WO2020022688A1 - 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 조성물 - Google Patents

감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 조성물 Download PDF

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WO2020022688A1
WO2020022688A1 PCT/KR2019/008765 KR2019008765W WO2020022688A1 WO 2020022688 A1 WO2020022688 A1 WO 2020022688A1 KR 2019008765 W KR2019008765 W KR 2019008765W WO 2020022688 A1 WO2020022688 A1 WO 2020022688A1
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liver cancer
leaf extract
metastasis
inhibiting
persimmon leaf
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PCT/KR2019/008765
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김영주
정상훈
박영년
김경아
권학철
이정환
허규원
유정은
전영식
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한국과학기술연구원
연세대학교 산학협력단
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/308—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on cancer prevention

Definitions

  • the present invention relates to a composition for inhibiting hepatic cancer metastasis, comprising a persimmon leaf extract, and specifically, a liver cancer metastasis inhibiting pharmaceutical composition comprising a persimmon leaf extract, characterized by inhibiting liver cancer metastasis by inhibiting cell migration and invasion of liver cancer cells.
  • Liver cancer is a malignant tumor originating from the liver cells that make up the majority of the liver. In a broad sense, it includes all types of malignant tumors of the liver (e.g., hepatic biliary tract cancer) or metastatic liver cancer caused by cancers of other organs that metastasize to the liver.However, hepatocellular carcinoma is the most common type of liver cancer. Means only hepatocellular carcinoma.
  • liver cancer The causes of liver cancer include hepatitis B and hepatitis C, excessive drinking and liver cirrhosis, and if the liver is destroyed and regenerated by infection or alcohol, the risk of developing liver cancer is greatly increased.
  • hepatic cancer Globally, the annual incidence of hepatic cancer is 560,000, or 4% of all cancers, with more than 390,000 cases in Asia. In Korea, 12,000 to 15,000 cases of hepatocarcinoma occur every year, which is ranked 5th after thyroid cancer, stomach cancer, colorectal cancer and lung cancer. It is one of the important diseases that can not be. It is known that 70% of Korean hepatitis cancers are caused by hepatitis B virus, and about 13% are caused by hepatitis C virus and 18% are others.
  • hepatic cancer can often recur after treatment even in patients who have undergone resection.
  • 60% of patients with hepatocarcinoma can relapse within 12 months after surgery, and micro-metastasis of hepatocarcinoma can be measured by a sensitive detection technique during surgery.
  • One year after surgery there was still a recurrence rate of 30-40%.
  • the remaining liver tissue after surgery may also develop and form liver cancer. Since recurrence of liver cancer greatly shortens the overall survival of the patient, preventing or delaying recurrence of recurrence in patients undergoing surgical treatment is still a major problem to be solved.
  • EMT epidermal-mesenchymal transition
  • mesenchymal stem cells can differentiate into various types of cells. It is a pluripotent stromal cell that can.
  • EMT is an essential process in various developmental processes such as mesoderm formation and neural tube formation, but it is known to be closely related to organ fibrosis, cancer progression and initiation of metastasis, and liver cancer cell metastasis is also related to EMT. There is a known need for research (Nagai, Tomoyuki, et al. Molecular cancer therapeutics 10.1 (2011): 169-177.).
  • the present inventors have made intensive studies to develop an effective therapeutic agent for liver cancer.
  • the persimmon leaf extract inhibits the migration and invasion of liver cancer cells induced by metastasis induced by HGF (Hepatocyte growth factor) even at a concentration without cytotoxicity.
  • HGF Hepatocyte growth factor
  • One object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for inhibiting liver cancer metastasis comprising persimmon leaf extract.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting liver cancer metastasis, comprising administering persimmon leaf extract to a subject.
  • Still another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant composition for inhibiting liver cancer metastasis, comprising a persimmon leaf extract.
  • Another object of the present invention to provide a quasi-drug composition for inhibiting metastasis of liver cancer comprising persimmon leaf extract.
  • Another object of the present invention to provide a health functional food for inhibiting liver cancer metastasis comprising persimmon leaf extract.
  • Persimmon leaf extract according to the present invention is low cytotoxicity and can inhibit the mobility and invasiveness of liver cancer cells, and can inhibit the metastasis of liver cancer cells by inhibiting metastasis-related signaling system, the pharmaceutical composition for inhibiting liver cancer metastasis, anticancer adjuvant It can be usefully used as a composition, quasi-drug composition or dietary supplement.
  • EEDK Persimmon Leaf Ethanol Extract
  • Figure 2 is a graph showing the cell mobility analysis of persimmon leaf extract in liver cancer cells.
  • Figure 3 is a graph showing the results of invasive analysis of persimmon leaf extract in liver cancer cells.
  • Figure 4 is a graph analyzing the metastasis related signaling factor phosphorylation level of persimmon leaf extract in liver cancer cells.
  • Figure 5 is a graph showing the results of analyzing the mRNA expression patterns of liver cancer joule function and EMT process-related factors of persimmon leaf extract in liver cancer cells.
  • Figure 6 is a graph showing the cytotoxicity analysis results of persimmon leaf extract in lung cancer cells.
  • Figure 7 is a graph showing the cell mobility analysis of persimmon leaf extract in lung cancer cells.
  • One aspect of the present invention for achieving the above object provides a pharmaceutical composition for inhibiting liver cancer metastasis comprising persimmon leaf extract.
  • Another aspect of the present invention for achieving the above object provides the use of the persimmon leaf extract for inhibiting metastasis of liver cancer.
  • the term "persimmon leaf” in the present invention means the leaves of the persimmon tree ( Diospyros kaki ), which is a deciduous broad-leaved arborescent of the persimmon tree persimmon family, and is mainly eaten as a tea in Korea.
  • the pharmacological activity of persimmon leaves is effective in lowering blood sugar, blood circulation disorders, metabolic disorders, immune enhancement, and optic nerve protection.
  • the effect of inhibiting liver cancer metastasis of persimmon leaves is not known and was first discovered by the present inventors.
  • the persimmon leaves can be used without limitation, such as harvested, grown or commercially available.
  • the persimmon leaf extract refers to all forms by the additional processing of the extract as well as the persimmon leaf crude extract.
  • the persimmon leaf extract may be persimmon leaf itself or a pulverized product thereof, or may be an extract obtained through the extraction process.
  • the extraction process may be carried out according to conventional methods used in the art.
  • the extraction solvent is not limited thereto, but may be any one solvent selected from the group consisting of water, C 1 to C 10 alcohols, hexane, Hexane, chloroform, and mixtures thereof. It may be to use ethanol.
  • the amount of the extraction solvent may be 2 to 20 times the dry weight of the persimmon leaf, but is not limited thereto.
  • the extraction method may be an extraction method such as hot water extraction, immersion extraction, reflux cooling extraction and ultrasonic extraction, specifically, may be extracted by the ultrasonic extraction method.
  • the temperature may be specifically 10 ° C. to 100 ° C., and more specifically, room temperature, but is not limited thereto.
  • the persimmon leaf extract may be used in combination with EEDK (ethanol extract of Diospyros kaki).
  • liver cancer refers to a malignant tumor originating from liver cells that make up the majority of the liver. In the broadest sense, it includes all types of malignant tumors of the liver (e.g., hepatic bile duct cancer) or metastatic liver cancer, which is caused by cancer of other organs that metastasize to the liver, but hepatocellular carcinoma (HCC) is the most common of the liver cancers. By means only hepatocellular carcinoma that occurs in liver cells.
  • HCC hepatocellular carcinoma
  • the liver cancer may be Hep3B, HepG2, and SNU475, but is not limited thereto.
  • the term "metastasis” refers to a phenomenon in which a tumor spreads from another organ (including the lymph node) to the other tissues (including lymph nodes) as the tumor first develops. As this progresses, new genetic traits are acquired and tumor cells infiltrate into blood vessels and lymph nodes, circulate along blood and lymph, and settle and proliferate in other tissues.
  • liver cancer cells acquire mobility and invasiveness through the EMT process and initiate metastasis (Nagai, Tomoyuki, et al. Molecular cancer therapeutics 10.1 (2011): 169-177.).
  • the epithelial-mesenchymal transition (EMT) process is a process of obtaining its mobility and invasiveness to lose its cell polarity and intercellular adhesion and become mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells can differentiate into various types of cells. It is a pluripotent stromal cell. EMT is an essential process in various developmental processes such as mesoderm formation and neural tube formation, but it is known to be closely related to organ fibrosis or cancer progression and initiation of metastasis.
  • composition according to the present invention may be one that achieves inhibition of liver cancer metastasis by inhibiting cell migration or invasion.
  • the experimental group induced metastasis to HGF compared to the control group, while the cell migration and invasion rate increased .
  • the experimental group treated with persimmon leaf extract after induction of metastasis was confirmed that the cell migration and invasion rate was reduced (FIGS. 2 and 3).
  • composition according to the present invention may be to achieve the inhibition of liver cancer metastasis by inhibiting metastasis-related cell signaling
  • metastasis-related cell signal may be Phosphorylation (Phosphorylation) of Met, JNK and cJun.
  • Met acts as an important mechanism for carcinogenesis and regulates the expression of K19, one of the stemness markers of liver cancer (Rhee, Kim, et al. Cancer Research) . 78. 7 (2016): 1619-1631.).
  • Hepatocellular carcinoma cells activate the Met signaling pathway from fibroblast-derived HGF to increase K19 expression, thereby obtaining an aggressive phenotype.
  • Met may be characterized by affecting the stem function (Stemness) of liver cancer.
  • the phosphorylation level of Met, JNK and cJun increased when HGF was added.
  • HGF phosphorylation factor
  • the persimmon leaf extract can be usefully used for inhibiting metastasis of the liver cancer cells.
  • the composition according to the present invention inhibits the EMT process to achieve inhibition of liver cancer metastasis. It may be.
  • the term "pharmaceutical composition” means that is prepared for the purpose of preventing or treating a disease, and can be used by formulating in various forms according to each conventional method. For example, it may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, and the like, and may be used in the form of external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions.
  • composition of the present invention may be prepared in the form of a pharmaceutical composition for preventing or treating wounds, further comprising a suitable carrier, excipient or diluent commonly used in the manufacture of a pharmaceutical composition, wherein the carrier is an unnatural carrier ( non-naturally occuring carriers).
  • carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, and the like in the lettuce extract and fractions thereof. , Sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium styrate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally, parenterally, rectally, topically, transdermally, intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously, etc. according to the desired method, and the active ingredient of the pharmaceutical composition may be administered to the age of the subject to be administered. , Sex, weight, pathology and severity, route of administration or prescriber's judgment. Dosage determination based on these factors is within the level of one of skill in the art and its daily dosage may be, for example, from 0.1 mg / g / day to 100 mg / g / day, more specifically from 5 mg / g / day to 50 mg / day. g / day, and the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered once a day or several times in divided doses. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for inhibiting liver cancer metastasis, comprising administering persimmon leaf extract to a subject.
  • the term "individual” may mean any animal, including humans, in whom metastasis of liver cancer has occurred or is likely to occur.
  • the animal may be, but is not limited to, mammals such as cattle, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, dogs, cats, etc., which require treatment of similar symptoms as well as humans.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present invention may specifically include administering the composition in a pharmaceutically effective amount to a subject having or at risk of developing a metastasis of liver cancer.
  • administration means introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner, and the route of administration of the composition of the present invention may be administered through various routes as long as it can reach the desired tissue. If desired, administration may be by administration of instillation, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, transdermal patch administration, oral administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration, etc. Can be.
  • Yet another aspect of the present invention provides an anticancer adjuvant composition for inhibiting liver cancer metastasis comprising a persimmon leaf extract.
  • composition of the present invention may be to achieve an anticancer adjuvant effect by inhibiting the invasion and migration of liver cancer so that the active substance of the anticancer agent can effectively act on the target.
  • the anticancer adjuvant composition of the present invention may be administered in combination with any kind of anticancer agent or anticancer adjuvant to increase the anticancer effect of the anticancer agent and to suppress or improve the side effects of the anticancer agent.
  • the anticancer agent adjuvant composition may be administered to the human body through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • composition may also be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • the composition may be administered together with a pharmaceutical carrier generally used in the treatment of anticancer drugs. Examples of such a carrier include physiological saline.
  • Another aspect of the present invention provides a quasi-drug composition for inhibiting liver cancer metastasis comprising a persimmon leaf extract.
  • quasi drug refers to articles that are less active than drugs among articles used for the purpose of diagnosing, treating, ameliorating, alleviating, treating or preventing diseases of humans or animals.
  • quasi-drug products under the Pharmaceutical Affairs Law exclude products used for the purpose of medicines, and include products used for the treatment or prevention of diseases of humans / animals, and products with slight or no direct action on the human body.
  • the persimmon leaf extract of the present invention can be added to the quasi-drug composition for the purpose of inhibiting metastatic liver cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When used as an quasi-drug additive, the pharmaceutical composition may be added as it is, or used together with other quasi-drugs or quasi-drug components, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the intended use.
  • the quasi-drug composition of the present invention may be, but is not limited to, a disinfectant cleaner, a shower foam, a gagreen, a wet tissue, a detergent soap, a hand wash, a humidifier filler, a mask, an ointment, or a filter filler.
  • Yet another aspect of the present invention provides a health functional food for inhibiting liver cancer metastasis comprising persimmon leaf extract.
  • Functional food is the same term as food for special health use (FOSHU), and refers to foods with high medical and medical effects that are processed to show efficient bioregulatory functions in addition to nutrition.
  • the food may be prepared in various forms such as tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, etc. in order to obtain useful effects in inhibiting cancer metastasis.
  • the dietary supplement of the present invention may further comprise a food acceptable carrier.
  • the composition containing the persimmon leaf extract of this invention there is no restriction
  • Other ingredients that do not interfere with the cancer metastasis inhibiting effect can be added to the food composition, and the kind thereof is not particularly limited.
  • various herbal extracts, food acceptable additives, natural carbohydrates, and the like may be contained as additional ingredients, such as conventional foods.
  • the food supplement additive is added to prepare the health functional food of each formulation can be used by those skilled in the art as appropriate.
  • various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters , Stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in the carbonated beverage, and the like but the kind is not limited by the above examples.
  • the content of the extract contained in the food is not particularly limited, but may be included in 0.01 to 100% by weight, more preferably 1 to 80% by weight relative to the total weight of the food composition.
  • the composition may include additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • additional ingredients that are commonly used in food compositions to improve the smell, taste, time and the like.
  • minerals such as zinc (Zn), iron (Fe), calcium (Ca), chromium (Cr), magnesium (Mg), manganese (Mn) and copper (Cu) may be included. It may also contain amino acids such as lysine, tryptophan, cysteine, valine and the like.
  • preservatives potassium sorbate, sodium benzoate, salicylic acid, sodium dehydroacetate, etc.
  • fungicides bleaching powder and highly bleaching powder, sodium hypochlorite, etc.
  • antioxidants butylhydroxyanisole (BHA), butylhydroxytoluene ( BHT), etc.
  • colorants such as tar pigment
  • colorants such as sodium nitrite, sodium nitrite
  • bleach sodium sulfite
  • seasonings such as MSG glutamate
  • sweeteners ducin, cyclate, saccharin, sodium, etc.
  • Food additives such as flavors (vanillin, lactones, etc.), swelling agents (alum, potassium D-tartrate, etc.), reinforcing agents, emulsifiers, thickeners (pigments), coatings, gum herbicides, foam inhibitors, solvents, improvers, etc.
  • the additive is selected according to the type of food and used in an appropriate amount.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material, and can be excellent in portability.
  • Persimmon leaves used in this experiment were purchased in Gangneung, Gangwon-do.
  • the dried persimmon leaf was powdered, and then 7 L of ethanol (95%) was added to 800 g, followed by ultrasonic extraction for 4 hours, and then the extract was filtered. After filtering the extract, 7 L of ethanol was added to the remaining residues and the method of ultrasonic extraction for 4 hours was repeated four more times to obtain 35 L of the total extract. 35 L of the extract was concentrated under reduced pressure at 35 ° C. to obtain 33 g of ethanol extract.
  • the extract was dissolved in DMSO at 20 mg / ml, diluted to an appropriate concentration, and used in the experiment.
  • Human liver cancer cell lines Hep3B, HepG2 and SNU475 cells were prepared using DMEM and RPMI1640 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 IU / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin. Incubated in a 5% CO 2 , 37 ° C. incubator (Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA). The medium compositions used for cell culture were all used by GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA).
  • EZ-CYTOX Daeil Labservice, Seoul, Korea
  • Liver cancer cells Hep3B, HepG2 and SNU475 cultured above were dispensed into 96 well cell culture plates at well concentrations of 1 ⁇ 10 4 / well and incubated for 24 hours.
  • Persimmon leaf extract was then treated with various concentrations (6.25, 12.5, 25, 50, 100 ⁇ g / ml) and incubated for 48 hours. Thereafter, EZ-CYTOX solution was added and cultured for 1 hour, and then the absorbance was measured at 450 nm to identify viable cells. This experiment was performed three times independently.
  • HepG2 and SNU475 showed no cytotoxicity by the persimmon leaf extract, but in Hep3B it was confirmed that the cytotoxicity at 100 ⁇ g / ml. Therefore, the subsequent experiment proceeded to a concentration that the persimmon leaf extract does not exhibit cytotoxicity.
  • liver cancer cells In order to measure the mobility of liver cancer cells, a wound healing assay was performed. Induction of metastasis of hepatic cancer cells was performed using HGF known to promote the EMT process in hepatocytes.
  • hepatocarcinoma cells Hep3B, HepG2 and SNU475 were inoculated into 24 well cell culture plates at a concentration when reaching 80% confluence in monolayer after 24 hours. After 24 hours, the monolayer was carefully and slowly scratched with a fresh 200 ⁇ l yellow pipette tip across the center of the well. The resulting gap distance was made equal to the outer diameter of the tip of the tip. After scratching, the cells were washed twice with PBS (phosphate buffered saline) carefully to prevent them from falling off the bottom to remove the separated cells.
  • PBS phosphate buffered saline
  • hepatocarcinoma cells Hep3B, HepG2 and SNU475 were cultured in a serum-free medium and a 10% FBS medium in a transwell coated with ECMatrix on the top of a polycarbonate membrane (8 ⁇ m pore-sized). The bottom of the transwell was incubated in a 37 ° C., 5%, CO 2 condition with serum free medium containing HGF (10 ng / ml) and medium containing 10% FBS.
  • Hep3B, HepG2 and SNU475 all showed a high invasion rate compared to the control group when HGF was added, but when incubated in a medium containing 10% FBS, the addition of 10 ⁇ g / ml persimmon leaf extract The invasion rate of all Hep3B, HepG2 and SNU475 was found to be similar or more reduced than the control. In addition, when incubated in serum-free medium, the addition of persimmon leaf extract decreased Hep3B concentration-dependently, and HepG2 significantly decreased the invasion rate even at low concentrations. It was confirmed.
  • the persimmon leaf extract may inhibit metastasis through a method of reducing the invasion rate of liver cancer cells.
  • hepatic cancer cells Hep3B and HepG2 were inoculated into 6-well cell culture plates at a concentration when reaching 70% confluence as a monolayer after 24 hours. After 24 hours, the cells were pretreated for 2 hours in the presence or absence of persimmon leaf extract (50 ⁇ g / ml), followed by incubation for each time period (0, 15, 30, 60 minutes) by adding HGF (10 ng / ml). . The cells were then washed with PBS and homogenized using RIPA (RadioImmunoPrecipitation) buffer to which proteolytic inhibitors (1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 ⁇ g / ml leupeptin) were added.
  • RIPA RadioImmunoPrecipitation
  • the homogenate was centrifuged at 13,000 rpm for 20 minutes and the supernatant was used for Western blot analysis.
  • the amount of protein was measured using Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA USA). 20 ⁇ g of protein was loaded per well and SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) was performed. Thereafter, the polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was transferred to an immune reaction using the antibodies specified below.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Primary antibodies include anti-phospho-Met (Tyr1234 / 1235), anti-Met, anti-phospho-JNK (Thr183 / Tyr185), anti-JNK, anti-phospho-ERK (Thr202 / Tyr204), anti-ERK, anti Experiments were performed in the manner commonly used in the art using -phospho-p38 (Thr180 / Tyr182), anti-p38, anti-phospho-cJun (Ser73), anti-cJun, anti-GAPDH. All antibodies used in this experiment were manufactured by Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).
  • persimmon leaf extract can be determined to inhibit the HGF-MET signaling system to inhibit the metastasis of liver cancer.
  • the QRT-PCR Quantitative real-time PCR
  • Hepatocarcinoma cells Hep3B, HepG2 and SNU475 were first inoculated into 6-well cell culture plates at a concentration when reaching 70% confluence as a monolayer after 24 hours. After 24 hours, the cells were pretreated for 2 hours in the presence or absence of persimmon leaf extract (50 ⁇ g / ml), followed by incubation for 48 hours with the addition of HGF (10 ng / ml). Then, the cells were washed with PBS and then the cells were supplied using a cell scraper. The collected cells were centrifuged at 7,200 rpm for 1 minute, the supernatant was removed, and only the pellet was used for reverse transcription polymerase chain reaction analysis.
  • RNA concentration from the cells was determined using Nanodrop (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). It measured using. Total RNA extraction was performed using the method suggested by the manufacturer using Qiashredder and RNeasy Mini Kit (Hilden, Germany).
  • RNA was adjusted to 1 ⁇ g, the volume of distilled water combined was 9 ⁇ l, and each sample was prepared by adding 1 ⁇ l of oligo dT and dNTP.
  • the reaction was carried out at 65 ° C. for 5 minutes using a PCR equipment, and then cooled by immersing in ice for 10 minutes. While cooling the sample using ice, cDNA synthesis mastermix containing 2 ⁇ l of 10 X RT and DTT and 4 ⁇ l of MgCl 2 was prepared and vortexed and spin down.
  • the persimmon leaf extract also inhibits the hepatic function and EMT process of liver cancer, and the results may be related to the inhibition of liver cancer metastasis through inhibition of HGF-Met signaling pathway activity.
  • metastatic effects were analyzed using lung cancer cell lines.
  • lung cancer cells showed a cytotoxicity even in 20 ⁇ g / ml persimmon leaf extract, it was confirmed that the cell viability decreases depending on the concentration.
  • the wound treatment assay of lung cancer cells was performed using the same method as Experimental Example 2.
  • the persimmon leaf extract showed cytotoxicity even at low concentrations in lung cancer cells, it did not affect the motility of the cells, it was confirmed that does not show a metastasis inhibitory effect on lung cancer cells.
  • the persimmon leaf extract according to the present invention has a low cytotoxicity in liver cancer cell lines, has been confirmed to inhibit cell migration and invasion, and confirmed that it can inhibit metastasis-related cell signaling system of liver cancer cell metastasis of persimmon leaf extract The inhibitory effect was confirmed.

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Abstract

본 발명은 감잎 추출물을 포함하는　간암　전이　억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제 방법, 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 항암 보조제 조성물, 의약외품 조성물 및 건강기능식품에 대한 것이다. 본 발명에 따른 감잎 추출물은 세포독성이 낮고 간암세포의 이동성 및 침습성을 저해시킬 수 있으며, 전이 관련 신호전달체계를 저해하여 간암세포의 전이를 억제할 수 있으므로, 간암 전이 억제용 약학 조성물, 항암 보조제 조성물, 의약외품 조성물 또는 건강기능식품 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 조성물
본 발명은 감잎 추출물을 포함하는　간암　전이　억제용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 간암 세포의 세포 이동 및 침습을 저해함으로써 간암 전이 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 약학 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제 방법, 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 항암 보조제 조성물, 의약외품 조성물 및 건강기능식품에 대한 것이다.
간암이란 간의 대부분을 차지하는 간 세포에서 기원하는 악성 종양을 말한다. 넓은 의미로는 간에 생기는 모든 종류의 악성 종양 (예를 들면 간내 담관암)이나 다른 기관의 암이 간에 전이되어 발생하는 전이성 간암까지도 포함하지만, 간세포 암종이 간암 중 가장 흔하기 때문에 일반적으로는 간 세포에서 발생하는 간세포 암종만을 의미한다.
간암의 발병 원인으로는 B형 간염이나 C형 간염, 지속적인 과량의 음주, 간경변 등이 있으며, 감염이나 알코올에 의해 간의 파괴와 재생이 지속될 경우 간암의 발생 위험이 크게 높아진다.
전 세계적으로　간암의 연간 발병률은 전체 암의 4％인 56만 명 수준이며, 아시아에서는 39만 명 이상의 환자가 발생한다. 우리나라에서는 매년 1만 2천 명 내지 1만 5천 명의　간암환자가 발생하는데 이는 갑상선암, 위암, 대장암, 폐암에 이어 5위에 해당하는 수치로 사망률에 있어서도 폐암, 위암에 이어 3위에 달하여 국가적으로 간과할 수 없는 중요한 질환 중 하나이다. 한국인　간암의 70％는 B형 간염 바이러스에 기인하고, C형 간염 바이러스에 의한 것이 13％ 정도, 기타가 18％ 정도를 차지한다고 알려져있다.
　비록　간암의 조기발견과 치료는 생존율을 높일 수 있지만, 절제수술을 받은 환자라 할지라도 치료 후에　간암이 흔히 재발할 수 있다. 외과수술연보 (Annals of Surgery)의 데이터에 따르면 60%의　간암환자가 수술 후 12개월 내에 재발할 수 있으며,　간암의 미소전이 (micro-metastasis)는 수술 시 민감한 검출기술로 측정할 수 있는데 환자가 수술 후 1년일 경우 여전히 30~40%의 재발률이 있다고 발견되었다. 이 외에, 수술 후 남아 있는 병변 간 조직 역시 발전하여 또다시　간암을 형성할 수 있다.　간암의 재발은 환자의 전체 생존기간을 대폭 단축하기 때문에 수술치료를 받은　간암환자의 재차 재발을 방지하거나 지연시키는 것은 여전히 해결해야 할 하나의 큰 문제이다.
특히, EMT (epithelial-mesenchymal transition) 과정은 자신의 세포 극성과 세포간 부착 능력을 잃고 중간엽 줄기세포가 되기 위한 이동성 및 침습성을 획득하는 과정으로, 중간엽 줄기세포는 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 다능성 기질 세포이다. EMT는 중배엽 형성과 신경관 형성 등 다양한 발달 과정에서 필수적인 과정이지만, 장기의 섬유증이나 암의 진행과　전이의 개시 단계와도 밀접한 연관이 있는 것으로　알려져 있으며, 간암 세포의 전이 과정 또한 EMT와 연관이 있는 것으로 알려져 있어 이에 대한 연구가 필요한 상황이다 (Nagai, Tomoyuki, et al.　Molecular cancer therapeutics　10.1 (2011): 169-177.).
이에, 본 발명자들은 간암에 대한 효과적인 치료제를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 감잎 추출물이 세포독성이 없는 농도에서도 HGF (Hepatocyte growth factor)에 의해 전이가 유도된 간암 세포의 이동 및 침습을 저해하여 간암의 전이를 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 감잎 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 항암 보조제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 감잎 추출물은 세포독성이 낮고 간암세포의 이동성 및 침습성을 저해시킬 수 있으며, 전이 관련 신호전달체계를 저해하여 간암세포의 전이를 억제할 수 있으므로, 간암 전이 억제용 약학 조성물, 항암 보조제 조성물, 의약외품 조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 간암세포에서 감잎 추출물의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다; EEDK, 감잎 에탄올 추출물.
도 2는 간암세포에서 감잎 추출물의 세포 이동성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 간암세포에서 감잎 추출물의 침습성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 간암세포에서 감잎 추출물의 전이 관련 신호전달 인자 인산화 수준을 분석한 그래프이다.
도 5는 간암세포에서 감잎 추출물의 간암 줄기능 및 EMT 과정 관련 인자의 mRNA 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6는 폐암세포에서 감잎 추출물의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 폐암세포에서 감잎 추출물의 세포 이동성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 하나의 양태는, 간암 전이를 억제하기 위한, 상기 감잎 추출물의 용도를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "감잎"은 감나무목 감나무과의 낙엽활엽 교목인 감나무 (Diospyros　kaki)의 잎을 의미하며, 국내에서는 주로 차로 우려먹는다. 감잎이 가지는 약리활성으로는 혈당 강하, 혈액순환 장애, 대사성 장애, 면역 증강, 시신경 보호 등의 효능이 있다. 그러나 감잎의 간암 전이 억제 효과에 대해서는 알려진 바가 없으며, 본 발명자들에 의해 최초로 발견되었다.
상기 감잎은 채취한 것, 재배한 것 또는 시판되는 것 등의 제한이 없이 사용 가능하다.
상기 감잎 추출물은 감잎 조추출물 뿐 아니라 추출물의 추가적인 가공에 의한 모든 형태를 의미한다.
상기 감잎 추출물은 감잎 그 자체 또는 이의 분쇄물이거나, 추출공정을 통해 수득한 추출물일 수 있다. 상기 추출공정은 당해 기술분야에서 이용되는 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다.
상기 추출 용매는 이에 한정되는 것은 아니나 물, C1 내지 C10의 알코올, 헥산 (Hexane), 클로로포름 (Chloroform) 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 용매를 사용하는 것일 수 있으며, 구체적으로 에탄올을 사용하는 것일 수 있다. 상기 추출 용매의 양은 감잎의 건조 중량의 2 내지 20배로 하는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출 방법은 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 초음파 추출방법으로 추출될 수 있다. 추출시 온도는 구체적으로 10℃ 내지 100℃일 수 있으며, 보다 구체적으로 상온일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 상기 감잎 추출물은 EEDK (ethanol extract of Diospyros kaki)와 혼용하여 사용될 수 있다.
본 발명에서의 용어, "간암 (liver cancer)"은 간의 대부분을 차지하는 간 세포에서 기원하는 악성 종양을 말한다. 넓은 의미로는 간에 생기는 모든 종류의 악성 종양 (예를 들면 간내 담관암)이나 다른 기관의 암이 간에 전이되어 발생하는 전이성 간암까지도 포함하지만, 간세포 암종 (Hepatocellular carcinoma, HCC)이 간암 중 가장 흔하기 때문에 일반적으로는 간 세포에서 발생하는 간세포 암종만을 의미한다.
상기 간암은 Hep3B, HepG2 및 SNU475일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서의 용어, "전이 (metastasis)"는 악성 종양이 진행함에 따라 종양이 처음 발생한 장기 (원발 부위)로부터 다른 조직 (림프절 포함)으로 퍼져 나가는 현상을 의미하며, 악성 종양 세포가 증식하고 암이 진행함에 따라 새로운 유전 형질을 획득하면서 종양 세포가 혈관과 임파선으로 침윤하고 혈액과 림프를 따라 순환하다가 다른 조직에 정착, 증식하게 되면 전이가 일어난다.
특히, 간암의 경우, 간암세포가 EMT 과정을 통해 이동성 및 침습성을 획득하여 전이를 개시하는 것으로 알려져있다 (Nagai, Tomoyuki, et al.　Molecular cancer therapeutics　10.1 (2011): 169-177.).
상기 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 과정은 자신의 세포 극성과 세포간 부착 능력을 잃고 중간엽 줄기 세포가 되기 위한 이동성 및 침습성을 획득하는 과정으로, 중간엽 줄기세포는 다양한 유형의 세포로 분화할 수 있는 다능성 기질 세포이다. EMT는 중배엽 형성과 신경관 형성 등 다양한 발달 과정에서 필수적인 과정이지만, 장기의 섬유증이나 암의 진행과　전이의 개시 단계와도 밀접한 연관이 있는 것으로　알려져 있다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 이동 또는 침습을 저해함으로써 간암 전이 억제를 달성하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 간암세포에 전이를 유도하고 감잎 추출물을 처리하여 세포 이동성 및 침습성을 분석한 결과, 대조군과 비교하여 HGF로 전이를 유도한 실험군은 세포 이동 및 침습율이 증가한 반면, 전이 유도 후 감잎 추출물을 처리한 실험군은 세포 이동 및 침습율이 감소한 것을 확인하였다 (도 2 및 3).
또한, 본 발명에 따른 조성물은 전이 관련 세포 신호전달을 저해함으로써 간암 전이 억제를 달성하는 것일 수 있으며, 상기 전이 관련 세포 신호는 Met, JNK 및 cJun의 인산화반응 (Phosphorylation)일 수 있다.
특히, 상기 Met은 활성화할 경우 발암 (carcinogenesis) 과정에 중요한 기전으로 작용하며, 간암의 줄기능 (Stemness) 마커 중 하나인 K19의 발현을 조절하는 것으로 알려져있다 (Rhee, Kim, et al. Cancer Research 78. 7 (2018): 1619-1631.). 간암세포는 섬유아세포 유래 HGF로부터 Met 신호전달경로가 활성화되어 K19 발현이 증가되며, 이를 통하여 공격적인 표현형을 획득하게 된다.
따라서, Met는 간암의 줄기능 (Stemness)에 영향을 주는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 간암세포에 전이를 유도하고 감잎 추출물을 처리하여 전이 관련 신호전달 인자의 인산화 분석을 진행한 결과, HGF 첨가시 증가했던 Met, JNK 및 cJun의 인산화 수준이 감잎 추출물을 첨가한 경우 첨가 후 배양 시간에 따라 그 수준이 감소하는 것을 확인하여 감잎 추출물이 간암세포의 전이 관련 신호전달체계를 저해하는 것을 확인하였다 (도 4).
이는, 상기 감잎 추출물이 상기 간암세포의 전이를 억제하는 용도로 유용하게 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
또한, 본 발명에 따른 감잎 추출물은 EMT 과정을 통한 전이를 유도하는 HGF에 의해 유도된 세포 이동, 침습 및 신호전달을 저해한 것이므로, 본 발명에 따른 조성물은 EMT 과정을 저해하여 간암 전이 억제를 달성하는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "약학 조성물"이란, 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각의 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 창상 예방 또는 치료용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 상엽 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구, 비경구, 직장, 국소, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 피하 등으로 투여할 수 있으며, 약학 조성물의 유효성분은 투여받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어 0.1 mg/g/일 내지 100 mg/g/일, 보다 구체적으로는 5 mg/g/일 내지 50 mg/g/일이 될 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 하나의 양태는, 감잎 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "개체"란, 간암의 전이가 발생하였거나 발생할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료방법은 구체적으로, 간암의 전이가 발생하였거나 발생할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 목적하는 바에 따라 점안 투여, 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경피패치투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 항암 보조제 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 간암의 침습 및 이동을 억제하여 항암제의 활성 물질이 표적에 효과적으로 작용할 수 있도록 함으로써 항암 보조 효과를 달성하는 것일 수 있다.
본 발명의 항암 보조제 조성물은 항암제의 항암 효과는 증대시키고, 항암제의 부작용은 억제 또는 개선시키기 위한 어떠한 종류의 항암제 또는 항암 보조제와 병용 투여될 수 있다. 또한, 상기　항암　보조제 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 인체에 투여될 수 있다.
상기 조성물은 또한 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물은　항암　치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있으며, 이런 담체로 생리학적 식염수를 예로 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 의약외품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미한다. 예를 들어, 약사법에 따른 의약외품은 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람/동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
구체적으로, 본 발명의 감잎 추출물은　간암 전이 억제를 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 수 있다.
본 발명의　조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기　조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 건강기능식품을 제공한다.
건강기능식품 (functional food)이란, 특정보건용 식품 (food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하는데, 상기 식품은 암 전이 억제에 유용한 효과를 얻기 위하여 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 식품학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 감잎 추출물을 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없으며, 예를 들어 각종 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다. 상기 식품 조성물에는 암 전이 억제 효과에 방해가 되지 않는 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 그 종류가 제한되는 것은 아니다.
이때, 상기 식품에 포함되는 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 식품 조성물의 총 중량에 대하여 0.01 내지 100 중량%, 보다 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함될 수 있다.
식품이 음료인 경우에는 100 ㎖를 기준으로 1 내지 30 g, 바람직하게는 3 내지 20 g의 비율로 포함될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신 (niacin), 비오틴 (biotin), 폴레이트 (folate), 판토텐산 (panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연 (Zn), 철 (Fe), 칼슘 (Ca), 크롬 (Cr), 마그네슘 (Mg), 망간 (Mn), 구리 (Cu) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다. 또한, 방부제 (소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제 (표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제 (부틸히드록시아니졸 (BHA), 부틸히드록시톨류엔 (BHT) 등), 착색제 (타르색소 등), 발색제 (아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제 (아황산나트륨), 조미료 (MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료 (둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료 (바닐린, 락톤류 등), 팽창제 (명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제 (호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물 (food additives)을 첨가할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용된다.
본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조 시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 감잎 추출물의 제조
본 실험에서 사용된 감잎은 강원도 강릉시에서 구입하였다. 감잎 추출물을 제조하기 위해, 건조된 감잎을 분말화한 후 800 g에 7 L의 주정 에탄올 (95%)을 가하고 4시간동안 초음파 추출한 후 추출액을 여과하였다. 추출액을 여과한 후 남은 잔사에 다시 7 L의 에탄올을 가하고 4시간동안 초음파 추출하는 방법을 추가로 4회 반복하여 총 추출액 35 L를 수득하였다. 상기 추출액 35 L를 35℃ 에서 감압 농축하여 에탄올 추출물 33 g을 수득하였다. 추출물은 20 mg/㎖로 DMSO에 녹여 적당한 농도로 희석해서 실험에 사용하였다.
실험예 1. 감잎 추출물의 세포독성 실험
감잎 추출물의 세포독성을 측정하기 위해, 세포생존율분석법을 수행하였다. 인간 간암 세포주인 Hep3B, HepG2 및 SNU475 세포 (한국세포주은행)를　10% 우태아혈청, 페니실린 (penicillin) 100 IU/㎖ 및 스트렙토마이신 (streptomycin) 100 ㎍/㎖이 첨가된 DMEM과 RPMI1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 배양기 (Forma Scientific Co., Marjetta, OH, USA)에서 배양하였다. 세포 배양에 사용한 배지 조성물들은 모두 GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA)사 제품을 사용하였다.
감잎 추출물의 첨가에 의한 암세포주의 생장 억제 효과를 조사하기 위하여, 세포생존율을 확인 할 수 있는 방법인 EZ-CYTOX (Daeil Labservice, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 상기에서 배양된　간암세포 Hep3B, HepG2 및 SNU475를 96웰 세포 배양 플레이트 (well plate)에 각각 1 ×104　개/웰의 농도로 분주하고 24시간 배양하였다. 그 후 감잎 추출물을 다양한 농도 (6.25, 12.5, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 그 후 EZ-CYTOX solution을 넣어 1시간 동안 배양 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여 생존 세포를 확인하였다. 본 실험은 독립적으로 3회 반복하여 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, HepG2 및 SNU475에서는 감잎 추출물에 의한 세포독성이 나타나지 않았으나, Hep3B에서는 100 ㎍/㎖에서 세포독성을 나타내는 것을 확인하였다. 따라서, 이후의 실험은 감잎 추출물이 세포독성을 나타내지 않는 농도로 진행하였다.
실험예 2. 간암세포에서 감잎 추출물 처리에 따른 세포 이동 저해효과 분석
간암세포의 이동성을 측정하기 위해, 상처 치료 어세이 (wound healing assay)를 수행하였다. 간암세포의 전이 유도는 간세포에서 EMT 과정을 촉진하는 것으로 알려진 HGF를 이용하였다.
우선, 간암세포 Hep3B, HepG2 및 SNU475를 24시간 후 단층으로 80% 컨플루언스에 도달했을 때의 농도로 24웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 웰의 중앙을 가로질러 새로운 200 ㎕ 옐로우 파이펫 팁으로 단층에 조심스럽게 천천히 스크래치를 냈다. 결과적으로 생성된 갭 거리를 팁의 끝의 외부 지름과 동일하게 하였다. 스크래치를 낸 후, PBS (phosphate buffered saline)로 세포가 바닥에서 떨어지지 않도록 조심스럽게 2회 세척하여 분리된 세포를 제거하였다.
HGF (10 ng/㎖) 및/또는 감잎 추출물 (50 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 세포를 48시간 동안 배양한 후, 현미경 상에서 염색된 단층의 사진을 촬영하였다 (도 2). 도 2에 나타낸 바와 같이, 감잎 추출물 (50 ㎍/㎖)의 처리에 의해서 HGF로부터 유도된 Hep3B, HepG2 및 SNU475의 운동성이 줄어들었음을 확인할 수 있었고, 이는 전이 억제에 영향을 줄 수 있다는 가능성을 증명하는 결과를 도출할 수 있었다.
실험예 3. 간암세포에서 감잎 추출물 처리에 따른 세포 침습 저해효과 분석
간암세포의 침습 (invasion) 여부를 확인하기 위하여 Cell Invasion Assay Kit (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 이용하여 침습 분석을 수행하였다.
먼저 polycarbonate membrane (8 ㎛ pore-sized)의 윗면에 ECMatrix가 코팅되어 있는 트랜스웰 (transwell)에 간암세포 Hep3B, HepG2 및 SNU475를 무혈청 배지 및 10% FBS가 포함된 배지에서 배양하였다. 트랜스웰 아래쪽은 HGF (10 ng/㎖) 포함되어 있는 무혈청 배지 및 10% FBS가 포함된 배지로 하여 37℃, 5%, CO2　조건으로 배양기 내에서 배양하였다. 상기 각각의 분주된 세포주에 감잎 추출물 (10 또는 50 ㎍/㎖)을 첨가하여 48시간 배양한 뒤, 막 위쪽의 ECMatrix 겔과 세포를 면섬유를 이용하여 닦아내고, 킷트 내 동봉되어 있는 염색시약으로 polycarbonate membrane을 염색하여 사진 촬영하였다. 또한, 촬영 후, 10% acetic acid로 용해하여 560 ㎚에서 흡광도를 측정하여 침습된 세포를 정량하였다.
그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, Hep3B, HepG2 및 SNU475 모두 HGF 첨가 시 대조군에 비해 높은 침습율을 나타냈으나, 10% FBS가 포함된 배지에서 배양한 경우, 10 ㎍/㎖의 감잎 추출물 첨가시 Hep3B, HepG2 및 SNU475 모두의 침습율이 대조군과 유사하거나 보다 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 무혈청 배지에서 배양한 경우, 감잎 추출물 첨가시 Hep3B는 농도 의존적으로 침습율이 감소하였고, HepG2는 낮은 농도에서도 침습율이 현저하게 감소하는 것을 확인하였으며, SNU475 또한 미약하지만 침습율이 감소하는 것을 확인하였다.
이는, 감잎 추출물이 간암세포의 침습율을 감소시키는 방법을 통해 전이를 억제할 가능성이 있을 것으로 판단할 수 있다.
실험예 4. 간암세포에서 감잎 추출물 처리에 따른 신호전달 인자 인산화 분석
감잎 추출물 처리에 따른 간암세포의 전이 관련 신호전달 체계의 변화를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 이용하여 HGF로 유도된 암세포의 전이와 관련된 단백질의 인산화 분석을 확인하였다.
우선 간암세포 Hep3B 및 HepG2를 24시간 후 단층으로 70% 컨플루언스에 도달했을 때의 농도로 6웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 감잎 추출물 (50 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 세포를 2시간 동안 전처리 한 후 HGF(10 ng/㎖)를 첨가하여 각 시간대 (0, 15, 30, 60분)별로 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척한 다음 단백질분해 억제제 (1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 ㎍/㎖ leupeptin)가 첨가된 RIPA (RadioImmunoPrecipitation) 버퍼를 이용하여 균질화 하였다. 이 균질액을 13,000 rpm에서 20분간 원심분리 후 상층액을 웨스턴 블롯 분석에 이용하였는데 단백질의 양은 Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA USA)를 이용하여 측정하였다. 웰당 20 ㎍의 단백질을 loading 하여 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 진행하였다. 그 후 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 옮긴 다음, 하기에 명시된 항체를 이용하여 면역 반응을 시켰다.
1차 항체로 anti-phospho-Met (Tyr1234/1235), anti-Met, anti-phospho-JNK (Thr183/Tyr185), anti-JNK, anti-phospho-ERK (Thr202/Tyr204), anti-ERK, anti-phospho-p38 (Thr180/Tyr182), anti-p38, anti-phospho-cJun (Ser73), anti-cJun, anti-GAPDH를 사용하여 이 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방식으로 실험을 수행하였다. 본 실험에서 사용된 항체는 모두 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)사 제품을 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, HGF를 첨가한 경우, Hep3B 및 HepG2에서 HGF-Met 신호전달 경로 관련 모든 단백질의 인산화된 단백질이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
하지만, HGF 및 감잎 추출물을 첨가한 경우, Hep3B에서는 ERK 및 p38은 인산화 수준의 차이를 확인하기 어려웠으나, Met, JNK 및 cJun의 경우, 시간에 따라 인산화 수준이 감소하는 것을 확인하였다. HepG2에서는 Hep3B와 동일한 Met,JNK 및 cJun의 인산화 억제뿐만 아니라 p38 역시 인산화 수준이 감소함을 확인하였다.
이는, 감잎 추출물이 HGF-MET 신호전달체계를 저해하여 간암의 전이를 억제하는 것으로 판단할 수 있다.
실험예 5. 간암세포에서 감잎 추출물 처리에 따른 간암 줄기능과 EMT 과정 관련 인자 분석
감잎 추출물 처리에 따른 간암세포의 줄기능과 EMT 과정 관련 인자를 확인하기 위해, qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)을 이용하여 HGF로 유도된 암세포의 줄기능과 EMT 관련된 mRNA의 발현량을 분석하였다.
우선 간암세포 Hep3B, HepG2 및 SNU475를 24시간 후 단층으로 70% 컨플루언스에 도달했을 때의 농도로 6웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 감잎 추출물 (50 ㎍/㎖)의 존재 또는 부재 하에서 세포를 2시간 동안 전처리 한 후 HGF(10 ng/㎖)를 첨가하여 48시간 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS로 세척한 다음 cell scraper를 이용하여 세포를 수급하였다. 수급한 세포는 7,200 rpm에서 1분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 펠렛 부분만 역전사 중합효소 연쇄반응 분석에 사용하였는데, 세포로부터 추출한 total RNA의 농도는 Nanodrop(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) 을 이용하여 측정하였다. Total RNA 추출은 Qiashredder 및 RNeasy Mini Kit(Hilden, Germany) 제품을 이용하여 제조사에서 제시한 방법대로 추출하였다.
cDNA를 합성하기 위해 total RNA를 1 ㎍ 가 되도록 부피를 맞춰서 증류수와 합한 부피가 9 ㎕가 되도록 하고, oligo dT 및 dNTP를 각각 1 ㎕씩 넣어서 각 샘플을 만들었다. PCR 장비를 이용하여 65℃에서 5분간 반응시킨 후 얼음에 10분간 묻어서 냉각시켰다. 얼음을 이용하여 샘플을 냉각시키는 동안 10 X RT 및 DTT를 각각 2 ㎕씩 넣고 MgCl₂를 4 ㎕를 넣은 cDNA 합성 마스터믹스를 만들고 vortexing 및 spin down 시켰다. 10분간 식힌 샘플에 cDNA 합성 마스터믹스를 8 ㎕ 넣고 SuperscriptⅢ 효소(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 1 ㎕ 넣은 후 PCR 장비를 이용하여 50℃에서 50분, 85℃에서 5분 반응시킨 후 4℃에서 냉각시켰다.
qRT-PCR 반응을 위해 cDNA 샘플을 4℃에서 냉각시키는 동안 hKRT19, hVIM, hMMP-1, hMMP-2, 및 hMMP-9의 TaqMan® Gene Expression Assays (Life Technologies Corporation, Pleasanton, CA, USA)를 빛이 최대한 차단된 상태에서 녹였다. 멸균된 증류수를 8 ㎕, 준비된 각각의 TaqMan® Gene Expression Assays 를 1 ㎕, TaqMan Universal PCR Master Mix (Life Technologies LTD, Warrington, UK)를 10 ㎕를 섞은 혼합액을 만들어 놓고, 플레이트에 준비한 혼합액을 19 ㎕ 넣고 cDNA 샘플을 1 ㎕ 넣었다. 샘플을 상기와 같이 플레이트에 다 넣고 나서 필름으로 잘 봉하여 qRT-PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, HGF를 첨가한 경우, SNU475의 MMP-2 발현량을 제외하면 모든 간암세포주에 대해 모든 mRNA의 발현량이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 하지만, HGF 및 감잎 추출물을 첨가한 경우, 모든 mRNA 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. HepG2 에서는 VIM, Hep3B에서는 MMP-1,2 그리고 9의 mRNA 발현이 관찰되지 않았다.
이는, 감잎 추출물이 간암의 줄기능과 EMT 과정 또한 저해하며 이에 대한 결과는 HGF-Met 신호경로 활성 억제를 통한 간암 전이 억제와 관련이 있을 수 있음을 시사한다.
비교예 1. 감잎 추출물의 폐암 전이 효과 분석
감잎 추출물이 다른 암에서도 전이 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 폐암 세포주를 이용하여 전이 효과를 분석하였다.
1-1. 폐암세포에서 감잎 추출물의 세포독성 실험
실험예 1과 같은 방법을 사용하여 폐암세포 A549에서 세포생존율분석을 수행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 폐암세포에서는 20 ㎍/㎖의 감잎 추출물에서도 세포독성을 나타내었으며, 농도의존적으로 세포생존률이 감소하는 것을 확인하였다.
1-2. 폐암세포에서 감잎 추출물 처리에 따른 세포 이동 저해효과 확인
실험예 2와 같은 방법을 사용하여 폐암세포의 상처 치료 어세이를 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 TGF-β1을 첨가한 경우, 운동성이 증가한 것을 확인할 수 있었으나, 감잎 추출물을 첨가한 경우, TGF-β1만을 첨가한 경우와 비교하여 운동성의 차이를 나타내지 않았다.
따라서, 감잎 추출물은 폐암세포에서 낮은 농도에도 세포독성을 나타냈으며, 세포의 운동성에 영향을 주지 않으므로 폐암세포에 대한 전이 억제 효과는 나타내지 않는다는 것을 확인하였다.
종합하면, 본 발명에 따른 감잎 추출물은 간암세포주에서 낮은 세포독성을 가지고, 세포 이동 및 침습을 저해하는 것을 확인하였으며, 전이 관련 세포 신호전달체계를 저해할 수 있는 것을 확인하여 감잎 추출물의 간암세포 전이 억제 효과를 확인하였다.
또한, 다른 암세포에 대해서는 전이 억제 효과를 나타내지 않는 것을 확인하여 감잎 추출물이 간암세포에 특이적으로 전이 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
본 명세서는 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 내용은 그 상세한 기재를 생략하였으며, 본 명세서에 기재된 구체적인 예시들 이외에 본 발명의 기술적 사상이나 필수적 구성을 변경하지 않는 범위 내에서 보다 다양한 변형이 가능하다. 따라서 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명하고 예시한 것과 다른 방식으로 실시될 수 있으며, 이는 본 발명의 기술 분야에 통상의 지식을 가진 자이면 이해할 수 있는 사항이다.

Claims (13)

  1. 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 감잎 추출물은 물, C1 내지 C10의 알코올, 헥산 (Hexane), 클로로포름 (Chloroform) 및 그의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 용매에 의해 추출된 것인, 약학 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 용매는 에탄올인 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 간암 전이 억제는 세포 이동 또는 침습을 저해함으로써 달성되는 것인, 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 간암 전이 억제는 전이 관련 세포 신호전달을 저해함으로써 달성되는 것인, 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 전이 관련 세포 신호는 Met, JNK 및 cJun의 인산화반응 (Phosphorylation)인 것인, 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Met는 간암의 줄기능(Stemness)에 영향을 주는 것을 특징으로 하는 것인, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 간암 전이 억제는 EMT (epithelial-mesenchymal transition) 과정을 저해함으로써 달성되는 것인, 약학 조성물.
  9. 감잎 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제방법.
  10. 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 항암 보조제 조성물.
  11. 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 의약외품 조성물.
  12. 감잎 추출물을 포함하는 간암 전이 억제용 건강기능식품 조성물.
  13. 간암 전이를 억제하기 위한, 상기 감잎 추출물의 용도.
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