WO2012099419A2 - 대계근 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품 - Google Patents

대계근 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품 Download PDF

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    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of the extract of Rhizome root. Specifically, the present invention relates to a therapeutic composition and a functional food containing the extract of the causal root as an active ingredient exhibiting excellent prophylactic or therapeutic efficacy against brain cancer.
  • Brain cancer refers to abnormally increased proliferation of any type of neuron, also referred to as primary brain cancer, or any other cancer that metastasizes to the central nervous system (CNS), also referred to as brain metastasis.
  • CNS central nervous system
  • Primary brain cancer can only occur in those cases where the nerve cells lose their protective ability to undergo apoptosis.
  • Examples of primary brain cancers include, but are not limited to, neuroma, astrocytoma, neuroblastoma, glioma, meningioma, oligodendrocyte, stromal blastoma, spinal cord tumor and neuromyoma.
  • Gliomas comprise about 60% of all primary CNS tumors and typically occur in the cerebral hemispheres of the brain, but can be found in other areas such as the visual nerve, brain stem or cerebellum. Gliomas can be classified into groups according to the type of glial cells from which they originate (Kornblith et al, (1986), Cancer: Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg , S, eds., JB Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41: Neoplasms of the Central Nervous System). The most common type of glioma is astrocytoma. These tumors develop from star-shaped glial cells called astroglia.
  • Astrocytes are assigned a rating according to their malignancy.
  • Low-grade astrocytomas also known as grade I and II astrocytomas
  • Mid-grade astrocytoma also known as grade III astrocytoma
  • Grade III astrocytoma is treated with radiation and some chemotherapy following surgery.
  • High-grade astrocytoma also known as grade IV astrocytoma
  • Grade IV astrocytomas are usually treated with a combination of radiation and chemotherapy following surgery.
  • Glioblastoma multiforme is a grade IV astrocytoma, which is the most malignant and lethal primary brain tumor (Id).
  • Id primary brain tumor
  • the benefit of treatment is minimal, and treatment can significantly reduce the quality of the patient's short-lived life.
  • CNS tumors represent the most common group of solid tumors in young patients, there is a clear need in the art for primary brain cancer prevention and treatment methods that overcome the disadvantages of the above-mentioned conventional approaches.
  • Brain tumors are a secondary-induced cause of cancer-related death in infants, with approximately 25% of all such deaths, with current therapies in which most of these infants die within the first year of diagnosis.
  • Brain metastasis results from primary tumors elsewhere in the body, including but not limited to lung cancer (both small and non-small cell), breast cancer, colorectal cancer, prostate cancer, melanoma and pancreatic cancer. Particularly in patients with metastatic breast cancer, the incidence of brain metastasis is diagnosed at a rate of 10-20% (Tyson, R.M. et al, Therapy 3 (1), 97-112 (2006)).
  • Breast cancer is the second leading cause of cancer-related death in women, and nearly all deaths from breast cancer are due to metastatic disease with brain metastases found in 30% of patients at autopsy.
  • Standard modes of treatment include surgical resection, chemotherapy and radiation therapy, especially whole-brain radiation therapy (WBRT) and stereotactic radiosurgery or combinations thereof.
  • Surgery for brain metastases can improve survival, especially in patients with a single lesion. Surgery, however, may not be possible in terms of multiple lesions, lesions that are difficult to surgically approach, or inability to withstand surgery. In breast cancer, 50% of patients with brain cancer metastases have multiple metastases, making them less suitable as surgical candidates.
  • WBRT can improve intermediate survival over untreated and as an adjuvant for surgery, which reduces the chance of relapse and dying nerve death, but does not change survival or level of action.
  • SRS provides a method for treating brain metastases that cannot be surgically resected by location or patient symptoms.
  • SRS provides an improvement in quality of life but does not provide survival benefits, except for patients with a single metastasis.
  • the use of chemotherapy in the treatment of brain metastases is hampered by the impossibility of high molecular weight compounds, limiting most chemotherapeutic agents across the blood brain barrier. This is reflected in the fact that chemosensitive tumors, such as most metastatic breast carcinomas, often exhibit a complete systemic response to chemotherapy simultaneously with tumor progression in the brain.
  • this initial resistance to the use of chemotherapy in the treatment of brain metastases has recently changed based on observations in animal models and human brain tumor autopsies, and metastatic lesions cause blood brain barrier insufficiency, whereby chemotherapy Drugs can always enter the tumor.
  • Radiation therapy combined with chemotherapy has evolved from a first-line approach in the treatment of brain metastases.
  • Some problems associated with the above approaches include (i) deleterious side effects, including alteration of intelligence, learning ability, memory, motor skills, consciousness and emotions; (ii) recurrence of tumors within 3 to 5 years of treatment because of the development of resistance to these therapies; (iii) death due to ineffectiveness of this treatment. From the foregoing, it will be apparent that there is an urgent need to develop a chemotherapeutic agent that can cross the blood brain barrier in an effective amount to reduce neoplastic expansion and / or growth of cancer in the central nervous system, which is not yet satisfied.
  • Brain cancer is a generic term for primary brain cancer that develops in the brain tissue and the envelope that surrounds the brain, and secondary brain cancer that has metastasized from cancer that occurs in the skull or other parts of the body. Such brain cancers are often distinguished from cancers occurring in other organs. First of all, the lung, stomach, breast and other cancers are limited to one or two types of organs, and their properties are similar and similar. However, the brain develops a wide variety of cancers. For example, glioblastoma multiforme, malignant gliomas, lymphomas, germ cell tumors, metastatic tumors, and the like.
  • glioma especially glioblastoma multiforme (GBM)
  • GBM glioblastoma multiforme
  • Circii Radix is the root of the coriander plant Cirsium japonicum DC. This is used for the treatment of boils and for hemostasis such as uterine bleeding, hemorrhage and nosebleeds.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that the extract of the Greater Root can effectively kill brain cancer cells during the herbal research of the Greater Root.
  • the present invention provides a composition for the prevention and treatment of brain cancer comprising an active ingredient extracted circii radix (Circii Radix) with an organic solvent.
  • the organic solvent is preferably ethanol.
  • the present invention provides a functional food for preventing brain cancer containing a circii Radix ethanol extract containing a food supplement acceptable food supplement as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for the prevention and treatment of brain cancer containing Cirsium japonicum ethanol extract as an active ingredient.
  • the composition of the present invention includes the extract of the Greater Root as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the ethanol extract is preferably extracted for 24 hours at 50 °C, wherein the ethanol extract is more preferably dried and concentrated at 45 °C reduced pressure conditions, the ethanol is Most preferred is 95%.
  • the composition for preventing and treating brain cancer of the present invention, preferably comprises a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” is a pharmaceutically acceptable substance such as a liquid or solid filler, diluent, excipient or solvent which serves to transport the active ingredient from one organ or part of the body to another organ or part of the body. , Composition or vehicle.
  • composition for treating brain cancer of the present invention may be prepared as a medicament by adding one or more pharmaceutically acceptable carriers together with the active ingredient.
  • the carrier may include, but is not limited to, saline, buffered saline, water, glycerol and ethanol, and any suitable agent known in the art (Remingtons's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA) may be used. .
  • Formulation for pharmacological extract of the present invention can be administered orally during clinical administration and can be used in the form of a general pharmaceutical formulation, when formulated, commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrant And diluents such as surfactants or excipients.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc.
  • liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.
  • various excipients may be included, such as wetting sweeteners, fragrances, preservatives and the like.
  • composition of the present invention may be administered in various parenteral formulations during actual clinical administration, and solid preparations include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • solid preparations include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • calcium or vitamin D 3 may be added to enhance the efficacy of the treatment.
  • Such compositions may be presented in unit-dose (single) or multi-dose (several) containers, such as sealed ampoules and vials, and immediately before use, sterile liquid carriers such as water for injection Can be stored under freeze-drying conditions requiring only the addition of. Immediate injection solutions and suspensions can be prepared from sterile powders, granules and tablets.
  • the formulations of the present invention can be applied differently depending on the age, sex, condition of the subject, the absorption of the active ingredient in the body, the inactivation rate and excretion rate, the drug used in combination.
  • the invention also includes formulations of dosage units.
  • the formulations are present in individual dosage forms, such as tablets, coated tablets, capsules, pills, suppositories, and ampoules, wherein the amount of active compound in the drug corresponds to the fraction or multiple of the individual dosage.
  • Dosage units may contain, for example, one, two, three or four times the individual dosage, or 1/2, 1/3 or 1/4 times.
  • the individual dosages preferably contain an amount in which the active compound is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dosage.
  • extract refers to an active ingredient isolated from natural products.
  • the extract may be obtained by an extraction process using water, an organic solvent, or a mixed solvent thereof, and includes an extract, a dry powder thereof, or any form formulated using the same.
  • the ethanol extract of Greater Root muscle killed 96.3% of U-87 MG brain cancer cells at 100 ⁇ g / ml and the EC 50 (half maximal effective concentration) was 63.783 ⁇ g / ml.
  • the results demonstrate that the extract of the present invention has excellent killing activity of U-87 MG cells, and further has brain cancer treatment and prophylactic activity.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of brain cancer by administration of the composition.
  • treatment means any action that improves or advantageously alters the symptoms of brain cancer by administration of the composition.
  • the geunyeogeun extract can be used to extract the geunyeogeun extract using water, an organic solvent, or a mixed solvent thereof.
  • an organic solvent in particular ethanol.
  • the extracted solution can be used directly or can be concentrated and / or dried.
  • methanol, ethanol, isopropanol, butanol, ethylene, acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, butyl acetate, dichloromethane, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, propylene glycol, or a mixed solvent thereof may be used and extracted by room temperature or warming under conditions where the active ingredient of the herbal medicine is not destroyed or minimized.
  • the degree of extraction and loss of the active ingredient of the drug may vary, so select an appropriate organic solvent.
  • the extraction method is not particularly limited, and examples thereof include cold needle extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, and the like.
  • Filtration is a process of removing the suspended solid particles from the extract, it may be used to filter the particles using cotton, nylon or the like, or may be used, such as ultrafiltration, cryofiltration, centrifugal separation, but is not limited thereto.
  • Concentration of the extract may be used, such as concentrated under reduced pressure, reverse osmosis concentration.
  • the drying step after concentration includes freeze drying, vacuum drying, hot air drying, spray drying, reduced pressure drying, foam drying, high frequency drying, infrared drying, and the like. If desired, a process of grinding the final dried extract may be added.
  • the extract can perform an additional fractionation process.
  • the extract is suspended in distilled water to obtain a nonpolar solvent soluble layer by extraction and separation with a nonpolar organic solvent such as hexane, ether, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, or a mixed solvent thereof. It can be used by concentrating and / or drying it.
  • a nonpolar organic solvent such as hexane, ether, dichloromethane, chloroform, ethyl acetate, or a mixed solvent thereof. It can be used by concentrating and / or drying it.
  • the term "pharmaceutically acceptable salts” means salts derived from pharmacologically or physiologically acceptable inorganic acids, organic acids and bases.
  • suitable acid include hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, Formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium, alkaline earth metals such as magnesium, ammonium and the like.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating brain cancer diseases of the present invention comprises 0.1 to 50% by weight of the extract or compound based on the total weight of the composition.
  • the composition does not increase the efficacy, but may include additional ingredients that are commonly used in the pharmaceutical composition to improve the smell, taste, time and the like.
  • the composition adds inorganic and organic additives such as vitamins B1, B2, B6, C, E, niacin, carnitine, betaine, folate pantothenic acid, biotin, zinc, iron, calcium, chromium, magnesium, and mixtures thereof. It can be included as.
  • the composition may include a substance having a therapeutic activity against brain cancer used alone or used in the past.
  • the term "patient” refers to humans, horses, sheep, pigs, goats, camels, Means antelope, dog and other animals.
  • a composition comprising the extract of the Greater Root of the present invention, the above-mentioned brain cancer can be effectively prevented and treated.
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with existing brain cancer therapeutics.
  • the term "administration” means introducing a predetermined substance into a patient by any suitable method, and the route of administration of the composition of the present invention is oral or parenteral via any general route as long as the target tissue can be reached. May be administered.
  • the composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to a patient's sexually transmitted disease, age, severity, and drug activity.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. It may be single or multiple doses.
  • the method of administering the composition comprising the extract or compound prepared according to the preparation method of the present invention is preferably oral administration or intravenous administration.
  • the effective dose is oral administration, it is usually 1 to 1 time per adult. 500 mg / kg is preferred, and in the case of intravenous administration, 1 to 100 mg / kg is preferred, and may be administered 2-3 times a day.
  • Dosage levels for a particular patient may vary depending on sex, age, health condition, diet, time of administration, method of administration, drug mixture, the condition of the patient, and the extent of the onset of neurological disease.
  • the present invention provides a functional food for preventing brain cancer containing a circii Radix ethanol extract containing a food supplement acceptable food supplement as an active ingredient.
  • Functional food of the present invention preferably contains 0.1 to 5% by weight, more preferably 1% by weight of the ethanol extract relative to the total weight.
  • the present invention As a result of injecting the extract of the present invention into U-87 MG brain cancer cells, it was confirmed that U-87 MG brain cancer cells are killed (see FIG. 1 ). Therefore, it can be seen that the extract of the Greater Root muscle has a brain cancer treatment effect.
  • the present invention was completed by preparing a functional food for preventing brain cancer, which contains the extract of Greater Root as an active ingredient (see Preparation Example 2).
  • the Greater Root Extract of the present invention inhibits the growth of brain cancer cells and induces apoptosis. Therefore, the composition for treating brain cancer according to the present invention will be very effective in the treatment of brain cancer patients.
  • FIG. 1 is a result of Alamar Blue analysis to determine the effect of the introduction of the paraglia in the human brain cancer U-87 MG cells on the growth of brain cancer cells.
  • the horizontal axis shows the concentration of the extract, and the vertical axis shows the survival rate of brain cancer cells.
  • FIG. 2 is a result of Alamar Blue analysis to determine the effect of the introduction of turmeric extract on the growth of brain cancer cells in human brain cancer U-87 MG cells.
  • the horizontal axis shows the concentration of the extract, and the vertical axis shows the survival rate of brain cancer cells.
  • Alamar Blue analysis was performed on U-87 MG, a human brain cancer cell.
  • the Alamar Blue assay is a modified form of the MTT assay, in which a specific enzyme degrades a living cell and then measures the fluorescence intensity of the product as the compound breaks down to determine the relative number of living cells after treatment. I am an experimental method. It will be described in more detail below.
  • U-87 MG cells a brain cancer cell line used in the present invention, were distributed from the Korean Cell Line Bank (KCLB) and used for experiments.
  • MEM Minimum Essential Medium
  • FBS fetal bovine serum, fetal bovine serum
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic acid
  • the colic root used in the present invention was widely used as a medicinal herb, it was determined that there was no problem in stability, but the oral administration and the intraperitoneal administration were performed to confirm the toxicity.
  • Acute toxicity test was performed using 6-week-old SPF SD rats. Two animals per group were suspended orally administered at a dose of 5 g / kg in suspension of the root of the extract of Example 1 of the present invention in 0.5% methylcellulose solution. After administration of the test substance, mortality, clinical symptoms, and changes in body weight were observed. Hematological and hematological examinations were performed, and autopsy was performed to observe abdominal and thoracic organ abnormalities.
  • Turmeric is a substance that shows anticancer activity against various kinds of cancers such as lung cancer, uterine cancer and breast cancer.
  • the present inventors confirmed the effectiveness of the extract of the root of the present invention by confirming the extent to which the turmeric affects the growth of brain cancer cells.
  • the turmeric extract was confirmed the growth inhibition of the U-87 MG cells in the same manner as in Example 2, and the results are shown in Table 2 and FIG.
  • turmeric hardly reduced the growth of brain cancer cells even when the treatment concentration was high.
  • turmeric which is widely known as an anticancer substance, has almost no brain cancer treatment efficacy, whereas the extract of the present invention has excellent U-87 MG cell killing activity and further shows that it has brain cancer treatment and prophylactic activity.
  • the present inventors have confirmed that the anti-cancer activity of the extract of the gynecological muscle through the above-described embodiment was prepared a brain cancer treatment agent containing the gyno-geun extract as an active ingredient as follows.
  • the preparation of the following therapeutic agent can be used for the application of the health food as well as the therapeutic agent.
  • Cinnamon Root Extract 35%, Vitamin C 10%, Vitamin D 3 0.001%, Manganese Sulfate 0.1%
  • the present inventors have confirmed that the extract of the Greater Rheum root is excellent in the activity of treating brain cancer through the above embodiment, and prepared a functional food containing the same as an active ingredient.
  • Chewing gum was prepared using a conventional method using the composition and content of 20% of gum base, 76.36 to 76.76% of sugar, 0.24 to 0.64% of extract of colic root, 1% of fruit flavor, and 2% of water.

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Abstract

본 발명은 대계근 추출물의 신규한 용도에 관한 것에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대계근 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 대계근 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방용 기능성 식품에 관한 것이다. 본 발명에 따른 뇌암 치료용 조성물 및 기능성 식품은 뇌암 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 유도하는 효과가 있어 뇌암 치료 및 예방에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

대계근 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 건강 기능성 식품
본 발명은 대계근 추출물의 신규한 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 뇌암에 대해 탁월한 예방 또는 치료 효능을 나타내는 대계근 추출물을 유효성분으로 함유하는 치료용 조성물 및 기능성 식품에 관한 것이다.
현대인의 주요 질환 중에서, 암의 치료방법과 진단방법에 관한 연구는 발병빈도가 높은 폐암, 간암, 위암 등을 중심으로 진행되고 있다. 그러나, 발병빈도가 낮은 뇌암, 식도암, 대장암, 췌장암 등에 대한 연구는 상대적으로 저조한 실정이다. 뇌암의 임상증세로는 두통, 간질발작, 구토, 운동마비, 물체가 겹쳐보이는 현상, 시력저하, 호르몬 이상, 청력 저하, 현기증, 언어장애 등이 있다.
"뇌암"은 원발성 뇌암으로도 언급되는, 임의의 유형의 신경 세포의 비정상적으로 증가된 증식, 또는 뇌 전이로도 언급되는, 중추신경계 (CNS)로 전이되는 임의의 다른 암을 의미한다. 예를 들어, 뉴런, 미세아교세포 및 별아교세포를 포함하는 CNS에서 발견되거나 이를 포함하는 세포인 대부분의 신경 세포는 "최종적으로 분화"되며, 이는 그들이 더이상 세포 주기를 완수할 능력을 지니지 않는 것을 의미한다(Kornblith et al, (1986), Cancer: Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg, S, eds., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41 : Neoplasms of the Central Nervous System). 신경 세포가 세포 주기로 유입되더라도, 그들은 통상 세포 자멸사(세포 사멸) 되기 때문에, 과정을 완료할 수 없다(Multani, A.S., et al, Neoplasia 2(4), 339-45 (2000)). 신경 세포가 세포 자멸사를 겪는 보호 능력을 잃는 이러한 경우에만 원발성 뇌암이 발생할 수 있다. 원발성 뇌암의 예는 신경종, 별아교세포종, 신경모세포종, 신경아교종, 수막종, 희소돌기아교세포종, 속질모세포종, 척수 종양 및 신경집종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
신경아교종은 모든 원발성 CNS 종양의 약 60%를 포함하며 통상 뇌의 대뇌반구에서 발생하나, 시각 신경, 뇌 줄기 또는 소뇌와 같은 다른 영역에서 발견될 수 있다. 신경아교종은 그들이 기원한 아교 세포의 유형에 따라 그룹으로 분류될 수 있다(Kornblith et al, (1986), Cancer: Principles and Practice of Oncology, 2nd Ed., DeVita, V., Hellman, S., Rosenberg, S, eds., J.B. Lippincott Company, Philadelphia, Chapter 41: Neoplasms of the Central Nervous System). 신경아교종의 가장 통상적인 유형은 별아교세포종이다. 이들 종양은 별아교세포로 불리는 별-모양의 아교 세포로부터 발달된다. 별아교세포종은 그들의 악성에 따라 등급으로 할당된다. I 및 II 등급 별아교세포종으로도 알려진 저-등급 별아교세포종은 최소의 악성이며, 상대적으로 느리게 성장하고, 종종 외과술을 사용하여 완전하게 제거될 수 있다. III 등급 별아교세포종으로도 알려진 중간-등급 별아교세포종은 더욱 빠르게 성장하고 더욱 악성이다. III 등급 별아교세포종은 외과술 이후 방사선 및 일부 화학 치료법으로 치료된다. IV 등급 별아교세포종으로도 알려진 고-등급 별아교세포종은 급속히 성장하며, 근처 조직에 침투하고 매우 악성이다. IV 등급 별아교세포종은 통상 외과술 이후 방사선 요법 및 화학 치료법의 조합으로 치료된다. 다형성 아교모세포종은 IV 등급 별아교세포종이며, 이는 그 중 가장 악성이고, 치명적인 원발성 뇌 종양 (Id)이다. 동일한 외과술 기술 및 원리가 다형성 아교모세포종 및 덜 악성인 뇌 종양을 치료하는 데 적용될 때, 다형성 아교모세포종 종양의 완전한 제거는 성취되기 더 어렵다.
악성의 차이는 또한 원발성 뇌 종양을 갖는 환자에 대한 예후에 반영된다. I 등급 별아교세포종에 대하여 치료된 환자가 통상 재발 없이 10년 이상을 생존할 수 있는 반면, IV 등급 별아교세포종 종양을 갖는 환자에 대한 평균 생존 기간은 외과술 치료 이후 15주이다. IV 등급 별아교세포종 종양의 높은-악성 성장 가능성 때문에, 오직 5%의 환자가 단독의 외과술 치료 이후에 1년 동안 생존하고, 2년 이후에는 거의 0% 생존율을 갖는다. 외과술 치료와 배합된 방사선 치료는 2년의 치료 이후에 약 10%로 생존율을 증가시키나, 사실상 5년 넘게 생존하는 환자는 없다.
외과술, 방사선 치료법 및 화학 치료법의 치료 요법이 IV 등급 별아교세포종 뇌 종양을 갖는 환자에 대하여 적당하게 증가된 수명에 대한 기회를 제공하는 한편, 각 치료 방법과 관련된 위험이 많다. 치료의 혜택이 최소이며, 치료는 환자의 잠시 남아있는 수명의 질을 상당히 감소시킬 수 있다. 따라서, 특히, CNS 종양이 어린 환자에서 고형 종양의 가장 통상적인 그룹을 나타내기 때문에, 상기-언급된 종래의 접근법의 단점을 극복하는 원발성 뇌암 예방 및 치료 방법이 본 분야에서 분명히 필요하다. 뇌 종양은 진단 첫 해 내에 이들 유아 대부분이 사망하는 현재 치료법과 함께 그리고 모든 그러한 사망의 대략 25%을 차지하는 유아의 암-관련 사망의 2차-유발 원인이다.
원발성 뇌 종양과 비교하여, 뇌 전이의 발생 수는 훨씬 더 많다. 대략 100,000명의 환자가 미국에서 해마다 증후성 두개내 전이를 가지며, 부검 연구에 따라 암 환자의 4분의 1은 종양 전이를 갖는다(Newton, H.B., et al, J. Neurooncol. 61, 35-44 (2003)). 뇌 전이는 예를 들어, 폐암 (소세포 및 비-소세포 둘다), 유방암, 직장결장암, 전립선암, 흑색종 및 췌장암을 포함하나 이에 한정되지 않는 신체의 다른 곳의 원발성 종양으로부터 유발된다. 특히 전이성 유방암을 갖는 환자에서, 뇌 전이의 발생수는 10 내지 20%의 비율로 진단된다(Tyson, R.M. et al, Therapy 3(1), 97-112 (2006)). 유방암은 여성에서 암-관련 사망을 두 번째로 유발하는 원인이며, 유방암으로부터의 거의 모든 사망은 부검에서 30%의 환자에서 발견되는 뇌 전이를 가지는 전이성 질환 때문이다.
치료의 표준 방식은 외과적 절제술, 화학 치료법 및 방사선 치료법, 특히 전-뇌 방사선 치료법 (WBRT) 및 정위방사선외과술 또는 이의 조합을 포함한다. 뇌 전이를 위한 외과술은 특히 단일 병변을 갖는 환자에서 생존을 개선시킬 수 있다. 그러나 외과술은 다발성 병변, 외과술적으로 가까이하기 어려운 병변 또는 외과술을 견딜 능력이 없는 환자의 면에서 가능하지 않을 수 있다. 유방암에서, 뇌암 전이를 지닌 50% 환자는 다발성 전이를 가져, 외과술 후보로서 덜 적합하게 한다. WBRT는 미치료에 대하여 중간 생존을 개선시킬 수 있으며, 외과술에 대한 어쥬번트로서, 이는 재발률 및 죽어가는 신경 죽음의 기회를 감소시키나, 이는 생존 또는 작용 수준을 변화시키지 않는다. SRS는 위치 또는 환자 증상에 의하여 외과술적으로 절제할 수 없는 뇌 전이를 치료하는 방법을 제공한다. SRS는 삶의 질의 개선을 제공하나, 단일 전이를 지닌 환자를 제외하고, 생존 혜택을 제공하지 않는다. 뇌 전이의 치료에서 화학 치료법의 사용은 고 분자량 화합물의 불가능에 의하여 방해되어, 혈액뇌장벽을 가로지르는 대부분의 화학 치료법 제제를 제한한다. 이는 화학 감수성 종양, 이를 테면 대부분 전이성 유방 암종이 종종 뇌에서 종양 진행과 동시에 화학 치료법에 대한 완전한 전신 반응을 나타내는 사실에 반영된다. 그러나 뇌 전이의 치료에서 화학 치료법의 사용에 대한 이러한 초기 저항은 동물 모델 및 인간 뇌 종양 부검에서의 관찰에 기초하여 최근에 변화하였으며, 전이성 병변은 혈액뇌장벽 부전을 유발하며, 이에 의하여, 화학 치료법 약물은 항시 종양으로 유입될 수 있다. 화학 치료법과 연결된 방사선 치료법이 뇌 전이의 치료에서 첫번째-선의 접근으로 진화되었다.
그러나 현재 치료 방법 모두와 관련된 심각한 위험 및 제한이 있다. 종종 신체의 정상 조직을 통하여 바람직하게 암 조직의 매우 특이적이며 종종 불완전하게 정의된 영역에 고도의 파괴성 용량의 전리 방사선을 전달하려는 시도의 방사선 치료법은 무엇보다 기억 손실 및 성격 변형을 유발하는 신체의 정상 신경계 또는 다른 조직의 파괴성 때문에 심각하며 상당한 부작용을 가질 수 있다. 신체의 조직에 다른 종류의 화학적 제제 또는 약물의 투여를 통하여 바람직하게 정상 세포 대신에 암 세포를 죽이려는 시도의 화학 치료법은 현재 이용가능한 화학적 제제에 의하여 효능이 제한되며, 정상 조직의 독성 및 의도하지 않은 부작용을 유발할 수 있다. 암의 진행을 기계적으로 파괴 또는 방해하는 시도의 외과술은 또한 정상 조직의 기계적 외상 또는 파괴의 결과로서 심각한 부작용 또는 결과를 유발할 수 있다. 상기한 접근법과 관련된 일부 문제점은 (i) 지능, 학습 능력, 기억, 운동 기능, 의식 및 감정의 변경을 포함하는 해로운 부작용; (ii) 이들 치료법에 대한 내성의 발달 때문에 치료 3 내지 5년 내에 종양의 재발; (iii) 이러한 치료가 효과가 없는 것에 따른 사망이다. 상기한 것으로부터, 아직 만족되지 않은, 중추신경계에서 암의 신생 확장 및/또는 성장을 감소시키기 위한 유효량으로 혈액뇌장벽을 가로지를 수 있는 화학치료제를 개발하는 것이 긴급하게 필요한 것이 명백할 것이다.
뇌암은 뇌조직과 뇌를 싸고 있는 뇌막에서 발생되는 원발성 뇌암과 두개골이나 신체의 다른 부위에서 발생된 암으로부터 전이된 이차성 뇌암을 통칭하는 것이다. 이와 같은 뇌암은 다른 장기에서 발생하는 암과 구분되는 점이 많다. 우선 폐, 위, 유방 등에 생기는 암은 장기별로 한 두 종류에 국한되고, 그 성질이 동일, 유사한 편이다. 그러나 뇌에는 매우 다양한 종류의 암이 발생한다. 예를 들면 다형성아교모세포종, 악성신경교종, 임파선종, 배아세포종, 전이성 종양 등 다양하다.
이 중에서도 신경교종(glioma), 특히 다형성아교모세포종(glioblastoma multiforme, GBM)은 가장 악성이고 공격적이어서 예후가 매우 좋지 않으며, 진단 후 평균 생존 기간이 약 1년을 넘지 못하는 매우 치명적인 질환이다. 뇌세포와 종양세포 간의 경계가 분명하지 않기 때문에, GBM를 외과적을 완전히 제거하는 것은 거의 불가능하다.
따라서, 외과적 치료 이외의 화학적 치료제의 개발이 시급한 실정이지만, 아직 효과적인 치료법이 개발되지 않아서, 이에 대한 연구와 개발이 요구된다.
대계근은(Circii Radix)은 엉기시과 식물인 대계(Cirsium japonicum DC.; 큰엉겅퀴)의 뿌리로 종기의 치료 및 자궁출혈, 토혈, 코피 등의 지혈에 사용된다.
그러나, 아직 대계근의 뇌암 억제 효과에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 대계근에 대한 생약 연구를 하던 중, 대계근 추출물이 뇌암 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대계근 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 치료용 조성물 및 기능성 식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대계근(Circii Radix)을 유기용매로 추출한 유효성분을 포함하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기 유기용매는 에탄올인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 대계근(Circii Radix) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방용 기능성 식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 대계근(Cirsium japonicum) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 활성성분으로서 대계근 추출물을 포함하며, 추가적으로 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 뇌암 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 에탄올 추출물은 50℃에서 24시간 동안 추출되는 것이 바람직하고, 이때 상기 에탄올 추출물은 45℃ 감압 조건에서 건조 및 농축되는 것이 보다 바람직하며, 상기 에탄올은 95%인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 뇌암 예방 및 치료용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 활성 성분을 수송하는 역할을 하는 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제 또는 용매와 같은 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 운반체(vehicle)를 의미한다.
본 발명의 뇌암 치료용 조성물은 유효성분과 함께 추가로 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체를 첨가하여 약제로 제조할 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remingtons's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 모두 사용 가능하다.
본 발명의 대계근 추출물을 약제화하기 위한 제제는 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 실제 임상 투여시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 구체적으로, 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 또한 치료제의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 제시될 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들면, 주사용 수의 부가 만을 요구하는 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.
본 발명의 제제는 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다. 본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재하고, 약제 중 유효 화합물의 함량은 개별 투약량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투여량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투여량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미한다. 추출물은 물, 유기용매, 또는 이의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.
본 발명의 구체적인 실시에서, 대계근의 에탄올 추출물은 U-87 MG 뇌암 세포를 100 ㎍/㎖에서 96.3% 사멸시키고, EC50(half maximal effective concentration)은 63.783 ㎍/㎖이었다. 상기 결과는 본 발명의 대계근 추출물이 우수한 U-87 MG 세포의 사멸 활성을 가지며, 나아가 뇌암 치료 및 예방 활성을 가진다는 것을 입증하는 것이다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 뇌암 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 뇌암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 대계근 추출물은 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 유기 용매, 특히 에탄올을 사용하여 추출한다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 여과는 추출액으로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러내거나 한외여과, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
추출액의 농축에는 감압농축, 역삼투압 농축 등의 방법이 사용될 수 있다. 농축 후 건조 단계는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
또한, 상기 추출물은 추가의 분획 공정을 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 추출물을 증류수에 현탁시켜 비극성 유기 용매, 예를 들어, 헥산, 에테로, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸아세테이드 또는 이들의 혼합 용매로 비극성용매 가용층을 추출, 분리하여 수득하도록 하고, 이를 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"이란 약리학적 또는 생리학적으로 허용되는 무기산, 유기산 및 염기로부터 유도된 염을 의미한다. 적합산 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 포함할 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 알칼리 금속, 예들 들어, 나트륨, 알칼리토금속, 예들 들어, 마그네슘, 암모늄 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 뇌암 질환 예방 및 치료용 약학조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다. 또한, 상기 조성물은 약효를 증가시키지는 않으나 약재 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 비타민 B1, B2, B6, C, E, 니아신, 카르니친, 베타인, 엽산 판토텐산, 비오틴, 아연, 철, 칼슘, 크롬, 마그네슘, 이들의 혼합물 등의 무기, 유기 첨가물들을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 단독 사용하거나 기존 사용되어진 뇌암에 대한 치료 활성을 가지는 물질을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "환자"는 뇌암 및 이의 직, 간접적 원인에 의해 유발된 질환을 가지고, 본 발명의 조성물을 투여에 의하여 증상이 호전될 수 있는 인간과 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물을 의미한다. 본 발명의 대계근 추출물을 포함하는 조성물을 환자에게 투여함으로써, 상기에서 언급한 뇌암을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물을 기존의 뇌암 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 성병, 연령, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물의 투여방법은 경구투여 또는 정맥투여가 바람직하고, 일반적으로 그 유효 용량은 경구투여인 경우에는 보통 성인을 기준으로 1회에 1 내지 500 ㎎/㎏이 바람직하며, 정맥투여인 경우에는 1 내지 100 ㎎/㎏이 바람직하며, 하루 2-3 회 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 성별, 연령, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 약제혼합, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변화될 수 있다.
또한, 본 발명은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 대계근(Circii Radix) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 기능성 식품은 에탄올 추출물을 총중량에 대해 0.1 내지 5중량% 포함하는 것이 바람직하며, 1중량%로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에서는 U-87 MG 뇌암 세포에 본 발명의 대계근 추출물을 투입한 결과, U-87 MG 뇌암 세포가 사멸하는 것을 확인하였다(도 1 참조). 따라서, 대계근 추출물이 뇌암 치료 효과가 있다는 것을 새롭게 알 수 있다. 이에, 본 발명에서는 대계근 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방용 기능성 식품을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다(제조예 2 참조).
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 대계근 추출물은 뇌암 세포의 성장을 억제하고 세포사멸을 유도한다. 따라서 본 발명에 따른 뇌암 치료용 조성물은 뇌암 환자의 치료에 매우 효과적일 것이다.
도 1은 인간 뇌암 U-87 MG 세포에서 대계근의 도입이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위한 Alamar Blue 분석 결과이다. 도면의 가로축은 추출물의 농도를, 세로축은 뇌암 세포의 생존률을 나타낸다.
도 2는 인간 뇌암 U-87 MG 세포에서 강황 추출물의 도입이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위한 Alamar Blue 분석 결과이다. 도면의 가로축은 추출물의 농도를, 세로축은 뇌암 세포의 생존률을 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
<실시예 1> 대계근 추출물의 제조
서울 약재상에서 구입한 대계근(국산) 3 ㎏을 음지 및 실온에서 5일간 건조하고 분쇄하였다. 상기 분쇄된 대계근을 95% 에탄올(ethanol) 30 ℓ에 침지시키고 50℃에서 24시간 동안 추출하였다. 이것을 여과지를 통하여 여과한 후 45℃ 감압 조건에서 건조 및 농축하여 총 추출물 481 g을 수득하고, -20℃에서 보관하였다.
<실시예 2> 대계근 추출물이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향
상기 실시예 1에서 추출한 대계근 추출물이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 사람 뇌암 세포인 U-87 MG에 대하여 Alamar Blue 분석을 시행하였다. Alamar Blue 분석은 MTT 분석의 변형된 형태인데, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 알아내는 실험방법이다. 하기에서 보다 상세히 설명한다.
<2-1> 인간 뇌암 세포주의 준비 및 처리
본 발명에 사용된 뇌암 세포주인 U-87 MG 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 실험에 이용하였다. 상기 U-87 MG 뇌암 세포를 10% FBS(fetal bovine serum, 소태아혈청)(Welgene)와 25 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)를 포함하는 MEM(Minimal Essential Medium) 배지에서 배양하였다. 상기 세포를 37℃, 5% CO2의 수분이 있는 상태로 유지하고, 2-3일 정도 계대배양하였다.
<2-2> U-87 MG 세포의 세포 성장 억제 측정
상기 실시예 1에서 추출한 대계근 추출물이 뇌암 세포인 U-87 MG에 대한 세포 성장 억제효과를 확인하였다. 구체적으로, 96 웰 플레이트에 각 웰 당 8.0 X 103 개의 U-87 MG 세포를 주입(seeding)하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹인 상기 대계근 에탄올 추출물을 각각 0 내지 100 ㎍/㎖ 농도(구체적으로, 각각 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 및 100 ㎍/㎖ 농도)로 48시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 저해하는 정도를 확인하였다(표 1). 각 농도의 추출물을 처리한 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 0.2 ㎖의 세포 배양액에 20 ㎕의 Alamar Blue 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 544 ㎚의 파장에서 조사광을 조사하면서 590 ㎚에서 형광의 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 흡광도를 측정하였고, 뇌암 세포의 생존율을 도 1에 나타내었다.
표 1
대계근 농도 뇌암 세포 생존율 (평균) 표준편차
0 ㎍/㎖ 1.000 0.000
3.125 ㎍/㎖ 0.863 0.008
6.25 ㎍/㎖ 0.870 0.024
12.5 ㎍/㎖ 0.833 0.021
25 ㎍/㎖ 0.888 0.039
50 ㎍/㎖ 0.850 0.034
100 ㎍/㎖ 0.037 0.015
그 결과, 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이, 대계근의 처리 농도가 높을수록 뇌암 세포의 성장이 감소하였으며, 이로부터 대계근이 뇌암 치료 효과를 가짐을 알 수 있었다. 즉, 3.125 ㎍/㎖에서 13.7%, 12.5 ㎍/㎖에서 16.7%, 100 ㎍/㎖에서 96.3%로 뇌암 세포를 사멸시켰다. 아울러, EC50(half maximal effective concentration)은 63.783 ㎍/㎖로 측정되었다. 상기 표 1에서 대계근을 처리하지 않은 대조군의 뇌암 세포의 생존율 수를 1을 기준으로 하여 각각의 대계근 처리 농도에 따른 48시간 후의 뇌암 세포의 상대적 세포수를 기재하였다. 이와 같이, 본 발명의 대계근 추출물은 우수한 U-87 MG 세포 사멸 활성을 가지며, 나아가 뇌암 치료 및 예방 활성을 가진다는 것을 입증한다.
<실시예 3> 대계근 추출물에 의한 급성독성 시험
본 발명에 이용된 대계근은 널리 약재로 이용되고 있어서 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 1의 대계근 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 5 g/㎏의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 대계근 추출물은 모두 랫트에서 5 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 5 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.
<비교예 1>
강황은 폐암, 자궁암, 유방암 등의 다양한 종류의 암에 대하여 항암 활성을 나타내는 물질이다. 본 발명자들은 상기 강황이 뇌암 세포의 성장에 미치는 정도를 확인함으로써 본 발명의 대계근 추출물의 유효성을 확인하였다.
구체적으로, 서울 약재상에서 구입한 강황(국산) 3 ㎏을 음지 및 실온에서 5일간 건조하고 분쇄하였다. 상기 분쇄된 강황을 95% 에탄올(ethanol) 30 ℓ에 침지시키고 50℃에서 24시간 동안 추출하였다. 이것을 여과지를 통하여 여과한 후 45℃ 감압 조건에서 건조 및 농축하여 총 추출물 474 g을 수득하고, -20℃에서 보관하였다.
상기 강황 추출물을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 U-87 MG 세포의 성장 억제 정도를 확인하고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 기재하였다.
표 2
강황 농도 뇌암 세포 생존율 (평균) 표준편차
0 ㎍/㎖ 1.000 0.000
3.125 ㎍/㎖ 1.020 0.076
6.25 ㎍/㎖ 1.042 0.097
12.5 ㎍/㎖ 1.060 0.092
25 ㎍/㎖ 1.021 0.081
50 ㎍/㎖ 0.987 0.090
100 ㎍/㎖ 0.913 0.029
그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 강황은 그 처리 농도가 높은 경우에도 거의 뇌암 세포의 성장을 감소시키지 못하였다. 이와 같이, 항암 물질로 널리 알려진 강황은 거의 뇌암 치료 효능이 없는데 반하여, 본 발명의 대계근 추출물은 우수한 U-87 MG 세포 사멸 활성을 가지며, 나아가 뇌암 치료 및 예방 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
<제조예 1> 대계근 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 치료제의 제조
본 발명자들은 상기 실시예를 통해 대계근 추출물의 뇌암 치료 효능이 뛰어남을 확인하여 대계근 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 치료제를 하기와 같이 제조하였다. 또한, 하기 치료제의 제조예는 치료제 뿐만 아니라 건강식품의 제조에도 응용하여 사용될 수 있다.
<1-1> 대계근 추출물을 함유하는 연질캅셀(soft gelatin capsules)
대계근 추출물 20%, 비타민 C 4.5%, 비타민 D3 0.001%, 황산망간0.1%, 밀납10%, 팜유25%, 홍화씨유30.399%
<1-2> 대계근 추출물을 함유하는 정맥주사용 제제의 제조
대계근 추출물0.2%, 만니톨0.3%, 생리식염수9.5%
<1-3> 대계근 추출물을 함유하는 정제(tablet)
대계근 추출물 35%, 비타민 C 10%, 비타민 D3 0.001%, 황산망간 0.1%
결정셀룰로오즈 25.0%, 유당 17.999%, 스테아린산마그네슘 2%
<제조예 2> 대계근 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품의 제조
본 발명자들은 상기 실시예를 통해 대계근 추출물이 뇌암 치료 활성이 뛰어남을 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 하기와 같이 제조하였다.
<2-1> 음료의 제조
꿀 522 ㎎, 치옥토산아미드 5 ㎎, 니코틴산아미드 10 ㎎, 염산리보플라빈나트륨 3 ㎎, 염산피리독신 2 ㎎, 이노시톨 30 ㎎, 오르트산 50 ㎎, 대계근 추출물 0.48 ~ 1.28 ㎎, 물 200 ㎖의 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.
<2-2> 츄잉껌의 제조
껌베이스 20 %, 설탕 76.36 ~ 76.76 %, 대계근 추출물 0.24 ~ 0.64 %, 후르츠향 1 %, 물 2 %의 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.
<2-3> 캔디의 제조
설탕 50 ~ 60 %, 물엿 39.26 ~ 49.66 %, 대계근 추출물 0.24 ~ 0.64 %, 오렌지향 0.1 %의 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.
<2-4> 비스켓의 제조
박력1급 88 ㎏, 중력1급 76.4 ㎏, 정백당 16.5 ㎏, 식염 2.5 ㎏, 포도당 2.7 ㎏, 팜쇼트닝 40.5 ㎏, 암모 5.3 ㎏, 중조 0.6 ㎏, 중아황산나트륨 0.55 ㎏, 쌀가루 5.0 ㎏, 비타민 B1 0.003 ㎏, 비타민 B2 0.003 ㎏, 밀크향 0.16 ㎏, 물 71.1 ㎏, 전지분유 4 ㎏, 대용분유 1 ㎏, 제일인산칼슘 0.1 ㎏, 살포염 1 ㎏, 분무유 25 ㎏, 대계근 추출물 0.2 ~ 0.5 ㎏의 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 비스켓을 제조하였다.
<2-5> 아이스크림의 제조
유지방 10.0 %, 무지유고형분 10.8 %, 설탕 12.0 %, 물엿 3.0 %, 유화안정제(스팬, span) 0.5 %, 향료(스트로베리) 0.15 %, 물 63.31 ~ 62.91 %, 대계근 추출물 0.24 ~ 0.64 %의 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.
<2-6> 쵸코렛의 제조
설탕 34.36 ~ 34.76 %, 코코아 버터 34 %, 코코아 매스 15 %, 코코아 파우다 15 %, 레시틴 0.5 %, 바닐라향 0.5 %, 대계근 추출물 0.24 ~ 0.64 %의 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 초코렛을 제조하였다.
한편, 본 발명의 구체적 범위는 상기 기술한 실시예 보다는 특허청구범위에 의하여 한정지어지며, 특허청구 범위의 의미와 범위 및 그 등가적 개념으로 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태를 본 발명의 범위로 포함하여 해석하여야 한다.

Claims (6)

  1. 대계근(Circii Radix)을 유기 용매로 추출한 유효성분을 포함하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 에탄올로 추출한 유효성분은 50℃에서 24시간 동안 추출되는 것을 특징으로 하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 에탄올 추출물은 45℃ 감압 조건에서 건조 및 농축되는 것을 특징으로 하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌암 예방 및 치료용 조성물.
  6. 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 대계근(Circii Radix) 유기용매 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 예방용 기능성 식품.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105399784A (zh) * 2015-11-08 2016-03-16 南阳师范学院 一种新苯丙素苷类化合物及其制备方法和用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060008544A1 (en) * 2004-03-23 2006-01-12 Myhill Paul R Methods for enhancing antioxidant enzyme activity and reducing C-reactive protein levels
KR20090070188A (ko) * 2007-12-27 2009-07-01 덕성여자대학교 산학협력단 엉겅퀴 추출물 및 그 용도

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060008544A1 (en) * 2004-03-23 2006-01-12 Myhill Paul R Methods for enhancing antioxidant enzyme activity and reducing C-reactive protein levels
KR20090070188A (ko) * 2007-12-27 2009-07-01 덕성여자대학교 산학협력단 엉겅퀴 추출물 및 그 용도

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HUI KYOUNG LEE ET AL.: 'Antioxidant, Antimutagenesity and Anticancer Activities of Extracts of Cirsium Japonicum var. ussuriense KITAMURA' KOREAN JOURNAL OF MEDICINAL CROP SCIENCE vol. 11, no. 1, 2003, pages 53 - 61 *
MEE-RYUNG PARK ET AL.: 'Effect of Cirsium Japonicum var. ussuriense Extract on Tumor Immunity' KOREAN JOURNAL OF ORIENTAL MEDICINE vol. 27, no. 4, 2006, pages 30 - 47 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105399784A (zh) * 2015-11-08 2016-03-16 南阳师范学院 一种新苯丙素苷类化合物及其制备方法和用途

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