JP2002524522A

JP2002524522A - 高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療のための、ルチンおよびケルセチンを含む組成物

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Publication number: JP2002524522A
Application number: JP2000569821A
Authority: JP
Inventors: ボク・ソンヘ; ジョン・テソク; ベ・キファン; パク・ヨンボク; チョイ・ミュンソク; モン・スルクシク; クウォン・ヨンコク; リー・エウンソク; ヒュン・ビュンファ; チョイ・ヤンキュー; リー・チュルホー; リー・セボム; パク・ヨンベ; キム・ヒョーソー
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 1998-09-15
Filing date: 1999-09-15
Publication date: 2002-08-06
Also published as: US20010014669A1; CN1317972A; WO2000015237A1; US6509372B2; WO2000015237A9; KR20000019717A; EP1124564A1; CA2344054A1; US6562866B1

Abstract

(57)【要約】活性成分として有効量のルチン、ケルセチンまたはこれらの混合物を医薬的に許容可能な担体とともに含む、哺乳動物の高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中および肝疾患のような高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療用医薬組成物、並びに有効量のルチンまたはケルセチンを含む前記疾患を予防または治療するための機能性食品または飲料組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、活性成分として有効量のルチンまたはケルセチンを医薬的に許容可
能な担体とともに含む、哺乳動物の高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中およ
び肝疾患のような高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療用医薬組成物；お
よび有効量のルチンまたはケルセチンを含む前記疾患を予防または治療するため
の機能性食品または飲料組成物に関する。

【０００２】発明の背景血中脂質、特にコレステロールおよびトリグリセリドは、動脈硬化症および高
脂血症および脂肪肝などの冠状動脈性心血管疾患のような種々の種類の疾患と密
接な関連がある。コレステロール、脂肪ステロイドアルコールは、肝において飽
和脂肪から生成される血中脂質である。トリグリセリドは、種々の疾患を引き起
こすおそれがあることが知られている別の種類の血中脂質である。また、血中コ
レステロールの濃度が高いと、血管壁に脂肪とともにマクロファージおよび泡沫
細胞が沈着してプラークを形成して動脈硬化症に至ることが報告されている(Ros
s R., Nature, 362, 801-809(1993))。血中コレステロールの量を減らす方法の
一つは、コレステロールおよび脂肪の摂取を減らす食餌療法である。他の方法は
、コレステロールの吸収に係わる酵素を阻害することによってコレステロールの
吸収を阻止することによる。

【０００３】アシルＣoＡ−コレステロール−o−アシルトランスフェラーゼ(Acyl ＣoＡ-ch
olesterol-o-acyltransferase、以下、ＡＣＡＴという)は、血中コレステロール
のエステル化を促進する。泡沫細胞は、ＡＣＡＴの作用によって形成され、低密
度リポタンパク質(ＬDL)によって運搬されるコレステロールエステルを多量に含
有している。動脈血管壁上での泡沫細胞の形成は、ＡＣＡＴ活性に従って促進さ
れるため、ＡＣＡＴ抑制剤は動脈硬化予防剤になり得る。また、ＬDLコレステロ
ールの血中濃度はＡＣＡＴ活性を阻害することによって減少させ得る(Witiak, D
. T. and D. R. Feller(eds), Antilipidemic Drugs : Medicinal, Chemical an
d Biochemical Aspects, Elsevier, pp159-195(1991))。

【０００４】さらに、リポタンパク質間のコレステロールの転移を媒介するコレステロール
エステル転移タンパク質(cholesterol ester transfer protein, CETP)の作用を
抑制するか、ステロールまたはイソプレノイド系化合物の生合成経路の中間体で
あるメバロン酸の生合成を媒介する３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−コ
ーエー(ＨMG−ＣoＡ)還元酵素の作用を阻害してコレステロール生合成速度を緩
めることによって高コレステロール血症を効果的に治療できると報告されている
(Willam, W.P., Cardiovascular Pharmacology, Kanu Chatterjee Ed, Wolfe Pu
llishing, 8.6-8.7(1994))。

【０００５】したがって、ＨMG−ＣoＡ還元酵素を阻害する薬物を開発するために多くの研
究が行われ、その結果、ペニシリウム属およびアスペルギルス属微生物に由来す
る数々の化合物が商業化された。特に、米国のメルク社のロバスタチン(商標)お
よびシンバスタチン(商標)、および日本の三共社のプラバスタチン(商標)などが
商品化された(C. D.R. Dunn, Stroke:Trends, Treatment and Markets, SCRIPT
Report, PJB Publications Ltd., 1995)。

【０００６】しかし、これらの薬物は、値段が非常に高く、長期間投与したとき、中枢神経
系において副作用を誘発することが知られている。また、長期間ロバスタチン(
商標)とシンバスタチンを投与すると、肝のＬDL受容体の活性を増加させて血中
ＬDLコレステロールの量を低めることができるが、肝におけるクレアチンキナー
ゼの増加および横紋筋変性(rhabdomyolysis)のような副作用を誘導する(Farmer,
J.A. et al., Baillers-clin. Endocrinol. Metal., 9, 825-847(1995))。した
がって、経済的で毒性のないＨMG−ＣoＡ還元酵素阻害剤の開発が求められてい
る。

【０００７】高い血中脂質濃度によって引き起こされる疾患の他の例としては、脂肪含有食
品およびアルコールの過度な摂取によって誘発される脂肪肝である。脂肪肝にな
ると、多量の脂質が肝組織に蓄積し、血清ＧＯＴ(glutamate-oxaloacetate tran
saminase)、ＧＰＴ(glutamate-pyruvate transaminase)およびγ−ＧＴＰ(γ−g
lutamyl transpeptidase)などが増加することになる(T. Banciu, et al., Med.
Interne., 20, 69-71(1982);およびA. Par, et al., Acta. Med. Acad. Sci. Hu ng., 33 , 309-319(1976))。

【０００８】脂肪肝の進行過程において、脂肪は主として肝にトリグリセリドおよび脂肪酸
の形で蓄積され、また小量ではあるが、コレステロールの形で蓄積され得る。脂
肪肝の主な徴候の一つは、高い血中コレステロールおよび／またはトリグリセリ
ド含量であると報告されている。したがって、脂肪肝は血中コレステロールおよ
び／またはトリグリセリドの濃度と密接な関連がある。

【０００９】バイオフラボノイドは、天然、特に野菜、果物、ワインなどに広く存在するポ
リフェノール性抗酸化剤である。ルチンおよびケルセチンを多量摂取する場合、
老人患者の心臓病に因る死亡を減少させ得ると報告されている(MG. L. Hertog e
t al., Dietary antioxidant flavonois and risk of coronary heart disease,
Lancet. 342:1007-1011, 1993)。

【００１０】バイオフラボノイドは、抗炎症、毛細血管強化、抗酸化、抗癌、抗ウイルスお
よび抗血小板凝集作用のような種々の有用な薬理学的作用を示すことが知られて
いる(O. Benavente-Garcia et al., Uses and properties of citrus flavonoid
s, J. Agr. Food Chem., 45, 4506-4515, 1997)。ルチンは、グリコシル化され
たケルセチンであって、微生物の作用によってケルセチンに分解され、腸におい
て吸収される(CManach et al., Biovailability, metabolism, and physiologic
al impact of 4-oxo-flavonoids. Nutrition Reserch 16:517-544, 1996)。

【００１１】柑橘類から発見される代表的なバイオフラボノイドを下記表Iに示す。

【表１】表Ｉ

【００１２】また、ルチンは、高蛋白性浮腫(High protein edema)の治療に効果があると知
られており(米国特許第５,０９６,８８７号)；ケルセチンは、抗癌および抗ウイ
ルス作用があると報告されている(日本特開平４−２３４３２０号公報参照)。

【００１３】本発明者らは、薬草、食料品、野菜および果物に多量存在するバイオフラボノ
イドの新規な薬理的な用途を開発するために鋭意研究した結果、ルチンおよびケ
ルセチンは高い血中脂質濃度に由来する疾患の治療または予防に効果的であるこ
とを発見した。特に、これらは、血中コレステロール濃度を著しく減少させ、Ｈ
MG−ＣoＡ還元酵素およびＡＣＡＴの活性を阻害し、動脈内壁内のマクロファー
ジ−脂質複合体の蓄積を防止し、哺乳動物の肝機能障害を抑制することができる
。

【００１４】発明の要約したがって、本発明の主な目的は、高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治
療のための、ルチンおよびケルセチンまたはこれらの混合物を含む医薬組成物を
提供することである。

【００１５】また、本発明の他の目的は、高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療のた
めの、ルチン、ケルセチンまたはこれらの混合物を含む食品または飲料組成物を
提供することである。

【００１６】本発明の一実施態様によって、活性成分としてルチン、ケルセチンまたはこれ
らの混合物を医薬的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤とともに含む、高血
中脂質濃度に因る疾患の予防または治療用医薬組成物が提供される。

【００１７】図面の簡単な説明本発明の前記および他の目的および特徴は、下記の図面を伴う本発明の詳細な
説明によって明白になる。図１Ａは、１％コレステロールを投与したウサギの動脈内皮を示す。図１Ｂは、１％コレステロールと１mg／kgロバスタチン(商標)を投与したウサ
ギの動脈内皮を示す。図１Ｃは、１％コレステロールと０.１％ルチンを投与したウサギの動脈内皮
を示す。図２Ａは、１％コレステロールを投与したウサギの肝の顕微鏡写真を示す。図２Ｂは、１％コレステロールと１mg／kgロバスタチン(商標)を投与したウサ
ギの肝の顕微鏡写真を示す。図２Ｃは、１％コレステロールと０.１％ルチンを投与したウサギの肝の顕微
鏡写真を示す。

【００１８】発明の詳細な説明本願に用いられる用語“血中脂質”は、血中に存在する脂質を意味する。血中
脂質は、血中に輸送されるコレステロールおよびトリグリセリドを意味する。

【００１９】血中脂質の“高いか上昇した濃度”とは、正常の濃度より高いことを意味し、
正常の濃度は患者の年齢、性別および体重のような患者の特定条件によって変化
する。高い血中脂質または血糖量は通常健康に有害であるとみなされる。

【００２０】 “高血中脂質濃度に因る疾患”とは、高いか上昇した血中脂質によって誘発さ
れる疾患、および／または高いか、上昇した血中脂質症状を伴う疾患を意味する
。そのような疾患の例としては、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中、脂肪
肝のような肝疾患がある。

【００２１】ルチン(Ｃ_２７Ｈ_３０Ｏ_１６、分子量６１０.５１、グリコール化されたケルセ
チン、文献[Merck Index 11^th ed.(1989)]参照)およびケルセチン(Ｃ_１５Ｈ_１０Ｏ₇, 分子量３０２.３２)は、レタスおよびタマネギのような野菜、柑橘類のよ
うな果物、およびソバのような穀類を含む種々の植物から抽出されるか、または
文献［Zemplen, Bognar in Ber., 1043(1943)およびSeka, Prosche, Monatsh., 69 , 284(1936)］に開示されている公知の方法によって合成し得る。

【００２２】たとえば、ルチンは、ソバの実、葉、茎、花、芽などに０.１〜１０重量％の量で含有されている。したがって、ルチンおよびケルセチンは、高温および高
圧の下で水または水性アルコールのような適切な溶媒を用いてソバから抽出され
得る。また、ソバの実、葉、茎、花および／または芽をＣａ(ＯＨ)_２またはＮａ
ＯＨ水溶液に一晩中放置し、中和した後、粗ルチン沈殿物を収集できる。また、
ソバの実、葉、茎および花の乾燥粉末を用いることもできる。一般に、ソバの葉
および茎に存在するルチンの含量は約０.６％であり、ソバの花に存在するルチ
ンの含量は約３％である。

【００２３】ルチンおよびケルセチンは、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中および肝
疾患のような高血中脂質濃度に因る疾患を抑制するだけでなく、治療する効果が
ある。さらに、このような有効性にも拘わらず、これらを１,０００mg／kgおよ
び１６０mg／kgの投与量でラットに経口投与したとき、ほとんど毒性を示さない
。また、これらは、肝機能に対する副作用も示さない。

【００２４】医薬製剤は、通常の方法に従って製造することができる。製剤の製造において
、活性成分を担体とともに混合または希釈するか、カプセル、におい袋(sachet)
またはその他容器形態の担体に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働
く場合には、活性成分に対するビヒクル、賦形剤または媒質として作用する固体
、半固体または液状物質であってもよい。したがって、製剤は、錠剤、丸剤、粉
末、におい袋、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾ
ル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であ
ってもよい。

【００２５】適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース
、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アラビアゴム、アルギ
ン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチル
セルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香
酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムお
よびミネラル油などを挙げることができる。製剤は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤
、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の組成
物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供す
るために当業界で公知の方法を用いて製剤化することができる。

【００２６】本発明の医薬組成物は、前記活性成分を０.０１〜１００重量％、好ましくは
０.１〜７０重量％の量で含む。さらに、本発明の医薬組成物は、経口、経皮、
皮下、静脈または筋肉内投与を含む種々の経路を通じて投与され得る。ヒトの場
合、ルチンおよびケルセチンの通常の１日投与量は０.１〜５００mg／kg体重で
あり、好ましくは０.５〜１００mg/kg体重の範囲であり、１回または数回に分け
て投与し得る。

【００２７】しかし、活性成分の実際投与量は治療する疾患、選択された投与経路、患者の
年齢、性別および体重、および患者の症状を含む色々な関連因子を考慮して決定
され、したがって、前記投与量は本発明の範囲を制限しない。

【００２８】また、ルチンおよびケルセチンは、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中お
よび肝疾患を予防または治療する目的で食品または飲料に添加され得る。前記食
品または飲料としては、肉類；野菜ジュース(たとえば、ニンジンジュース、ト
マトジュース)および果物ジュース(たとえば、オレンジジュース、ブドウジュー
ス、パイナップルジュース、リンゴジュースおよびバナナジュース)；チョコレ
ート；スナック類；お菓子類；ピザ；パン、ケーキ、クラッカー、クッキー、ビ
スケット、ヌードルなどのように穀物の粉末から作られた食品類；チューインガ
ム類；牛乳、チーズ、ヨーグルトおよびアイスクリームのような乳製品；スープ
；肉汁；ペースト、ケチャップおよびソース；茶；アルコール飲料類；炭酸飲料
；ビタミン複合体；および種々の健康補助食品類などがある。

【００２９】食品または飲料中のルチンおよびケルセチンの含量は０.０１〜１０重量％の
範囲であってもよい。特に、本発明による飲料は１,０００ml当りルチン、ケル
セチンまたはこれらの混合物を１０〜１００ｇ含み得る。

【００３０】前述のように、ルチンまたはケルセチンは有効で、かつ毒性のない、高脂血症
、動脈硬化症、狭心症、脳卒中および肝疾患のような高血中脂質濃度に由来する
疾患の予防または治療用医薬として用いられる。

【００３１】下記実施例は本発明をさらに詳細に説明するためのものであり、本発明の範囲
を制限しない。

【００３２】また、下記固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に対して
下記に与えられた百分率は、各々重量／重量、容量／容量および重量／容量に基
づいたものであり、特に言及しない限りすべての反応は室温で行われた。

【００３３】実施例１：経口投与されたルチンの毒性実験特に病気のない(specific pathogens free) ７週齢のＩＣＲマウスであって、
体重が２５〜２９ｇである雌マウス６匹と体重が３４〜３８ｇである雄マウス６
匹を温度２２±１℃、相対湿度５５±５％、光周期１２Ｌ／１２Ｄの条件下で飼
育した。実験動物用飼料(Cheiljedang Co., マウスおよびラット用)および飲料
水は滅菌した後摂取させた。

【００３４】アルドリッチ・シグマケミカル社(St. Louis, Mo, USA)から購入したルチンを
０.５％ツイーン８０に１００mg／mlの濃度で溶解した後、この溶液をマウスに
マウス体重２０ｇ当り０.２mlずつ経口投与した。この溶液は、１回経口投与し
、その後副作用または致死についての観察を１、４、８、および１２時間後、そ
してその後は１２時間ごとに１０日間行った後、ルチンの効果を調査するために
マウスの体重変化を記録した。また、投与１０日目に動物を屠殺した後、肉眼で
内部臓器を観察した。

【００３５】すべてのマウスは１０日目まで生存し、これはルチンンが１,０００mg／kgの
投与量では毒性を示さないことを示す。検体によってマウスに何ら病理的異常が
発生しなかったことが確認され、１０日間の試験期間中体重減少は観察されなか
った。したがって、ルチンは動物に経口投与する場合毒性がないと結論づけるこ
とができる。

【００３６】実施例２：ルチンおよびケルセチンの血中総コレステロール、ＨDL−コレステ
ロールおよび中性脂質濃度に及ぼす影響 (段階１)ラットにルチンおよびケルセチンを投与体重が９０〜１１０ｇの３週齢スプラグダウリーラット(テハン実験動物セン
ター、大韓民国)３０匹を無作為ブロックデザイン(randomized Block design)に
従って３つの食餌群に分けた。３グループのラットに３種類の高コレステロール
食餌、すなわち、１％コレステロールを含むＡＩＮ−７６実験動物食餌(ICN Bio
chemicals, Cleveland, OH, U.S.A.)(対照群)、１％コレステロールと０.１％ル
チンを含むＡＩＮ−７６実験動物食餌(ルチン群)、および１％コレステロールと
０.１％ケルセチンを含むＡＩＮ−７６実験動物食餌(ケルセチン群)を各々摂取
させた。３群に摂取させた食餌組成は表IIに示す。

【表２】表II ^＊１は、テクラドプレミアー社(TEKLAD premier Co., Madison, WI, U. S. A.)
から購入した。^＊２は、シグマケミカル社(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, U. S. A.)か
ら購入した。

【００３７】ラットに水とともに特定食餌を６週間自由に摂取させ、摂取量を毎日記録し、
ラットの体重を７日ごとに測定した後飼育記録を分析した。すべてのラットは正
常の成長速度を示し、食餌摂取量と体重増加量においては２群間の差はほとんど
なかった。

【００３８】 (段階２)血中総コレステロール、ＨDL−コレステロールおよび中性脂質含量の決
定ルチンまたはケルセチンの投与がラットの血中コレステロールと中性脂質含量
に及ぼす影響を次のように調査した。

【００３９】前記段階１で得られた３つの食餌群のラットから血液試料を採取し、これらを
２時間放置し、３,０００rpmで１５分間遠心分離して上澄液を分離し、使用前ま
でディープフリーザーに保管した。血液化学分析器(CIBA Corning 550 Express,
USA)を用いて血液の化学分析を行って総コレステロールおよびＨDL−コレステ
ロールおよびトリグリセリドの濃度を測定した。その結果を下記表IIIに示す。

【表３】表III

【００４０】表IIIから分かるように、血中総コレステロール濃度は、ルチンおよびケルセチン投与群において対照群の場合に比べて各々２１％および３０％減少した。Ｈ
DL−コレステロール／総コレステロールの比率は、ルチンおよびケルセチン投与
群において対照群に比べて各々１８％および５４％増加した。また、中性脂質含
量は、ルチンおよびケルセチン投与群において対照群に比べて各々２０％および
１７％減少した。

【００４１】実施例３：ルチンおよびケルセチンのＡＣＡＴ阻害活性 (段階１)ミクロソームの製造ラットに投与したルチンがＡＣＡＴ酵素活性に及ぼす影響を調査するために肝
組織からミクロソームを分離して酵素源として用いた。

【００４２】まず、実施例２の各群のラットから切り取った肝組織１ｇを均質化溶液５ml(
０.１Ｍリン酸カリウム(ｐＨ７.４)、０.１mＭＥＤＴＡおよび１０mＭ β−
メルカプトエタノール)中で均質化した。この均質液を４℃で３,０００ｘｇで１
５分間遠心分離し、得られた上澄液を４℃で１５分間１５,０００ｘｇでさらに
遠心分離して上澄液を得た。上澄液を超遠心分離チューブ(ベックマン社)に入れ
、４℃で１００,０００ｘｇで１時間遠心分離してミクロソームペレットを得た
後、これを均質化溶液３mlに懸濁し、４℃で１００,０００ｘｇで1時間遠心分離
した。得られたペレットを前記均質化溶液１mlに懸濁した。懸濁液中のタンパク
質濃度をローリ(Lowry)らの方法で測定した後、タンパク質の濃度を４〜８mg／m
lに調節した。この懸濁液をディープフリーザー(Biofreezer, Forma Scientific
Inc.)に保管した。

【００４３】 (段階２)ＡＣＡＴ活性測定アセトンに１mg／mlの濃度で溶解したコレステロール溶液６.６７μlを１０％
トリトンＷＲ−１３３９(Sigma Co.)アセトン溶液６μlと混合した後、窒素ガス
を用いてアセトンを蒸発させた。この混合物に蒸留水を加えてコレステロールの
濃度が３０mg／mlになるように調節した。

【００４４】前記コレステロール水溶液１０μlに１Ｍリン酸カリウム１０μl(ｐＨ７.４)
、０.６mＭウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)５μl、段階１で得られたミクロソーム
溶液１０μlおよび蒸留水５５μlを加えた(総９０μl)。混合物を３７℃水浴で
３０分間予備反応させた。

【００４５】 (１−^１４Ｃ)オレオイル−ＣoＡ溶液１０μl(０.０５μＣi、最終濃度：１０
μＭ)を予備反応された混合物に加え、生成した混合物を３７℃水浴中で３０分
間反応させた。これに、イソプロパノール：ヘプタン混合溶液(４：１(v／v))５
００μl、ヘプタン３００μlおよび０.１Ｍリン酸カリウム２００μl(ｐＨ７.４
)を加え、混合物をボルテックスミキサー(vortex mixer)で激しく混合した後、
室温で２分間静置した。

【００４６】上澄液２００μlをシンチレーション瓶に入れ、シンチレーション液(Lumac社)
４mlを加えた。この混合物の放射線量を１４５０マイクロベータ液体シンチレー
ション計数器(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy, Finl
and)で測定した。ＡＣＡＴ酵素活性は、タンパク質１mg当り１分間合成したオレ
イン酸コレステリルの量(ピコモル／分／mgタンパク質)で計算した。その結果を
表IVに示す。

【表４】表IV

【００４７】表IVから分かるように、ルチンおよびケルセチン投与群のＡＣＡＴ活性度は対照群に比べて各々２０％〜２５％減少した。

【００４８】実施例４：ルチンおよびケルセチンのＨMG−ＣoＡ還元酵素抑制活性ＨMG−ＣoＡ還元酵素の活性を測定するために、フルチャー(Hulcher)の方法(J
. Lipid Res., 14, 625-641(1973))を若干変更して行った。この方法において、
ＨMG−ＣoＡ還元酵素の活性によってＨMG−ＣoＡがメバロン酸塩に還元されると
きに生成する助酵素−Ａ(ＣoＡ−ＳＨ)の濃度は分光器で測定し、ＨMG−ＣoＡ還
元酵素の活性を算出した。

【００４９】 (段階１)ミクロソームの製造実施例２の各群のラットから切り取った肝組織３ｇを冷食塩水(0.15M NaCl)
１００mlおよび冷緩衝溶液Ａ(０.１Ｍトリエタノールアミン、ＨＣＬ／０.２Ｍ
ＥＤＴＡ／２mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ))で洗浄した。肝組織１ｇ当り２
mlの冷緩衝溶液Ａを加えた後、この混合物を均質化器で均質化した。均質化した
溶液を１５,０００ｘｇで１５分間遠心分離した後、上澄液を１００,０００ｘｇ
で６０分間超遠心分離してミクロソーム沈澱物を得た。このように得られた沈澱
物を冷緩衝溶液Ａで洗浄し、−７０℃で１.５mlチューブで保管した。

【００５０】 (段階２)ＨMG−ＣoＡ還元酵素分析ＨMG−ＣoＡ還元酵素の活性分析に用いられる反応基質は次の通りである：ｉ)
緩衝液Ｂ：０.１Ｍトリエタノールアミン、ＨＣｌ／０.０２ＭＥＤＴＡ(ｐＨ
７.４)、ii)ＨMG−ＣoＡ溶液：１５０μモル／培養培地、およびiii)ＮＡＤＰＨ
溶液：２μモル／培養培地。

【００５１】懸濁液(ミクロソーム)を反応基質と混合し、遠心分離チューブに入れて３７℃
で３０分間活性化させた。反応混合物を０.０１Ｍ亜ヒ酸ナトリウム２０μlで処
理し、１分間放置した後、３７℃でクエン酸緩衝液(２Ｍクエン酸／３％タング
ステン酸ナトリウム、ｐＨ３.５)１００μlと反応させた後、２５,０００ｘｇで
１５分間遠心分離してタンパク質を除去した。得られた上澄液１mlをチューブに
移し、これに２Ｍトリス−ＨＣｌ(ｐＨ１０.６)溶液０.１mlおよび２Ｍトリス−
ＨＣｌ溶液(ｐＨ８.０)０.１mlを加えて反応物のｐＨを８.０に調整した。

【００５２】次いで、反応物をＤＴＮＢ緩衝溶液(３mＭＤＴＮＢ／０.１Ｍトリエタノー
ルアミン／０.２ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４)２０μlと混合し、混合物の吸光度を
４１２ｎｍで測定してＣoＡ−ＳＨの量(ＨMG−ＣoＡ還元酵素の活性)を計算した
。

【００５３】ルチンおよびケルセチンによるＨMG−ＣoＡ還元酵素の抑制範囲は前記結果に
基づいて計算した。その結果を下記表Ｖに示す。

【表５】表Ｖ

【００５４】表IVから分かるように、ルチンおよびケルセチン投与群から観察されたＨMG−
ＣoＡ還元酵素の活性は対照群に比べて３０％〜４０％減少した。

【００５５】実施例５：ルチンの投与がヒトの血中脂質代謝に及ぼす影響５０代の男性２人にルチンを一日１０mg／kgの投与量でカプセルの形で６０日
間経口投与した。投与前および投与後に血中コレステロールおよび中性脂質(ト
リグリセリド)含量を測定した。

【００５６】血中コレステロールおよび中性脂質含量は、ルチンの投与によって各々２５％
と２０％減少した。

【００５７】実施例６：動脈硬化症の抑制 (段階１)ウサギにルチンを投与実験動物として、体重が２.５〜２.６kgの３月齢ニュージーランド白ウサギ(
大韓民国ヨンアム園芸畜産大学)２４匹を温度２０±２℃、相対湿度５５±５％
および光周期１２Ｌ／１２Ｄの動物室で飼育した。ウサギを４つの群に分け、４
群のウサギに４つの異なる食餌、すなわち、１％コレステロール(対照群、１)；
１％コレステロールおよび１mg／kgロバスタチン(商標)(メルク社、米国)(ロバ
スタチン(商標)比較群)；１％コレステロールおよび０.１％ルチン；および１％
コレステロールと０.１％ケルセチンを含むＲＣ４食餌(Oriental Yeast Co.,日
本)を摂取させた。ＲＣ４食餌は水分７.６％、粗タンパク質２２.８％、粗脂肪
２.８％、粗灰粉８.８％、粗セルロース１４.４％および可溶性無窒素物４３.６
％を含む。ルチンおよびケルセチンはシグマケミカル社(St. Louis, Mo)から入
手した。

【００５８】実験用ウサギは食餌と水を自由に摂取できるようにしながら６週間飼育した。

【００５９】 (段階２)血液の化学分析６週後、ケタミン(５０mg／kg)を大腿部筋肉注射でウサギを麻酔して屠殺した
。各ウサギの心臓から採取した血液試料を２時間静置した後、３,０００rpmで１
５分間遠心分離し、上層部の血清を分離し、使用前に超低温冷凍庫に保管した。

【００６０】血液化学分析器(CIBA Corning 550 Express, USA)を用いてＧＯＴ、ＧＰＴ、
γＧＴＰ、総コレステロール、トリグリセリドの濃度を測定した。その結果を下
記表VIに示す。

【００６１】 (段階３)大動脈内脂肪腺(fatty streak)の測定段階２で屠殺した各ウサギの胸部を切開した。大動脈を大動脈弁の１cm上方か
ら下方に約５cm長さに切り取り、大動脈周辺の脂肪を除去した。大動脈の中間を
縦軸に沿って切開した後、皿上にピンで固定した。この湿った組織を写真撮影し
た後エスパー(Esper E. et al.(J. Lab. Clin. Med., 121, 103-110(1993))の方
法に従って次のように脂肪腺の染色を行った。

【００６２】切開した大動脈の一部を無水プロピレングリコールで２分間隔で３回洗浄し、
プロピレングリコールに溶かしたオイルレッドオー(ORO, Sigma Co.)の飽和溶液
で３０分間染色した。次いで、動脈を８５％プロピレングリコールで３分間隔で
２回洗浄して残っている染色溶液を除去した後、生理食塩水で洗浄した。動脈を
写真撮影した後写真を透写した。染色された領域(脂肪腺領域)の面積をイメージ
分析器(LEICA、Q-600、ドイツ)で測定し、全体大動脈の面積に対する脂肪腺の比
率(％)を計算した。その結果を表VIに示す。

【００６３】図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、各々１％コレステロール(対照群)；１％コレステ
ロールと１mg／kgロバスタチン(商標)(比較群)；および１％コレステロールと０
.１％ルチン(ルチン群)を投与したウサギの動脈写真を示す。図１Ａ、１Ｂおよ
び１Ｃから分かるように、１％コレステロールを投与したウサギの動脈内皮上に
はマクロファージ−脂質複合体の厚い層が観察されたが、１％コレステロールと
１mg／kgロバスタチン(商標)投与群および１％コレステロールと０.１％ルチン
投与群のウサギの動脈内皮上にはマクロファージ−脂質複合体の非常に薄い層が
形成されるか、層が形成されなかった。

【００６４】したがって、本発明のルチン組成物は動脈内皮上にマクロファージの蓄積を強
く抑制すると結論づけられる。

【００６５】 (段階４)臓器の組織観察段階２で屠殺した各ウサギから大動脈、心臓、肺、肝、腎臓および筋肉の一部
を切取り、肉眼で病変の有無を確認した。各臓器の半分は急速凍結させ、残りの
半分は１０％中性ポルマリン中に入れて２４時間以上固定した。次いで、固定し
た組織の断片を流れる水で十分洗浄し、７０％、８０％、９０％および１００％
エタノールで段階的に脱水した後、シャンドン(SHANDON(商標), Histocentre 2,
USA)を用いてパラフィン中に固定した。固定した臓器をミクロトーム(microtom
e；LSICA, RM2040, Germany)を用いて約４μｍ厚さに切り、ヘマトキシリンとエ
オシンで染色した。染色した組織の切片をキシレンで透明化し、パーマウントに
乗せた後、光学顕微鏡の下で観察して病変の有無を調査した。

【００６６】いずれの組織の切片においても病変は観察されなかった。

【００６７】実施例７：肝疾患予防ルチンおよびケルセチンと高コレステロール食餌の摂取が肝組織にもたらす効
果を観察するために、段階２で屠殺したウサギから切り取った肝組織をポグトら
の方法(Fogt F. and Nanji A. Toxicology and Appkied Pharmacology 136:87-9
3, 1996)とキーガンらの方法(Keegan A., et al., Jounal of Hepatology 23:59
1-600, 1995)に従って顕微鏡で観察して中心静脈に基づいて肝小葉内非正常脂肪
含有細胞の分布比率の程度によって１＋(０〜２５％)、２＋(２６〜５０％)、３
＋(５１〜７５％)および４＋(７６〜１００％)の４等級に分類した。その結果を
表Ｖに示す。

【００６８】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃは、各々１％コレステロール(対照群)、１％コレステロー
ルと１mg／kgロバスタチン(商標)投与群(比較群)および１％コレステロールと０
.１％ルチン投与群のウサギの肝の顕微鏡写真を示す。図２Ａ、２Ｂにおいて、
過度な脂肪を含有する多くの細胞が中心静脈から観察された。これとは異なり、
図２Ｃにおいては、すべての肝細胞が正常の形態を示したが、これは、ルチンが
脂肪肝の形成を効果的に抑制できることを示す。

【００６９】前記から分かるように、ルチンまたはケルセチンの投与はウサギにおける脂質
代謝および肝機能を向上させ、表VIに示すように、大動脈内皮でのプラーク形成
および脂肪肝への進行を抑制することができる。この結果、マイクロソフトエク
セル(バージョン７.０)プログラムを用いてＴ−テストでテストした結果である
。

【表６】表VI

【００７０】前記表VIから分かるように、ルチンおよびケルセチン投与群は、対照群に比べ
て血中総コレステロールおよび中性脂肪の数値が３０および４４〜４５％減少し
た。特に、ルチンおよびケルセチン投与群は、血中総コレステロールおよび中性
脂肪の数値を減少させるのにロバスタチン(商標)よりさらに効果的である。

【００７１】実施例８：ルチンの抽出ソバの実、葉または花にＣＡ(ＯＨ)_２を加えてｐＨを１０〜１２.０に調整し
、この混合物を一晩中放置した。この混合物をｐＨ６〜７に調整し、沈澱物を回
収して粗ルチン(純度：４０〜５０％)を得た。

【００７２】また、ソバの葉およびソバの花１００ｇずつを６０℃で５時間７０％エタノー
ル５００mlで抽出した。得られた抽出物を濾過した。この抽出物は各々１.６％(
葉、茎)および４％(花)のルチンを含有した。

【００７３】ソバの実、葉、茎および花を室温で乾燥した後、粉砕した。

【００７４】また、水に浸してふやかしたソバの実を適当な容器に入れ、恒湿条件で芽の長
さが約１〜１０cmになるまで栽培した。このように得られた芽を前述のように粉
末化するか、抽出した。

【００７５】ルチン粉末または抽出物を含む医薬または健康食品を通常の方法に従って製造
した。

【００７６】実施例９：ヒトにルチンを投与した効果５０代の男性２人に水に懸濁したソバの花粉末の形でルチンを一日１０ｇ／kg
の投与量で２ヶ月間投与した。投与前および投与後の血中コレステロールおよび
中性脂質の含量を測定した。

【００７７】血中コレステロールおよび中性脂質含量は、ルチンの投与によって各々２５％
および２０％減少した。

【００７８】したがって、ルチンをソバの花粉末の形で投与する場合も、動脈硬化症および
高脂血症の抑制効果があることが分かる。

【００７９】製造例１：医薬製剤の製造下記成分を含む硬質ゼラチンカプセルを製造した：

【表７】量(mg／カプセル) 活性成分 (ルチン、ケルセチンまたはこれらの混合物) ２００mg ビタミンＣ５０mg ラクトース(担体) １５０mg 合計４００mg

【００８０】製造例２：ルチンまたはケルセチンを含む食品ルチンまたはケルセチンを含む食品を次のように製造した。

【００８１】 (１)トマトケチャップおよびソースの製造トマトケチャップまたはソースに１００〜２００μｍサイズのソバ粉を十分量
加えてルチン０.０１〜１０重量％を含む健康増進用トマトケチャップまたはソ
ースを得た。または、実施例８で得られたソバ抽出物をトマトケチャップまたはソースに加
えてルチン０.０１〜１０重量％を含む健康増進用トマトケチャップまたはソー
スを得た。

【００８２】 (２)小麦粉食品の製造小麦粉にソバ粉を十分量加えてルチン０.０１〜１０重量％を含む小麦粉混合
物を得た後、この混合物を用いてパン、ケーキ、クッキー、クラッカーおよび麺
類を製造して健康増進用食品を得た。または、実施例８で得られたソバ抽出物の形でルチン０.０１〜１０重量％を
含む小麦粉混合物を用いてこれらの食品を製造した。

【００８３】 (３)スープおよび肉汁の製造スープまたは肉汁にソバ粉を十分量加えてルチン０.０１〜１０重量％を含む
健康増進用スープまたは肉汁を得た。または、実施例８で得られたソバ抽出物を用いてこれらの食品を製造した。

【００８４】 (４)グラウンドビーフの製造グラウンドビーフにソバ粉を十分量加えてルチン０.０１〜１０重量％を含む
健康増進用グラウンドビーフを得た。または、実施例８で得られたソバ抽出物を用いてこれらの食品を製造した。

【００８５】 (５)乳製品の製造牛乳にソバ粉を十分量加えてルチン０.０１〜１０重量％を含む牛乳を製造し
、これを用いてバーターおよびアイスクリームのような種々の牛製品を製造した
。または、実施例８で得られたソバ抽出物を用いてこれらの食品を製造した。

【００８６】しかし、チーズの製造の際には、ソバ粉または抽出物を凝固牛乳タンパク質に
加え、ヨーグルトの製造の際には、ソバ粉または抽出物を醗酵後に得られた凝固
牛乳タンパク質に加えた。

【００８７】製造例３：ルチンを含む飲料 (１)野菜ジュースの製造野菜ジュース１,０００mlにソバ粉または実施例８で得られたソバ抽出物１０
〜１００ｇを加えて健康増進用野菜ジュースを得た。 (２)果物ジュースの製造果物ジュース１,０００mlにソバ粉または実施例８で得られたソバ抽出物を１
０〜１００ｇを加えて健康増進用果物ジュースを得た。

【００８８】製造例４：ルチンを含む健康食品下記成分を混合し、錠剤化して健康食品を製造した。

【表８】含量(wt／wt％) 人参粉末または抽出液５０％ルチン、ケルセチンまたはこれらの混合物３０％甘味剤および香味剤２０％合計１００％

【００８９】本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲
によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形
および変化させ得ると理解されなければならない。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】１％コレステロールを投与したウサギの動脈内皮を示す。

【図１Ｂ】１％コレステロールと１mg／kgロバスタチン(商標)を投与した
ウサギの動脈内皮を示す。

【図１Ｃ】１％コレステロールと０.１％ルチンを投与したウサギの動脈
内皮を示す。

【図２Ａ】１％コレステロールを投与したウサギの肝の顕微鏡写真を示す
。

【図２Ｂ】１％コレステロールと１mg／kgロバスタチン(商標)を投与した
ウサギの肝の顕微鏡写真を示す。

【図２Ｃ】１％コレステロールと０.１％ルチンを投与したウサギの肝の
顕微鏡写真を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ２３Ｃ 9/152 Ａ２３Ｃ 9/152 ４Ｂ０３２ 19/093 19/093 ４Ｂ０３６Ａ２３Ｆ 3/14 Ａ２３Ｆ 3/14 ４Ｂ０４６Ａ２３Ｇ 1/00 Ａ２３Ｇ 1/00 ４Ｂ０４７ 3/00 3/00 ４Ｃ０５７ 3/30 3/30 ４Ｃ０６２ 9/02 9/02 ４Ｃ０８６Ａ２３Ｌ 1/16 Ａ２３Ｌ 1/16 Ａ４Ｃ０８８ 1/24 1/24 Ｂ 1/30 1/30 ＢＺ 1/302 1/302 1/39 1/39 1/48 1/48 2/02 2/02 ＡＥ 2/52 Ａ６１Ｋ 31/7048 Ａ６１Ｋ 31/7048 35/78 Ｘ 35/78 Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/06 9/10 9/10 １０１１０１Ｃ１２Ｇ 3/00 Ｃ１２Ｇ 3/00 Ｃ０７Ｄ 311/30 // Ｃ０７Ｄ 311/30 Ｃ０７Ｈ 17/07 Ｃ０７Ｈ 17/07 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (72)発明者ジョン・テソク大韓民国305−333テジョン、ユソンク、エウンドン、ナンバー99番、ハンビット・アパートメント127−1103 (72)発明者ベ・キファン大韓民国302−200テジョン、ソーク、ゴイジョンドン、ナンバー113−12番 (72)発明者パク・ヨンボク大韓民国706−014テグ、スソンク、ブメオ４ドン、ガーデン・ハイツ・アパートメント102−203 (72)発明者チョイ・ミュンソク大韓民国706−014テグ、スソンク、ブメオ４ドン、ガーデン・ハイツ・アパートメント102−203 (72)発明者モン・スルクシク大韓民国314−110チュンチョンナムド、ゴンジュシ、シンクワンドン、ナンバー５番、ゴムナル・アパートメント101−601 (72)発明者クウォン・ヨンコク大韓民国305−333テジョン、ユソンク、エウンドン、ナンバー99番、ハンビット・アパートメント126−1307 (72)発明者リー・エウンソク大韓民国301−013テジョン、ジュンク、テフン３ドン、ナンバー49−２番 (72)発明者ヒュン・ビュンファ大韓民国305−333テジョン、ユソンク、エウンドン、ナンバー99番、ハンビット・アパートメント131−1401 (72)発明者チョイ・ヤンキュー大韓民国305−333テジョン、ユソンク、エウンドン、ナンバー99番、ハンビット・アパートメント137−706 (72)発明者リー・チュルホー大韓民国302−171テジョン、ソーク、ガルマドン、ギュンソン・クンマエウル・アパートメント120−1307 (72)発明者リー・セボム大韓民国305−333テジョン、ユソンク、エウンドン、ナンバー99番、ハンビット・アパートメント111−301 (72)発明者パク・ヨンベ大韓民国135−110ソウル、カンナムク、アプグジョンドン、ヒュンダイ・アパートメント83−206 (72)発明者キム・ヒョーソー大韓民国135−110ソウル、カンナムク、アプグジョンドン、ヒュンダイ・アパートメント85−1401 Ｆターム(参考） 4B001 AC99 EC05 4B014 GB01 GB11 GB13 GB18 GG01 GK06 GL03 4B017 LC03 LG04 LG07 LG11 LK06 4B018 LB01 LB02 LB06 LB07 LB08 LB09 MD07 MD15 MD23 ME14 MF01 4B027 FB13 FC06 FK02 FK14 4B032 DB01 DB05 DB22 DB23 DB32 DG20 DK05 DL20 4B036 LC06 LF01 LF03 LF14 LH05 LH22 LK06 4B046 LA01 LC07 LG06 LG32 4B047 LB09 LG05 LG41 LG66 4C057 BB03 CC01 DD01 KK08 4C062 FF56 4C086 AA01 AA02 BA08 EA11 MA02 MA04 NA14 ZA36 ZA45 ZC33 4C088 AB43 AC03 AC04 AC05 BA14 CA01 CA03 NA14 ZA36 ZA45 ZC33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】有効量のルチン、ケルセチンまたはこれらの混合物を医薬的
に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤とともに含む、哺乳動物における高血中
脂質濃度に因る疾患の予防または治療用医薬組成物。
【請求項２】前記疾患が、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中または
脂肪肝である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】前記哺乳動物がヒトである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】ルチン、ケルセチンまたはこれらの混合物の有効量が０.１m
g〜５００mg／kg体重／日である、請求項１記載の組成物。
【請求項５】０.０１〜１０重量％のルチン、ケルセチンまたはこれらの
混合物を含む、哺乳動物における高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療用
食品組成物。
【請求項６】前記疾患が、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中または
脂肪肝である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】前記ルチンが、ソバの実、芽、花、葉または茎からの粉末ま
たは抽出物の形で加えられる、請求項５記載の組成物。
【請求項８】前記食品が、肉類、チョコレート、スナック類、菓子類、ピ
ザ、穀物の粉末から作られた食品類、チューインガム類、乳製品、スープ、肉汁
、ペースト、ケチャップ、ソースまたはビタミン複合体である、請求項５記載の
組成物。
【請求項９】前記穀物の粉末から作られた食品類が、パン、ケーキ、クラ
ッカー、クッキー、ビスケットまたは麺類である、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】前記乳製品が、牛乳、アイスクリーム、チーズまたはヨー
グルトである、請求項８記載の組成物。
【請求項１１】０.０１〜１０重量％のルチン、ケルセチンまたはこれら
の混合物を含む、哺乳動物における高血中脂質濃度に因る疾患の予防または治療
用飲料組成物。
【請求項１２】前記疾患が、高脂血症、動脈硬化症、狭心症、脳卒中また
は脂肪肝である、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】前記飲料が、野菜ジュース、果物ジュース、茶、アルコー
ル飲料類または炭酸飲料である、請求項１１記載の組成物。