KR101686777B1 - 감잎 추출물을 포함하는 혈액순환 장애 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 유자 추출물 또는 이의 분획물을 추가로 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 복합 추출물 또는 이들의 분획물은 매우 우수하게 혈장 응고 및 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가지며, in vivo에서도 혈장 및 간 조직의 지질을 감소시키므로, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감잎 추출물을 포함하는 혈액순환 장애 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Composition for prevention or treatment of blood circulation disorders or metabolic disorders comprising an Persimmon leaf extract}

본 발명은 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

최근 경제적 발전과 식습관 등의 변화에 따라 비만, 고지혈증, 고혈압, 동맥경화, 당뇨병 또는 간질환 등 다양한 질환을 포함하는 대사증후군 질환의 발병이 급증하고 있는 상황이다. 이와 같은 질환들은 각각 발생하기도 하지만 일반적으로는 서로 밀접한 관련을 맺고 있으면서 여러 증상들을 동반하여 발생되는 경우가 대부분이다.

비만은 지방간, 고혈압, 당뇨병, 심혈관계질환 등의 만성질환을 유발하는 것으로 널리 알려져 있으며, 최근 보건복지가족부의 2007년 국민건강ㆍ영양조사결과에 의하면 한국성인의 31.7%가 비만으로 나타났다. 또한, 전 세계인구의 약 25%에 해당하는 17억명이 현재 과체중(BMI> 25)이고, 미국, 유럽, 일본 등 주요 국가들의 1억2천명을 포함한 서구지역 3억명 이상이 비만환자(BMI> 30)로 분류되고 있다. 그러국내외에서 판매되는 비만치료제로는 미 FDA에서 승인을 받은 orlistat을 주원료로 하는 ‘제니칼’이 있는데, 리파아제작용을 억제하는 제니칼의 경우 지방변, 가스생성, 지용성비타민 흡수저하 등의 위장계 부작용이 있다.

고지혈증은 혈중 콜레스테롤과 같은 지질성분이 증가하면서 혈액의 흐름이 원활하지 않게 되고 동맥벽에 지질성분들이 부착되면서 만성적인 염증반응을 일으키게 되고 동맥내벽이 좁아지면서 혈관이 굳어지는 동맥경화가 유발되고 장기적으는 이로부터 생성된 혈전이 심장관상동맥이나 뇌혈관 등을 막아 심근경색, 뇌졸중이나 뇌경색 등을 일으키는 원인이 된다. 현재 고지혈증치료제는 간에서의 콜레스테롤의 합성과정에 중요한 역할을 하고 있는 에이치엠지코에이리덕테이즈(HMG-CoA reductase)를 억제활성을 갖고 있는 '스타틴' 계열의 약물들이 사용되고 있는데 장기간 사용할 경우 간독성이나 근육독성 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다.

고혈압은 동맥의 혈압이 만성적으로 높은 상태로서, 18세 이상의 성인에서 수축기 혈압이 140mmHg 이상이거나 확장기 혈압이 90mmHg이상인 경우를 말하며, 비만 등에 의해 발생하기도 한다. 현재 고혈압 치료제는 레닌 저해제 약물, 안지오텐신전환효소 활성 저해 약물, 안지오텐신과 안지오텐신 수용체간의 결합을 저해하는 약물들이 개발되어 있으나, 여전히 보다 효과적인 치료제의 개발의 필요성이 대두되고 있다.

동맥경화는 콜레스테롤, 인지질, 칼슘 등을 함유한 지방성 물질 (plaque)이 혈관 내막에 축적되어 동맥은 단단해져 탄력성을 잃고 좁아져서 혈액공급이 저해되거나 압력이 높아져 동맥이 파열, 박리 등이 일어나는 상태를 말한다. 현재 동맥경화 치료제로 HMG-CoA reductase 저해제인 다양한 스타틴 (statin)류 등이 개발되어 있으나, 여전히 보다 효과적인 치료제의 개발의 필요성이 대두되고 있다.

당뇨병은 인슐린이 부족하거나 인슐린에 대한 감수성이 떨어져 탄수화물대사에 이상이 생기는 질환으로서 두 가지 유형이 있다. I형은 전에는 연소 당뇨병이라 부르던 인슐린의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus/IDDM)으로, 인슐린 주사가 필요하다. 이는 췌장에서 인슐린이 분비되지 않기 때문으로 주사를 통해 인슐린을 공급해주어야 한다. II형은 성인형 당뇨병이라 일컬어지던 인슐린비의존성 당뇨병(non-insulin-dependent diabetes mellitus/NIDDM)으로, 식이요법으로 조절이 가능하다. 이것은 췌장의 인슐린 분비 기능이 떨어지거나 인슐린에 대한 조직의 거부반응에서 비롯되며, 베타세포가 인슐린을 분비하는 데 일어나는 미묘한 변화로 인해 더욱 악화된다. 한편, 종래 인슐린비의존성 당뇨병 즉, 타입 2(II형) 당뇨병을 치료하기 위한 물질로서는 PPAR-γ 활성제, GLP-1 유도체, DPP-IV 저해제, PTP1B 저해제 등이 주요 당뇨병 치료제들로서 개발되어 있으나 이러한 종래의 약제들은 각각의 기작에 기인한 부작용을 보이고 있다. 예를 들어, 간이나 신장, 근육 및 심장에 대한 독성과 함께 체중증가 증상 등이 대표적인 부작용이라 할 수 있다. 따라서, 부작용이 적고 체중증가 등을 유발하지 않으면서, 동시에 효과적으로 당뇨병을 치료 또는 예방할 수 있는 당뇨병 치료제에 대한 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

간은 영양소 대사의 중심 역할을 하는 장기로 정상적인 사람의 간은 약 1,500g의 무게를 가지며 간 기능의 이상이 초래되면 생체의 영양소 대사에 문제를 유발하여, 포도당을 글리코겐으로 만들거나 또는 단백질을 알부민으로 전환하거나 불필요한 것을 분해하여 쓸개즙으로 전달하는 등의 간의 기능에 이상이 생긴다. 정신적 휴식을 가질 경우 경미한 간 손상의 경우, 간세포는 다시 복구될 수 있지만, 바쁜 현대사회에서는 휴식을 취할 여유를 가질 수 없어서 간질환이 가중되기도 한다. 일반적으로 간에 염증이 생기는 간염이 간질환의 대부분을 차지하며, 양상에 따라 급성 간염과 만성 간염, 원인에 따라 바이러스성 간염, 알코올성 간염, 약물성 간염 등으로 나눌 수 있다. 이런 이상으로 유발되는 간질환에는 지방간, 간염, 간경변증, 간암 등이 있다. 운동이나 금주, 식이요법 등과 약물 치료 등을 병행해서 간질환을 치료하고는 있지만, 근본적으로 완전히 치유가 되기는 어렵기 때문에 효과적이고 개선된 간질환 치료제 또는 보호제의 개발이 계속적으로 필요하다.

아울러, 최근 경제발전에 따른 생활수준의 향상으로 인하여 위생환경이 개선되고 식생활의 향상으로 섭취열량 또한 급속한 증가가 이루어지고 있는 반면, 운동은 부족하고 소비되는 열량은 적어 체내에 과도한 영양분의 축적 등으로 인한 각종 성인병의 발생이 증가하고 있다. 이와 같은 성인병 중 특히 지방간은 과도한 지방이나 알코올 섭취, 간의 지방합성 증가, 중성지방 배출 및 연소 감소 등으로 인하여 간에 지방이 축적되어 발생하며, 일반적으로 간에서 축적된 지방의 비중이 5%이상일 때 지방간으로 정의된다.

지방간에서 축적된 지방의 대부분은 중성지방 (triglyceride)이며, 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 알코올성 지방간은 알코올을 과다 섭취하여 간에 지방 합성이 촉진되고 정상적인 에너지 대사가 이루어지지 않아 발생하게 된다. 일부에서는 지방간이 단순히 간에 지방이 축적되는 현상 정도로 생각하고 있으나, 알코올성 지방간으로 판명된 환자의 50%, 비알코올성 지방간으로 판명된 환자의 30%는 간경변으로 발전한다는 사실을 고려할 때, 지방간은 매우 심각한 간질환의 하나라고 보아야 할 것이다. 현재 지방간을 약물학적으로 치료하는데 유용한 약제는 거의 없는 상태이며 운동과 식이요법만이 권장되고 있으나, 실제로 이러한 방법에 의한 지방간의 치료효율은 매우 낮아 유효한 치료제 개발이 요구된다. 지방간이 당뇨병 및 비만상태에서 관찰되는 세포의 인슐린 저항성과 관련성이 있다고 확인되면서 일부 메트폴민 (metformin)과 같은 혈당 강하제가 지방간 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었으나, 상기 약물은 간 독성 또는 젖산증과 같은 부작용을 유발한다는 문제점이 있다. 이외에 대체 약물보조요법으로서 베타인 (betaine), 글루큐로네이트 (glucuronate), 메티오닌 (methionine), 콜린 (choline) 및 친지방 (lipotrophic) 제제가 보조적으로 이용되기도 하지만, 이들에 대한 의약학적 근거가 완전히 증명된 것은 아니다. 따라서, 효과가 탁월하면서도 부작용을 유발하지 않는 안전한 지방간 치료제의 개발이 절실한 실정이다.

아울러, 상기 대사성 질환의 발생과 진행에 있어서 혈전(thrombus)은 그 중심적인 역할을 하기 때문에 혈전의 생성을 예방하고 생성된 혈전을 효과적으로 제거하는 것이 대사성 질환 치료에서 중요하다. 혈전은 정상적인 지혈과정(haemostasis)에 대하여 병적으로 대응하는 개념으로서, 혈소판의 응집 및 혈장의 응고 과정이 과도하게 활성화되었을 때 발생할 수 있다. 혈전성 질환의 예방과 치료 약물들은 혈전용해제, 항응고제 및 항혈소판제로 크게 분류된다. 혈액 응고계를 차단하여 혈전 형성을 억제하는 헤파린, 쿠마린 등의 항응고제들이나 혈전의 주요 구성성분인 피브린을 분해하여 이미 형성된 혈전을 용해시키는 혈전용해제들은 혈전성 질환의 응급처치 목적으로 사용되고 있으나, 혈관 손상 부위에서의 출혈 또는 전신성 출혈 등의 부작용으로 인하여 장기 치료에는 적합하지 못하다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 효과적으로 치료할 수 있고, 상기와 같은 부작용 및 제한점이 없는 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 복합 추출물 또는 이들의 분획물은 매우 우수하게 혈장 응고 및 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가지고, 혈장의 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키며, HDL-C를 증가시키고, 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시키므로, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 및 유자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 하나의 양태는 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물은 유자 추출물 또는 이의 분획물을 추가로 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 복합 추출물 또는 이들의 분획물은 매우 우수하게 혈장 응고 및 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가지고, 혈장의 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키며, HDL-C를 증가시키고, 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시키므로, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 본 발명에서 처음으로 규명하였다.

본 발명의 용어 "감잎(Persimmon leaf)"은 감나무과(Ebenaceae)에 속하는 낙엽 교목의 잎을 의미하는 것으로, 상기 감잎에 함유되어 있는 유기산과 카페인은 피로회복과 각성효과가 있으며, 플라보노이드 성분은 천연 항산화제 역할을 한다.

본 발명의 용어 "유자(Yuzu)"는 귤속(Citrus)에 속하는 나무의 열매를 의미하는 것으로, 구체적으로 시트러스 주노스(Citrus junos), 시트러스 그란디스 (Citrus grandis), C. 이찬젠시스 × C. 레티큘라타(Citrus ichangensis × C. reticulata)일 수 있으며, 더욱 구체적으로 시트러스 주노스 시에브(Citrus junos Sieb)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어 "추출물"은 상기 감잎 또는 유자의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농충액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 구체적으로 본 발명의 상기 추출물은 추출 후 건조 분말 형태로 제조되어 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 추출물은, 상기 식물의 천연, 잡종 또는 변종 식물로부터 추출될 수 있고, 식물 조직 배양물로부터도 추출이 가능하다.

본 발명의 상기 감잎 또는 유자의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다. 또한, 구체적으로

본 발명에서 상기 감잎 또는 유자를 추출하는 데 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 탄소수 1 내지 4 저급 알콜; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알콜; 및 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 상기 감잎 또는 유자를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 저급 알콜은 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 본 발명에서 감잎 추출물은 감잎과 0 내지 100%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:10 내지 1:20(건조원물:용매)으로 혼합하여, 상온 내지 90℃에서, 1 내지 6시간 동안, 1 내지 2회 추출한 것일 수 있고, 유자 추출물은 유자와 0 내지 70%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:10 내지 1:30(건조원물:용매)으로 혼합하여, 상온 내지 90℃에서, 1 내지 6시간 동안, 1 내지 3회 추출한 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 감잎 추출물은 50%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:20(건조원물:용매)으로 혼합하여 90℃에서 2시간 동안, 1회 추출한 것일 수 있고, 유자 추출물은 50%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:20(건조원물:용매)으로 혼합하여 70℃에서 2시간 동안, 1회 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 나일론 등을 이용해 입자를 걸러내거나 냉동여과법 등을 이용해 여과한 후, 그대로 사용하거나 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 감잎 또는 유자의 추출조건 설정을 위해, 주정함량, 온도, 추출 시간, 용매비율 및 반복횟수 순으로 조건 설정 실험을 진행하였으며, 수율, 지표함량 등을 함께 고려한 결과, 감잎의 최적 추출조건은 50%(v/v) 주정(에탄올), 90℃, 2시간, 1:20(건조원물:용매), 1회 추출로 확정하였고(표 1), 유자의 최적 추출조건은 50%(v/v) 주정, 70℃, 2시간, 1:20(건조원물:용매), 1회 추출로 확정하였다(표 2).

본 발명의 용어 "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 감잎 또는 유자를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로 에탄올일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "혈액순환 장애(blood circulation disorders)"는 신체 전체 또는 일부분의 조직에서 혈액순환이 원활하게 이루어 지지 않는 상태를 말한다. 구체적으로 본 발명에서 상기 혈액순환 장애는 혈전 질환일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 혈전 질환의 비제한적인 예로는 혈전증, 고혈압, 뇌졸중, 뇌경색, 협심증, 심근경색, 동맥경화증, 말초동맥폐쇄증, 신장정맥폐쇄증, 중심 망막정맥 폐쇄증, 폐 혈전증, 심부정맥 혈전증, 간문맥 혈전증, 뇌 정맥동 혈전증, 뇌 동맥경화증, 심장병, 허혈성 심질환, 두개내출혈, 동맥류, 죽상혈전증, 또는 신경화증 등이 있다.

본 발명의 용어 "대사성 질환(metabolic disorder)"은 지질 또는 당 대사 이상으로 인한 질환을 총칭하며, 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고혈압, 통풍, 뇌졸증, 동맥경화, 심장병 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 말한다. 대사성 질환의 증상 자체는 치명적이진 않지만, 심각한 질병으로 발전할 소인이 있기 때문에 현대인을 가장 크게 위협하는 질환이 되고 있다.

상기 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물은 매우 우수하게 혈장 응고 및 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가지고, 혈장의 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키며, HDL-C를 증가시키고, 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시키므로, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "예방"은 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "치료"는 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 구체적으로 투여 개체의 몸무게 1kg 당 일반적으로 1일 0.01mg 내지 5000mg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 감잎 추출물 또는 유자 추출물의 혈장 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time, aPTT) 연장 효과를 Thrombotimer(Behnk Elektronik, Germany)을 사용하여 분석한 결과, 감잎 추출물 또는 유자 추출물은 PT 및 aPTT를 현저하게 연장시키므로 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인한바(표 3 내지 10), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 감잎 추출물 또는 유자 추출물을 사용하여 세로토닌 형성능을 측정한 결과, 감잎 추출물 및 유자 추출물은 매우 우수하게 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바(도 1 및 2), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물의 혈액 순환 장애 및 대사성 질환 치료 효과를 in vivo에서 확인하기 위해, 4주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 5개의 식이군으로 나누고, 고지방식이를 섭취시켰다(실시예 5-1).

그 결과, 감잎 추출물은 in vivo에서도 고지방식이로 인해 감소된 PT를 현저하게 증가시키므로 혈장 응고를 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바(표 11), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 감잎 및 유자 복합 추출물도 in vivo에서 고지방식이로 인해 감소된 PT를 시너지적으로 현저하게 증가시키므로 혈장 응고를 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바(표 11), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 감잎 추출물은 in vivo에서도 현저하게 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키고, HDL-C를 증가시킴을 확인한바(표 12), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 감잎 및 유자 복합 추출물도 in vivo에서 시너지적으로 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키고, HDL-C를 증가시킴을 확인한바(표 12), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 감잎 추출물은 in vivo에서도 현저하게 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시킴을 확인한바(도 3), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 감잎 및 유자 복합 추출물도 in vivo에서 시너지적으로 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시킴을 확인한바(도 3), 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 감잎 추출물 또는 이의 분획물에 더하여 유자 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 경우, 상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 및 유자 추출물 또는 이의 분획물을 중량 기준으로 1 내지 10 : 10 내지 1, 구체적으로 5 : 1로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 한 상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 다양한 함량으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 25 중량%, 더욱 구체적으로 0.05 내지 5 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지는 한 상기 유자 추출물 또는 이의 분획물을 다양한 함량으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.002 내지 5 중량%, 더욱 구체적으로 0.01 내지 1 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 4주령 수컷 C57BL/6J 마우스에 고지방식이와 함께 0.5 중량% 감잎 추출물 및 0.1 중량% 유자 추출물의 혼합 추출물을 투여한 결과, 감잎 및 유자 복합 추출물은 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다

상기 감잎, 유자, 추출물, 분획물, 혈액 순환 장애, 대사성 질환, 예방 및 투여는 전술한 바와 같다.

상기 투여를 위한 투여량, 투여 빈도 및 투여 경로는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개체"란, 상기 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 또한, 상기 조성물은 유자 추출물 또는 이의 분획물을 추가로 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기 감잎 및 유자는 천연 물질로서 오랫동안 사용되어 안정성이 입증되었으므로, 상식할 수 있으면서도 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선을 도모할 수 있는 식품의 형태로 제조되어 섭취할 수 있다.

상기 감잎, 유자, 추출물, 분획물, 혈액 순환 장애, 대사성 질환 및 예방은 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어 "개선"은 본 발명의 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 기능성 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

상기 기능성 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)와 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 기능성 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 기능성 식품의 제형 또한 기능성 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 기능성 식품은 관절염 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)는 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 기능성식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 호용된다.

구체적으로, 상기 건강 식품은 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 추출물 또는 이들의 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

본 발명의 식품 조성물은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선 효과를 기대할 수 있어 매우 유용하다.

또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 추출물 또는 이들의 분획물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 추출물 또는 이들의 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 및 유자 추출물 또는 이의 분획물을 중량 기준으로 1 내지 10 : 10 내지 1, 구체적으로 5 : 1로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선 효과를 가지는 한 상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물을 다양한 함량으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 25 중량%, 더욱 구체적으로 0.05 내지 5 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 혈액 순환 장애, 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선 효과를 가지는 한 상기 유자 추출물 또는 이의 분획물을 다양한 함량으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 조성물 총 중량에 대하여 0.002 내지 5 중량%, 더욱 구체적으로 0.01 내지 1 중량%로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물의 일 예로 건강음료 조성물으로 사용될 수 있으며, 이 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL 당 일반적으로 약 0.01 ∼ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ∼ 0.03 g 이다.

상기 외에 건강음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산, 펙트산의 염, 알긴산, 알긴산의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 또는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스, 과일주스 음료, 또는 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 또는 감잎 및 유자의 복합 추출물 또는 이들의 분획물은 매우 우수하게 혈장 응고 및 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가지며, in vivo에서도 혈장 및 간 조직의 지질을 감소시키므로, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 감잎 추출물(PL ethanol extract)의 세로토닌 형성 억제 효능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 유자 추출물(CJS ethanol extract)의 세로토닌 형성 억제 효능을 나타낸 그래프이다.
도 3은 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물의 간 조직의 유리지방산(A), 콜레스테롤(B), 및 중성지방(C) 감소 효과를 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 감잎 추출물의 최적 추출조건

감잎의 추출조건 설정을 위해 건조된 감잎(경동시장, 경북영천)을 이용하여 조건 설정 실험을 진행하였다. 조건 설정 실험은 주정함량(추출 용매), 온도, 추출 시간, 용매비율 및 반복횟수 순으로 진행하였으며, 추출조건 설정은 수율 및 지표함량을 함께 고려하였다(표 1).

그 결과, 감잎의 최적 추출조건은 50 %(v/v) 주정, 90 ℃, 2시간, 중량기준 1:20(건조원물:용매), 1회 추출로 확인하였다.

실시예 2. 유자 추출물의 최적 추출조건

유자의 추출조건 설정을 위해 동결건조된 거제유자(2012. 1. 확보)을 이용하여 조건 설정 실험을 진행하였다. 조건 설정 실험은 주정함량(추출 용매), 온도, 추출 시간, 용매비율 및 반복횟수 순으로 진행하였으며, 추출조건 설정은 수율 및 지표함량을 함께 고려하였다(표 2).

그 결과, 유자의 최적 추출조건은 50%(v/v) 주정(에탄올), 70℃, 2시간, 중량기준 1:20(건조원물:용매), 1회 추출로 확인하였다.

실시예 3. 혈장응고 시간 측정

실시예 3-1. 감잎 추출물 및 유자 추출물의 제조

감잎 추출물을 청도 지역의 5곳(region 1 내지 5)에서 얻은 감잎을 사용하여 상기 실시예 1에서 설정한 최적 추출조건인 50 %(v/v) 주정, 70 ℃, 2시간, 중량기준 1:20(건조원물:용매), 1회 추출 조건으로 제조하였다.

또한, 유자 추출물을 거제 지역의 2곳(Gujae region 1 및 2), 고흥 지역(Goheung region 1) 및 남해 지역의 3곳(Namhae region 1 내지 3)에서 얻은 유자를 사용하여 상기 실시예 2에서 설정한 최적 추출조건인 50 %(v/v) 주정, 90℃, 2시간, 중량기준 1:20(건조원물:용매), 1회 추출 조건으로 제조하였다.

실시예 3-2. 혈장 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 측정 방법

혈장 프로트롬빈 시간(prothrombin time, PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time, aPTT)을 측정하기 위해 Thrombotimer(Behnk Elektronik, Germany)을 사용하였다.

*PT는 시험관 실험에서 platelet rich plasma(PRP) 90 ㎕와 시험물질(감잎 추출물 또는 유자 추출물) 10 ㎕를 섞었고, 동물실험에서는 혈장 100 ㎕를 37℃에서 3분간 반응시킨 후 PT시약 200 ㎕를 첨가한 후 응고시간을 측정하였다.

aPTT는 시험관 실험에서 platelet rich plasma(PRP) 90 ㎕와 시험물질(감잎 추출물 또는 유자 추출물) 10 ㎕를 섞은 후 aPTT 시약 100 L를 반응시켰고, 동물실험에서는 혈장 100 ㎕에 aPTT 시약 100 ㎕를 37℃에서 3분간 반응시킨 후 20 M CaCl₂ 시약 100 ㎕를 첨가하여 응고시간을 측정하였다.

또한, PBS(phosphate buffered saline)를 대조군으로 사용하여 응고시간을 측정하였다.

실시예 3-3. 감잎 추출물의 PT 및 aPTT 측정 결과

상기 실시예 3-1에서 제조한 감잎 추출물(PL ethanol extract)의 혈장 응고 시간을 비교하기 위해 PT 및 aPTT를 실시하여 그 결과를 각각 하기 표 3 및 4에 나타내었다.

상기 표 3에서 감잎 추출물은 낮은 농도인 1 mg/mL에서도 대조군(PBS)에 비해 PT를 연장시켜 혈장 응고를 억제함을 확인하였다.

상기 표 4에서 감잎 추출물은 낮은 농도인 1 mg/mL에서도 대조군(PBS)에 비해 aPTT를 현저하게 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

이를 통해 감잎 추출물은 현저하게 혈장 응고를 억제함을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-4. 유자 추출물의 PT 및 aPTT 측정 결과

상기 실시예 3-1에서 제조한 유자 추출물(CJS ethanol extract)의 혈장 응고 시간을 비교하기 위해 PT 및 aPTT를 실시하여 그 결과를 각각 하기 표 5 내지 7, 및 표 8 내지 10에 나타내었다.

상기 표 5에서 거제 지역(Gujae region 1 및 2)에서 얻은 유자로 제조된 유자 추출물은 대조군(PBS)에 비해 약 4배 이상 PT를 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

상기 표 6에서 고흥 지역(Goheung region 1)에서 얻은 유자로 제조된 유자 추출물은 대조군(PBS)에 비해 약 5배 이상 PT를 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

상기 표 7에서 남해 지역(Namhae region 1 내지 3)에서 얻은 유자로 제조된 유자 추출물은 대조군(PBS)에 비해 약 2배 내지 4배 이상 PT를 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

상기 표 8에서 거제 지역(Gujae region 1 및 2)에서 얻은 유자로 제조된 유자 추출물은 대조군(PBS)에 비해 aPPT를 현저하게 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

상기 표 9에서 고흥 지역(Goheung region 1)에서 얻은 유자로 제조된 유자 추출물은 대조군(PBS)에 비해 약 2배 이상 aPPT를 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

상기 표 10에서 남해 지역(Namhae region 1 내지 3)에서 얻은 유자로 제조된유자 추출물은 대조군(PBS)에 비해 약 3배 정도 aPPT를 연장시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다.

이를 통해 유자 추출물은 매우 우수하게 혈장 응고를 억제함을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4. 세로토닌(serotonin) 형성능 측정

실시예 4-1. 세로토닌 형성능 측정 방법

혈장 세로토닌의 함량 측정을 위해 ELISA kit(MyBioSource, San Diego, USA)를 사용하였다. 먼저, PRP(platelet rich plasma)를 감잎 추출물과 함께 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 아실화를 시켜 아실화된 혈장(25 ㎕)과 세로토닌 항혈청(100 ㎕)을 30분간 실온에서 반응시켰다. 플레이트를 세척한 후 anti-rabbit IgG와 퍼옥시다제의 복합물 100 ㎕를 플레이트에 첨가하여 실온에서 15분간 반응시켰다. 그 다음 테트라메틸벤조이미드(tetramethylbenzimide, TMB) 100 ㎕와 반응정지액 0.25 M 황산 50 ㎕를 첨가하여 450 nm에서 5분간 흡광도를 모니터링하였다.

실시예 4-2. 감잎 추출물 및 유자 추출물의 세로토닌 형성능 측정 결과

상기 실시예 3-1에서 청도 지역에서 얻은 감잎으로 제조한 감잎 추출물 (region 3)을 사용하여 세로토닌 형성능을 측정한 결과, 감잎 추출물은 낮은 농도인 1 mg/ml부터 세로토닌 함량을 감소시켰으며, 5 및 10 mg/ml에서 유의적인 세로토닌 형성 억제 효능을 나타내었다(도 1).

이를 통해 감잎 추출물은 매우 우수하게 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4-3. 유자 추출물의 세로토닌 형성능 측정 결과

상기 실시예 3-1에서 고흥 지역에서 얻은 유자로 제조한 유자 추출물 (Goheung region 1)을 사용하여 세로토닌 형성능을 측정한 결과, 유자 추출물은 낮은 농도인 1 mg/ml에서 세로토닌 함량을 감소시켰으며, 10 및 20 mg/ml에서 유의적인 세로토닌 형성 억제 효능을 나타내었다(도 2)

이를 통해 유자 추출물은 매우 우수하게 세로토닌 형성을 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물에 의한 마우스의 혈장 및 간 조직의 지질 변화 분석 방법

실시예 5-1. 동물실험 방법

실험동물 모델로 4주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 Lab-chow 식이를 제공하면서 2주간 안정화시킨 후 실험동물을 각각의 식이군으로 무작위 배정하였다. 정상식이(normal diet, ND)군은 AIN-76 식이를 기본으로 하고, ND군을 제외한 다른 식이군은 고지방식이(high-fat diet, HFD; 라드 17 %, 옥수수유 3 %, 및 콜레스테롤 1 %, wt/wt)를 기본으로 하되, 추출물 처리군은 상기 제조한 감잎 추출물 및/또는 유자 추출물을 식이에 추가하였다. 각각의 식이군에 섭취시킨 식이는 하기와 같다.

제1군, ND군 : 양성 대조군, 정상식이(normal diet, ND)

제2군, HFD군 : 음성 대조군, 고지방식이(high-fat diet, HFD)

제3군, PL군 : HFD + 감잎 알콜 추출물 0.5 %

제4군, CJS군 : HFD + 유자 알콜 추출물 0.1 %

제5군, MPC군 : HFD + 감잎 0.5% 알콜 추출물 및 유자 알콜 추출물 0.1 %

실험동물을 항온(25 ℃), 항습(50 %) 및 6시부터 18시까지의 light cycle에서 유지하였고, 개개의 stainless cage 안에서 사육하였으며, 식이와 식수는 자유식(ad libitum)으로 공급하였다. 또한, 식이는 4 ℃로 냉장보관 하였고, 매주 체중과 식이섭취량을 측정하였다.

실시예 5-2. 시료수집

각 실험동물에 대하여 행동이상 유무 등과 같은 기초적인 임상증상을 관찰하면서 체중 및 식이섭취량을 비교하였고, 실험식이 급여 12주 후 마우스를 12시간 절식 후 에테르 흡입을 통해 마취시킨 후 복부 하대 정맥(inferior venacava)에서 공복 혈액을 채취하였다. 상기 채취한 혈액을 헤파린으로 처리된 시험관에 바로 수집하여 혈장을 분리하였고, 시료 분석시까지 -70℃에 보관하였다.

각 실험동물의 장기 조직을 PBS용액에 수차례 헹군 후 물기를 제거하여 정량하였다. 간 조직의 각종 효소활성도 측정, 유전자 발현분석, 및 조직지질 정량을 위해 간 조직을 분리 수집하여 액체 질소에 급냉 시킨 후 시료 분석시까지 -70 ℃에서 보관하였다.

실시예 5-3. 혈장 지질 분석

1. 혈장 총 콜레스테롤(Total-cholesterol) 정량

혈장 총 콜레스테롤 정량은 Allain 등(1974)의 효소법을 응용한 측정용 시액(아산제약 키트)을 사용하였다. 혈장 콜레스테롤은 콜레스테릴 에스테르(cholesteryl ester, CE) 및 유리콜레스테롤의 두 형태로 존재하므로, 이들 전체를 정량하기 위하여 CE를 콜레스테롤 에스터라제(cholesterol esterase)에 의해 지방산과 유리 콜레스테롤로 전환시켰다. 상기 전환된 유리콜레스테롤을 콜레스테롤 옥시다제(cholesterol oxidase)에 의해 H₂O₂와 △⁴-cholestenon으로 전환시키고, 이 중 H₂O₂를 퍼옥시다제, 페놀, 및 4-아미노-안티프트린(4-amino-antiptrine)과 혼합하여 적색으로 발색시킨 후, 500 nm에서 흡광도를 측정하여 콜레스테롤 표준용액(300 mg/dL)을 통해 총 콜레스테롤을 정량하였다.

2. 혈장 중성지질(Triglyceride) 정량

혈장 중성지질은 McGowan 등(1983)의 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 중성지방 측정용 시약(아산제약 키트)를 사용하여 측정하였다. 혈장 내 중성지질은 지단백 리파제(lipoprotein lipase, LPL)에 의해 글리세롤과 지방산으로 분해되고, 이 중 글리세롤은 ATP와 글리세롤 키나제(glycerol kinase, GK)의 작용으로 L-α-글리세롤포스페이트(L-α-glycerophosphate)를 형성하며, 이것은 O₂ 및 글리세롤포스포옥시다제(ycerophosphooxidase, GPO)와 반응하여 H₂O₂를 발생시켰다. 여기에 퍼옥시다제와 4-아미노-안티피린(4-amino-antipyrin)을 처리하여 적색으로 발색시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하여 글리세롤 표준곡선을 통해 중성지질을 정량하였다.

3. 혈장 HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol) 정량

혈장 HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol, HDL-C)을 HDL-C 측정용 시액(아산제약 키트)를 사용하여 측정하였다. 혈장 100 ㎕를 취하여 인텅스텐 나트륨 500 ㎍과 염화마그네슘 1 mg을 처리한 결과, 인텅스텐산과 마그네슘 양이온의 작용으로 지단백 중 apo B를 포함하는 LDL 및 VLDL이 침전되었다(Warnick, 1982). 이를 원심분리한 후 상층액에 남은 HDL을 총콜레스테롤과 같은 방법으로 발색반응 시켜 500 nm에서 흡광도를 측정하고, 콜레스테롤 표준용액(50 mg/dL)과 비교하여 HDL-콜레스테롤을 정량하였다.

4. 혈장 유리지방산 정량

혈장 유리지방산을 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 유리지방산 측정용 시액(Non-esterified fatty acid, NEFA kit, Wako, Osaka, Japan)을 사용하여 측정하였다. 우선 혈장 유리지방산에 아실 코엔자임 A 신테타제(acyl coenzyme A synthetase)를 작용시켜 Acyl-CoA, AMP 및 pyrophosphoric acid를 생성시킨 후, 여기에 아실 코엔자임 A 옥시다제를 첨가하여 2,3-트랜스-에노일-CoA(2,3-Trans-enoyl-CoA) 및 과산화수소를 생성시켰다. 이를 퍼옥시다제와 4-아미노-안티피린 및 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포-오로필)-m-토루이딘(N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfo -oropyl)-m-toruidine)으로 처리하여 적색으로 발색시킨 후 555 nm에서 흡광도를 측정하여 유리지방산 표준곡선을 통해 유리지방산을 정량하였다.

5. 동맥경화지수(atherogenic index, AI) 계산

AI는 하기 공식에 의해 계산되었다.

AI = [(Total-C)-(HDL-C)]/(HDL-C)

6. 혈장 아포지단백(Apolipoprotein, Apo) A-I 정량

혈장 Apo A-I 농도는 지단백에 특이적으로 반응하는 anti-Human Apo A-1 혈청을 사용하여 면역비탁법 원리로 정량하였다(日東紡株式會社, JAPAN).

7. 혈장 아포지단백 B(ApoB) 정량

혈장 Apo B 농도는 지단백에 특이적으로 반응하는 anti-Human Apo B 혈청을 사용하여 면역비탁법 원리로 정량하였다(日東紡株式會社, JAPAN).

실시예 5-4. 간 조직 지질 분석

간 조직 지질을 Folch 등(1957)의 방법으로 추출하였고, 간조직 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 Sale 등(1983)에 의해 수정 및 보완된 방법을 통해 측정하였다.

먼저, 간조직 0.5 g을 잘게 자른 후 5 mL 클로로폼:메탄올(2:1) 용액으로 균질화시켜 조직 지질을 추출하였다. 상기 추출액을 Whatman 여과지(No. 2)로 걸러내고, 질소 가스로 건조시킨 후, 동일 추출용매 1 mL에 다시 녹였다. 이 중 중성지질과 총 콜레스테롤 측정용으로 각각 100 ㎕를 취하여 다시 질소 가스로 건조시키고 5 mL의 에탄올로 용해시킨 후, 혈장 지질 정량법과 동일한 효소반응법으로 조직 지질(콜레스테롤, 중성지방, 유리지방산)을 정량하였다. 이때 유화액으로 0.5 % Triton X-100과 3 mM 소듐 콜레이트(sodium cholate)를 혼합하여 사용하였다.

실시예 6. 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물에 의한 마우스의 혈장 및 간 조직의 지질 변화 분석 결과

실시예 6-1. 혈장 PT 측정 결과

감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물이 in vivo에서 혈장 응고 시스템에 미치는 영향을 실시예 3-2에서 설명한 PT를 측정하여 분석하였다(표 11).

상기 표 11에서 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물은 고지방식이로 인해 감소된 PT를 증가시키므로, 혈장 응고를 매우 우수하게 억제함을 확인하였다. 또한, 감잎 및 유자 복합 추출물은 감잎 또는 유자 단독 추출물보다 매우 높게 PT를 증가시켜 정상식이군과 유사한 수치를 나타내므로, 혈장 응고 억제에 시너지 효과를 가짐을 확인하였다.

이를 통해 감잎 추출물은 in vivo에서도 현저하게 혈장 응고를 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 감잎 및 유자 복합 추출물도 in vivo에서 시너지적으로 혈장 응고를 억제하여 항혈전 효능을 가짐을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6-2. 혈장 지질 분석 결과

감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물이 in vivo에서 혈장 지질에 미치는 영향을 실시예 5-3에서 설명한 방법으로 분석하였다(표 12).

상기 표 12에서 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물은 고지방식이로 인해 증가된 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI를 감소시키며, 고지방식이로 인해 감소된 HDL-C를 증가시킴을 확인하였다.

또한, 고지방식이로 인해 증가된 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI와 관련하여 유자 단독 추출물이 효과를 나타내지 않거나 오히려 더욱 증가시키는 것에 반해, 감잎 및 유자 복합 추출물은 감잎 추출물보다 매우 현저하게 감소시킴을 확인하였다. 또한 고지방식이로 인해 감소된 HDL-C와 관련하여 감잎 또는 유자 단독 추출물보다 감잎 및 유자 복합 추출물은 매우 현저하게 증가시킴을 확인하였다.

이를 통해 감잎 추출물은 in vivo에서도 현저하게 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키고, HDL-C를 증가시킴을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 감잎 및 유자 복합 추출물도 in vivo에서 시너지적으로 nonHDL-콜레스테롤, Apo B, AI을 감소시키고, HDL-C를 증가시킴을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 6-3. 간 조직 지질 분석 결과

감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물이 in vivo에서 간 조직 지질에 미치는 영향을 실시예 5-4에서 설명한 방법으로 분석하였다.

그 결과, 도 3에서 감잎 추출물, 또는 감잎 및 유자 복합 추출물은 증가된 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시킴을 확인하였다.

또한, 고지방식이로 인해 증가된 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방과 관련하여 유자 단독 추출물이 효과를 나타내지 않거나 오히려 더욱 증가시키는 것에 반해, 감잎 및 유자 복합 추출물은 감잎 추출물보다 매우 현저하게 감소시킴을 확인하였다.

이를 통해 감잎 추출물은 in vivo에서도 현저하게 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시킴을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 감잎 및 유자 복합 추출물도 in vivo에서 시너지적으로 간 조직의 유리지방산, 콜레스테롤, 및 중성지방을 감소시킴을 확인한바, 혈액 순환 장애 및 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 데에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 모든 실험결과는 SPSS package program을 사용하여 각 실험군당 평균과 표준오차로 나타내었고, 각 군간의 평균차이에 대한 유의성 검정은 one-way analysis of variance(ANOVA)를 이용하였다. 다군간의 차이는 Duncan's multiple range test에 의하여 p<0.05 수준에서 검정하였다(Steel and Torrie, 1960).

또한, 본 발명의 표 및 도에서 *는 p<0.05, **는 p<0.01,***는 p<0.001을 의미한다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

1. (a) 감잎 추출물 또는 이의 분획물 및 (b) 유자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
   상기 대사성 질환은 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고혈압, 뇌졸증, 동맥경화, 심근경색, 협심증, 허혈성 심질환 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것인, 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물 또는 분획물은 각각 독립적으로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 및 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출 또는 분획된 것인, 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 저급 알콜 용매는 에탄올인 것인, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 감잎 추출물은 감잎과 0 내지 100%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:10 내지 1:20으로 혼합하여, 상온 내지 90℃에서 1 내지 6시간 동안 1 내지 2회 추출한 것인, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 감잎 추출물은 감잎과 50%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:20으로 혼합하여 90℃에서 2시간 동안 1회 추출한 것인, 약학적 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 유자 추출물은 유자와 0 내지 70%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:10 내지 1:30으로 혼합하여, 상온 내지 90℃에서 1 내지 6시간 동안 1 내지 3회 추출한 것인, 약학적 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 유자 추출물은 유자와 50%(v/v) 에탄올을 중량기준 1:20으로 혼합하여 70℃에서 2시간 동안 1회 추출한 것인, 약학적 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 및 유자 추출물 또는 이의 분획물을 중량 기준으로 1 내지 10 : 10 내지 1으로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 조성물은 감잎 추출물 또는 이의 분획물; 및 유자 추출물 또는 이의 분획물을 중량 기준으로 5 : 1로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
   
10. 제1항에 있어서,
    상기 감잎 추출물 또는 이의 분획물은 조성물 총 중량에 대하여 0.005 내지 5 중량%로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
    
11. 제1항에 있어서,
    상기 유자 추출물 또는 이의 분획물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 1 중량%로 포함되는 것인, 약학적 조성물.
    
12. (a) 감잎 추출물 또는 이의 분획물 및 (b) 유자 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 대사성 질환은 당뇨병, 비만, 이상지질혈증, 지방간, 고혈압, 뇌졸증, 동맥경화, 심근경색, 협심증, 허혈성 심질환 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것인, 식품 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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