KR100511720B1

KR100511720B1 - 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물

Info

Publication number: KR100511720B1
Application number: KR10-2002-0047056A
Authority: KR
Inventors: 김상건; 강건욱; 박은영
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2002-08-09
Filing date: 2002-08-09
Publication date: 2005-09-02
Also published as: KR20040013919A

Abstract

본 발명은 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

Description

간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물{Pharmaceutical compositions for preventing or treating fibrosis or cirrhosis of the liver}

본 발명은 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간은 체외에서 들어온 물질 및 체내의 물질대사에서 중추적인 역할을 담당하며 지속적으로 효소 반응 및 에너지 대사가 일어나는 생체 기관이다. 현재 한국 내의 만성적 질병 중에서 간염, 간 경화 및 간암이 차지하는 비중은 순환기계 질환과 함께 가장 높은 것으로 나타나고, 질병으로 인한 사망 원인 중 큰 비중을 차지하는 실정이다. 특히 선진국에 비하여 음주 인구가 상대적으로 높고, 폭음에 의한 간 손상 발생 원인이 높은 만큼 이에 대한 관심도 지대하다. 바이러스 감염이나 음주에 의한 지속적인 간조직의 손상은 간 경화나 간암으로 발전되는 특징을 가진다. 간조직의 생리적 특성 및 중요성을 고려할 때 간질환의 치료 및 예방은 대단히 중요하며 간조직 손상을 줄이고 궁극적으로 치료 및 예방용 의약 조성물의 개발이 요구된다.

여러 합성 화합물 및 생약제 등 다양한 물질들이 시험관 내 또는 생체 내에서 간 보호 작용을 나타낸다. 예를 들어 실리마린이나 비테인이 여기에 속하는데, 그 작용 기전은 시토킨의 억제나 글루타치온의 증가 등 여러 작용점이 관여한다고 알려져 있다. 이들은 효력이 낮아서 치료 효과를 기대할 수 없는 문제점이 있지만, 간 질환의 적절한 치료제가 없는 현실에서 상기의 약물들이 실제 임상에서 사용되고 있는 실정이다.

간 경화 치료를 위한 약리작용점 중의 하나는 활성화된 간의 성상세포의 자가사멸을 촉진시키거나 그 증식을 억제하는 것이다. 실제로 트리코스타틴 A(Trichostatin A)나 살비아놀산-A(salvianolic acid-A)의 경우 간의 성상세포의 증식을 억제하는 작용이 있고 간 경화 치료작용이 있는 후보물질로 알려져 있다 (Rombouts et al., Trichostatin A, Lead compound for development of antifibrogenic drugs. Acta Gastroenterol Belg. 2001 64:239-246; Liu et al., Effects of salvianolic acid-A on rat hepatic stellate cell proliferation and collagen production in culture. Acta Pharmacol Sin. 2000 21:721-726).

간 섬유화는 간염 등 만성 간질환에 수반되는 생체 적응 반응의 일부로서 손상된 간 조직이 정상적인 간세포로 복구되는 것이 아니라 콜라겐과 같은 섬유조직으로 변형되는 상태를 말한다. 간 섬유화는 조직손상의 복구과정에서 발생하는 생체 적응 반응이지만 생체내 물질의 대사 및 담즙분비 등 간의 고유기능을 전혀 수행할 수 없는 섬유 조직으로 간이 대체된다는 점에서 간 기능의 저하가 필연적으로 나타난다. 간 섬유화 현상이 지속적으로 반복될 때에는 간 경화로 발전되어 사망에까지 이르게 된다는 점에서 적절한 치료제의 개발은 신약개발의 중요한 과제가 된다. 그러나 현재까지는 간 섬유화의 기전 자체가 명확하게 밝혀져 있지 않으므로 적당한 치료약물이 개발되지 않은 실정이다.

간 섬유화는 여러 원인으로 인하여 간 조직에 만성적으로 심각한 손상이 있을 때 발생하는 간 경화의 전단계이다. 간 경화증은 부분적으로 발암성과 관련되고 간암의 위험이 간경화를 가진 환자에게 현저히 증가하기도 한다. 그럼에도 불구하고, 간 경화의 병리적인 기전은 간암과는 뚜렷하게 구분된다. 즉, 간 섬유화는 만성적으로 간 조직에 심각한 손상이 있을 때 발생하는데 그 원인 인자로는 바이러스, 기생충, 음주, 화학물질과 약물이 포함된다.

최근 간조직 내의 대식쿠퍼세포와 이토세포에서 유리되는 시토킨인 형질전환 성장 인자-베타(Transforming growth factor-β: TGF-β)가 간 섬유화의 중요 매개물로 밝혀졌다. 또한, TGF-β의 항체, 안티센스 RNA, 세포 TGF-β 수용체 변형을 통하여 TGF-β의 작용을 차단하였을 때에는 간 섬유화과정이 현저히 억제된다고 보고되었다. 본 발명자들은 올티프라즈가 TGF-β 발현을 억제함으로써 간 섬유화 또는 간 경화의 진행을 차단한다는 것을 대한민국 특허 출원 제 10-2001-0010686호에서 규명하였다. 또한, 올티프라즈에 의한 C/EBP 활성화는 간 조직 재생과 간의 성상세포에서의 TGF-β 발현 억제의 핵심 신호임을 상기의 특허 출원서에서 밝혔다. 이러한 선행연구를 바탕으로 본 발명자들은 세포배양 및 시험관 시험으로 간 경화 치료 효능을 갖는 화합물 검색법을 확립하였다. 이는 1) 간의 성상세포의 활성화 (α-SMA 발현) 및 섬유화 신호 평가 (TGF-β1 발현), 2) 간 세포주에서 C/EBPβ 발현 측정 (간 세포 복구 신호)과 관련 유전자 발현 측정 (GSTA2) 및 3) C/EBP 결합부위를 활용한 표적유전자 활성 검색 시스템으로 구성된다.

본 발명자들은 상기 검색법을 활용하여 간 섬유화 또는 간 경화의 치료 효능이 있는 의약의 개발을 위해 부단히 연구를 거듭한 결과, 플라본 또는 플라본을 모핵으로 갖는 화합물이 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는다는 것을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 플라본계 화합물을 유효성분으로 함유하며, 통상적으로 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적으로 약제학적으로 허용되는 약학적 제형으로 제제화하여 제조한 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 하기 화학식 1의 플라본계 화합물을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공한다.

상기 식에서,

R¹은 -H, -OH 또는 (여기서, R⁵는 -H 또는 -OH이다) 이고;

R²는 -H 또는 (여기서, R⁶는 -H, -OH 또는 -NH₂이고; R⁷은 -H, -OH 또는 C_1-6 알콕시이며; R⁸ 및 R⁹은 각각 -H 또는 -OH이다) 이며;

R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 -H 또는 -OH이고;

단, R¹이 -H 또는 -OH인 경우 R²는 이고, R¹이 인 경우 R²가 -H이다.

또한, 본 발명은 플라본계 화합물이 하기 화학식의 플라본, PD98059, 제니스테인, 다이드제인, 쿠에세틴, 캠프페롤, 루테올린, 아피게닌, 피세틴, 미리세틴 및 4'-브로모플라본으로 구성되는 군으로부터 선택되는 의약 조성물을 제공한다.

플라본 PD98059

제니스테인 다이드제인

쿠에세틴 캠프페롤

루테올린 아피게닌

피세틴 미리세틴

또한, 본 발명은 상기 의약 조성물이 경구 투여용 제제 또는 주사제로 제형화되는 의약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 경구 투여용 제제가 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제 및 산제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제제인 의약 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 플라본류는, 플라본 및 플라본과 같은 골격을 가진 아피게닌, 루테올린 등의 황색 색소이며 식물계에 널리 분포하고 있다. 플라본(flavone, 2-페닐-4H-1-벤조피란-4-온)은 분자량은 222.23이고 무색 결정으로 물에 녹지 않지만 에탄올, 에테르 등의 유기용매에 잘 녹고 용액은 보라색 형광을 낸다. 플라바논을 브롬화한 뒤에 알칼리로 처리하여 탈브롬화수소를 행하면 얻는다. 또, 플라본은 앵초에, 아피게닌은 달리아의 노랑꽃, 루테올린은 인동의 꽃이나 디기탈리스의 잎 등에 함유되어 있다.

플라본계 화합물이 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 및 치료에 효과를 갖는다는 것은 어느 문헌에도 보고되거나 제안된 바가 없다. 본 발명자들은 플라본계 화합물이 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는다는 것을 최초로 발견하였다.

플라본계 화합물은 플라본; PD98059, 제니스테인 및 다이드제인과 같은 이소플라본; 쿠에세틴 및 캠프페롤과 같은 플라보놀; 루테올린 및 아피게닌과 같은 플라본; 피세틴; 미리세틴; 4'-브로모플라본을 포함하지만 그것에 제한되지는 않는다. 본 발명에 있어서 플라본계 화합물로는 플라본과 PD98059가 바람직하다. 상기 화합물들의 염, 유도체도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에서는 래트에서 분리한 1차배양 활성 간의 성상세포에 플라본과 PD98059를 처치시 간의 성상세포 활성화 지표로 α-SMA 발현, 섬유화 시토킨으로 TGF-β1의 발현 및 증식 지표로 티미딘 삽입을 정량하였다. 그 결과 플라본과 PD98059 처치시 α-SMA 발현과 TGF-β1의 발현이 농도 의존적으로 감소하였고, 티미딘 삽입이 감소하였다. 간 경화시에는 간세포의 정상적인 복구, 증식 과정이 차단된다. 실제로 간세포의 증식에 관련된 전사인자 중 핵심적인 것은 C/EBP 패밀리이고, 그 중에서도 C/EBPβ가 간세포의 증식에 가장 중요한 것으로 인정된다. 실제로 C/EBPβ 유전자를 제거한 생쥐에서는 부분 간 절제술시 간 크기의 회복이 현저히 감소된다 (Greenbaum LE, Li W, Cressman DE, Peng Y, Ciliberto G, Poli V, Taub R., CCAAT enhancer-binding protein β is required for normal hepatocyte proliferation in mice after partial hepatectomy. J Clin Invest. (1998) 102:996-1007). 본 발명이 제시하는 실시예에서도 간세포주에 플라본과 PD98059 처치시 경시적으로 C/EBPβ의 핵내로의 이동이 증가함을 관찰하였다. 대조로 관찰한 Nrf2 전사인자의 핵내 이동은 나타나지 않았다. 또한, C/EBP와 Nrf2에 의하여 전사활성이 조절되는 지표유전자인 GSTA2의 발현이 플라본 또는 PD98059에 의하여 증가됨을 규명하였으며, 이러한 현상은 PD98059에 의한 MKK1-ERK 경로와는 무관함을 규명하였다. 또한, C/EBP 결합부위를 활용한 표적유전자 활성 검색시 플라본과 PD98059는 C/EBP를 활성화시키고 이것이 간 경화 억제와 관련된 유전자 발현을 조절함을 제시하였다.

이상의 발견에 근거하여 플라본계 화합물 단독 또는 다른 통상의 간질환 치료 및 예방용 약물과 병용하여 투약할 수 있는 간 경화 치료용 간 조직 재생효능을 갖는 의약물을 발명하였다.

본 발명의 플라본계 화합물은 실제로 사용할 때 바람직하게는 약제학적인 분야에서 통상적인 방법에 따라 경구투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여한다. 이러한 목적에 적합한 경구투여용 제형에는 경질 및 연질캅셀제, 정제, 산제 등이 포함된다. 이러한 경구투여용 제제에는 하나 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 간 손상 정도, 간염 발생시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 언급된 중량비로 조합된 조성물 20내지 400mg, 바람직하게는 50 내지 200mg을 1일 1내지 2회 분할하여 투여한다. 그러나 간 손상의 정도가 심한 환자나 간암절제 후 재발방지용으로는 본 발명의 조성물을 상기 범위를 벗어나는 대용량까지 증량하여 투여할 수 있다. 가장 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물 100mg을 함유하는 단위 투여체 1~2개를 1일 2회 경구 투여한다.

본 발명을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이며, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

이하 실험예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다.

실험예 1

<활성 간의 성상세포에서 플라본 또는 PD98059의 α-SMA 발현 억제작용>

랫트의 간을 0.05%의 콜라게나제(collagenase) 및 3.6 mM의 칼슘 클로라이드(CaCl2)를 함유한 한크의 평형 염 용액 (Hank's balanced saline solution: HBSS) 버퍼로 20분간 관류(perfusion)하였다. 처치한 간에 피콜(Ficoll)과 퍼콜(Percoll)을 넣어 1400g에서 15분 원심분리 하여 성상세포를 분리하고, 이들 세포를 플라스틱 세포배양용 디쉬에서 3회 이상 계대배양 하였다. 이 경우 간의 성상세포는 활성화되어 α-SMA 및 TGF-β1 발현이 증가한다. 세포에 플라본 (Aldrich Chemicals사(Milwaukee, WI) 제조) 또는 PD98059 (Calbiochem사(San Diego, CA) 제조) 3-30 μM를 가하여 24시간 동안 처치한 후 스크래퍼(scrapper)로 긁어내어 라이시스(lysis) 버퍼 [20 mM 염화 트리스 (pH 7.5), 1% 트리톤 엑스-100, 137 mM 염화 나트륨, 10% 글리세롤, 20 mM EDTA, 1 mM 오소바나데이트 나트륨(sodium orthovanadate), 25 mM 베타 글리세로포스페이트(β-glycerophosphate), 2 mM 피로포스페이트 나트륨(sodium pyrophosphate), 1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(phenylmethylsulfonylfluoride, 1㎍/ml 류펩틴(leupeptin)]를 50 ㎕ 넣고 1시간 얼음에 방치하였다. 시료를 10,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 라이세이트(lysate)로 사용하였다. 분리한 라이세이트를 전기영동시켜 니트로세룰로즈지에 전이시킨 후 항-마우스 α-SMA 항체(1:1000 in 1×PBS)와 결합시켰고, 이어 2차 항체인 서양 고추냉이 페록시다제 접합 염소 항-마우스(Horseradish peroxidase conjugated goat anti-Mouse) 항체(1:10000 in 1×PBS)와 상온에서 반응시켰다. α-SMA의 발현을 증진된 화학발광(Enhanced chemiluminescence :ECL) 법으로 발색하였을 때 α-SMA단백질은 농도의존적으로 감소하였다 (도 1a). 이 결과는 플라본 모핵을 갖는 화합물이 활성화된 간 성상세포를 정상화시키거나 활성화 단계를 억제하는 효능이 있음을 보여준다.

<활성 간의 성상세포에서 기타 플라본계 화합물의 α-SMA 발현 억제작용>

랫트에서 간 부분만을 적출하여 분리한 1차 간의 성상세포를 플라스틱 세포배양용 디쉬에서 3회 이상 계대배양 한다. 이 경우 간의 성상세포는 활성화되어 α-SMA 및 TGF-β1 발현이 증가한다. 플라본계 화합물을 각각 1, 3, 10 μM씩 24시간 처치시 α-SMA의 발현은 농도 의존적으로 감소하였다. 이 결과는 플라본 모핵을 갖는 화합물이 활성화된 간의 성상세포를 정상화시키거나 활성화 단계를 억제하는 효능이 있음을 보여준다. 아래의 표는 플라본계 화합물(10 μM, 24h)의 α-SMA 발현 억제율을 나타낸다.

화합물명	아피게닌	쿠에세틴	캠프페롤	4'-브로모플라본	피세틴	미리세틴
α-SMA 발현 억제율(%)	35	40	43	36	42	44

아피게닌, 쿠에세틴, 캠프페롤, 4'-브로모플라본: Calbiochem사 제조

피세틴, 미리세틴: Sigma사 제조

<활성화된 간의 성상세포에서 플라본 또는 PD98059의 TGF-β1 발현 억제작용>

활성화된 간 성상세포를 플라본 (3, 10, 30 μM) 또는 PD98059 (3, 10, 30 μM)와 각각 12시간 동안 반응시킨 후 세포로부터 총 RNA를 콤크진스키(Chomczynski) 및 사키(Sacchi)의 방법에 의해 분리하였다. 분리한 총 RNA중 TGF-β1 mRNA을 cDNA로 전환한 후 TGF-β1 선택적인 프라이머를 사용하여 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription- polymerase chain reaction)으로 DNA를 증폭하였다. TGF-β1 발현은 PD98059의 농도 의존적으로 감소하였다 (도 1b). 이 결과는 플라본 모핵을 갖는 화합물이 활성화된 간의 성상세포에서 TGF-β1 발현을 억제하는 효능이 있음을 보여준다.

<플라본 또는 PD98059의 활성화된 간의 성상세포의 증식억제 작용: 티미딘 삽입 억제효능>

본 발명에서 활성화된 간 성상세포 증식의 지표를 티미딘 삽입(thymidine incorporation)으로 관찰하였다. 성상세포에 플라본 또는 PD98059 (3, 10, 30 μM)을 6 시간동안 처치한 후 동위원소로 표식된 티미딘을 가하여 18시간동안 반응시켰다. 세포를 10% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)으로 세척한 후 수산화나트륨(NaOH)으로 2시간 중화시키고 칵테일(cocktail) 용액을 첨가하여 액체섬광계측기(Liquid Scintillation Counters)로 계측하였다. 세포내로의 티미딘 삽입(thymidine incorporation)은 플라본 또는 PD98059에 의하여 경시적으로 감소하였다 (도 1c). 이 결과는 플라본 모핵을 갖는 화합물이 활성화된 간 성상세포의 증식작용을 차단하는 효과가 있음을 보여준다.

실험예2

<간 세포주에서 플라본 또는 PD98059의 GSTA2 유도 작용>

본 발명에서는 플라본 또는 PD98059가 GSTA2를 유도하는 지의 여부를 웨스턴 블롯(western blot)으로 관찰하였다. 간세포주(H4ⅡE)에 플라본 또는 PD98059 (3, 10, 30 μM)를 가하여 각각 24시간 동안 처치하였다. 세포를 스크래퍼(scrapper)로 긁어내어 라이시스(lysis) 버퍼를 100 ㎕를 넣은 후 1시간 동안 얼음에 방치하였다. 시료를 10,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 라이세이트(lysate)로 사용하였다. 분리한 라이세이트를 전기영동시켜 니트로세룰로즈 지에 전이시켜 항-랫트 GST-α항체(1:5000 in 1×PBS)와 결합시키고, 이어 2차 항체인 서양 고추냉이 페록시다제 접합 염소 항-마우스(Horseradish peroxidase conjugated rabbit anti-goat) 항체(1:10000 in 1×PBS)와 함께 상온에서 반응시켰다. ECL방법으로 발색했을 때 GSTA2의 발현이 플라본 또는 PD98059에 의하여 농도 의존적으로 증가하였다 (도 2a). 이 결과는 플라본 모핵을 갖는 화합물이 GSTA2의 유도활성이 있음을 보여주며, 이는 플라본 및 플라본계 화합물에 의한 간 경화 억제효능과 상관될 가능성을 지지한다.

<간 세포주에서 플라본 또는 PD98059의 C/EBPβ 활성화 작용>

플라본 모핵을 갖는 화합물에 의한 GSTA2 유도 작용이 올티프라즈와 동일하게 C/EBPβ 활성화를 경유하는 지를 확인하기 위하여 간세포주에 플라본 10 μM 또는 PD98059 30 μM를 처치한 후 핵내로 이동한 C/EBPβ를 웨스턴블롯으로 측정하였다. 플라본과 PD98059는 모두 3-12시간에 핵내로 C/EBPβ의 유입을 증가시켰으며 C/EBPα의 경우 화합물에 의하여 영향받지 않았다 (도 2b). 플라본 모핵 화합물에 의한 C/EBPβ의 핵내로의 유입이 실제로 핵내 유전자의 C/EBP 결합부위에 결합되는 지를 겔 이동(gel shift) 분석법으로 측정하였다. 플라본 또는 PD98059를 처치한 간세포주(H4ⅡE)에 라이시스 버퍼 [10 mM HEPES (pH 7.5), 10 mM 염화 칼륨, 0.1 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 0.5 mM 페닐메틸설포닐프루오라이드)]를 넣고 얼음에 10분 방치한 후, 7,200g에서 6분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 침전에 추출(extraction) 버퍼 [20 mM HEPES (pH 7.9), 400 mM 염화 나트륨, 1 mM EDTA, 1 mM 디티오트레이톨, 1 mM 페닐메틸설포닐프루오라이드]를 넣고 얼음에 30분간 방치한 후 15,000g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하여 핵단백질로 사용하였다. 핵단백질에 5×바인딩 버퍼(binding buffer)[20% 글리세롤, 250 mM EDTA, 2.5 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), 0.25 mg/ml poly dI-dc, 50 mM Tris-Cl (pH 7.5)]를 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 말단-표지(end-labeling)한 C/EBP 공통(consensus) 염기서열을 넣어 30 분간 반응하여 C/EBP 단백질 복합체의 형성을 관찰하였다. 이때 반응혼합액을 0.5% TBE 버퍼의 4% 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에 전기영동하고 겔을 고정시킨 후 오토래디오그래피(autoradiography)하였다. 복합체 단백질은 항-랫트 C/EBP β항체, 항-랫트 C/EBP α항체 또는 항-랫트 ARNT 항체로 60분간 반응시켜 동정하였다. 세포를 PD98059 또는 플라본으로 처치할 때 C/EBP DNA 공통염기배열(consensus) 결합부위에 단백질복합체의 결합이 증가하는 것으로 나타났으며, 이 단백질 복합체는 C/EBPβ 항체 선택적으로 수퍼시프트(supershift)되었다 (도 2b).

<간 세포주에서 플라본 또는 PD98059의 Nrf2/ARE 활성화 작용>

GSTA2 유도는 C/EBP/XRE 이외에도 Nrf2/ARE에 의존적임이 밝혀져 있다. 따라서 본 실험예에서는 플라본계 화합물에 의한 GSTA2 유도 작용이 Nrf2/ARE 활성화를 경유하는 지를 확인하기 위하여 간세포주에 플라본 10 μM 또는 PD98059 30 μM를 처치한 후 핵내로 이동한 Nrf2를 웨스턴블롯으로 측정하였다. 플라본과 PD98059는 Nrf2의 핵내 유입을 크게 자극하지 못하였다 (도 2c). 또한 겔 이동(gel shift) 분석법에 의한 ARE DNA 결합력 측정실험에서도 세포를 PD98059 또는 플라본으로 처치할 때 Nrf2/ARE DNA 결합활성이 변화하지 않았다 (도 2C).

실험예3

플라본 모핵을 지닌 PD98059는 MKK1-ERK활성의 선택적 억제제로 널리 사용된다. 플라본과 PD98059의 MKK1-ERK 활성억제 효능이 상기 실험예의 간 경화 치료효능과 관련되는 지의 여부를 MKK1 우성 음성 돌연변이(dominant negative mutant)를 영구적으로 주입시킨 간세포주를 이용하여 실험하였다. MKK1 우성음성 돌연변이는 간세포주에 MKK1 음성 돌연변이(dominant negtive mutant) 플라스미드 10 μg에 20 ㎕의 트랜스펙탐(Transfectam)과 배지를 넣고 37℃에서 6시간 동안 인큐베이션하였다. 플라본 또는 PD98059에 의한 C/EBP 의존적인 GSTA2 유도는 노던 블롯(Northern blot)을 활용하여 관찰하였다. 이때 GSTA2 mRNA 유도는 MKK1 음성 세포주에서도 관찰되었다 (도 3). 따라서 상기 실험예에서 관찰된 플라본과 PD98059에 의한 C/EBP매개성 GSTA2 유도효과는 PD98059에 의한 MKK1-ERK 활성억제와는 무관한 효과임을 알 수 있다. 또한, PD98059와 플라본 화합물에 의한 ERK 활성 억제를 인산화된 ERK에 선택적 항체를 사용하여 웨스턴블롯으로 정량시 PD98059의 억제효능이 1 μM 이상에서 관찰되는 데 비하여 플라본은 30 μM에서만 약한 억제작용을 보였다 (도 3). 플라본과 PD98059의 활성화된 간의 성상세포의 증식억제 및 TGFβ1 억제효능이 본 발명에서 사용한 세포 검색계에서 동등하였으므로 본 발명에서의 PD98059 효능은 MKK1-ERK 억제와는 무관한 플라본 모핵에 의한 약리 효능으로 해석할 수 있다.

실험예4

<간세포주에서의 C/EBP, Nrf2 결합부위 프로모터를 활용한 리포터 유전자 분석>

이상 실험예 결과들은 플라본계 화합물이 C/EBP 활성화를 통하여 간 경화의 치료 및 억제효능이 있음을 보여준다. 이러한 효능을 C/EBP, Nrf2 결합부위 프로모터를 활용한 리포터 유전자 분석법으로 증명하였다. pGL-1651 [C/EBP/XRE와 ARE 결합부위를 갖는 프로모터 함유 형광리포터 유전자]를 주입한 세포를 트랜스펙탐(Transfectam)과 함께 3시간 동안 트랜스펙션(Transfection)시킨 후 이들 세포를 PD98059 또는 플라본으로 18시간 동안 처치하였다. 이들 세포를 라이시스(lysis)시키고 난 후 루미노스캔(Luminoskan)을 사용하여 리포터유전자 발현의 활성도를 측정하였다. 유전자 활성은 PD98059 및 플라본에 의하여 각각 7.2배 및 9.3배 증가하였다 (도 4). 반면에 C/EBP 결합부위를 제거한 pGL-797 [ARE 결합부위만 갖는 프로모터 함유 형광 리포터 유전자] 를 주입한 세포에서는 활성 증가가 소실되었다 (도 4). 또한, C/EBP 선택적인 억제 효능을 갖는 AC/EBP (C/EBP 억제 플라스미드)를 pGL-1651과 동시에 세포에 주입한 경우에는 플라본계 화합물에 의한 리포터 유전자 활성증가가 완전히 차단되었다 (도 4). 따라서, 이러한 실험예 결과는 플라본계 화합물에 의한 간 경화 억제효과가 올티프라즈의 경우와 마찬가지로 C/EBPβ 의존적 효능임을 지지한다.

실시예 1

플라본 25mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

실시예 2

PD98059 100mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

실시예 3

제니스테인 250mg

유당 50mg

전분 10mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 전분의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

실시예 4

아피게닌 25mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

실시예 5

쿠에세틴 100mg

유당 30mg

전분 28mg

탈크 2mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캅셀제의 제조방법에 따라 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

실시예 6

캠프페롤 250mg

이성화당 10g

설탕 30mg

나트륨 CMC 100mg

레몬향 적량

정제수 적량 가하여 전체 100ml

상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조하고 100ml 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.

실시예 7

4'-브로모플라본 500mg

이성화당 20g

설탕 20g

나트륨 알지네이트 100mg

오렌지향 적량

정제수 가하여 전체 100ml

실시예 8

피세틴 250mg

유당 30mg

전분 20mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 긴밀히 혼합하고 폴리에틸린이 코팅된 포에 충진하고 씰링하여 산제를 제조하였다.

실시예 9

연질캅셀제 1정 중 함량

플라본 100mg

폴리에틸렌글리콜 400 400mg

농글리세린 55mg

정제수 35mg

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60℃로 유지한 상태에서 플라본을 넣고 교반기로 약 1,500rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합한 후 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프를 사용하여 기포를 제거하고 연질캅셀의 내용물로 한다.

연질캅셀의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132mg, 농글리세린 52mg, 디솔비톨액 70% 6mg 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제방법으로 제조한다.

본 발명의 플라본계 화합물은 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 약물로 사용이 가능하며, 비교적 저용량부터 간 섬유화 지표의 억제효과를 나타낸다. 본 발명에서 제공하는 최적의 용량을 이용한 제제는 간 섬유화 또는 간경화의 예방 또는 치료에 탁월한 효과를 가진다.

도 1a는 플라본과 PD98059의 간의 성상세포 활성화 억제 효능 {α-Smooth muscle actin (α-SMA) 발현}을 도시한 것이다.

도 1b는 플라본과 PD98059의 간의 성상세포에서의 형질전환 성장 인자-베타1 (Transforming growth factor-beta1: TGF-β1) 발현 억제 효능을 도시한 것이다.

도 1c는 플라본과 PD98059의 간의 성상세포에서의 티미딘 삽입(thymidine incorporation) 억제 효능을 도시한 것이다.

도 2a는 플라본과 PD98059의 간세포주에서의 글루타티온 S-트랜스퍼라제 A2 (Glutathione S-transferase A2: GSTA2) 유도 효능을 도시한 것이다.

도 2b는 플라본과 PD98059의 간세포주에서의 CCAAT/인핸서-결합 단백질 β (CCAAT/enhancer-binding protein β: C/EBP β) 활성화 효능을 도시한 것이다.

도 2c는 플라본과 PD98059의 간세포주에서의 Nrf2 활성화에 미치는 영향을 도시한 것이다.

도 3는 플라본과 PD98059의 MKK1 활성제거 간세포주에서의 GST 유도 효능을 도시한 것이다.

도 4는 플라본과 PD98059의 간세포주에서의 C/EBP, Nrf2 결합부위 프로모터를 활용한 리포터 유전자 분석을 도시한 것이다.

Claims

하기 화학식의 PD98059을 유효성분으로 포함하는 간 섬유화 또는 간 경화의 예방 또는 치료용 의약 조성물:
삭제
제 1항에 있어서, 경구 투여용 제제 또는 주사제로 제형화되는 의약 조성물.
제 3항에 있어서, 경구 투여용 제제가 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제 및 산제로 구성되는 군으로부터 선택되는 제제인 의약 조성물.