罗丹明标记山羊抗鼠二抗、罗丹明标记山羊抗兔二抗、FITC标记兔抗羊二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司(产品号：ZF-0313，ZF-0316，ZF-0314)。
2.细胞培养方法
HUVECs细胞在37℃、5％CO2、饱和湿度的条件下培养在含有10％胎牛血清的 DMEM培养基中。细胞融合至80％-90％后，用25％胰酶消化传代。将传代至3-8代且处于对数生长期的细胞培养在无血清的培养基24小时(h)后用于实验。MTT细胞毒性实验显示(图5A)：甲基莲心碱在0μM-20μM浓度之间，对细胞无毒性作用，不影响细胞存活率，超过20μM细胞存活率下降，且与甲基莲心碱的浓度成负相关性。细胞模型和动物模型用药浓度相差比较大，不容易统一。选处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，接种于24孔板或盖玻片上。
选处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，接种于盖破片上，在70％-80％融合时，在无血清培养基中培养24h。设正常对照组、LPS组、LPS+Nef低剂量组、LPS+Nef 中剂量组、LPS+Nef高剂量组。LPS+Nef低剂量组、LPS+Nef中剂量组及LPS+Nef高剂量组分别给予Nef(5μM、10μM、20μM)预处理1h，LPS组、LPS+Nef低剂量组、 LPS+Nef中剂量组及LPS+Nef高剂量组给予LPS(1μg/mL)刺激6小时(h)。6小时 (h)后，去除细胞培养液。各孔PBS冲洗5分钟(min)×3次，加入4％多聚甲醛固定 15分钟(min)，PBS冲洗5分钟(min)×3次，血清封闭，(37℃，60分钟(min))，滴加一抗，4℃过夜，PBS冲洗5分钟(min)×3次，滴加二抗，37℃避光孵育60分钟(min)，PBS冲洗5分钟(min)×3次，甘油封片，荧光显微镜观察拍照。
如图5B和5C所示，HUVECs表面有SDC-1的表达，与正常对照组相比，LPS组细胞SDC-1的免疫荧光强度降低70.7％。与LPS组相比，LPS+Nef低剂量组(Nef:5μM) 细胞SDC-1的荧光强度升高26.8％,LPS+Nef中剂量组(Nef:10μM)细胞SDC-1的荧光强度升高114.4％，LPS+Nef高剂量组(Nef:20μM)细胞SDC-1的荧光强度升高188.7％。
实验结果说明不同浓度(5μM、10μM、20μM)甲基莲心碱均可以通过减少LPS 刺激的HUVECs细胞多糖包被SDC-1的降解来保护多糖包被的完整性，且随浓度增加，保护作用增加。
实施例6：甲基莲心碱对细胞多糖包被HS表达的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于细胞多糖包被HS表达的影响，本实施例中使用LPS刺激的HUVECs细胞损伤模型。
材料和细胞培养方法同实施例5
如图6A和6B所示，HUVECs表面有HS的表达，与正常对照组相比，LPS组细胞 HS的免疫荧光强度降低55.3％。与LPS组相比，LPS+Nef低剂量组(Nef:5μM)细胞 HS的荧光强度升高23.4％,LPS+Nef中剂量组(Nef:10μM)细胞HS的荧光强度升高 50.5％，LPS+Nef高剂量组(Nef:20μM)细胞HS的荧光强度升高89.3％。
实验结果说明不同浓度(5μM、10μM、20μM)甲基莲心碱均可以通过减少LPS刺激的HUVECs细胞多糖包被HS的降解来保护多糖包被的完整性，且随浓度增加，保护作用增加。
实施例7：甲基莲心碱对ROS含量的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于ROS含量的影响，本实施例中使用LPS刺激的HUVECs细胞损伤模型。
材料和细胞培养方法同实施例5。
选处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，接种于盖破片上，在70％-80％融合时，在无血清培养基中培养24h。设正常对照组、LPS组、LPS+Nef低剂量组、LPS+Nef 中剂量组及LPS+Nef高剂量组。LPS+Nef低剂量组、LPS+Nef中剂量组及LPS+Nef高剂量组分别给予Nef(5μM，10μM，20μM)预处理1h，LPS组、LPS+Nef低剂量组、 LPS+Nef中剂量组及LPS+Nef高剂量组细胞给予LPS(1μg/mL)刺激6小时(h)。6 小时(h)后，去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA(10μM)。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL。37℃细胞培养箱内孵育20分钟(min)。用无血清细胞培养液洗涤细胞3 次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，置于荧光显微镜观察。
如图7所示，与正常对照组相比，LPS组细胞内ROS水平显著增高，荧光强度增加228.9％。与LPS组比LPS+Nef低剂量组(Nef:5μM)、LPS+Nef中剂量组(Nef:10μM) 及LPS+Nef高剂量组(Nef:20μM)细胞内ROS水平明显降低，荧光强度分别降低15.4％， 34.4％，54.8％。
实验结果说明不同浓度(5μM、10μM、20μM)甲基莲心碱均可以降低LPS刺激的HUVECs细胞ROS水平，且随浓度增加，抑制作用增加。
实施例8：甲基莲心碱对T-AOC、SOD及MDA含量的影响。
本实施例检测甲基莲心碱对于T-AOC、SOD及MDA含量的影响，本实施例中使用LPS刺激的小鼠HUVECs细胞损伤模型。
材料和细胞培养方法同实施例5。
选处于对数生长期的细胞，制成单个细胞悬液，接种于24孔板上，待细胞生长在70％-80％融合时，无血清培养基培养24小时(h)。设正常对照组、LPS组、Nef+LPS 组和Nef组。Nef+LPS组与Nef组的细胞给予Nef(10μM)预处理1小时(h)，LPS 组与Nef+LPS组的细胞给予LPS(1μg/mL)刺激。6小时(h)后，收集细胞，严格按照相应试剂盒说明书操作检测各实验细胞组T-AOC、SOD、MDA含量。
如图8所示，与正常对照组相比，LPS组细胞T-AOC降低37.3％(图8A)(#p<0.05)、SOD含量(图8B)降低49.7％(#p<0.05)，而MDA(图8C)含量升高133.1％(#p<0.05)。而与LPS组相比，Nef+LPS组细胞T-AOC升高28.8％(图8A)(#p<0.05)、SOD含量升高44.8％(图8B)(*p<0.05)，而MDA含量降低33.6％(图8C)(*p<0.05)。 Nef组与正常组相比，细胞中T-AOC、SOD及MDA含量未见明显改变(图8)。
实验结果说明甲基莲心碱可以增强HUVECs细胞的抗氧化能力，降低LPS刺激引起的氧化损伤。
本申请的上述结果说明甲基莲心碱通过降低ROS的产生、降低组织/细胞氧化损伤，对保护多糖包被的完整性发挥保护作用，进而抑制ARDS的发生和发展，预防或治疗ARDS。
以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。
Claims (5)
1.甲基莲心碱在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用，其中，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述肺外因素是LPS刺激。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述甲基莲心碱的给药浓度是5-20mg/kg。
5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述甲基莲心碱的给药浓度是20mg/kg。
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