JP2020537686A - タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法および非アルコール性脂肪肝を治療する用途 - Google Patents

Abstract

タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、８０〜８５％のルチンを含有する。調製方法において、特定の組成、特定の混合比の酵素組成である複合酵素を選択して酵素分解を行い、マクロ孔質樹脂を用いた抽出、濃縮およびマクロ孔質樹脂を用いた単離、精製を行う。該抽出物は、非アルコール性脂肪肝に対して治療作用を有する。【選択図】図１

Description

本発明は薬品または健康製品の分野に属し、具体的にタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法および非アルコール性脂肪肝を治療する用途に関する。

非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）は、過剰な飲酒歴はないが、いくつかの原因による肝細胞の脂肪変性および脂質蓄積を特徴とした臨床病理症候群であり、主に単純脂肪肝および脂肪性肝炎を含み、脂肪性肝炎は肝線維化および肝硬変に進行する。現在、全世界で非アルコール性脂肪性肝疾患の罹患率は２０〜３０％に達し、世界で半数を超える人が非アルコール性脂肪性肝疾患を発症する危険を有している。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎およびアルコール性肝疾患の発症率を明らかに超え、すでに最も一般的な肝疾患になっている。疫学調査は、ＮＡＦＬＤがすでに中国で一般的な慢性肝疾患の１つになっており、上海、広州および香港などの先進地域の成人罹患率は１０％〜２５％に達し、低年齢化しつつあることを示している。脂肪肝は短期間で不可逆的な肝損傷に進行し、その線維化の発症率は２５％に達し、約１０％の患者は肝硬変に進行し、国民の健康を深刻に脅かす。現在、ＮＡＦＬＤの臨床治療には、治療効果が確実な特効薬はまだない。したがって、非アルコール性脂肪肝を治療する薬物の開発は、すでに研究の焦点となっている。

タカサゴサンシチソウ（Ｇｙｎｕｒａ ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｋｉｔａｍ．）は、キク科サンシチソウ属の多年生草木植物で、別名は白背天葵、片仔ファン草である。豊富なビタミン、アルカロイド類およびフラボノイド物質を含有し、薬食両用の植物である。タカサゴサンシチソウは主に肺炎、肺癌、肝炎、肝硬変、高血圧などの疾病の治療に用いられ、解熱解毒の効果も有することが研究により明らかにされている。既存技術において、ある文献は、タカサゴサンシチソウのアルコール抽出物が非アルコール性脂肪肝ラットに対して治療作用を有することを報告している。

しかしながら、現在、既存技術において、タカサゴサンシチソウの水抽出物が非アルコール性脂肪肝を治療することができるという関連報告はまだない。

このため、本発明はタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供し、さらにその調製方法および用途を提供する。

上記技術的問題を解決するため、本発明は以下の技術案を採用し、これにより実現する。

本発明は、重量百分率で８０〜８５％のルチンを含有する、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。

本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法を提供し、以下の工程を含む。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４〜８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０〜５０℃で１〜４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る。

好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記酵素分解工程で、パパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を用いて酵素分解を行う。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比は１：５〜１：３である。

さらに好ましくは、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、（０．５〜１．５）：（２〜５）：（１〜３）である。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、１：３：２である。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、
前記マクロ孔質樹脂Ａは、ＡＢ−８、ＤＭ−１３０、ＨＺ８４１、ＺＨ−００、ＺＨ−０１、ＺＨ−０２、ＺＨ−０３、ＣＡＤ−４０、ＣＡＤ−４５、ＢＳ−３０から選択される少なくとも１つである。
前記マクロ孔質樹脂Ｂは、Ｄ−１０１、Ｄ−１４０、Ｄ−１４１、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＬＤ−６０５、ＬＳＡ−１０から選択される少なくとも１つである。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記浸出工程の浸出溶媒は水であり、前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比は１：（２０〜６０）である。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７０〜８０％のエタノール水溶液であり、溶出速度は３〜１５ｍ／ｈである。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７５％のエタノール水溶液であり、溶出速度は５ｍ／ｈである。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度は０．５ｍｇ／ｍＬである。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記抽出、濃縮工程で、マクロ孔質樹脂Ａを収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０〜１５０ｒｐｍで６〜２４時間撹拌してろ過する。マクロ孔質樹脂Ａの重量に基づいて、吸着後のマクロ孔質樹脂Ａに重量で１０〜３０倍量の体積濃度７０〜９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０〜１５０ｒｐｍで６〜２４時間撹拌してろ過し、抽出液を得る。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記浸出工程で、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて浸出液のｐＨ値を４〜８に調節する。

さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記乾燥は凍結乾燥である。

本発明は、さらに上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。

本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を活性成分とし、通常の工程に基づき、通常の添加剤を添加して、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造される医薬品を提供する。

前記通常の添加剤は、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、甘味剤、矯味剤、防腐剤、基剤などである。充填剤は、デンプン、アルファ化デンプン、ラクトース、マンニトール、キトサン、微結晶セルロース、スクロースなどを含み；崩壊剤は、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウムなどを含み；滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム、タルク粉末、二酸化ケイ素などを含み；懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、スクロース、寒天、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含み；結合剤は、デンプンスラリー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含み；甘味剤は、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、スクロース、チクロ、グリチルレチン酸などを含み；矯味剤は、甘味剤および各種フレーバーを含み；防腐剤は、パラベン類、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびその塩類、ベンザルコニウムブロミド、酢酸クロロヘキシジン、ユーカリ油などを含み；基剤は、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ４０００、白ろうなどを含む。

本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または非アルコール性脂肪肝を治療する薬品または健康製品の調製における上記医薬品の応用を提供する。

本発明の技術案は以下の利点を有する。
（１）本発明は、８０〜８５％のルチンを含有するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を浸出、単離する。有効性試験の結果は、該抽出物が非アルコール性脂肪肝に対して比較的良好な治療作用を有し、非アルコール性脂肪肝ラットの脂質異常症および脂肪変性を顕著に改善することができることを表している。したがって、非アルコール性脂肪肝を潜在的に治療する薬物とすることができる。
（２）本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法は、浸出工程の後、特定の組成、特定の混合比の酵素組成である複合酵素を選択し、３０〜５０℃で酵素分解を行う。タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の構造が高温下で破壊されるのを防止するだけでなく、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物を最大限に浸出させることができる。さらにマクロ孔質樹脂を用いた抽出、濃縮およびマクロ孔質樹脂を用いた単離、精製工程により、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率は１．８％〜２．０％に達することができる。既存方法におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率より３０％以上高くなり、得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンのＨＰＬＣ純度は８０〜８５％に達することができる。

本発明の内容をより容易に明確に理解できるようにするため、以下、本発明を実施するための形態に基づき、図を組み合わせて、本発明についてさらに詳細に説明する。

図１は、本発明の実験例１における溶出液のクロマトグラムである。 図２は、本発明の実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の赤外吸収スペクトルである。 図３は、本発明の実施例１におけるルチン標準物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムである。 図４は、本発明の実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 図５は、本発明の実験例１におけるＮＡＦＬＤラットの肝臓組織に対するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の病理学的影響である（４０×、ＨＥ染色）。

本発明は以下の実施例および実験例において、タカサゴサンシチソウを福建省ザン州市竜文区登科村から入手し、タカサゴサンシチソウと同定している。

本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で３０倍量の水を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を５に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２５ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１：３：２のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、４０℃で３時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＡＢ−８マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１００ｒｐｍで１２時間撹拌して、ろ過する。ＡＢ−８マクロ孔質樹脂の重量に基づき、吸着後のＡＢ−８マクロ孔質樹脂に重量で２０倍量の体積濃度７５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１２０ｒｐｍで１２時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を１００００ｒｐｍで１０分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂Ｄ−１０１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７５％のエタノール水溶液を用いて、５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図（クロマトグラムは図１に示す）を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。

計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は２．０％である。

図１から、溶出液は３４０ｍｉｎ部分に１つの明らかな吸収ピークを有し、ピーク形状は比較的単一であることがわかり、溶出液中のフラボノイドが相対して比較的純粋であることを説明している。

Ａ、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で赤外吸収スペクトルによる同定を行う。
一定質量の乾燥させたルチン標準物質に１：１００で乾燥させた臭化カリウムを添加し、すり混ぜた後、固体の錠剤を作製する。フーリエ赤外線分光光度計を用いて、スキャン範囲４０００〜４００ｃｍ^−１、分解能４、スキャン回数４の条件で赤外吸収スペクトルを作成する。同じ方法で精製後のタカサゴサンシチソウ抽出物の赤外吸収スペクトルを作成し、比較同定する。結果は図２に示す通りである。

図２から以下のことがわかる。ルチン標準物質およびタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の赤外吸収スペクトルは、それぞれ３６８５．４５５〜３０１８．１７７ｃｍ^−１前後に、広く強い吸収ピークが出現する。これは−ＯＨの伸縮振動ピークであり、フェノール性ヒドロキシ基または糖のヒドロキシ基が存在し、数が比較的多いことを表す。２９１４．０３６ｃｍ^−１部分に弱い吸収ピークが出現し、これは炭素水素結合の伸縮振動ピークであり、飽和炭素の水素が比較的少ないことを説明している。１６５４．６９４ｃｍ^−１部分にＣ＝Ｏの中強度の伸縮振動ピークが出現し、両者の位置およびピーク形状は基本的に一致し、抽出物がフラボノイド物質であることを説明している。１３７１．８８、１３６２．８９ｃｍ^−１部分にヒドロキシ基の変角振動ピークが出現する。８０４．８０、８１０．５６ｃｍ^−１部分にベンゼン環のオルト位の水素による吸収ピークが出現する。１０１０．０７〜６９６．６２ｃｍ^−１部分にベンゼン環の置換基の位置による吸収ピークが出現するが、ピーク位置は異なり、抽出物およびルチンのヒドロキシ基の置換位置が異なることを説明している。これらは抽出物中にヒドロキシ基、カルボニル基および異なる位置が置換されたベンゼン環などの官能基を含有し、特徴的な吸収ピークは基本的に一致することを表している。したがって、抽出物がフラボノイド化合物であると確定することができる。

Ｂ、以下の方法に基づいて、液体クロマトグラフィにより、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量を分析する。
Ｂ１、液体クロマトグラフ条件の確定
液体クロマトグラフ条件：ガードカラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＧｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１２．５ｍｍ、５μｍ）：ＺＯＲ ＢＺＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、検出波長３６８ｎｍ、２５４ｎｍ、２１０ｎｍ、サンプル体積１０μＬ、移動相０．０３％ギ酸水溶液（Ａ）、アセトニトリル（Ｂ）、グラジエント溶離プログラム：０〜１０ｍｉｎ、２０％Ｂ；１０〜１２ｍｉｎ、２０％〜２４％Ｂ；１２〜２０ｍｉｎ、２４％Ｂ；２０〜２５ｍｉｎ、２４％〜３０％Ｂ；２５〜４８ｍｉｎ、３０％Ｂ。

Ｂ２、標準物質溶液の調製
ルチン０．００１ｇを正確に秤取し、１ｍＬメタノール中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの単一の標準物質溶液を調製する。使い捨てフィルタでろ過し、小さな試験管に入れて使用に備える。

Ｂ３、測定
標準物質溶液、被験物質溶液（実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物であり、濃度１μｇ／μＬのメタノール溶液に調製した）を精密に量り、液体クロマトグラフの検出条件に基づいて、それぞれ検出分析する。

標準物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムは図３に示す通りであり、被験物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムは図４に示す通りである。

図３から、ルチン標準物質溶液は、１０分間で完全に分離することができることがわかる。ルチンは本実験のクロマトグラフ条件で、クロマトグラムのベースラインが基本的に平らでまっすぐである。クロマトグラフピークにテーリング現象がなく、不純物の干渉もなく、ピークの出現は比較的早く、その保持時間は２．７４５ｍｉｎであることを示している。

図４から、面積百分率法で計算し、タカサゴサンシチソウ抽出物中のルチン含量が８１．２９％であることがわかる。

本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で２０倍量の水を添加して浸出させ、希水酸化ナトリウム溶液で浸出液のｐＨ値を８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２０ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で０．５：５：１のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、３０℃で４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＤＭ−１３０マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌して、ろ過する。ＤＭ−１３０マクロ孔質樹脂の重量に基づいて、吸着後のＤＭ−１３０マクロ孔質樹脂に重量で１０倍量の体積濃度９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を６０００ｒｐｍで８分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＨＰ−２１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度８０％のエタノール水溶液を用いて、３ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。

計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は１．８２％である。

実施例１における「項目Ｂ」に基づいて、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンを測定する。測定分析により、ＨＰＬＣクロマトグラムで、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量が８０％であることがわかる。

本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で６０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を４に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に３２ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１．５：２：３のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、５０℃で１時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＺＨ−０１マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌して、ろ過する。ＺＨ−０１マクロ孔質樹脂の重量に基づいて、吸着後のＺＨ−０１マクロ孔質樹脂に重量で３０倍量の体積濃度７０％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を８０００ｒｐｍで５分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＸＡＤ−３を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７０％のエタノール水溶液を用いて、１５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。

計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は１．９１％である。

実施例１における「項目Ｂ」に基づいて、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンを測定する。測定分析により、ＨＰＬＣクロマトグラムで、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量が８５％であることがわかる。

実験例１ タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の非アルコール性脂肪肝ラットに対する治療作用の研究
１、実験目的
高脂肪飼料で誘導した非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）モデルラットに対するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の治療効果を研究する。

２、材料および方法
２．１ 実験動物
健康なＳＰＦレベルの雄Ｓｐａｇｕｅ−Ｄａｗｌａｙ（ＳＤ）ラット６２匹は、体重２１０±１０ｇであり、上海市西普爾−必凱実験動物有限公司から提供された（合格証番号：２００７０００５３１４９４、許可証番号：ＳＣＸＫ（フゥー）２００７−０００５）。

２．２ 被験薬物および実験試薬
実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を被験薬物とし、高、中、低の各群は、使用するときに蒸留水で希釈してから投与する。このうち３つの用量はそれぞれ低用量６ｍｇ／１０ｍＬ、中用量１２ｍｇ／ｍＬ、高用量２４ｍｇ／１０ｍＬである。

総トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、高比重リポタンパク（ＨＤＬ−Ｃ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ−Ｃ）のキットは、南京建成工程研究所から購入した。高脂肪飼料（豚脂１０％、コレステロール２％、豚胆汁酸塩０．７％、基礎飼料８７．３％）は、福州ビン侯竹岐動物服務中心から提供され、普通飼料は福建中医薬大学実験動物中心から提供された。

２．３ 実験機器
電子天秤（上海奥豪斯儀器有限公司）、ＢＸ５１Ｔ−ＰＨＤ−Ｊ１１顕微鏡（日本ＯＬＹＭＰＵＳ社）、低速遠心機（米国Ｔｈｅｒｍｏ社）、生物組織パラフィン包埋装置（湖北孝感亜光医用電子技術有限公司）、生物組織自動脱水装置（亜光医用電子技術有限公司）、全自動ミクロトーム（ドイツライカ）、ＢＳ−１２０全自動生化学分析装置（深ゼン邁端生物医療電子股フン有限公司）。

３、実験方法
３．１ 動物の群分けおよびモデルの構築
ＳＰＦレベルの雄ＳＤラット６２匹を選択し、１週間の適応飼育の後、体重に基づいて、無作為に正常対照群（１６匹）および高脂肪群（４６匹）の２群に分ける。正常対照群は基礎飼料を与えて飼育し、高脂肪群は高脂肪飼料で飼育する。動物は自由に摂餌、飲水を行い、明期、暗期は交代で各１２ｈであり、毎週１回体重を量る。

６週間実験した後、それぞれ正常対照群および高脂肪飲食群から無作為に６匹抽出して屠殺し、肝臓を採取して組織病理切片を作製する。肝臓組織を病理学的に観察すると、モデル群ラットの肝臓脂肪変性は深刻であり、単位面積の脂肪変性はすでに２／３を超え、肝組織はびまん性大滴性の重度脂肪変性、肝細胞の点状壊死および肝組織の軽度の線維化増殖を示すことを結果は明らかにしている。これは、非アルコール性脂肪肝モデルの構築に成功したことを表している。

モデルの構築に成功したことが確定すると、高脂肪群の残りの４０匹のラットを、モデル対照群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の低用量群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の中用量群およびタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高用量群に、無作為に各群１０匹で分ける。７週目から、ブランク対照群およびモデル群に生理食塩水を強制投与する以外、残りの各群ラットに異なる用量のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を与える（低用量群は６ｍｇ／１０ｍＬタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を与え、中用量群は１２ｍｇ／１０ｍＬタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を与え、高用量群は２４ｍｇ／１０ｍＬタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を与える）。１０週目の末に一晩１２ｈ絶食させ、次の日にペントバルビタールナトリウム４０ｍｇ／ｋｇで腹腔内麻酔を行う。その後、腹部大動脈法で採血し、３０００ｒ／ｍｉｎで１５ｍｉｎ遠心分離し、血清を分離して、−８０℃の冷凍庫で保存し、検査に備える。

３．２ 実験データの観察および測定
実験過程において、ラットの活動度、毛髪の光沢、食欲および死亡などの状況を観察し、毎週体重を量って記録する。肝臓および内臓脂肪体を採取し、重さを量って写真を撮り、各群マウスの肝臓の大体の形態を観察した後、肝右葉部分を採取して４％パラホルムアルデヒド溶液で固定する。通常のパラフィン包埋を行い、病理切片にして、通常のＨＥ染色を行う。光学顕微鏡で観察し、さらに中華肝臓病学会の脂肪肝およびアルコール性肝疾患グループが制定したＮＡＦＬＤ診断基準を参考にして、組織の脂肪変性、炎症および壊死の程度を評価する。全自動生化学分析装置で、血清のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＬ）、コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、高比重リポタンパク（ＨＤＬ−Ｃ）および低比重リポタンパク（ＬＤＬ−Ｃ）の含量を測定する。

４、実験データ処理
すべての実験データをＳＰＳＳ１８．０パッケージソフトウェアで分析し、結果は平均±標準偏差（ｘ±ｓ）で表す。複数の群のデータ間の比較は一元配置分散分析を使用し、２つの群のデータ間の比較はｔ検定を採用し、計数データは順位和検定を用いる。Ｐ＜０．０５は有意差を有することを表す。

５、実験結果
５．１ ＮＡＦＬＤラット肝臓の大体の形状に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響
正常対照群ラットは肝臓の外観が明るい赤色を呈し、大きさは正常で、形状は規則的であり、柔らかく、表面は滑らかである。モデル群ラットは肝臓体積が明らかに増加し、クリーム色を呈し、縁部は鈍くて厚い。表面はびまん性の微粒子様隆起を有し、切断面は脂っこく、比較的もろく、部分的に黄白色の変性病巣を有する。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群においては、肝臓体積は正常群よりやや増大し、色はモデル群より赤色に寄り、正常な色に近く、切断面に明らかな脂っこさはない。

５．２ ＮＡＦＬＤラットの肝臓組織に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす病理学的影響
ＮＡＦＬＤラットの肝臓組織に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす病理学的影響は、図５に示す通りである。

図５から以下のことがわかる。正常対照群ラットの肝小葉構造は完全で、細胞の輪郭は明瞭であり、中央静脈は大きくて壁が薄く、肝細胞索は放射状を呈して配列し、肝細胞脂肪変性および炎症細胞浸潤はない。モデル群は、肝組織の細胞質内に幅広く広がって分布した大きな脂肪空胞を確認でき、肝細胞の体積が増大する。肝細胞索の配列は乱れ、肝類洞が狭くなり、細胞核は一方向に押される。病変は中央静脈の周囲が最も明らかであり、炎症細胞浸潤を有する。肝小葉にも及び、主に大滴性脂肪変性である。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群は、ラット肝細胞脂肪変性の量および程度がモデル群より明らかに軽減し、高倍率レンズ下でのみ肝細胞の小空胞状変性が確認できる。

５．３ ＮＡＦＬＤラットの肝臓重量、内臓脂肪体に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響
ＮＡＦＬＤラットの肝臓重量、内臓脂肪体に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響は、表１に示す通りである。

表１から以下のことがわかる。モデル群ラットは、肝臓重量が正常対照群より明らかに上昇し、差は統計的有意性を有する（Ｐ＜０．０１）。タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群およびモデル群は、差がいずれも統計的有意性を有する（Ｐ＜０．０５）。モデル群ラットは、内臓脂肪体（腎周囲および副睾丸）の重量が正常対照群より明らかに上昇し、タカサゴサンシチソウの各用量群はいずれも肝臓重量を明らかに軽減させ、内臓脂肪体の重量を軽減させることができ、差は統計的有意性を有する（Ｐ＜０，０５）が、内臓脂肪体の重量について、各実験群間の差は統計的有意性を有さない（Ｐ＜０．０５）。

５．４ ＮＡＦＬＤラット血清の生化学指標に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響
ＮＡＦＬＤラット血清の生化学指標に対してタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が及ぼす影響は、表２〜４に示す通りである。

表２〜３から、モデル群ラットは、血清のＴＧ、ＴＣ、ＡＬＴおよびＡＳＴ含量が対照群より明らかに高く（Ｐ＜０．０５）；タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群ラットは、血清のＴＧ、ＴＣ、ＡＬＴ、ＡＳＴ含量がいずれもモデル群より有意に低い（Ｐ＜０．０５）ことがわかる。

表４から、対照群と比較して、モデル群ラットは、ＬＤＬ−Ｃが顕著に上昇し、ＨＤＬ−Ｃは明らかに低下し、いずれも統計的有意性を有し（Ｐ＜０．０５）；タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の各用量群は、ＨＤＬ−Ｃをモデル群と比較すると、明らかな統計学的差異はなく、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高、中用量群は、ＬＤＬ−Ｃをモデル群と比較すると、顕著に低下する（Ｐ＜０．０５）ことがわかる。

６、実験の結論
タカサゴンサンシチソウのフラボノイド抽出物は、非アルコール性脂肪肝に対して比較的良好な治療作用を有し、非アルコール性脂肪肝ラットの脂質異常症および脂肪変性を顕著に改善することができる。

上記実施例は実施した例を明確に説明したに過ぎず、実施方式を限定するものでないことは明らかである。当業者は、上記説明を基に、その他の様々な形式の変更または修正を行うこともできる。ここでは、すべての実施方式を網羅する必要はなく、することもできない。これから派生した明らかな変更または修正は、依然として本発明の保護の範囲内である。

Claims (10)

1. 重量百分率で８０〜８５％のルチンを含有することを特徴とする、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物。
2. 以下の工程
   （１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４〜８に調節して反応液を得る；
   （２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０〜５０℃で１〜４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する；
   （３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る；
   （４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る；
   を含むことを特徴とする、請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
3. 前記酵素分解工程で、パパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を用いて酵素分解を行い；
   前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比が１：５〜１：３である
   ことを特徴とする、請求項２に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
4. 前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比が、（０．５〜１．５）：（２〜５）：（１〜３）であることを特徴とする、請求項２または３に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
5. 前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比が、１：３：２であることを特徴とする、請求項４に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
6. 前記マクロ孔質樹脂Ａが、ＡＢ−８、ＤＭ−１３０、ＨＺ８４１、ＺＨ−００、ＺＨ−０１、ＺＨ−０２、ＺＨ−０３、ＣＡＤ−４０、ＣＡＤ−４５、ＢＳ−３０から選択される少なくとも１つであり；
   前記マクロ孔質樹脂Ｂが、Ｄ−１０１、Ｄ−１４０、Ｄ−１４１、ＸＡＤ−３、ＸＡＤ−４、ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＬＤ−６０５、ＬＳＡ−１０から選択される少なくとも１つである
   ことを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
7. 前記浸出工程の浸出溶媒が水であり、前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比が１：（２０〜６０）である
   ことを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
8. 前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７０〜８０％のエタノール水溶液であり、溶出速度は３〜１５ｍ／ｈであり；
   前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬである
   ことを特徴とする、請求項２〜７のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
9. 請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または請求項２〜８のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を活性成分とし、通常の工程に基づき、通常の添加剤を添加して、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造されることを特徴とする、医薬品。
10. 請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、請求項２〜８のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または非アルコール性脂肪肝を治療する薬品もしくは健康製品の調製における請求項９に記載の医薬品の応用。