JP7166345B2 - タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法および高尿酸血症を治療する用途 - Google Patents
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Description
本発明は薬品または健康製品の分野に属し、具体的にタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、ならびにその調製方法および高尿酸血症を治療する用途に関する。
痛風は、プリン代謝障害および（または）尿酸排泄の減少により血中尿酸レベルが上昇し、尿酸一ナトリウム結晶が関節、軟骨および腎臓などに蓄積することによる代謝障害である。その主な症状は反復発作性の関節の赤み、腫れ、発熱、痛みおよび機能障害であり、さらには関節の奇形、腎結石および尿酸腎症である。尿酸排泄の減少または尿酸生成の増加による高尿酸血症は、痛風の主要な病因である。高尿酸血症は痛風の直接の誘因であるだけでなく、メタボリックシンドローム、ＩＩ型糖尿病、高血圧、心血管疾患、慢性腎疾患などと密接に関係する。高尿酸血症および痛風の発病メカニズムは、遺伝要素、環境要素、糖原病、腎機能不全、血液疾患および薬物などと関係する。
近年、痛風および高尿酸血症の罹患率は年々上昇している。中国において、成人の高尿酸血症の罹患率は８．４％であり、男性は女性より高く、それぞれ９．９％、７．０％であり；都市の住民は農村の住民より明らかに高く、それぞれ１４．９％、６．６％であり；一人当たりの国内総生産（ＧＤＰ）レベルが比較的高い地域は、高尿酸血症の罹患率も比較的高いことを疫学研究は明らかにしている。
現在、抗高尿酸血症に用いる薬物は、主に３つに分類される。つまり、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、尿酸トランスポータ１（ＵＲＡＴＡ１）阻害剤および尿酸オキシダーゼである。臨床で尿酸代謝を調節する薬物は、アロプリノール、プロベネシドなどがあり、急性痛風性関節炎を治療する薬物は、コルヒチン、非ステロイド性抗炎症薬およびグルココルチコイドなどがある。しかしながら、これらの薬物は、頭痛、皮疹、水腫、胃腸出血、慢性腎乳頭壊死および致死性過敏症候群など、多くの副作用を有し、したがってこれらを臨床的に応用するには多くの制限がある。
昔から、中国、インド、カナダなどの多くの国家および地域で、植物薬を用いて高尿酸血症および痛風を治療する伝統がある。
タカサゴサンシチソウ（Ｇｙｎｕｒａ ｆｏｒｍｏｓａｎａ Ｋｉｔａｍ．）は、キク科サンシチソウ属の多年生草木植物で、別名は白背天葵、片仔ファン草である。豊富なビタミン、アルカロイド類およびフラボノイド物質を含有し、薬食両用の植物である。タカサゴサンシチソウは主に肺炎、肺癌、肝炎、肝硬変、高血圧などの疾病の治療に用いられ、解熱解毒の効果も有することが研究により明らかにされている。
現在、既存技術に、タカサゴサンシチソウ抽出物を高尿酸血症の治療に用いることができるという関連報告はまだない。
このため、本発明はタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供し、さらにその調製方法および用途を提供する。
上記技術的問題を解決するため、本発明は以下の技術案を採用し、これにより実現する。
本発明は、重量百分率で８０～８５％のルチンを含有する、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。
本発明は、重量百分率で８０～８５％のルチンを含有する、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法を提供し、以下の工程を含む。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４～８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０～５０℃で１～４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４～８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０～５０℃で１～４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る。
好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記酵素分解工程で、パパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を用いて酵素分解を行う。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比は１：５～１：３である。
さらに好ましくは、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、（０．５～１．５）：（２～５）：（１～３）である。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、１：３：２である。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比は、１：３：２である。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、
前記マクロ孔質樹脂Ａは、ＡＢ－８、ＤＭ－１３０、ＨＺ８４１、ＺＨ－００、ＺＨ－０１、ＺＨ－０２、ＺＨ－０３、ＣＡＤ－４０、ＣＡＤ－４５、ＢＳ－３０から選択される少なくとも１つである。
前記マクロ孔質樹脂Ｂは、Ｄ－１０１、Ｄ－１４０、Ｄ－１４１、ＸＡＤ－３、ＸＡＤ－４、ＨＰ－２０、ＨＰ－２１、ＬＤ－６０５、ＬＳＡ－１０から選択される少なくとも１つである。
前記マクロ孔質樹脂Ａは、ＡＢ－８、ＤＭ－１３０、ＨＺ８４１、ＺＨ－００、ＺＨ－０１、ＺＨ－０２、ＺＨ－０３、ＣＡＤ－４０、ＣＡＤ－４５、ＢＳ－３０から選択される少なくとも１つである。
前記マクロ孔質樹脂Ｂは、Ｄ－１０１、Ｄ－１４０、Ｄ－１４１、ＸＡＤ－３、ＸＡＤ－４、ＨＰ－２０、ＨＰ－２１、ＬＤ－６０５、ＬＳＡ－１０から選択される少なくとも１つである。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記浸出工程の浸出溶媒は水であり、前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比は１：（２０～６０）である。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７０～８０％のエタノール水溶液であり、溶出速度は３～１５ｍ／ｈである。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７５％のエタノール水溶液であり、溶出速度は５ｍ／ｈである。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度は０．５ｍｇ／ｍＬである。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記抽出、濃縮工程で、マクロ孔質樹脂Ａを収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０～１５０ｒｐｍで６～２４時間撹拌してろ過する。マクロ孔質樹脂Ａの重量に基づいて、吸着後のマクロ孔質樹脂Ａに重量で１０～３０倍量の体積濃度７０～９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０～１５０ｒｐｍで６～２４時間撹拌してろ過し、抽出液を得る。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記浸出工程で、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて浸出液のｐＨ値を４～８に調節する。
さらに好ましくは、上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法において、前記乾燥は凍結乾燥である。
本発明は、さらに上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を提供する。
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を活性成分とし、通常の工程に基づき、通常の添加剤を添加して、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造される医薬品を提供する。
前記通常の添加剤は、充填剤、崩壊剤、滑沢剤、懸濁化剤、結合剤、甘味剤、矯味剤、防腐剤、基剤などである。充填剤は、デンプン、アルファ化デンプン、ラクトース、マンニトール、キトサン、微結晶セルロース、スクロースなどを含み；崩壊剤は、デンプン、アルファ化デンプン、微結晶セルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウムなどを含み；滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム、タルク粉末、二酸化ケイ素などを含み；懸濁化剤は、ポリビニルピロリドン、微結晶セルロース、スクロース、寒天、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含み；結合剤は、デンプンスラリー、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを含み；甘味剤は、サッカリンナトリウム、アスパルテーム、スクロース、チクロ、グリチルレチン酸などを含み；矯味剤は、甘味剤および各種フレーバーを含み；防腐剤は、パラベン類、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびその塩類、ベンザルコニウムブロミド、酢酸クロロヘキシジン、ユーカリ油などを含み；基剤は、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ４０００、白ろうなどを含む。
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または高尿酸血症を治療する薬品もしくは健康製品の調製における上記医薬品の応用を提供する。
本発明は、さらに上記タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、上記調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、または痛風を治療する薬品もしくは健康製品の調製における上記医薬品の応用を提供する。
本発明の技術案は以下の利点を有する。
（１）本発明は、８０～８５％のルチンを含有するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を浸出、単離する。有効性試験の結果は、該抽出物が一定程度に高尿酸血症モデルマウスの肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性を低下させ、尿酸の合成を低下させることができ、一定の尿酸降下作用を有し、高尿酸血症または痛風を潜在的に治療する薬物とすることができることを表している。
（２）本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法は、浸出工程の後、特定の組成、特定の混合比の酵素組成である複合酵素を選択し、３０～５０℃で酵素分解を行う。タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の構造が高温下で破壊されるのを防止するだけでなく、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物を最大限に浸出させることができる。さらにマクロ孔質樹脂を用いた抽出、濃縮およびマクロ孔質樹脂を用いた単離、精製工程により、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率は１．８％～２．０％に達する。既存方法におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率より３０％以上高くなり、得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンのＨＰＬＣ純度は８０～８５％に達する。
（１）本発明は、８０～８５％のルチンを含有するタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を浸出、単離する。有効性試験の結果は、該抽出物が一定程度に高尿酸血症モデルマウスの肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性を低下させ、尿酸の合成を低下させることができ、一定の尿酸降下作用を有し、高尿酸血症または痛風を潜在的に治療する薬物とすることができることを表している。
（２）本発明のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法は、浸出工程の後、特定の組成、特定の混合比の酵素組成である複合酵素を選択し、３０～５０℃で酵素分解を行う。タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の構造が高温下で破壊されるのを防止するだけでなく、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物を最大限に浸出させることができる。さらにマクロ孔質樹脂を用いた抽出、濃縮およびマクロ孔質樹脂を用いた単離、精製工程により、タカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率は１．８％～２．０％に達する。既存方法におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物の抽出率より３０％以上高くなり、得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンのＨＰＬＣ純度は８０～８５％に達する。
本発明の内容をより容易に明確に理解できるようにするため、以下、本発明を実施するための形態に基づき、図を組み合わせて、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明は以下の実施例および実験例において、タカサゴサンシチソウを福建省ザン州市竜文区登科村から入手し、タカサゴサンシチソウと同定している。
本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で３０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を５に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２５ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１：３：２のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、４０℃で３時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＡＢ－８マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１００ｒｐｍで１２時間撹拌して、ろ過する。ＡＢ－８マクロ孔質樹脂の重量に基づき、吸着後のＡＢ－８マクロ孔質樹脂に重量で２０倍量の体積濃度７５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１２０ｒｐｍで１２時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を１００００ｒｐｍで１０分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂Ｄ－１０１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７５％のエタノール水溶液を用いて、５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図（クロマトグラムは図１に示す）を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で３０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を５に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２５ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１：３：２のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、４０℃で３時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＡＢ－８マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１００ｒｐｍで１２時間撹拌して、ろ過する。ＡＢ－８マクロ孔質樹脂の重量に基づき、吸着後のＡＢ－８マクロ孔質樹脂に重量で２０倍量の体積濃度７５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１２０ｒｐｍで１２時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を１００００ｒｐｍで１０分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂Ｄ－１０１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７５％のエタノール水溶液を用いて、５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図（クロマトグラムは図１に示す）を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は２．０％である。
図１から、溶出液は３４０ｍｉｎ部分に１つの明らかな吸収ピークを有し、ピーク形状は比較的単一であることがわかり、溶出液中のフラボノイドが相対して比較的純粋であることを説明している。
Ａ、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で赤外吸収スペクトルによる同定を行う。
一定質量の乾燥させたルチン標準物質に１：１００で乾燥させた臭化カリウムを添加し、すり混ぜた後、固体の錠剤を作製する。フーリエ赤外線分光光度計を用いて、スキャン範囲４０００～４００ｃｍ－１、分解能４、スキャン回数４の条件で赤外吸収スペクトルを作成する。同じ方法で精製後のタカサゴサンシチソウ抽出物の赤外吸収スペクトルを作成し、比較同定する。結果は図２に示す通りである。
一定質量の乾燥させたルチン標準物質に１：１００で乾燥させた臭化カリウムを添加し、すり混ぜた後、固体の錠剤を作製する。フーリエ赤外線分光光度計を用いて、スキャン範囲４０００～４００ｃｍ－１、分解能４、スキャン回数４の条件で赤外吸収スペクトルを作成する。同じ方法で精製後のタカサゴサンシチソウ抽出物の赤外吸収スペクトルを作成し、比較同定する。結果は図２に示す通りである。
図２から以下のことがわかる。ルチン標準物質およびタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の赤外吸収スペクトルは、それぞれ３６８５．４５５～３０１８．１７７ｃｍ－１前後に、広く強い吸収ピークが出現する。これは－ＯＨの伸縮振動ピークであり、フェノール性ヒドロキシ基または糖のヒドロキシ基が存在し、数が比較的多いことを表す。２９１４．０３６ｃｍ－１部分に弱い吸収ピークが出現し、これは炭素水素結合の伸縮振動ピークであり、飽和炭素の水素が比較的少ないことを説明している。１６５４．６９４ｃｍ－１部分にＣ＝Ｏの中強度の伸縮振動ピークが出現し、両者の位置およびピーク形状は基本的に一致し、抽出物がフラボノイド物質であることを説明している。１３７１．８８、１３６２．８９ｃｍ－１部分にヒドロキシ基の変角振動ピークが出現する。８０４．８０、８１０．５６ｃｍ－１部分にベンゼン環のオルト位の水素による吸収ピークが出現する。１０１０．０７～６９６．６２ｃｍ－１部分にベンゼン環の置換基の位置による吸収ピークが出現するが、ピーク位置は異なり、抽出物およびルチンのヒドロキシ基の置換位置が異なることを説明している。これらは抽出物中にヒドロキシ基、カルボニル基および異なる位置が置換されたベンゼン環などの官能基を含有し、特徴的な吸収ピークは基本的に一致することを表している。したがって、抽出物がフラボノイド化合物であると確定することができる。
Ｂ、以下の方法に基づいて、液体クロマトグラフィにより、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量を分析する。
Ｂ１、液体クロマトグラフ条件の確定
液体クロマトグラフ条件：ガードカラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＧｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１２．５ｍｍ、５μｍ）：ＺＯＲ ＢＺＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、検出波長３６８ｎｍ、２５４ｎｍ、２１０ｎｍ、サンプル体積１０μＬ、移動相０．０３％ギ酸水溶液（Ａ）、アセトニトリル（Ｂ）、グラジエント溶離プログラム：０～１０ｍｉｎ、２０％Ｂ；１０～１２ｍｉｎ、２０％～２４％Ｂ；１２～２０ｍｉｎ、２４％Ｂ；２０～２５ｍｉｎ、２４％～３０％Ｂ；２５～４８ｍｉｎ、３０％Ｂ。
Ｂ１、液体クロマトグラフ条件の確定
液体クロマトグラフ条件：ガードカラムＥｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８ ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＧｕａｒｄ Ｃｏｌｕｍｎ（４．６×１２．５ｍｍ、５μｍ）：ＺＯＲ ＢＺＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度３５℃、検出波長３６８ｎｍ、２５４ｎｍ、２１０ｎｍ、サンプル体積１０μＬ、移動相０．０３％ギ酸水溶液（Ａ）、アセトニトリル（Ｂ）、グラジエント溶離プログラム：０～１０ｍｉｎ、２０％Ｂ；１０～１２ｍｉｎ、２０％～２４％Ｂ；１２～２０ｍｉｎ、２４％Ｂ；２０～２５ｍｉｎ、２４％～３０％Ｂ；２５～４８ｍｉｎ、３０％Ｂ。
Ｂ２、標準物質溶液の調製
ルチン０．００１ｇを正確に秤取し、１ｍＬメタノール中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの単一の標準物質溶液を調製する。使い捨てフィルタでろ過し、小さな試験管に入れて使用に備える。
ルチン０．００１ｇを正確に秤取し、１ｍＬメタノール中に溶解し、１ｍｇ／ｍＬの単一の標準物質溶液を調製する。使い捨てフィルタでろ過し、小さな試験管に入れて使用に備える。
Ｂ３、測定
標準物質溶液、被験物質溶液（実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物であり、濃度１μｇ／μＬのメタノール溶液に調製した）を精密に量り、液体クロマトグラフの検出条件に基づいて、それぞれ検出分析する。
標準物質溶液、被験物質溶液（実施例１で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物であり、濃度１μｇ／μＬのメタノール溶液に調製した）を精密に量り、液体クロマトグラフの検出条件に基づいて、それぞれ検出分析する。
標準物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムは図３に示す通りであり、被験物質溶液のＨＰＬＣクロマトグラムは図４に示す通りである。
図３から、ルチン標準物質溶液は、１０分間で完全に分離することができることがわかる。ルチンは本実験のクロマトグラフ条件で、クロマトグラムのベースラインが基本的に平らでまっすぐである。クロマトグラフピークにテーリング現象がなく、不純物の干渉もなく、ピークの出現は比較的早く、その保持時間は２．７４５ｍｉｎであることを示している。
図４から、面積百分率法で計算し、タカサゴサンシチソウ抽出物中のルチン含量が８１．２９％であることがわかる。
本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で２０倍量の水を添加して浸出させ、希水酸化ナトリウム溶液で浸出液のｐＨ値を８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２０ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で０．５：５：１のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、３０℃で４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＤＭ－１３０マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌して、ろ過する。吸着後のＤＭ－１３０マクロ孔質樹脂に重量で１０倍量の体積濃度９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を６０００ｒｐｍで８分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＨＰ－２１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度８０％のエタノール水溶液を用いて、３ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で２０倍量の水を添加して浸出させ、希水酸化ナトリウム溶液で浸出液のｐＨ値を８に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に２０ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で０．５：５：１のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、３０℃で４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＤＭ－１３０マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌して、ろ過する。吸着後のＤＭ－１３０マクロ孔質樹脂に重量で１０倍量の体積濃度９５％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、８０ｒｐｍで２４時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を６０００ｒｐｍで８分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＨＰ－２１を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度８０％のエタノール水溶液を用いて、３ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は１．８２％である。
実施例１における「項目Ｂ」に基づいて、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンを測定する。測定分析により、ＨＰＬＣクロマトグラムで、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量が８０％であることがわかる。
本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物は、以下の方法で調製する。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で６０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を４に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に３２ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１．５：２：３のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、５０℃で１時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＺＨ－０１マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌して、ろ過する。吸着後のＺＨ－０１マクロ孔質樹脂に重量で３０倍量の体積濃度７０％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイドの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を８０００ｒｐｍで５分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＸＡＤ－３を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７０％のエタノール水溶液を用いて、１５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
（１）浸出：タカサゴサンシチソウ１００ｇに重量で６０倍量の水を添加して浸出させ、希塩酸で浸出液のｐＨ値を４に調節して反応液を得る。
（２）酵素分解：その後、反応液中に３２ｇの複合酵素（該複合酵素は重量比で１．５：２：３のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる）を添加して酵素分解を行い、５０℃で１時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する。
（３）抽出、濃縮：ＺＨ－０１マクロ孔質樹脂を収容した抽出槽中にろ液を添加し、３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌して、ろ過する。吸着後のＺＨ－０１マクロ孔質樹脂に重量で３０倍量の体積濃度７０％のエタノール溶液を添加する。その後３０℃、１５０ｒｐｍで６時間撹拌し、ろ過して抽出液を得る。抽出液を合わせて、タカサゴサンシチソウのフラボノイドの濃度が０．５ｍｇ／ｍＬになるまで抽出液を減圧濃縮し、濃縮液を得る。
（４）単離、精製：濃縮液を８０００ｒｐｍで５分間高速遠心分離し、マクロ孔質樹脂ＸＡＤ－３を収容したクロマトグラフィカラム内に上清液を添加し、６０ｍｉｎ静止吸着させる。体積濃度７０％のエタノール水溶液を用いて、１５ｍ／ｈの速度で溶出し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定する。吸光度値を縦座標、溶出時間を横座標として、溶出曲線図を作成し、溶出曲線中の吸収ピーク範囲内の溶出液を収集し、濃縮、凍結乾燥して、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を得る。
計算の結果、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド化合物における抽出率は１．９１％である。
実施例１における「項目Ｂ」に基づいて、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチンを測定する。測定分析により、ＨＰＬＣクロマトグラムで、本実施例のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物におけるルチン含量が８５％であることがわかる。
実験例１ タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の抗痛風に対する実験研究
１、実験の目的
キサンチンを高尿酸血症モデルに腹腔注射する方式を採用して、体内の尿酸前駆体含量を増加させ、尿酸生成を増加させ、マウス高尿酸血症モデルを作製する。高尿酸血症マウスにタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を胃内注入し、マウス血清中の尿酸の抑制率、酸無水物の抑制率および肝臓キサンチンオキシダーゼ活性の抑制率を指標とし、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が高尿酸血症による痛風症状に及ぼす影響を探る。
１、実験の目的
キサンチンを高尿酸血症モデルに腹腔注射する方式を採用して、体内の尿酸前駆体含量を増加させ、尿酸生成を増加させ、マウス高尿酸血症モデルを作製する。高尿酸血症マウスにタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を胃内注入し、マウス血清中の尿酸の抑制率、酸無水物の抑制率および肝臓キサンチンオキシダーゼ活性の抑制率を指標とし、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が高尿酸血症による痛風症状に及ぼす影響を探る。
２、実験材料
２．１ 実験動物
クリーングレード、体重２８±２ｇの雄マウス８４匹は、呉氏動物中心から購入した。いずれも空調室内で飼育し、室温２２±２℃、湿度（６０±５）％であり、顆粒の標準飼料を与え、飲水および摂餌は自由である。
２．１ 実験動物
クリーングレード、体重２８±２ｇの雄マウス８４匹は、呉氏動物中心から購入した。いずれも空調室内で飼育し、室温２２±２℃、湿度（６０±５）％であり、顆粒の標準飼料を与え、飲水および摂餌は自由である。
２．２ 薬物
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、アロプリノール錠（合肥久聯製薬有限公司、ロット番号２０１４０４０１）、痛風定錠（長春海外製薬、ロット番号１３０９１０５）；キサンチン（阿拉丁）；生理食塩水；尿酸キット（南京建成生物工程研究所、製品番号Ｃ０１２、生産ロット番号２０１４０９１８）、キサンチンオキシダーゼ測定キット（南京建成生物工程研究所、製品番号Ａ００２、生産ロット番号２０１４０２１０）；クレアチニン（Ｃｒ）キット（南京建成生物工程研究所、製品番号Ｃ０１１－１）。
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物、アロプリノール錠（合肥久聯製薬有限公司、ロット番号２０１４０４０１）、痛風定錠（長春海外製薬、ロット番号１３０９１０５）；キサンチン（阿拉丁）；生理食塩水；尿酸キット（南京建成生物工程研究所、製品番号Ｃ０１２、生産ロット番号２０１４０９１８）、キサンチンオキシダーゼ測定キット（南京建成生物工程研究所、製品番号Ａ００２、生産ロット番号２０１４０２１０）；クレアチニン（Ｃｒ）キット（南京建成生物工程研究所、製品番号Ｃ０１１－１）。
２．３ 実験機器
低速遠心分離機；マイクロピペット；ディスポーザブル注射器；キャピラリー；時計皿；ディスポーザブル遠沈管；外科用ハサミ；ホモジナイザー。
低速遠心分離機；マイクロピペット；ディスポーザブル注射器；キャピラリー；時計皿；ディスポーザブル遠沈管；外科用ハサミ；ホモジナイザー。
３、実験方法
３．１ 被験薬物
実施例１の方法で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を被験薬物とする。
３．１ 被験薬物
実施例１の方法で調製したタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を被験薬物とする。
３．２ 痛風実験
３．２．１ マウス抗痛風実験
昆明マウス雄８４匹は体重２８±２ｇであり、これらを無作為に７群に分け、それぞれブランク群、モデル対照群、痛風定錠群、アロプリノール群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高、中、低用量群である。陽性群は痛風定錠（９．６ｍｇ／１０ｇ）およびアロプリノール（０．２ｍＬ／１０ｇ）を与え、タカサゴサンシチソウの高、中、低用量群はそれぞれ２４ｍｇ／１０ｍＬ、１２ｍｇ／１０ｍＬ、６ｍｇ／１０ｍＬで、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物水溶液を強制注入する。モデル対照群は同体積の生理食塩水を強制注入し、１回／日で１１日間続ける。
３．２．１ マウス抗痛風実験
昆明マウス雄８４匹は体重２８±２ｇであり、これらを無作為に７群に分け、それぞれブランク群、モデル対照群、痛風定錠群、アロプリノール群、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の高、中、低用量群である。陽性群は痛風定錠（９．６ｍｇ／１０ｇ）およびアロプリノール（０．２ｍＬ／１０ｇ）を与え、タカサゴサンシチソウの高、中、低用量群はそれぞれ２４ｍｇ／１０ｍＬ、１２ｍｇ／１０ｍＬ、６ｍｇ／１０ｍＬで、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物水溶液を強制注入する。モデル対照群は同体積の生理食塩水を強制注入し、１回／日で１１日間続ける。
３．２．２ 血清中の尿酸およびクレアチニン指標
最後の投与の１ｈ後、０．８％ＣＭＣ－Ｎａを溶媒として調製した１０％キサンチンをマウスに腹腔注射する。モデル作製の０．５ｈ後、マウスの眼球を摘出して採血し、採血後すぐにマウスの肝臓を解剖して取り出し、低温で保存する。得られた血液サンプルから、３０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離して血清を採取する。キットの説明に基づいて、尿酸およびクレアチニンを測定する。
最後の投与の１ｈ後、０．８％ＣＭＣ－Ｎａを溶媒として調製した１０％キサンチンをマウスに腹腔注射する。モデル作製の０．５ｈ後、マウスの眼球を摘出して採血し、採血後すぐにマウスの肝臓を解剖して取り出し、低温で保存する。得られた血液サンプルから、３０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離して血清を採取する。キットの説明に基づいて、尿酸およびクレアチニンを測定する。
３．２．３ 肝臓中のキサンチンオキシダーゼ（ＸＯＤ）活性の測定
採血後すぐにマウスを屠殺し、速やかに肝臓を取り出して重さを量り、予め４℃に冷やした生理食塩水を添加して１０％ホモジネートを作製する。３０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を採取し、キットの規定する方法に基づいてキサンチンオキシダーゼ活性を測定する。
採血後すぐにマウスを屠殺し、速やかに肝臓を取り出して重さを量り、予め４℃に冷やした生理食塩水を添加して１０％ホモジネートを作製する。３０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清液を採取し、キットの規定する方法に基づいてキサンチンオキシダーゼ活性を測定する。
３．４ データの統計分析
指標を測定し、説明書を参照して計算する。各群の実験データは平均±標準偏差（ｘ±ｓ）で表し、ＳＰＳＳ２０．０統計ソフトウェアで統計分析し、群間の差は一元配置分散検定を用いる。
指標を測定し、説明書を参照して計算する。各群の実験データは平均±標準偏差（ｘ±ｓ）で表し、ＳＰＳＳ２０．０統計ソフトウェアで統計分析し、群間の差は一元配置分散検定を用いる。
４、実験結果
４．１ マウス血清における尿酸およびクレアチニンレベルの測定
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が、マウス血清の尿酸レベルに及ぼす影響は、表１に示す通りである。
４．１ マウス血清における尿酸およびクレアチニンレベルの測定
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物が、マウス血清の尿酸レベルに及ぼす影響は、表１に示す通りである。
表１から以下のことがわかる。（１）モデルを作製して投薬した後、モデル群血清の尿酸レベルは明らかに増加し、ブランク群と比較して差は統計的有意性を有し（Ｐ＜０．００１）、モデルの構築に成功したことを表す。
（２）治療の投薬後、タカサゴサンシチソウの高、中、低の３つの用量群は、尿酸レベルがいずれも一定程度に低下し、モデル群と比較して明らかな統計的差異を有する（Ｐ＜０．０１）。各群の血清クレアチニン含量は、いずれも明らかな差はない。
（２）治療の投薬後、タカサゴサンシチソウの高、中、低の３つの用量群は、尿酸レベルがいずれも一定程度に低下し、モデル群と比較して明らかな統計的差異を有する（Ｐ＜０．０１）。各群の血清クレアチニン含量は、いずれも明らかな差はない。
４．２ マウス肝臓のキサンチンオキシダーゼレベルの測定
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がマウス血清の尿酸レベルに及ぼす影響は、表２に示す通りである。
タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物がマウス血清の尿酸レベルに及ぼす影響は、表２に示す通りである。
表２から以下のことがわかる。（１）ブランク群と比較して、モデル群の差は有意性を有し（Ｐ＜０．０１）、モデル作製が成功したことを説明している。
（２）中用量群および高用量群は肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性がモデル群より明らかに低く、差は有意性を有する（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）が、低用量群はモデル群と比較して明らかな統計的差異を有さない。これは、タカサゴサンシチソウの中、高用量群が一定程度に高尿酸血症モデルマウスの肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性を低下させ、尿酸の合成を低下させることを表し、これにより一定の尿酸降下作用を達成する。
（２）中用量群および高用量群は肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性がモデル群より明らかに低く、差は有意性を有する（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）が、低用量群はモデル群と比較して明らかな統計的差異を有さない。これは、タカサゴサンシチソウの中、高用量群が一定程度に高尿酸血症モデルマウスの肝臓のキサンチンオキシダーゼ活性を低下させ、尿酸の合成を低下させることを表し、これにより一定の尿酸降下作用を達成する。
上記実施例は実施した例を明確に説明したに過ぎず、実施方式を限定するものでないことは明らかである。当業者は、上記説明を基に、その他の様々な形式の変更または修正を行うこともできる。ここでは、すべての実施方式を網羅する必要はなく、することもできない。これから派生した明らかな変更または修正は、依然として本発明の保護の範囲内である。
Claims (7)
- 以下の工程
（１）浸出：タカサゴサンシチソウに浸出溶媒を添加して浸出させ、浸出液のｐＨ値を４～８に調節して反応液を得る；
（２）酵素分解：その後、反応液中に複合酵素を添加して酵素分解を行い、３０～５０℃で１～４時間強制循環反応させ、吸引ろ過し、ろ液を収集する；
（３）抽出、濃縮：ろ液をマクロ孔質樹脂Ａで抽出し、抽出液を合わせて濃縮し、濃縮液を得る；
（４）単離、精製：濃縮液を遠心分離し、上清液をマクロ孔質樹脂Ｂで単離精製し、波長５１０ｎｍで吸光度を測定し、溶出液を収集して、濃縮、乾燥させ、フラボノイド抽出物を得る；
を含む、タカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法であって、当該フラボノイド抽出物は、重量百分率で８０～８５％のルチンを含有する、高尿酸血症もしくは痛風用薬品もしくは健康製品の調製におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。 - 前記酵素分解工程で、パパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる複合酵素を用いて酵素分解を行い；
前記複合酵素および前記タカサゴサンシチソウの重量比が１：５～１：３であることを特徴とする、請求項１に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。 - 前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比が、（０．５～１．５）：（２～５）：（１～３）であることを特徴とする、請求項１または２に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
- 前記複合酵素のパパイン、セルラーゼおよびペクチナーゼの３つの重量比が、１：３：２であることを特徴とする、請求項３に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
- 前記浸出工程の浸出溶媒が水であり、前記タカサゴサンシチソウおよび前記水の重量比が１：（２０～６０）であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。
- 前記単離、精製工程の溶出溶媒は、体積濃度７０～８０％のエタノール水溶液であり、
前記濃縮液におけるタカサゴサンシチソウのフラボノイド濃度が０．５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物の調製方法。 - 請求項１～６のいずれか１項に記載の調製方法で得られたタカサゴサンシチソウのフラボノイド抽出物を活性成分として、通常の工程に基づき、通常の添加剤を添加して、臨床的に許容可能な錠剤、カプセル剤、散剤、配合剤、丸剤、顆粒剤、シロップ、貼付剤、坐剤、スプレー、軟膏または注射剤に製造することを特徴とする、方法。
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