CN108403708B - 秦皮苷在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了秦皮苷预防或治疗急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的应用。秦皮苷是从木犀科白蜡树，尖叶白蜡或宿柱白蜡的干燥树皮中提取的香豆素类化合物。已有研究表明其具有抗炎，降低血尿酸，抗菌，利尿的药理作用。在构建急性呼吸窘迫综合征的动物损伤模型的基础上，本发明通过HE、伊文思蓝（Evan blue ）染色、荧光探针、免疫荧光标记，蛋白质免疫印记等验证秦皮苷能够降低活性氧（ROS ）的产生与释放、抑制炎症因子的产生和释放，抑制信号通路MAPKs的激活，从而减少血管内皮多糖包被的降解，进而降低血管通透性，以致于预防或治疗ARDS。

Description

秦皮苷在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用

技术领域

本发明涉及秦皮苷的药物新用途，具体地涉及秦皮苷在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用。 秦皮苷通过抑制急性呼吸窘迫综合征中活性氧（ROS ）的产生与释放，降低氧化损伤；抑制炎症因子的产生和炎症关键调节信号通路的激活，缓解炎症反应；减少血管内皮细胞多糖包被损伤，抑制血管通透性增加和肺水肿；进而抑制ARDS的发生和发展，预防或治疗ARDS。

背景技术

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指由严重感染、创伤、误吸等多种非心源性的肺内外致病因素所导致，以肺毛细血管弥漫性损伤、通透性增加为基础，以肺水肿、透明膜形成和肺不张为主要病理变化的急性呼吸衰竭综合征。该综合征发病急，发展迅速，预后极差，死亡率高，是严重危害人类健康的临床常见急危重症之一。

因此，ARDS 发病发展机制和治疗方法的研究一直是呼吸和危重病医学界研究的热点和难点，深入开展其相关发病机制研究具有重要的临床意义。ARDS尚无特效治疗药物，临床主要以机械通气支持治疗为主，以用来改善 ARDS 患者呼吸窘迫症状和顽固性低氧血症。虽然其在 ARDS 的治疗中发挥了重要作用，但也存在着继发感染和呼吸机相关肺损伤的风险，因此开发ARDS 有效治疗药物一直是人们关注的热点和研究的难点。近年来研究表明，ARDS 的发病机制复杂，因此探寻有效治疗药物，对开辟预防或治疗ARDS 的新途径具有重要的理论指导意义。

秦皮苷是从木犀科白蜡树，尖叶白蜡或宿柱白蜡的干燥树皮中提取的香豆素类化合物。已有研究表明其具有抗炎，降低血尿酸，抗菌，利尿的药理作用。目前尚未有秦皮苷预防或治疗急性呼吸窘迫综合征方面的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的缺点，本发明的目的是提供通过秦皮苷来预防或治疗急性呼吸窘迫综合征。

根据本发明的一个方面，本发明提供了秦皮苷在制备预防或治疗 ARDS 的药物中的应用。

根据本发明的某些实施方式，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。

根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。

根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是 LPS 刺激。

根据本发明的某些实施方式，所述秦皮苷的给药浓度是 10-40mg/kg 。

根据本发明的某些实施方式，所述秦皮苷的给药浓度是 10或20或40mg/kg。

根据本发明的某些实施方式，所述的药物是以秦皮苷为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

根据本发明的某些实施方式，所述的制剂可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂。

术语

急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是指非心源性的各种肺内和肺外因素所导致的急性缺氧性的呼吸衰竭。其主要的病理特征为，炎症反应所致的肺泡上皮细胞及肺微血管内皮细胞损伤，肺毛细血管通透性增高，导致富含蛋白质的液体大量渗出到肺泡腔和肺间质，进而引起弥漫性肺水肿和透明膜形成；其主要的病理生理改变为肺容积减少、严重的通气/血流比例失调、肺内分流增加和肺顺应性降低；其临床表现呼吸窘迫、顽固性低氧血症、进行性的呼吸困难、呼吸衰竭。肺部影像学特点为：双肺渗出样改变。目前对于ARDS的治疗是综合治疗，以呼吸支持治疗为主，包括治疗控制感染、合理液体管理、营养支持及心电监护支持治疗，预防深静脉血栓形成等多项辅助治疗。

ARDS的发病因素包括直接因素（肺内因素）和间接因素（肺外因素）。直接因素主要有严重的肺炎（病毒性或细菌性）、胃内容物的吸入、吸入性肺损伤、肺挫伤等；间接因素主要有：脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒等。本专利从造模方式（脂多糖腹腔注射）上可以归类为肺外因素（间接因素）。

内毒素是导致ARDS的重要因素之一，LPS(Lipopolysaccharide)是内毒素主要成分。LPS(Lipopolysaccharide, LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞外膜成分，是病原菌主要的致病物质，进入机体后导致感染，引发ARDS，造成肺泡-毛细血管屏障损伤，毛细血管通透性增加、中性粒细胞浸润和氧自由基释放等病理生理学改变。本实验运用LPS腹腔注射诱导的小鼠ARDS模型。

内皮细胞多糖包被(Glycocalyx, GCX)为覆盖于血管内皮细胞表面，一层由糖蛋白和蛋白聚糖为主体相互交联形成带负电荷的被膜结构，是保护血管内皮细胞的第一道屏障。GCX骨架结构主要包括核心蛋白，核心蛋白主要有多配体聚糖（Syndecan, SDC）组成。内皮细胞表面的多糖包被作为重要的血管屏障，具有维持血管内皮细胞结构和功能、调节毛细血管通透性、抗凝血、抗炎症反应等作用。研究证明，感染性休克或手术后患者的血清中多糖包被标记物多配体聚糖1（SDC-1）,浓度明显升高。由肺毛细血管内皮细胞受损导致的血管通透性增加是ARDS的基本病理特点，因此，降低肺毛细血管多糖包被的降解或脱落成为治疗ARDS的关键。氧化损伤在多糖包被降解中发挥着重要的作用。肺是含氧量最多的器官，也是最易受内源性和外源性ROS损伤的器官。活性氧（ROS）的大量产生可以引起细胞的氧化应激反应。ROS可以直接降解多糖包被HS GAGs，此外完整的多糖包被可以结合抗氧化酶如黄嘌呤氧化酶、超氧化物歧化酶，以清除氧自由基。多糖包被完整性破坏后，ROS直接损伤内皮细胞，中性粒等炎症细胞粘附，大量炎症因子释放，导致内皮细胞功能障碍, 血管通透性增高，ARDS病情加剧。

秦皮苷是从木犀科白蜡树，尖叶白蜡或宿柱白蜡的干燥树皮中提取的香豆素类化合物。研究表明其具有抗炎镇痛，降低血尿酸，抗菌，利尿等的药理作用。

肺湿重/肺干重是指反映肺组织水肿的直接指标，也是反映肺组织损伤的敏感指标。主要测量方法为：动物麻醉处死后，用眼科解剖剪仔细游离出右肺下叶，置于天平中称肺湿重（W）标号，然后将标好的肺组织置于60 ℃专用烤箱中烘干48小时（h）至恒重，再次称重为肺干重（D）质量，肺组织的湿/干重比（wet/dry weight ratio，W/D）=肺湿重/干重。W/D比值升高，表明肺水含量增加，肺水肿程度加剧，肺血管通透性升高。

肺组织气血屏障通透性是指肺泡内的氧气与肺毛细血管内的进行气体交换的结构，其结构的完整性可以维持机体正常的通气/血流比例。当损伤因素导致气血屏障受损时，如肺泡及间质水肿，可导致通气/血流比例失调，临床表现为呼吸窘迫和顽固性的低氧血症。

肺水肿及肺血管通透性是指各种因素导致的肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞损伤，导致内皮细胞屏障功能障碍，引起肺血管通透性增高，富含蛋白质的液体渗出到肺泡和肺间质引起肺水肿。

活性氧（ROS）是指一类由氧衍生出来的、化学性质较基态氧活泼的含氧物质统称，包括氧自由基和一些非自由基的物质，其主要由线粒体产生。其过量积累可对细胞产生氧化损伤。

超氧化物歧化酶（SOD）是指机体内能有效清除过氧化物的抗氧化酶，其能催化超氧化物阴离子生成过氧化氢与氧气，其活性水平反映了机体清除氧自由基的能力。

丙二醛（MDA）是指生物体脂质过氧化产物中的一种，MDA的量反映了机体细胞细胞膜结构受氧自由基破坏程度。

脂质氧化是指机体受到损伤因素时，过量产生的活性氧作用于生物膜产生脂质过氧化损伤。

丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK )是哺乳动物细胞内广泛存在的蛋白激酶 ，是多种信息传递的共同通路。 M APK能将细胞外刺激信号转导至细胞核内，介导细胞产生反应的信号转导系统,研究表明 ，MAPK可以调节内皮的通透性，调节细胞凋亡和多种炎症因子的产生和活化，也可以活化NF-κB进而激活炎性因子的基因转录，参与ARDS的发生发展。

本申请所述药物组合物可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂。所述药物组合物可制成干粉形式，并且在给药前与无菌水或缓冲液混合以制成溶液形式。所述缓冲液的pH 通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。

本申请中术语“药盒”或“试剂盒”可互换使用。本申请公开了包含治疗有效量的所述治疗剂或药物组合物的药盒。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含一种或多种其他的治疗剂。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含使用说明书。

根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含用于相应给药方式的装置，例如但不限于针头。术语“给药”、“给予”或“施予”是指将一定剂量的化合物或药物组合物通过合适的给药方式给予对象。

所述“给药方式”包括但不限于口服给药、静脉内给药、呼吸道内给药、舌下给药、局部给药、肌肉内给药、眼内给药、透皮吸收、胃肠外给药、腹膜内给药、阴道给药、颊部给药、经直肠给药等本领域已知的任何给药方式。本领域技术人员应该了解对象的给药方式取决于多个因素，所述因素包括疾病的位置、对象的年龄、疾病的严重程度、以及药物组合物的成分等。

本申请所述化合物或药物组合物可以在任意时间给药。例如所述化合物或药物组合物可以在对象疾病发作前、发作时或者发作后给药，例如可以在疾病发作前或发作后的约1 小时、约2 小时、约4 小时、约5 小时、约8 小时、约12 小时、约24 小时、约2 天、约4天、约8 天、约16 天、约30 天或1 个月、约2 个月、约4 个月、约6个月给药。

本申请所述化合物或药物组合物可以一次给药，也可以多次给药。当多次给药时，可以以间隔任意时间的方式，例如后续剂量与前面剂量的间隔为约8 周、约4 周、约2周、约1 周、约5 天、约3 天、约2 天、约24 小时、约12 小时、约8 小时、约6 小时、约4 小时、约3小时、约2 小时、约1 小时、约30 分钟或更少时间。

方法和用途

根据本发明的一个方面，本发明公开使用秦皮苷来预防或治疗急性呼吸窘迫综合征的方法。

根据本发明的某些实施方式，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。

根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。

根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是LPS刺激。

根据本发明的某些实施方式，所述秦皮苷的给药浓度是 10-40mg/kg ，例如5-20mg/kg 、5-16mg/kg 、5-14mg/kg 、5-12mg/kg 、5-10mg/kg 、8-20mg/kg 、8-18mg/kg 、8-16mg/kg、8-14mg/kg、8-12mg/kg、10-20mg/kg、10-18mg/kg、10-16mg/kg、10-14mg/kg、13-20mg/kg、13-18mg/kg、13-16mg/kg、15-20mg/kg、15-18mg/kg、或 18-20mg/kg 。

根据本发明的某些实施方式，所述秦皮苷的给药浓度是 10 mg/kg、11 mg/kg、12mg/kg、 13 mg/kg、5mg/kg、20 mg/kg、22mg/kg、24 mg/kg、26mg/kg、28 mg/kg、30 mg/kg、32mg/kg、34 mg/kg、36 mg/kg、38 mg/kg、或40 mg/kg 。

根据本发明的一个方面，本发明公开秦皮苷在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用。

根据本发明的某些实施方式，所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。

根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。

根据本发明的某些实施方式，所述肺外因素是 LPS 刺激。

根据本发明的某些实施方式，所述秦皮苷的给药浓度是 10-40mg/kg ，例如

5-20mg/kg 、5-16mg/kg 、5-14mg/kg 、5-12mg/kg 、5-10mg/kg 、8-20mg/kg 、8-18mg/kg 、8-16mg/kg、8-14mg/kg、8-12mg/kg、10-20mg/kg、10-18mg/kg、10-16mg/kg、10-14mg/kg、13-20mg/kg、13-18mg/kg、13-16mg/kg、15-20mg/kg、15-18mg/kg、或 18-20mg/kg 。

据本发明的某些实施方式，所述秦皮苷的给药浓度是 10 mg/kg、11 mg/kg、12mg/kg、 13 mg/kg、5mg/kg、20 mg/kg、22mg/kg、24 mg/kg、26mg/kg、28 mg/kg、30 mg/kg、32mg/kg、34 mg/kg、36 mg/kg、38 mg/kg、或40 mg/kg 。

除非另外定义，本文使用的所有专业术语或专有词汇具有本发明技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。

在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动±10%、±9%、±8%、±7%、±6%、±5%、±4%、±3%、±2%或±1%的范围内。

除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中（包括权利要求的上下文中）使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语（即“包括但不限于”）。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。

本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。

秦皮苷可抑制急性呼吸窘迫综合征中活性氧（ROS ）的产生与释放，降低氧化损伤；抑制炎症因子的产生和炎症关键调节信号通路的激活，缓解炎症反应；减少血管内皮细胞多糖包被损伤，抑制血管通透性增加和肺水肿；进而抑制ARDS的发生和发展，预防或治疗ARDS。

附图说明

图 1 显示了秦皮苷对 LPS（Lipopolysaccharide, 革兰氏阴性杆菌细胞外膜中含有的主要致病物质）诱导的 ARDS 小鼠肺组织病理改变的 HE 染色结果、肺水肿及肺血管通透性结果。（#p < 0.05 , 与正常对照组比较； *p < 0.05， 与 LPS 组比较； § p<0.05， 与 LPS+Fraxin (10mg/kg) 剂量组比较； &p < 0.05， 与 LPS + Fraxin (20 mg/kg) 剂量组比较，下面的图片相同。）

图 2 显示了秦皮苷对 LPS 诱导的 ARDS 小鼠肺泡灌洗液中炎症因子IL-6,IL-1β,TNF-α表达的结果。

图3 显示了秦皮苷对LPS 诱导的ARDS 小鼠肺组织中氧化损伤指标活性氧（ROS）,超氧化物歧化酶(SOD), 丙二醛(MDA) 含量的改变的结果；

图4显示了秦皮苷对 LPS 诱导的 ARDS 小鼠多糖包被 SDC-1 表达的结果

图5显示了秦皮苷对 LPS 诱导的 ARDS 小鼠MAPKs信号通路的激活的结果。

具体实施方式

本发明通过构建急性呼吸窘迫综合征的动物，通过HE 、伊文思蓝（Evan blue ）染色、荧光探针、免疫荧光标记，蛋白质免疫印记等验证秦皮苷能够降低活性氧（ROS ）的产生与释放、抑制炎症因子的产生和释放，抑制信号通路MAPKs的激活，从而减少血管内皮多糖包被的降解，进而降低血管通透性，以致于预防或治疗ARDS。

实施例 1：秦皮苷对于肺组织病理改变、肺水肿及肺血管通透性的影响。

本实施例检测秦皮苷对于肺组织病理改变、肺水肿及肺血管通透性的影响，本实施例中使用由肺外因素 LPS 诱导的 ARDS 小鼠损伤模型。

1.材料

C57BL/6 小鼠，雄性，体重 18-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司（产品号：SCXK(鲁)20140007 ），适应性喂养3 天（d ），给药期间自由饮水进食。

秦皮苷（Fraxin）纯度98%，购自成都曼思特生物科技有限公司（产品号： A0405 ）；脂多糖(LPS)、伊文思蓝（Evans blue ）购自sigma 公司（产品号：L2880 ，E2129 ）。

2. 方法

2.1 ARDS 小鼠动物模型建立与分组：

根据查阅文献及预实验结果筛选的优选的药物浓度是10，20，40mg/kg。把 C57BL/6 小鼠 60 只，随机分为 5 组，即正常对照组、LPS（20mg/kg）组、LPS+Fraxin 10mg/kg，LPS+Fraxin 20mg/kg ，LPS+Fraxin 40mg/kg 给药组。首先，对于LPS+Fraxin组的小鼠，灌胃Fraxin预处理 1 周。此期间正常对照组和 LPS 组的小鼠给予相同剂量的生理盐水。一周后，LPS 组、LPS+Fraxin 组的小鼠腹腔注射 20m/kg的 LPS ，正常对照组的小鼠给予等量的生理盐水。

2.2 病理学观察与相关实验检测：

各组实验小鼠分别取 8 只于 LPS 注射 6 小时（h ）后处死，取肺组织。取左肺，称肺湿重（W ），60°C 烘干 48 小时（h ），再次称重得肺干重（D ），测肺组织湿干重比W/D值（wet/dry weight ratio，W/D ）=肺湿重/肺干重。取右肺在 4%多聚甲醛溶液中固定，然后使用病理学方法 HE 染色。

剩余每组实验小鼠，进行肺组织气血屏障通透性检测，经尾静脉注射伊文思蓝（Evans blue ）染液，30 分钟（min ）后开胸取肺脏约0.1g，剪碎肺组织浸泡在甲酰胺溶液中，置于37℃ 温箱中温育 24 小时（h ）。待组织中的色素浸出后取出组织，12000g/分钟（min ）离心 10 分钟（min ）后取上清液，用分光光度计在波长 620nm 处进行比色，对照标准曲线计算出各组样本伊文思蓝的浓度。

3. 结果

如图1A,1E所示，正常对照组小鼠肺组织无明显改变。与正常小鼠肺组织结构相比， LPS 组小鼠的肺间质增宽，间质及肺泡腔有出血、水肿、渗出、大量炎性细胞浸润，肺损伤评分显著升高。与 LPS 组相比，LPS+Fraxin组小鼠的肺间质及肺泡出血、水肿，炎症渗出较 LPS 组减轻，并且随着秦皮苷药物浓度的增加肺损伤减轻越明显。

如图1B所示，与正常对照组相比，LPS 组小鼠的肺组织湿干重比（wet/dry weightratio，W/D=肺湿重/肺干重）W/D 增加（#p <0.05 ）；与LPS 组相比，LPS+Fraxin组小鼠的肺组织 W/D 降低，随着秦皮苷药物浓度的增加降低越明显 （*p <0.05）。

如图1C,1D所示，与正常对照组相比，LPS 组小鼠肺组织伊文思蓝含量升高 （ #p<0.05 ）；与 LPS 组相比，LPS+Fraxin组小鼠的肺组织伊文思蓝含量降低，随着秦皮苷药物浓度的增加降低越明显（*p <0.05）。

实验结果说明秦皮苷可以改善LPS 诱导的小鼠肺组织结构病理改变及损伤, 减轻小鼠肺水肿及血管通透性改变。

实施例 2：秦皮苷对肺泡灌洗液中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、 IL-6）含量的影响。

本实施例检秦皮苷对于肺泡灌洗液中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、 IL-6）含量的影响，本实施例中使用 LPS 诱导的 ARDS 小鼠损伤模型。

1.材料

C57BL/6 小鼠，雄性，体重 18-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司（产品号：SCXK(鲁)20140007 ），适应性喂养3 天（d ），给药期间自由饮水进食。

秦皮苷（Fraxin）纯度98%，购自成都曼思特生物科技有限公司（产品号： A0405 ）；脂多糖(LPS)、伊文思蓝（Evans blue ）购自sigma 公司（产品号：L2880 ，E2129 ）试剂盒肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒、白介素（IL-6）试剂盒、白介素（IL-1β）试剂盒，购自碧云天生物技术公司（品号： PT512， P1326 ，PI301）。

2.方法

2.1 ARDS 小鼠动物模型建立与分组：

根据查阅文献及预实验结果筛选的优选的药物浓度是10，20，40mg/kg。把 C57BL/6 小鼠 60 只，随机分为 5 组，即正常对照组、LPS（20mg/kg ）组、LPS+Fraxin 10 mg/kg，LPS+Fraxin 20 mg/kg ，LPS+Fraxin 40mg/kg 给药组。首先，对于LPS+Fraxin组的小鼠，灌胃Fraxin预处理 1 周。此期间正常对照组和 LPS 组的小鼠给予相同剂量的生理盐水。一周后，LPS 组、LPS+Fraxin 组的小鼠腹腔注射 20m/kg的 LPS ，正常对照组的小鼠给予等量的生理盐水。

2.2肺泡灌洗液中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、 IL-6）含量检测。

将各组实验小鼠分别取 6 只麻醉好后气管切开插入导管，用磷酸盐缓冲液（PBS）进行支气管肺泡的灌洗，每次0.5 mL，重复 3 次，将回收的肺泡灌洗液使用离心机离心（4°C, 3000 rpm,20 min）后，回收上清液。按照ELISA 试剂盒的检测步骤检测各组肺泡灌洗液中炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、IL-6）的含量。

3.结果

如图2A,2B,2C所示：与正常对照组相比，LPS 组肺泡灌洗液内 TNF-α, IL-1β，IL-6含量明显增高（ #p<0.05 ）。与 LPS 组比，LPS+Fraxin组肺泡灌洗液内 TNF-α, IL-1β， IL-6含量明显降低，并随着秦皮苷作用浓度的增加，其含量降低越明显（*p <0.05）。

实验结果说明秦皮苷可以降低LPS 诱导的小鼠肺泡灌洗液中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL-1β、 IL-6）的含量。

实施例 3：秦皮苷对肺组织中氧化损伤指标活性氧（ROS）, 超氧化物歧化酶(SOD), 丙二醛(MDA) 含量的影响。

本实施例检秦皮苷对于肺组织中活性氧（ROS）, 超氧化物歧化酶(SOD), 丙二醛(MDA)含量的影响，本实施例中使用 LPS 诱导的 ARDS 小鼠损伤模型。

1.材料

C57BL/6 小鼠，雄性，体重 18-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司（产品号：SCXK(鲁)20140007 ），适应性喂养3 天（d ），给药期间自由饮水进食。

秦皮苷（Fraxin）纯度98%，购自成都曼思特生物科技有限公司（产品号： A0405 ）；脂多糖(LPS)、伊文思蓝（Evans blue ）、2′,7′-dichlorofluorescein diacetate均购于美国Sigma公司购自sigma 公司（产品号：L2880 ，E2129 ）超氧化物歧化酶（SOD ）试剂盒、脂质氧化（MDA ）试剂盒均购自碧云天生物技术公司（品号： S0101, S0131）。

2.方法

2.1 ARDS 小鼠动物模型建立与分组：

根据查阅文献及预实验结果筛选的优选的药物浓度是10，20，40mg/kg。把 C57BL/6 小鼠 60 只，随机分为 5 组，即正常对照组、LPS（20mg/kg ）组、LPS+Fraxin10 mg/kg，LPS+Fraxin20 mg/kg ，LPS+Fraxin40mg/kg 给药组。首先，对于LPS+Fraxin组的小鼠，灌胃Fraxin预处理 1 周。此期间正常对照组和 LPS 组的小鼠给予相同剂量的生理盐水。一周后，LPS 组、LPS+Fraxin 组的小鼠腹腔注射 20m/kg的 LPS ，正常对照组的小鼠给予等量的生理盐水。

2.2肺组织中氧化损伤指标活性氧（ROS）, 超氧化物歧化酶(SOD), 丙二醛(MDA)含量的实验检测。

各组实验小鼠分别取 6 只于 LPS 注射 6 小时（h ）后处死，于4℃ 条件下取小鼠肺组织，称量 60mg 左右的小鼠肺组织，按 1:5 加入组织裂解液，经超声匀浆后，13800g/20分钟（min ）离心，20 分钟（min ）后，取200μL 上清加入 96 孔板中，每孔加入10μL 2 ， 7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)，37℃孵育 30 分钟（min ）。在活性氧存在的条件下，DCFH-DA可被氧化生成氧化型二氯荧光素(DCF) 。通过荧光酶标仪在激发波长485nm ，发射波长 530nm 进行组织检测 DCF 荧光，从而测定 ROS 水平。肺组织中超氧化物歧化酶(SOD), 丙二醛(MDA) 含量的检测严格按照碧云天酶联免疫试剂盒说明书步骤检测。

如图3A ,3B,3C所示：与正常对照组相比，LPS 组肺组织内 ROS ,SOD,MDA含量明显增高（ #p<0.05 ）。与 LPS 组比LPS+Fraxin组肺组织 ROS ,SOD,MDA 含量降低，并随着秦皮苷作用浓度的增加，其含量降低越明显（*p <0.05）。

实验结果说明秦皮苷可以降低 LPS 诱导的 ARDS小鼠肺组织内 ROS ,SOD,MDA的含量水平，说明秦皮苷可以降低 LPS 诱导的氧化损伤。

实施例 4：秦皮苷对肺多糖包被 SDC-1表达的影响。

本实施例检测秦皮苷对于肺多糖包被 SDC-1表达的影响，本实施例中使用由肺外因素 LPS 诱导的 ARDS 小鼠损伤模型。

1.材料

C57BL/6 小鼠，雄性，体重 18g-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司（产品号：SCXK(鲁)20140007 ），适应性喂养3 天（d ），给药期间自由饮水进食。

秦皮苷（Fraxin）纯度98%，购自成都曼思特生物科技有限公司（产品号：A0405 ）；脂多糖(LPS); Syndecan-1 抗体购自 Abcam 公司（产品号：ab128936 ）；山羊血清封闭液、兔血清封闭液购自索莱宝公司（产品号：ZLI-9022 ，ZLI-9026 ）；罗丹明标记山羊抗鼠二抗、罗丹明标记山羊抗兔二抗、FITC 标记兔抗羊二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司（产品号：ZF-0313 ，ZF-0316 ，ZF-0314 ）。

2.组织免疫荧光及相关实验检测：

各组实验小鼠分别取 6 只于 LPS 注射 6 小时（h ）后，按5mL/kg 给予腹腔注射4% 水合氯醛，待小鼠进入麻醉状态后（无疼痛反应等），将小鼠四肢外展固定于取材板上（麻绳固定），用预热好的生理盐水经左心室灌注，直至无血性液体流出，继而用4% 多聚甲醛固定液灌注，待小鼠出现四肢抽出现象，在等待一段时间即可。用镊子轻轻固定剪取肺组织，将肺组织剪成 0.5×1×1cm3大小，放入多聚甲醛固定液中，在 4 °C 条 件下固定 48小时（h ）。待 48 小时（h ）后，将固定好的肺组织进行梯度酒精脱水、石蜡包埋。石蜡切片经脱蜡、水化后，将切片放入盛有柠檬酸的染色盒内，置于微波炉中以百分之百火力加热五分钟至沸腾，后以百分之四十火力继续加热十五分钟，以进行抗原修复，取出染色盒，静置至室温。然后用 PBS 冲洗 5 分钟（min ）×3 次，将载玻片置于湿盒内，分别于各组织上滴加动物非免疫血清工作液封闭，室温孵育 60 分钟（分钟（min ））。60 分钟（min ）后，分别滴加抗 SDC-1一抗 50μL 4 °C 过夜，PBS 冲洗 15 分钟（min ）×3 次，滴加相应的荧光标记的二抗，37 °C 避光孵育 2 小时，PBS 冲洗 15 分钟（min ）×3 次，除去 PBS 冲洗 15分钟（min ）×3 次，甩干后用动物非免疫血清封闭 60 分钟。60 分钟后， 每张切片滴加50μL蛋白抗体，4 °C 过夜，PBS 冲洗 15 分钟（min ）×3 次。除 去 PBS 液，每张切片滴加100μL DAPI 染核溶液，37 °C 避光孵育 15 分钟（min ），PBS 冲洗 10 分钟（min ）×3次，除去 PBS 液，切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察拍照。

3.结果

如图4A,4B,4C所示，小鼠肺组织毛细血管内皮细胞有 SDC-1 的表达，与正常对照组相比，LPS 组肺组织 SDC-1 的免疫荧光强度降低,血液中脱落的SDC-1含量增加。与 LPS组相比，LPS+Fraxin组肺组织 SDC-1 荧光强度升高 ，血液中脱落的SDC-1含量降低，并随着秦皮苷作用浓度的增加肺组织 SDC-1 荧光强度升高更明显，血液中脱落的SDC-1降低更明显。

实验结果说明秦皮苷可以通过减少 LPS 诱导的 ARDS 小鼠多糖包被 SDC-1 的降解来保护多糖包被的完整性。

实施例 5：秦皮苷对 LPS 诱导的 ARDS 小鼠MAPKs信号通路的影响。

本实施例检测秦皮苷对肺组织MAPKs信号通路的影响，本实施例中使用由肺外因素 LPS 诱导的 ARDS 小鼠损伤模型。

1.材料

C57BL/6 小鼠，雄性，体重 18g-20g，清洁级，购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司（产品号：SCXK(鲁)20140007 ），适应性喂养3 天（d ），给药期间自由饮水进食。

秦皮苷（Fraxin）纯度98%，购自成都曼思特生物科技有限公司（产品号：A0405 ）；脂多糖(LPS) ；山羊血清封闭液、兔血清封闭液购自索莱宝公司（产品号：ZLI-9022 ，ZLI-9026 ）；罗丹明标记山羊抗鼠二抗、罗丹明标记山羊抗兔二抗、FITC 标记兔抗羊二抗购自北京中杉金桥生物科技有限公司（产品号：ZF-0313 ，ZF-0316 ，ZF-0314 ）。兔单克隆抗体p38、 ERK 、JNK 、p-ERK 、p-JNK 、p-p38均购买于Abcam公司（产品号：ab170099，ab184699，ab112501， ab201015，ab4821，ab47363，ab25539）。

2.组织蛋白质印迹法（Western Blot）及相关实验检测：

称取肺组织约 60-80 g，剪碎，加入由RIPA组织裂解液和PMSF按100：1比例配制成的裂解液，超声匀浆后，离心收集含肺组织总蛋白的上清液并使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，计算上样量。配制 10％分离胶及 5％浓缩胶，加样，SDS-PAGE电泳80V 30min，100V 1h分离出样品后,200mA 90min转移至PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭至少2h，封闭后加入一抗ERK, JNK, p38，p-ERK, p-JNK, p-p38，NF-κB/P65, IkB-α，p-IkB-α, beta-Actin,Lamin B1（抗体稀释），4℃过夜 。次日将过夜的一抗37℃恒温箱静置30min，TBST洗膜3次/10min后，加入辣根酶标记的山羊抗兔IgG室温摇床上孵育1 h，20转/分钟，再一次TBST洗膜后，用ECL试剂显色发光曝光，用 Image软件对蛋白条带进行灰度值析。

3.结果

如图5所示正常组的p-ERK、p-JNK，p-p38表达量均很低， LPS刺激后各种激酶均被明显激活，p- ERK、p-JNK，p-p38的的表达量显著增加，秦皮苷处理后则明显的抑制了p-ERK、p-JN K，p-p38的表达并且其抑制效果随着秦皮苷药物浓度的增加而增加。

实验结果说明秦皮苷可以抑制LPS诱导ARDS小鼠MAPK信号通路的激活。

本申请的上述结果说明秦皮苷通过能够降低活性氧（ROS ）的产生与释放、抑制炎症因子的产生和释放，抑制信号通路MAPKs的激活，从而减少血管内皮多糖包被的降解，进而降低血管通透性，以致于预防或治疗ARDS。

以上结合附图示例性地说明了本申请的各实施例。本领域技术人员根据本说明书公开的内容可以很容易地想到，可以根据实际需要对各实施例进行适当调整和重新组合，而不会脱离本申请的精神。本申请的保护范围以本申请的权利要求书为准。

Claims (8)

1.秦皮苷在制备预防或治疗急性呼吸窘迫综合征药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述急性呼吸窘迫综合征是由肺外因素产生。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肺外因素是脓毒症、大面积烧伤、重症急性胰腺炎、药物中毒。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肺外因素是LPS刺激。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述秦皮苷的给药浓度是10-40mg/kg。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述秦皮苷的给药浓度是10或20或40mg/kg。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的药物是以秦皮苷为活性成分，加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的制剂可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂。