CN114601865A - 桑提取物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用 - Google Patents

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CN114601865A CN202210338779.2A CN202210338779A CN114601865A CN 114601865 A CN114601865 A CN 114601865A CN 202210338779 A CN202210338779 A CN 202210338779A CN 114601865 A CN114601865 A CN 114601865A
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Abstract

本发明公开了桑提取物的应用。该应用是桑提取物在制备治疗和/或预防溃疡性结肠炎产品中的应用。本发明通过实验证实，阳性药物组、SZ‑A‑1、SZ‑A‑2、SZ‑A‑3、SZ‑A‑4和SZ‑A‑5(pretreatment)均能显著抑制UC模型小鼠结肠萎缩，SZ‑A‑2、SZ‑A‑3和SZ‑A‑4组的效果与阳性药组相当，SZ‑A‑5(pretreatment)较阳性药抑制结肠萎缩的效果更好。本发明的桑提取物作为来源于天然植物的成分具有毒副作用小、作用温和持久的独特优势。因此用药安全性大大提升的桑提取物在溃疡性结肠炎方面具有巨大优势。

Description

桑提取物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及桑提取物在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是指各种原因引起的结肠炎症性病变的自身免疫性疾病，主要包括克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)，我国近20年来其确诊人数呈快速上升趋势，至今为止其发病机制尚不完全清楚，影响因素众多，如：环境因素，免疫反应因素，遗传因素，微生物因素等。炎症性肠病(IBD)不同于一般的肠道炎症(如CN113143996A中的)。具有抗炎活性的药物或活性成分，往往可用于治疗肠道炎症，但对炎症性肠病(IBD)却束手无策。虽然关于炎症性肠病的治疗已经取得了很多进展，但其仍是不治之症，全球范围内仍没有特效药物。
CN113143996 A中公开的糖尿病小鼠经过高脂喂养后出现全身肠道的慢性低度炎症，溃疡性结肠炎的炎症只局限于大肠(中华医学会消化病学分会炎症性肠病学组.炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2018年，北京)[J].中华消化杂志,2018,38(5):292-311.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1432.2018.05.002)。溃疡性结肠炎与慢性低度炎症不同的是还会出现如下症状：1.便血、肛周脓肿；2.全身症状如体重下降、发热、乏力、贫血等；3.肠外表现如关节、皮肤、粘膜、眼部病变等；严重者可出现肠穿孔、肠梗阻、大出血等，甚至癌变。此外，溃疡性结肠炎病程迁延，反复发作，目前仍无法治愈。
临床上，主要采用氨基水杨酸制剂进行治疗，用于轻度UC的治疗，足量氨基水杨酸制剂治疗后(一般2～4周)症状控制不佳者，尤其是病变较广泛者，可采用糖皮质激素治疗。对于激素无效或依赖者则采用免疫抑制剂硫嘌呤类药物。若以上治疗方式仍不能缓解，则对其施用anti-TNFα抑制剂。
而且目前的IBD药物还伴随着严重的副作用，包括丧失免疫耐受性和耐药性、感染并发症、内分泌损伤、肾脏肝脏损伤。目前IBD的治疗方案疗效低，不良反应升高是临床治疗主要关注的问题。
因此研发一种安全有效的治疗IBD的药物已成为亟需解决的重大科学问题。
发明内容
本发明的目的是提供桑提取物或其主要活性成分的药物新用途。
本发明所提供的桑提取物或其主要活性成分的新用途为如下(a1)-(a4)中任一所述：
(a1)桑提取物在制备治疗溃疡性结肠炎产品中的应用；
(a2)桑提取物在制备预防溃疡性结肠炎产品中的应用；
(a3)桑提取物在治疗溃疡性结肠炎中的应用；
(a4)桑提取物在预防溃疡性结肠炎中的应用。
所述预防和/或治疗溃疡性结肠炎病体现在下述至少一方面：
1)抑制溃疡性结肠炎患者结肠萎缩；
2)抑制溃疡性结肠炎患者体重下降；
3)降低溃疡性结肠炎患者疾病活动指数DAI；
4)改善溃疡性结肠炎患者结肠结构、腺体排列及炎性细胞浸润。
本发明还保护桑提取物或其主要活性成分的应用，为如下(b1)-(b8)中的至少一种：
(b1)制备抑制溃疡性结肠炎患者结肠萎缩的产品；
(b2)制备抑制溃疡性结肠炎患者体重下降的产品；
(b3)制备降低溃疡性结肠炎患者疾病活动指数DAI的产品；
(b4)制备改善溃疡性结肠炎患者结肠结构、腺体排列及炎性细胞浸润的产品；
(b5)抑制溃疡性结肠炎患者结肠萎缩；
(b6)抑制溃疡性结肠炎患者体重下降；
(b7)降低溃疡性结肠炎患者疾病活动指数DAI；
(b8)改善溃疡性结肠炎患者结肠结构、腺体排列及炎性细胞浸润。
所述产品为药物或药物制剂。
所述桑提取物为桑枝提取物、桑白皮提取物和/或桑叶提取物。或，所述桑提取物也可以采用市售的桑枝总生物碱片(国药准字Z20200002)的形式提供。
桑提取物可参照CN 113143997 A中记载的方法进行制备，具体制备方法包括以下步骤：
1)制备桑科植物粗提液；
2)将所述粗提液经阳离子树脂和/或任选的阴离子树脂分离，得到所述桑提取物。
所述方法还可包括下述步骤：
3)对步骤2)的树脂流出液进行醇沉处理，收集上清液；
4)对所述上清液进行浓缩干燥处理。
所述方法还可包括下述步骤：将步骤2)的树脂流出液进行浓缩干燥处理。
所述桑提取物作用于人或哺乳动物。
所述桑科植物可选自广东桑、鲁桑、白桑、细齿桑、山桑或杂交桑，所述杂交桑优选为粤桑11号、桂桑优62号或桑特优2号。可以使用所述植物的叶、根、枝、皮、芽、茎、果实等各部位。
在本发明的一种实施方式中，所述桑提取物主要包括生物碱，还包括多糖、黄酮和氨基酸。
优选地，所述生物碱包含1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin或DNJ)、N-甲基-1-脱氧野尻霉素(N-methly-1-deoxynojirimycin)、荞麦碱(fagomine或FAG)、3-表荞麦碱(3-epi-fagomine)、1,4-双脱氧-1,4-亚氨基-D-核糖醇(1,4-dideoxy-1，4-imino-D-arabinitol或DAB)、打碗花精B2(calysteginB2)、打碗花精C1(calysteginC1)、2-氧-(α-D-半乳吡喃糖基)-1-脱氧野尻霉素(2-O-(α-D-galactopyranosyl)-1-deoxynojirimycin)、6-氧-(β-D-吡喃葡萄糖)-1-脱氧野尻霉素(6-O-(β-D-glucopyranosyl)-1-deoxynojirimycin)、1，4-双脱氧-1，4-亚胺-(2-氧-β-D-吡喃葡萄糖)-D-阿拉伯糖醇(1,4-dideoxy-1,4-imino-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-D-arabinitol)中的至少一种。
其中，DNJ的重量百分比不低于总生物碱的50％。
基于所述桑提取物，各组分重量含量为：
Figure BDA0003577806720000031
优选的，桑提取物，各组分重量含量为：
Figure BDA0003577806720000032
在一种实施方式中，所述桑提取物的制备包括以下步骤：制备粗提液；任选地，经阳离子树脂和/或阴离子树脂分离；任选地，对树脂流出液进行醇沉处理；以及任选地，浓缩干燥处理。优选地，所述桑提取物的制备包括以下步骤：步骤1)：制备粗提液；步骤2)：经阳离子树脂和/或任选的阴离子树脂分离；任选的步骤3)：对步骤2)的树脂流出液进行醇沉处理；任选的步骤4)浓缩干燥处理。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液浓缩上阴离子交换树脂，收集不吸附的部分，加入乙醇，沉淀去除杂质，离心，清液减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液浓缩上阴离子交换树脂，收集不吸附的部分，减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水和/或醇溶液或酸水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍，重复提取1-3次，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
在一种实施方式中，所述桑提取物按照以下步骤制备：将桑枝、桑叶或桑白皮粉碎，用水加热回流提取，溶剂量为原药材的3-20倍(优选为4-15倍，更优选4-12倍)，重复提取1-3次(提取时间优选为每次0.5-3h，更有选为每次1-2h)，合并提取液，浓缩，上阳离子交换树脂，蒸馏水洗尽不吸附的杂质，用0.2-3N氨水洗脱，洗脱液上阴离子交换树脂，收集不吸附的部分(即阴离子树脂流出液)，加入乙醇，沉淀去除杂质，离心，清液减压浓缩或喷雾干燥或冷冻干燥，得提取物。
优选地，在阳离子树脂装柱后，按照酸性溶液洗、碱性溶液洗、酸性溶液洗的顺序进行活化。优选地，碱性溶液洗至洗出液pH为8.0-9.5，优选为8.5-9.5；优选地，所述碱性溶液选自氨水溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或碳酸钠溶液；优选地，所述碱性溶液的浓度为0.5-4mol/L。优选地，酸性溶液洗至洗出液pH为3.0-7.0，优选为4.5-6.5。优选地，所述酸性溶液选自盐酸溶液(浓度可为1.5-2mol/L)、磷酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。任选地，所述阳离子树脂经最后一次酸性溶液洗后还可以使用3-5倍柱体积的去离子水冲洗。
优选地，所述阳离子树脂为732型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、734型强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂、D001型大孔强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂或D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂。
优选地，所述阳离子树脂的用量与植物原材料投料重量比为1:2-20(更优选的所述阳离子树脂的用量与植物原材料投料重量比为1：2-7)。上样植物粗提液至阳离子树脂后，用洗脱剂对上样后的阳离子树脂进行洗脱，优选地，所述洗脱剂的浓度为0.5-2.5mol/L。优选地，洗脱剂流速为5-10BV/h，更优选为5-6BV/h。检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，将收集液直接过阴离子柱纯化。
优选地，在阴离子树脂装柱后，按照碱性溶液洗、酸性溶液洗、碱性溶液洗的顺序进行活化。优选地，碱性溶液洗至洗出液pH为8.0-9.5，优选为8.5-9.5；优选地，所述碱性溶液选自氨水溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液或碳酸钠溶液；优选地，所述碱性溶液的浓度为0.5-4mol/L。优选地，酸性溶液洗至洗出液pH为3.0-7.0，优选为3.5-4.5。优选地，所述酸性溶液选自盐酸溶液(浓度可为1.5-2mol/L)、磷酸溶液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
优选地，所述阴离子树脂为717型强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂，D201型大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂或D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子交换树脂。优选地，所述阴离子树脂的用量与植物原材料投料重量比为1:1-32(更优选的所述阴离子树脂的用量与植物原材料投料重量比为1：5-16)。当液体流出阴离子树脂时开始收集(优选收集pH大于8的流出液)。优选地，当收集液的体积达到植物原材料投料重量的0.1-5倍时，停止收集。
优选地，醇沉处理所用的乙醇与植物原材料投料重量比为1:20-300(更优选为1：20-50)。醇沉处理中，搅拌速度为40-500rpm。醇沉处理的时间为12-24h。
进一步的，所述醇沉处理前，还包括将阴离子树脂流出液进行离心除杂或微滤膜过滤除杂，再进行反离子渗透膜浓缩的步骤。浓缩后的液体比重可为1.1-1.25。
本发明所述的“动物”所指的动物种类不受特别限制，可以为任何具有肠道器官的动物，优选哺乳动物，更优选大鼠、小鼠和人，最优选人。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体。所述载体为符合用药途径或给药方式的对人体无毒害作用的非活性成分。所述载体可以是固体或液体辅料。固体辅料，例如，包括微晶纤维素、甘露醇、乳糖、预胶化淀粉，低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮，羧甲基淀粉钠、阿斯巴甜、磷酸氢钙、乳酸钠、泊洛沙姆、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钠、明胶、黄原胶、聚维酮、淀粉、硬脂酸镁、羧甲基淀粉钠和滑石粉；液体辅料，例如，包括水、乙醇、糖浆和甘油。
优选地，所述药物为口服给药剂型；进一步优选地，所述药物为片剂、胶囊剂、口服溶液剂、口服乳剂、丸剂、颗粒剂、糖浆剂和散剂。
本发明具有以下优点：
1、与目前临床主要应用药物严重的毒副作用相比，如：氨基水杨酸制剂可能会使患者出现过敏反应、黄疸、腹痛等；糖皮质激素毒副作用相较于氨基水杨酸制剂更大，本发明的桑提取物作为来源于天然植物的成分具有毒副作用小、作用温和持久、多通路多靶点的独特优势。因此用药安全性大大提升的桑提取物在治疗炎症性肠病方面具有巨大优势。
2、实验结果表明，特定的桑提取物能抑制UC模型小鼠结肠萎缩、抑制UC模型小鼠体重降低、降低UC模型小鼠疾病活动指数DAI，且经桑提取物治疗后小鼠结肠组织病理学得到明显的改善，结肠结构较为完整，腺体排列规则，炎性细胞浸润较轻。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为各处理组小鼠的结肠长度(采用制备例1中的桑提取物)，*表示与模型组相比p<0.05,**表示与模型组相比p<0.01，***表示与模型组相比p<0.001；
图2为各处理组小鼠的结肠图片(采用制备例1中的桑提取物)；
图3为各处理组小鼠的体重变化趋势图(采用制备例1中的桑提取物)；
图4为各处理组小鼠的疾病活动指数DAI评分结果(采用制备例1中的桑提取物)；***表示与模型组相比p<0.001；
图5为各制备例中的桑提取物处理后小鼠的疾病活动指数DAI评分结果；***表示与模型组相比p<0.001；
图6为各处理组小鼠病理图片结果(采用制备例1中的桑提取物)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进一步详细说明。通过这些示例性说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
在这里专业的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
本发明涉及的组分含量根据已公开的方法进行检测(参考公开号为CN111077247A和CN110393738A的专利中记载的方法)。
一、桑提取物的制备实例
制备例1
取新鲜桑枝(细齿桑粤桑11号)1000kg，粉碎后，加4000L水，用加热回流法提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液热浓缩至固形物质量百分含量达到4％，保温50℃作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂150kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到870L结束。
收集液进行离心除杂再进行反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.25，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨500rpm下加入无水乙醇25L。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。
所述桑枝提取物浸膏中，生物碱的含量为52％，多糖的含量为22％，黄酮的含量为0.8％，氨基酸的含量为20％。在生物碱中，1-DNJ的含量为60％，FAG为17％，DAB为15％。
制备例2
取新鲜桑枝(桑特优2号)10kg，粉碎后，加150L水，分2次加入，每次用煎煮法提取3h，合并提取液，过滤除去不溶物。提取液热浓缩至固形物质量百分含量达到8％，将其转移至醇沉罐，搅拌桨300rpm下加入2367.9g无水乙醇(3L)。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液作为阳离子树脂柱的上样液。使用002SC型强酸性苯乙烯系阳离子树脂5kg装柱，按照实施例1的方法对阳离子树脂进行活化。上样经浓缩醇沉处理的提取液，然后使用100L 5mol/L氯化钾洗脱，洗脱速度为5BV/h，用20％硅钨酸检测流出液，当有白色沉淀生成时开始收集，当收集液达到25L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用711型强碱性苯乙烯系阴离子树脂10kg装柱，按照制备例1的方法对阴离子树脂进行活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到15L结束。将收集液重新上样至阳离子树脂，按照上述方法依次用阳离子树脂和阴离子树脂再分离两次。
将经过三次柱分离后得到的收集液进行离心除杂再进行反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.25，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨1000rpm下加入无水乙醇125g。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。另外取新鲜桑白皮和桑叶(桑特优2号)进行提取，提取方法和参数与上述方法相同。
得到的桑枝提取物浸膏中，生物碱的含量为98％，多糖的含量为0.2％，黄酮的含量为0.05％，氨基酸的含量为0。在生物碱中，1-DNJ的含量为99％，FAG为0.5％，DAB为0.4％。
得到的桑白皮提取物中，生物碱的含量为95％，多糖的含量为2％，黄酮的含量为0.1％，氨基酸的含量为1％。在生物碱中，1-DNJ的含量为96％，FAG为1.5％，DAB为1.4％。
得到的桑叶提取物中，生物碱的含量为90％，多糖的含量为4％，黄酮的含量为0.1％，氨基酸的含量为3％。在生物碱中，1-DNJ的含量为91％，FAG为3.1％，DAB为2.8％。
制备例3
取新鲜桑枝(广东桑)1000kg，粉碎后，加11500L水，加热回流提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液先经离心除杂，再用反离子渗透膜浓缩至固形物质量百分含量达到1％，作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D001型大孔强酸性苯乙烯系阳离子树脂300kg装柱，按照制备例1的方法对阳离子树脂进行活化。上样经浓缩处理的粗提液，使用5000L 0.04mol/L硝酸铵洗脱，洗脱速度为5BV/h，用20％硅钨酸检测流出液，当有白色沉淀生成时开始收集，当收集液达到1000L时，停止收集。
将经过阳离子柱分离后得到的收集液进行纳滤膜浓缩，减压浓缩得提取物浸膏。
得到的桑枝提取物中，生物碱的含量为15％，多糖的含量为20％，黄酮的含量为7％，氨基酸的含量为45％。在生物碱中，1-DNJ的含量为55％，FAG为23％，DAB为10％。
制备例4
取干桑枝(粤桑11号)333kg，粉碎后，加4000L水，加热回流法分两次提取，每次回流1h，合并提取液，过滤，将提取液浓缩至1kg生药量/L。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂150kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂125kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集pH大于8的流出液至流出液达到870L结束。
将经过阴离子柱分离后得到的收集液进行微滤膜过滤除杂再用反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.1，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨400rpm下加入无水乙醇15kg。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。样品含量：生物碱的含量为80％，多糖的含量为5％，黄酮的含量为0.1％，氨基酸的含量为4％。在生物碱中，1-DNJ的含量为75％，FAG为12％，DAB为10％。
制备例5
取干桑枝(粤桑11号)400kg，粉碎后，加4000L水，加热回流法分两次提取，每次回流1h，合并提取液，过滤，将提取液浓缩至1kg生药量/L。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的提取浓缩液上样至阴离子树脂，收集流出液。
将经过阴离子柱分离后得到的收集液进行微滤膜过滤除杂再用反离子渗透膜浓缩，进一步减压浓缩干燥得桑枝提取物浸膏。样品含量：生物碱的含量为3％，多糖的含量为70％，黄酮的含量为10％，氨基酸的含量为10％。在生物碱中，1-DNJ的含量为68％，FAG为17％，DAB为8％。
制备例6
取新鲜桑枝(细齿桑粤桑11号)1500kg，粉碎后，加6000L水，用加热回流法提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液热浓缩至固形物质量百分含量达到4％，保温50℃作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂100kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到870L结束。将流出液减压浓缩得桑枝提取物浸膏，其中，生物碱的含量为30％，多糖的含量为35％，黄酮的含量为2％，氨基酸的含量为25％。在生物碱中，1-DNJ的含量为62％，FAG为20％，DAB为13％。
制备例7
取新鲜桑枝(细齿桑粤桑11号)1000kg，粉碎后，加4000L水，用加热回流法提取2h，合并提取液，过滤除去不溶物，得到粗提液。粗提液热浓缩至固形物质量百分含量达到4％，保温50℃作为阳离子树脂柱的上样液。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂100kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集流出液至流出液达到870L结束。将流出液减压浓缩得桑枝提取物浸膏，其中，生物碱的含量为40％，多糖的含量为25％，黄酮的含量为0.5％，氨基酸的含量为25％。在生物碱中，1-DNJ的含量为57％，FAG为24％，DAB为16％。
制备例8
取干桑枝(粤桑11号)333kg，粉碎后，加4000L水，加热回流法分两次提取，每次回流1h，合并提取液，过滤，将提取液浓缩至1kg生药量/L。
使用D113型大孔弱酸性苯丙烯系阳离子树脂150kg装柱，使用2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；使用1mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为8.5；2mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为4.5；再使用5倍柱体积的去离子水冲洗，完成活化。上样经浓缩处理的提取液，然后使用1000L 2.5mol/L氨水洗脱，洗脱速度为6BV/h，检测阳离子柱流出液的pH>7时收集洗脱液，当收集液达到900L时，停止收集，将收集液直接过阴离子柱纯化。
使用D218型大孔强碱性丙烯酸系阴离子树脂62.5kg装柱，使用1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；使用1.5mol/L的盐酸溶液洗至洗出液pH为3.5；1.5mol/L氢氧化钠溶液洗至洗出液pH为9.0；完成活化。将收集的阳离子树脂洗脱液上样至阴离子树脂，收集pH大于8的流出液至流出液达到870L结束。
将经过阴离子柱分离后得到的收集液进行微滤膜过滤除杂再用反离子渗透膜浓缩，浓缩后的液体比重为1.1，将其转移至醇沉罐内，搅拌桨400rpm下加入无水乙醇15kg。乙醇加入完毕后停止搅拌，醇沉24h，取上清液，减压浓缩得桑枝提取物浸膏。样品含量：生物碱的含量为63％，多糖的含量为23％，黄酮的含量为1％，氨基酸的含量为5％。在生物碱中，1-DNJ的含量为61.9％，FAG为16.6％，DAB为11.1％。
二、桑提取物的效果验证
实验例9：桑提取物预防和/或治疗炎症性肠病的药效学试验
一、实验方案
1.1实验动物
6-8周龄小鼠入驻动物房后进行适应性饲养3天，称重后，随机分为8组(计为0天)，每组5-6只。
实验分组分别为：1正常对照组、2模型组、3阳性对照组、4-8为不同给药剂量的SZ-A组。详见表1。
1.2实验药物
3％DSS配置方法：3g DSS(葡聚糖硫酸钠盐)溶解于100mL无菌水；
制备例1制备的桑枝提取物配制不同浓度，溶于1％CMC溶液；
阳性对照药：柳氮磺吡啶肠溶片(国药准字H31020557)。本品主要成份为：柳氮磺吡啶；其化学名为：5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸。
1.3造模与给药
分组完成当天，对第8组SZ-A-5(pretreatment)组小鼠口服灌胃给药桑枝提取物(给药剂量见下表)，每天给药1次。所有组别均正常饮食饮水。
第8组小鼠给药3天后，除正常对照组外，其余各组均开始自由饮用3％DSS(葡聚糖硫酸钠盐)进行造模和灌胃给药；其中，阳性对照组的给药剂量为：5-[对-(2-吡啶胺磺酰基)苯]偶氮水杨酸500mg/kg/d。造模开始5天后，停止3％DSS饮用，所有组更换为正常饮水，给药正常进行；继续给药观察10天，脱颈椎处死小鼠；解剖获取小鼠结肠，测量结肠长度并拍照。给药期间，检测各组小鼠体重。造模及给药期间每日监测小鼠大便性状及便血情况，根据下表2进行小鼠疾病活动指数DAI评分。结果见图1-3以及图4。
表1实验分组及给药剂量
Figure BDA0003577806720000121
表2小鼠疾病活动指数DAI评分标准
计分 体重下降(％) 粪便性状 便血
0 无 正常 隐血阴性
1 1-5 / /
2 6-10 半稀 隐血阳性
3 11-15 / /
4 16-20 稀便 肉眼便血
注：DAI＝体重下降分数+粪便性状分数+隐血分数；正常大便：成形大便；半稀大便：不粘附于肛门的糊状、半成形大便；稀便：可粘附于肛门的稀水样便。
取结肠组织，进行H&E染色，具体包括如下步骤：
1、组织样本，取材3mm厚，梯度酒精脱水70％、80％、95％、100％各30分钟，二甲苯两瓶各20分钟，石蜡浸蜡两缸各12分钟，包埋，切片4微米，烤片。
2、苏木素伊红(hematoxylin eosin，HE)染色：(1)脱蜡，三瓶二甲苯每瓶脱蜡8分钟；两瓶100％酒精每瓶8分钟；90％酒精、80％酒精、60％酒精各8分钟。(2)苏木素染色4分钟，流水清洗；(3)盐酸酒精分化2-3秒，流水清洗；(4)0.5％氨水20秒，流水清洗，上镜观察。(5)0.5％伊红染色1分钟；(6)80％酒精、90％酒精各分化3-5秒；95％酒精5分钟；三瓶100％酒精各5分钟；两瓶二甲苯各5分钟。(7)中性树脂胶封固；光镜观察并显微照相。取各组新鲜结肠组织放入4％多聚甲醛中固定，48小时以后，置于不同浓度的酒精中，梯度脱水，随后置于二甲苯中透明。将已透明的组织置于石蜡中进行包埋。包埋好的蜡块固定于切片机上，进行切片。
1.4各个制备例中的桑枝提取物的疾病活动指数DAI评分比较
参考上述1.1-1.3实验步骤，各个制备例中的桑枝提取物进行小鼠疾病活动指数DAI评分比较，药物为制备例1、3、4、6和8中的桑枝提取物，用药剂量按桑枝提取物计，均为200mg/kg/d。结果见图5。
1.5实验结果
从图1-2中可以看出，与正常对照组相比，模型组结肠长度显著下降；与模型组相比，阳性药物组、SZ-A-1、SZ-A-2、SZ-A-3、SZ-A-4和SZ-A-5(pretreatment)均显著抑制UC模型小鼠结肠萎缩，SZ-A-2、SZ-A-3和SZ-A-4组的效果与阳性药组相当，SZ-A-5(pretreatment)较阳性药的效果更好。
从图3中可以看出，与正常对照组相比，模型组小鼠体重显著下降；与模型组相比，阳性药物组、SZ-A-1、SZ-A-2、SZ-A-3、SZ-A-4和SZ-A-5(pretreatment)均能抑制UC模型小鼠体重降低，且效果相当。
从图4中可以看出，与模型组相比，阳性药物组、SZ-A-1、SZ-A-2、SZ-A-3、SZ-A-4和SZ-A-5(pretreatment)均能降低UC模型小鼠疾病活动指数DAI。
从图5中可以看出，制备例1(生物碱的含量为52％，多糖的含量为22％，黄酮的含量为0.8％，氨基酸的含量为20％)和制备例8(生物碱的含量为63％，多糖的含量为23％，黄酮的含量为1％，氨基酸的含量为5％)提供的特定的桑提取物能够降低UC模型小鼠疾病活动指数，而其他制备例中的桑提取物治疗效果不显著。
从图6可以看出，在光镜下观察UC模型小鼠组织切片，对照组小鼠结肠结构完整、清楚，腺体排列规则；而模型组中，连续饮用3％DSS的小鼠结肠组织存在结肠壁充血、水肿、黏膜层和黏膜下层出现严重的炎症细胞浸润，以及上皮细胞损伤脱落，杯状细胞缺失、隐窝肿胀破坏和较为严重的结肠溃疡情况；经桑提取物治疗后小鼠结肠组织病理学得到明显的改善，结肠结构较为完整，腺体排列规则，炎性细胞浸润较轻，且效果优于阳性对照组。说明桑提取物可以有效防治UC的发生，对炎症肠病有较好的防治效果。

Claims (8)

1.桑提取物或其主要活性成分的应用，为如下任一所述：
(a1)桑提取物在制备治疗溃疡性结肠炎产品中的应用；
(a2)桑提取物在制备预防溃疡性结肠炎产品中的应用；
(a3)桑提取物在治疗溃疡性结肠炎中的应用；
(a4)桑提取物在预防溃疡性结肠炎中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述预防和/或治疗溃疡性结肠炎体现在下述至少一方面：
1)抑制溃疡性结肠炎患者结肠萎缩；
2)抑制溃疡性结肠炎患者体重下降；
3)降低溃疡性结肠炎患者疾病活动指数DAI；
4)改善溃疡性结肠炎患者结肠结构、腺体排列及炎性细胞浸润。
3.桑提取物或其主要活性成分的应用，为如下任一所述：
(b1)制备抑制溃疡性结肠炎患者结肠萎缩的产品；
(b2)制备抑制溃疡性结肠炎患者体重下降的产品；
(b3)制备降低溃疡性结肠炎患者疾病活动指数DAI的产品；
(b4)制备改善溃疡性结肠炎患者结肠结构、腺体排列及炎性细胞浸润的产品；
(b5)抑制溃疡性结肠炎患者结肠萎缩；
(b6)抑制溃疡性结肠炎患者体重下降；
(b7)降低溃疡性结肠炎患者疾病活动指数DAI；
(b8)改善溃疡性结肠炎患者结肠结构、腺体排列及炎性细胞浸润。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述产品为药物或药物制剂；所述桑提取物为桑枝提取物、桑白皮提取物和/或桑叶提取物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的应用，其特征在于：
所述桑提取物的制备方法包括以下步骤：
1)制备桑科植物粗提液；
2)将所述粗提液经阳离子树脂和/或任选的阴离子树脂分离，得到所述桑提取物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述方法还包括下述步骤：
3)对步骤2)的树脂流出液进行醇沉处理，收集上清液；
4)对所述上清液进行浓缩干燥处理；
或，所述还包括下述步骤：将步骤2)的树脂流出液进行浓缩干燥处理。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的应用，其特征在于：所述桑提取物的主要活性成分包括：1-脱氧野尻霉素、N-甲基-1-脱氧野尻霉素、荞麦碱、3-表荞麦碱、1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-核糖醇、打碗花精B2、打碗花精C1、2-氧-(α-D-半乳吡喃糖基)-1-脱氧野尻霉素、6-氧-(β-D-吡喃葡萄糖)-1-脱氧野尻霉素、1，4-双脱氧-1，4-亚胺-(2-氧-β-D-吡喃葡萄糖)-D-阿拉伯糖醇中的至少一种。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其特征在于：所述桑提取物作用于人或哺乳动物。
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