CN111189936A - 一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法 - Google Patents

一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种HPLC‑MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法，包括以下步骤，(1)校正标示样的配置，质控样品的配置；(2)样品处理；(3)标准曲线的制作；(4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的Rutin、Ombuoside的浓度。应用HPLC‑MS/MS(高效液相质谱)法同时测量犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度，该测试方法的准确度高，基质效应的影响小，干扰性小，回收率高。

Description

一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的 方法
技术领域
本发明涉及了生物分析领域，尤其涉及一种采用HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法。
背景技术
肝纤维化是肝病中的一种。人体患有肝纤维化后，容易出现疲乏无力、食欲减退等症状，可能还会出现慢性消化不良、出血等症状，这些症状会给人体造成很大伤害。
扶正化瘀片是常用的治疗肝纤维化的中成药之一，其主要成分包括：五味子醇甲(Schisandrin)、五味子乙素(γ-Schisandrin)、马索亚内酯(Massoia Lactone)、丹参素钠(Sodium Danshensu)、野黑樱苷(Prunasin)、苦杏仁苷(Amygdalin)、柚皮素(Naringenin)、槲皮素(Quercetin)、芦丁(Rutin)、商陆苷(Ombuoside)及其代谢产物商陆素(Ombuin)、槲皮苷(Quercitrin)、山奈酚(Kaempferol)、葵烯酸钠(Sodium 5-Hydroxy-2-Decenoic)。检测比格犬(Beagle犬)血浆中扶正化瘀片的毒代动力学特征，评估药物主要成分在比格犬体内的暴露水平，对于帮助了解药物在人体内的作用效果具有重要意义。因此，本领域技术人员持续致力于研究测定血浆中扶正化瘀片主要成分浓度的HPLC-MS/MS方法。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法，包括如下步骤：
(1)储备液的配置：对Rutin、Ombuoside和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分别用甲醇溶解，配置得到Rutin储备液、Ombuoside储备液和Osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中Osalmide作为内标；
校正标示样品工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用甲醇-水溶液稀释成浓度为4*105、3.2*105ng/mL的所述校正标示样品工作液，将等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度400～8*104ng/mL的所述校正标示样品工作液；
质控工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用甲醇-水溶液稀释成浓度为3*105ng/mL的质控工作液，将等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度400～2*105ng/mL的所述质控工作液；
内标工作液的配置：将所述Osalmide储备液用甲醇-水溶液稀释成浓度为200、50ng/mL的所述内标工作液；
校正标示样的配置：将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的犬血浆；
质控样品的配置：将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为20～1.5*104ng/mL的所述质控样品；
(2)样品处理：取等体积的所述校正标示样和所述质控样品，并分别加入370μL所述内标工作液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析；
(3)标准曲线的制作：以Rutin比内标Osalmide、Ombuoside比内标Osalmide的色谱峰面积比为纵坐标，以犬血浆中Rutin、Ombuoside的浓度为横坐标制作标准曲线；
(4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的Rutin、Ombuoside的浓度。
进一步地，所述步骤(2)中高效液相质谱联用仪的工作条件为：
(1)色谱条件为：
色谱柱：ACE C18(2.1mm x 50mm,5AQ),ACE，柱温为40℃；
自动进样器温度：8℃；
流动相A：0.2％乙酸水溶液；
流动相B：0.2％甲醇溶于甲醇-乙腈溶液；
进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(30/70，v/v)；R3:MeOH；
洗脱方式：梯度洗脱；
(2)质谱条件为：
质谱仪：AB SCIEX API5000 LC/MS/MS system；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Positive；
检测模式：MRM多反应监测；
涡旋离子喷雾温度：550℃；
进一步地，在步骤(1)中，利用等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成的所述校正标示样品工作液的梯度浓度分别为80000、32000、3200、800、400ng/mL；利用等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成的所述质控工作液的梯度浓度分别为2*105、1.2*104、1200、400ng/mL；所述校正标示样的梯度浓度分别为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL；所述质控样品的梯度浓度分别为1.5*104、1*104、600、60、20ng/mL。
进一步地，所述校正标示样和所述质控样品是当天使用所述空白基质连续稀释新鲜配置得到。
进一步地，所述步骤(2)中的离心条件为：10℃，4000rpm，离心10min。
进一步地，所述步骤(2)中还包括对空白(BK)样品、QC0样品、ULOQ without IS样品的处理：取30μL空白基质形成所述空白样品；在30μL空白基质中加入370μL所述内标工作液形成所述QC0样品；所述空白(BK)样品、所述ULOQ without IS样品中加入370μL甲醇溶液；所述空白(BK)样品、所述QC0样品、所述ULOQ without IS样品在稀释混合后涡旋离心取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。
进一步地，所述步骤(2)中还包括对基质效应样品的处理：取单个供体(n≥6)的30μL的空白基质，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。
进一步地，所述步骤(2)中还包括对回收率样品的处理：取单个供体的空白基质，再取30μL的多个供体的混合的所述空白基质形成所述回收率样品，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。
本发明的有益效果如下：应用HPLC-MS/MS(高效液相质谱)法同时测量犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度，该测试方法的准确度高，基质效应的影响小，干扰性小，回收率高。
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中Rutin-Blank空白样品的谱图；
图2是本发明实施例中Rutin-QC0样品的谱图；
图3是本发明实施例中Rutin-Carryover Blank样品的谱图；
图4是本发明实施例中Rutin-LLOQ样品的谱图；
图5是本发明实施例中Rutin-ULOQ样品的谱图；
图6是本发明实施例中Ombuoside-Blank空白样品的谱图；
图7是本发明实施例中Ombuoside-QC0样品的谱图；
图8是本发明实施例中Ombuoside-Carryover Blank样品的谱图；
图9是本发明实施例中Ombuoside-LLOQ样品的谱图；
图10是本发明实施例中Ombuoside-ULOQ样品的谱图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或隐含地包括一个或者更多个该特征。
为达到上述目的，本发明提供一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法，包括以下步骤：
一、样品的配置
储备液的配置：对Rutin、Ombuoside和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分别溶于甲醇中，配置得到Rutin储备液、Ombuoside储备液和Osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中Osalmide作为内标；如表1所示。
Figure BDA0002352355330000051
校正标示样品工作溶液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用等体积的甲醇-水溶液稀释成浓度为4*105、3.2*105ng/mL的校正标示样品工作液；将所述Rutin和所述Ombuoside等浓度混合，再用等体积的甲醇-水溶液稀释成浓度为8*104、3.2*104、3200、800、400ng/mL的校正标示样品工作液；如表2所示。
Figure BDA0002352355330000052
质控工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用等体积的甲醇-水溶液稀释成浓度为3*105ng/mL的质控工作液；将所述Rutin和所述Ombuoside等浓度混合再用等体积的甲醇-水溶液稀释成浓度为2*105、1.2*104、1200、400ng/mL的质控工作液；如表3所示。
Figure BDA0002352355330000053
Figure BDA0002352355330000061
内标工作液的配置：将所述Osalmide储备液用等体积的甲醇-水溶液稀释成浓度为200、50ng/mL的内标工作液；如表4所示。
Figure BDA0002352355330000062
neat溶液的配置：将所述质控溶液和所述内标工作液用等体积的甲醇-水溶液稀释成neat溶液；如表5所示。
Figure BDA0002352355330000063
注：上述校正标示样品工作液、所述质控工作液、所述内标工作液和所述回收率和基质效应的纯溶液，只要终浓度不变，稀释过程/体积可以改变。只要溶液ID唯一，溶液ID可以改变，不影响实验的可追溯性。并且均在室温下制备。
校正标示样的配置：将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成浓度为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含分析物与内标的犬血浆，在本实施例中指不含Rutin、Ombuoside和Osalmide；如表6所示。
Figure BDA0002352355330000064
Figure BDA0002352355330000071
质控样品的配置：将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为1.5*104、1*104、600、60、20ng/mL的所述质控样品；如表7所示。
Figure BDA0002352355330000072
二、PHLC-MS/MS分析测定过程的工作条件
(1)、色谱条件：
色谱柱：ACE C18(2.1mm x 50mm,5AQ),ACE，柱温为40℃；
自动进样器温度：8℃；
流动相A：0.2％乙酸-水溶液；
流动相B：0.2％甲醇溶于等体积的甲醇-乙腈溶液；
进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(30/70，v/v)；R3:MeOH；
洗脱方式：梯度洗脱；
泵梯度：
Figure BDA0002352355330000073
Figure BDA0002352355330000081
进样体积：0.5μL；
运行时间：4.60min；
保留时间：Rutin，大约1.37min；Ombuoside，大约1.62min；Osalmide，大约1.63min；
(2)、质谱条件：
质谱仪：AB SCIEX API5000 LC/MS/MS system；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Positive；
检测模式：MRM多反应监测；
涡旋离子喷雾温度：550℃；
三、样品处理
吸取30μL的所述校正标示样、所述质控样品，再转移至96孔板中，然后再分别加入370μL的50ng/mL所述内标工作液，封板后涡旋混匀，在10℃，4000rpm条件下离心10min。离心后取上清液100μL至所述96孔板中，并加入300μL的甲醇溶液。然后再密封孔板，进行低速涡旋混匀，取0.5μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进行分析。如图4、5、9、10所示。
四、直线回归模型的建立
按上述色谱和质谱条件对所述校正标示样、所述质控样品进行检测，色谱图采集和色谱峰积分由软件Analyst 1.6.3,Applied Biosystem进行处理。以Rutin比内标Osalmide、Ombuoside比内标Osalmide的色谱峰面积比为纵坐标，以犬血浆中Rutin、Ombuoside的浓度为横坐标，用加权(权重为1/X2)最小二乘法以犬血浆中Rutin、Ombuoside的浓度(X)与色谱峰面积比(Y)进行线性回归，所构建的线性回归方程(Y＝aX+b)即为标准曲线。结果表明，Rutin和Ombuoside的校正曲线范围在20.0ng/mL-20000ng/mL内线性良好制作标准曲线。
五、定量分析
取30μL待测样品按照上述的样品处理步骤的方法处理，并按样品处理步骤所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中分析物Rutin、Ombuoside的浓度。
六、测试方法的评价
制备空白(BK)样品、QC0样品、ULOQ without IS样品用来相互校正，减少干扰性。取30μL空白基质形成所述空白样品；在30μL空白基质中加入370μL所述内标工作液形成所述QC0样品；所述空白(BK)样品、所述ULOQ without IS样品中加入370μL甲醇溶液；所述空白(BK)样品、所述QC0样品、所述ULOQ without IS样品在稀释混合后涡旋离心取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。分析结果如图1～3,6～8所示。
制备基质效应样品和回收率样品用来评价该方法的基质效应和回收率。取单个供体(n≥6)的30μL的空白基质，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的所述Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。分析得到该方法的基质效应为93.0～100％。
取单个供体的空白基质，再取30μL的多个供体的混合的所述空白基质形成所述回收率样品，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的所述Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。分析得到该方法的回收率为100％。
经过多方面的验证与评价，该测试方法在一定程度上消除了基质效应的影响，检测高效稳定，干扰性小。
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (8)

1.一种HPLC-MS/MS法测定犬血浆中Rutin和Ombuoside的浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)储备液的配置：对Rutin、Ombuoside和Osalmide各取1.00mg/mL，并且分别用甲醇溶解，配置得到Rutin储备液、Ombuoside储备液和Osalmide储备液，≤-15℃密闭，遮光保存，其中Osalmide作为内标；
校正标示样品工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用甲醇-水溶液稀释成浓度为4*105、3.2*105ng/mL的所述校正标示样品工作液，将等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度400～8*104ng/mL的所述校正标示样品工作液；
质控工作液的配置：将所述Rutin储备液和所述Ombuoside储备液分别用甲醇-水溶液稀释成浓度为3*105ng/mL的质控工作液，将等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成梯度浓度400～2*105ng/mL的所述质控工作液；
内标工作液的配置：将所述Osalmide储备液用甲醇-水溶液稀释成浓度为200、50ng/mL的所述内标工作液；
校正标示样的配置：将所述校正标示样品工作液用空白基质稀释成梯度浓度为20～2*104ng/mL的所述校正标示样，所述空白基质为不含所述分析物与所述内标的犬血浆；
质控样品的配置：将所述质控工作液用所述空白基质稀释成浓度为20～1.5*104ng/mL的所述质控样品；
(2)样品处理：取等体积的所述校正标示样和所述质控样品，并分别加入370μL所述内标工作液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL在高效液相质谱联用仪(HPLC-MS/MS)上进样分析；
(3)标准曲线的制作：以Rutin比内标Osalmide、Ombuoside比内标Osalmide的色谱峰面积比为纵坐标，以犬血浆中Rutin、Ombuoside的浓度为横坐标制作标准曲线；
(4)定量分析：根据步骤(2)对待测样品进行处理，并按照步骤(3)所得所述标准曲线计算得到所述待测样品中的Rutin、Ombuoside的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中高效液相质谱联用仪的工作条件为：
(1)色谱条件为：
色谱柱：ACE C18(2.1mm x 50mm,5AQ),ACE，柱温为40℃；
自动进样器温度：8℃；
流动相A：0.2％乙酸水溶液；
流动相B：0.2％甲醇溶于甲醇-乙腈溶液；
进样器清洗液：R0:MeOH/H2O(30/70，v/v)；R3:MeOH；
洗脱方式：梯度洗脱；
(2)质谱条件为：
质谱仪：AB SCIEX API5000 LC/MS/MS system；
离子源：ESI电喷雾电离；
离子化模式：Positive；
检测模式：MRM多反应监测；
涡旋离子喷雾温度：550℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，利用等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成的所述校正标示样品工作液的梯度浓度分别为80000、32000、3200、800、400ng/mL；利用等浓度的所述Rutin和所述Ombuoside混合再用甲醇-水溶液稀释成的所述质控工作液的梯度浓度分别为2*105、1.2*104、1200、400ng/mL；所述校正标示样的梯度浓度分别为2*104、1.6*104、4*103、1.6*103、160、40、20ng/mL；所述质控样品的梯度浓度分别为1.5*104、1*104、600、60、20ng/mL。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述校正标示样和所述质控样品是当天使用所述空白基质连续稀释新鲜配置得到。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的离心条件为：10℃，4000rpm，离心10min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括对空白(BK)样品、QC0样品、ULOQ without IS样品的处理：取30μL空白基质形成所述空白样品；在30μL空白基质中加入370μL所述内标工作液形成所述QC0样品；所述空白(BK)样品、所述ULOQ withoutIS样品中加入370μL甲醇溶液；所述空白(BK)样品、所述QC0样品、所述ULOQ without IS样品在稀释混合后涡旋离心取上清液100μL，再加入300μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括对基质效应样品的处理：取单个供体(n≥6)的30μL的空白基质，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中还包括对回收率样品的处理：取单个供体的空白基质，再取30μL的多个供体的混合的所述空白基质形成所述回收率样品，并加入370μL甲醇溶液，涡旋离心后取上清液100μL，再加入50μL的Neat溶液和250μL的甲醇溶液，涡旋混匀后取0.5μL进样分析。
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