WO2012144854A2 - 리코찰콘 ａ의 신규 용도 - Google Patents

리코찰콘 ａ의 신규 용도 Download PDF

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WO2012144854A2
WO2012144854A2 PCT/KR2012/003066 KR2012003066W WO2012144854A2 WO 2012144854 A2 WO2012144854 A2 WO 2012144854A2 KR 2012003066 W KR2012003066 W KR 2012003066W WO 2012144854 A2 WO2012144854 A2 WO 2012144854A2
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licochalcone
ampk
present
obesity
hyperlipidemia
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정성현
권해연
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경희대학교 산학협력단
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to novel uses of Licochalcone A.
  • Obesity is a complex syndrome involving various factors, including genetic, nutritional, environmental and social factors. Due to obesity, hyperlipidemia, which increases the amount of cholesterol and triglycerides in the blood, may occur, resulting in hypertension, cardiovascular disease, and stroke. In addition, excessive intake of fat may also lead to fatty liver accumulation of blood due to blood cholesterol and fat accumulation in the body, ie, increased liver fat synthesis, reduced triglyceride release and burning, which may lead to fatty liver accumulation in the liver and cardiovascular diseases such as arteriosclerosis. have.
  • fatty liver can be divided into alcoholic fatty liver due to heavy drinking and non-alcoholic fatty liver due to obesity, diabetes, hyperlipidemia or drugs.
  • Non-alcoholic fatty liver often occurs in people suffering from obesity, insulin hypersensitivity, and diabetes, and is caused by high levels of free fatty acids in the blood due to insulin resistance or excessive fat breakdown.
  • Lipid metabolism abnormalities are caused not only by insulin resistance but also by excess intake of fat or cholesterol. Increased blood LDL cholesterol or triglyceride levels and lower HDL cholesterol levels both cause atherosclerosis. Due to this phenomenon, it is strongly desired to develop medicines and foods that are effective in improving lipid metabolism and suppressing fat accumulation.
  • AMP-activated protein kinase is a protein that senses and activates intracellular AMPs. It inhibits ATP-consuming signaling pathways and activates ATP-synthesizing signaling pathways to promote energy metabolism. It is a representative protein that plays an important role. By activating AMPK, it is known that it may have a prophylactic or therapeutic effect such as promoting fatty acid oxidation, inhibiting triglyceride accumulation in liver, type 2 diabetes, metabolic syndrome, obesity, cancer, degenerative disease (dementia), etc. ⁇ AMPK and the biochemistry of exercise: Implications for human health and disease.
  • SREBP Sterol regulatory element-binding protein
  • SREBP1 is synthesized as an inert precursor bound to the endoplasmic reticulum membrane and is activated after the N-terminus is cut off and moved to the nucleus to regulate the sterol regulatory element (SRE) of the regulatory gene promoter.
  • SREBP1 is known to mainly regulate the synthesis of neutral lipids.
  • Genes that regulate lipoogenesis include SREBP1, fatty acid synthase (FAS), sterol coA desaturase (SCD1), and glycerol-3-phosphate acyltransferase (GPAT). Acyl transferase).
  • PPAR ⁇ Peroxisome proliferator-activated receptor- ⁇
  • C / EBP CCAAT / enhancer-binding protein
  • adipocyte protein 2 adipocyte protein 2
  • the present invention seeks to provide a pharmaceutical or food composition for the prevention or treatment of lipid metabolism, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity or fatty liver, and the use thereof.
  • lycosalcon A activates AMPK in hepatocytes, promotes lipolysis, inhibits lipogenesis, inhibits the differentiation of adipocytes into adipocytes, and inhibits adipogenesis in adipocytes. It confirmed and completed this invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of AMPK (AMP-activated protein kinase) -related diseases containing lycochalcone A as an active ingredient.
  • AMPK AMP-activated protein kinase
  • the present invention provides a food composition for the improvement or prevention of AMPK-related diseases, containing Licochalcone A as an active ingredient.
  • the AMPK-related disease is selected from lipid metabolism disorder, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative disease (especially dementia). Means one or more diseases.
  • Licochalcone A ⁇ (2E) -3- [5- (1,1-dimethyl-2-propenyl) -4-hydroxy-2-methoxyphenyl] which is an active ingredient of the pharmaceutical or food composition of the present invention
  • 1- (4-hydroxyphenyl) -2-propen-1-one ⁇ is one of the major flavonoids of Glycyrrhizae radix (Saitoh & Shibata. Tetrahedron Lett. 50, pp4461-4462, 1975), its chemical structure Is as follows.
  • lycochalcone A The physiological function of lycochalcone A is unknown, but it has long been used as a powerful antimalarial agent (Chen et al., Antimicrob Agents Chemother. 38 (7) pp.1470-1475, 1994), and anticancer effect (EJPark et al., Planta Med. 64, pp. 464, 1998), anti-inflammatory effect (Korean Patent Publication No. 10-2010-0077553), prevention and treatment of diabetic nephropathy (Korean Patent Publication No. 10-2010-0135424)
  • the AMPK activating effect, lipid metabolism abnormality, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity or fatty liver treatment effects have not been known.
  • licochalcone A may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt thereof, and may also be used in the form of solvates and prodrugs.
  • licochalcone A may be separated from natural materials such as licorice and turnip by a method well known in the art, and artificially synthesized by those skilled in the art by methods commonly used in the art.
  • the licochalcone A content in the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms, progression of the disease, the condition of the patient, and the like, for example, 1 to 50% by weight, preferably 1 to 5% by weight based on the total composition weight. %, But not limited to.
  • Licochalcone A contained as an active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated with a pharmaceutically or food-acceptable carrier, excipient or diluent, etc.
  • a pharmaceutically or food-acceptable carrier for formulation, see Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), See Mack Publishing Company, Easton PA, et al.
  • the pharmaceutical composition containing licochalcone A according to the present invention may be prepared in an oral dosage form such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc. It may be used in the form of external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions.
  • Carriers, excipients and diluents which may be included here include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl Cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like, but are not limited thereto.
  • compositions of the present invention may include diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, humectants, disintegrating agents, surfactants, and other pharmaceutically acceptable additives which are commonly used.
  • solid preparations for oral administration tablets, pills, powders, granules, capsules and the like are possible, and such solid preparations include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, water, in addition to licochalcone A. It may be prepared by mixing cross or lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • excipient such as starch, calcium carbonate, water, in addition to licochalcone A. It may be prepared by mixing cross or lactose, gelatin and the like.
  • lubricants such as magnesium styrate talc may also be used.
  • suspensions When formulated as a liquid preparation for oral administration, suspensions, solvents, emulsions, syrups, and the like are possible, and various excipients, for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin Etc. may be included.
  • excipients for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin Etc. may be included.
  • sterile aqueous solutions When formulated into preparations for parenteral administration, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories are included.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like may be used, but are not limited thereto.
  • the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like may be used, but are not limited thereto.
  • Preferred dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on the condition and weight of the patient, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, but may be a therapeutically effective amount appropriately selected by one of ordinary skill in the art.
  • the dosage of the composition of the present invention is 10 mg / kg to 30 mg / kg per day, preferably 5 mg / kg to 10 mg / day, based on the content of lycochalcone A, the active ingredient. kg.
  • Administration may be administered once a day or may be divided several times. However, the scope of the present invention is not limited by the dose and frequency of administration.
  • compositions of the present invention can be used in mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like, for example, orally, or intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrauterine dural or brain. It may be administered by injection or the like intravascularly (Intracerebroventricular).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of AMPK related diseases. That is, the pharmaceutical composition of the present invention can be used for the prevention or treatment of one or more diseases selected from lipid metabolism abnormality, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative disease (especially dementia).
  • hyperlipidemia also includes hyperlipidemia-related diseases
  • hyperlipidemia-related diseases include atherosclerosis, angina pectoris, carotid artery disease, cerebral atherosclerosis, xanthoma, CHD, ischemic attack, restenosis after angioplasty, peripheral vascular disease, intermittent claudication, myocardial infarction ( For example, reduction of necrosis), dyslipidemia, postprandial lipidemia, and the like.
  • the degenerative disease may be dementia, preferably Alzheimer's dementia.
  • the invention also provides the use of Licochalcone A for the prophylaxis or treatment of the diseases listed above.
  • the invention also provides the use of Licochalcone A for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of the diseases listed above.
  • the present invention also provides for the prevention or treatment of AMPK related diseases described above, comprising administering a therapeutically effective amount of Licochalcone A to a subject in need thereof, such as a mammal, including a human. Provide a method of treatment.
  • the present invention also provides a food composition for the improvement or prevention of AMPK-related diseases, containing Licochalcone A as an active ingredient.
  • the food composition of the present invention can be used as a dietary supplement.
  • Health functional food means a food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functional functionality useful to the human body in accordance with Korean Act No. 6727 of the Health Functional Food, and "functionality” means the structure of the human body And ingestion for the purpose of obtaining nutrients for function or for obtaining useful effects in health uses such as physiological actions.
  • the food composition of the present invention may include a conventional food additive, and the suitability as a "food additive" is applied to the item in accordance with the General Regulations and General Test Methods of the Food Additives approved by the Food and Drug Administration, unless otherwise specified. Determined by the relevant standards and standards.
  • Food Additive Reduction examples include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid, natural additives such as color pigments, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigments, guar gum, and L. And mixed preparations such as sodium glutamate preparation, noodle addition, preservative preparation and tar coloring preparation.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamon acid
  • natural additives such as color pigments, licorice extract, crystalline cellulose, high color pigments, guar gum, and L.
  • mixed preparations such as sodium glutamate preparation, noodle addition, preservative preparation and tar coloring preparation.
  • the health functional food composition of the present invention can be used in various ways, such as food and beverages for the prevention or improvement of AMPK-related diseases, specifically, lipid metabolism abnormalities, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative diseases (especially dementia).
  • AMPK-related diseases specifically, lipid metabolism abnormalities, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative diseases (especially dementia).
  • it may be used in various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, health supplements, food additives, and the like, and may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, or beverages.
  • it may be in any food form.
  • the food composition of the present invention is a licochalcone A with respect to the total weight of the composition for the purpose of preventing or ameliorating AMPK related diseases, specifically, lipid metabolism abnormalities, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative diseases (particularly dementia) About 1 to 50% by weight, preferably 1 to 5% by weight.
  • the food composition of the present invention for the purpose of preventing and / or ameliorating AMPK related diseases, specifically, lipid metabolism abnormality, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative disease (especially dementia), It may be prepared and processed in the form of powder, granules, liquid phase, or the like.
  • the health functional food in tablet form may be granulated in a conventional manner with a mixture of licochalcone A, excipients, binders, disintegrants, and other additives, and then compression-molded with a lubricant or the like. Can be compression molded directly.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a mating agent and the like, if necessary, may be coated with a suitable coating agent.
  • excipients binders, disintegrants, glidants, copulation agents, flavoring agents, etc. are described in the literature known in the art and include those having the same or similar functions (Korean Pharmacopoeia, Munseongsa, Korea Pharmacy University Council, 5th edition, p33-48, 1989).
  • Licochalcone A of the present invention activates AMPK in hepatocytes, promotes lipolysis, inhibits fat biosynthesis, inhibits the differentiation of adipocytes into adipocytes, and inhibits adipogenesis in adipocytes. Accordingly, the pharmaceutical or food composition containing Licochalcone A of the present invention can be used for the prevention, amelioration of AMPK related diseases, specifically, lipid metabolism abnormalities, hyperlipidemia, metabolic syndrome, obesity, fatty liver, or degenerative diseases (especially dementia) or It has a therapeutic effect.
  • Figure 1 is a diagram showing the shape of 3T3-L1 adipocytes after adipocyte differentiation of the drug (con), pioglitazone (Pio), lycosalcon A treatment group.
  • 2 is a graph showing triglyceride content at 540 nm after destaining.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Western blotting confirming the effect of licochalcone A on the expression of adipose differentiation transcription factor (PPAR ⁇ , C / EBPa) in 3T3-L1 cells.
  • PPAR ⁇ , C / EBPa adipose differentiation transcription factor
  • Figure 4 shows the expression of licochalcone A in the 3T3-L1 cells (PPAR ⁇ , C / EBPa) (FIG. 4A) and apoptosis related genes SREBP1, FAS, SCD1, GPAT, fatty acid oxidation related genes
  • CPT- Figure 1 shows the results of RT-PCR confirmed the effect on the expression (Fig. 4B).
  • 5 is a view showing the results of confirming the effect of AMPK and ACC phosphorylation by licochalcone A.
  • Figure 6 shows the results of RT-PCR confirming the effect of inhibiting the expression of lipochalcone transcription factors (SREBP1, SCD1, FAS) and lipolytic genes (PPAR ⁇ , CD36) expression by licochalcone A.
  • SREBP1, SCD1, FAS lipochalcone transcription factors
  • PPAR ⁇ , CD36 lipolytic genes
  • Licochalcone A was purchased from Sigma-Aldrich (product number 68783, MO, USA) and performed the following experiment.
  • 3T3-L1 adipocytes (ATCC No. CL-173) were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). Incubate at 37 ° C., 5% CO 2 in a CO 2 incubator using Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco), including 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100U / ml) and streptomycin (100U / ml) It was.
  • Gibco Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100U / ml
  • streptomycin 100U / ml
  • post-confluent hormone cocktail 0.5 mM dexamethasone
  • 10 ⁇ g / ml insulin 10 ⁇ g / ml insulin
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • the differentiation-induced 3T3-L1 adipocytes were homogenized with Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% sucrose, 0.4 mg / ml digonin and 1.5 mM PMSF) and the protein was then subjected to 4 ° C. Centrifugation at 12000 rpm for 20 minutes at.
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% sucrose, 0.4 mg / ml digonin and 1.5 mM PMSF
  • Protein quantitation was measured using a Bio-Rad assay reagent (Bio-Rad, USA), 30 ⁇ g of the analyzed protein was separated by SDS-PAGE, transferred to a gel membrane, and room temperature at 5% skim milk. After blocking for 1 hour at 1, the primary antibody (PPAR- ⁇ , Santa cruz, 7273; C / EBPa, Santa cruz, 61, Actin, Santa cruz, 1616) diluted 1: 1000 ratio was reacted overnight at 4 °C. Then washed three times with Tris-buffered saline tween-20 (TBST) and diluted 1: 2000. The secondary antibody (Santa Cruz, sc-2313; sc-2005; sc-2033) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • licochalcone A inhibited the expression of adipose differentiation transcription factor in a concentration-dependent manner, thereby inhibiting adipose differentiation.
  • Total RNA was isolated from the differentiation-induced 3T3-L1 adipocytes using a guanidine thiocyanate-water saturated phenol / chloroform separation method. Total RNA in the water layer was precipitated using isopropyl alcohol, and the isolated RNA was quantified by measuring absorbance at wavelengths of 260 nm and 280 nm, and 1 ⁇ g of total RNA was derived from Moroniy leukemia virus-based transcriptase (Moloney murine leukemia virus). reverse transcriptase) and oligo (dT) 15 primers were used for reverse transcription. Primer types and sequences are shown in Table 1 below.
  • Primers were each final concentration in 25 ⁇ l of reaction solution containing 20 mM Tris-HCl, pH 8.4, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 0.5 mM dNTP, 5 ⁇ l cDNA and 2.5 units of Taq DNA polymerase. Was added to 0.5 ⁇ M.
  • PCR conditions were carried out for a total of 30 cycles by denaturing for 1 minute at 95 °C, annealing for 30 seconds (corresponding annealing temperature is shown in Table 1 above), extended for 1 minute at 72 °C.
  • the reaction product was then electrophoresed at 100V using 1% agarose gel stained with 0.5 ⁇ g / ml ethidium bromide. ⁇ -actin was used as a control for the amplified genes.
  • licochalcone A has a concentration-dependent effect of inhibiting fat differentiation and fat formation and promoting fatty acid oxidation.
  • Human liver cancer cell line HepG2 (ATCC No. HB-8065) was purchased from the American Type Culture Collection (ATCC). CO 2 using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco), including 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 U / ml) The culture was incubated at 37 °C, 5% CO 2 conditions.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • penicillin 100 U / ml
  • streptomycin 100 U / ml
  • HepG2 cells were seeded in 6-well plates and samples were prepared the next day by treating Licochalcone A by concentration (24 hour treatment) and hourly 0,6, 12, 24 hours (20 ⁇ M treatment of Licochalcone A), respectively.
  • Licochalcone A by concentration (24 hour treatment) and hourly 0,6, 12, 24 hours (20 ⁇ M treatment of Licochalcone A), respectively.
  • AMPK inhibitor Compound C (AMPK inhibitor) (Kalbiocam, Darmstadt, Germany) was prepared.
  • the HepG2 cells were homogenized with Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% sucrose, 0.4 mg / ml digonin and 1.5 mM PMSF) and then the protein was run at 12000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. Centrifuged.
  • Lysis buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% sucrose, 0.4 mg / ml digonin and 1.5 mM PMSF
  • Protein quantitation was measured using a Bio-Rad assay reagent (Bio-Rad, USA), 30 ⁇ g of the analyzed protein was separated by SDS-PAGE, transferred to a gel membrane, and room temperature at 5% skim milk.
  • Primary antibody pAMPK: Cell signaling, 2531; AMPK: Cell signaling, 2532; pACC: Cell signaling, 3661; ACC: Cell signaling, 3662; Actin: Santa cruz, 1616
  • the secondary antibody (Santa Cruz, sc-2313; sc-2005; sc-2033) was reacted at room temperature for 1 hour.
  • lycochalcone A phosphorylated AMPK and ACC significantly, time and dose dependent.
  • an AMPK inhibitor when the pretreatment of compound C, an AMPK inhibitor, it was confirmed that AMPK and ACC phosphorylation is inhibited. From this result, it was confirmed that lycochalcone A can exhibit activity through the AMPK pathway.
  • RT-PCR was performed in the same manner as in Example 1- (5), except that the human liver cancer cell line HepG2 cells obtained above and the primer sequences and annealing conditions of Table 2 were used. RT-PCR results are shown in FIG. 6.

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Abstract

본 발명은 리코찰콘 A를 유효성분으로 함유하는, AMPK 관련 질환, 구체적으로, 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매)의 예방,개선 또는 치료를 위한 약학적 또는 식품 조성물, 및 그의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 또는 식품 조성물은 지방세포의 분화 및 지방세포에서 지방 축적, 간세포에서 지방생합성을 유의적으로 감소시키고, 간세포에서 AMPK를 활성화하는 작용효과를 나타낸다. 따라서, AMPK 관련 질환, 구체적으로, 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매)의 예방 또는 치료에 유용하다.

Description

리코찰콘 Ａ의 신규 용도
본 발명은 리코찰콘 A 의 신규 용도에 관한 것이다.
생활습관의 변화, 특히 1인당 지방 섭취량의 상승 및 운동부족 등으로 인해 비만, 고지혈증, 당뇨병, 고혈압 등의 소위 '생활 습관증'이라고 불리는 질환들이 급격히 늘어나고 있다. 여기서 비만은 유전적, 영양적, 환경적 및 사회적 요인 등 다양한 요인들이 관여하는 복잡한 증후군이다. 비만으로 인하여, 혈액 내의 콜레스테롤과 중성지방의 양이 증가되는 고지혈증이 발생되어 고혈압, 심혈관계 질환 및 뇌졸중이 발생할 수 있다. 또한 지방의 과다 섭취도 혈중 콜레스테롤, 체내 지방축적으로 인하여, 즉 간의 지방합성 증가, 중성지방 배출 및 연소 감소 등을 초래하여 간에 지방이 축적되는 지방간을 유발하며 또한 동맥경화 등 심혈관계 질환을 유발할 수 있다.
지방간에서 축적된 지방의 대부분은 중성지방(triglyceride)이며, 지방간은 크게 과음으로 인한 알코올성 지방간과 비만, 당뇨병, 고지혈증 또는 약물 등으로 인한 비알코올성 지방간으로 나눌 수 있다. 비알콜성 지방간은 비만, 인슐린 과민증, 당뇨병으로 앓고 있는 사람에게서 많이 발생하며 인슐린 저항성이나 과도한 지방 분해에 의해 혈액내 유리 지방산의 농도가 높아지는 것에 기인하여 나타난다.
현재 지방간을 약물학적으로 치료하는데 유용한 약제는 거의 없는 상태이며 운동과 식이요법만이 권장되고 있기 때문에 지방간 치료제 개발이 요구된다.
지질대사 이상은 인슐린 저항성에 의해서 뿐만 아니라 지방 또는 콜레스테롤의 과잉섭취에 의해서도 발생한다. 혈중 LDL 콜레스테롤 또는 중성지방량의 증가와 HDL 콜레스테롤량의 저하는 모두 동맥 경화증의 원인이 된다. 이러한 현상으로 인하여 지질대사 개선, 지방 축적 억제 등에 효과가 있는 의약품, 음식물이 개발이 강하게 요망되고 있다.
AMPK(AMP-activated protein kinase: AMP-활성화 단백질 키나아제)는 세포 내 AMP를 감지하여 활성화되는 단백질로서 ATP를 소모하는 신호전달경로를 억제하고 ATP를 합성하는 신호전달경로를 활성화하여 에너지 대사의 촉진에 있어서 중요한 역할을 하는 대표적인 단백질이다. AMPK를 활성화시킴으로써, 지방산 산화 촉진, 간에서의 트리글리세리드 축적 억제, 2형 당뇨, 대사증후군, 비만, 암, 퇴행성질환 (치매) 등의 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것이 알려져 있다{AMPK and the biochemistry of exercise: Implications for human health and disease. Biochem J 418(2), 261-275 (2009), Mechanisms linking obesity, chronic kidney disease, and fatty liver disease: the roles of fetuin-A, adiponectin, and AMPK. J Am Soc Nephrol 2010 Mar.; (21) 3: 406-12}.
SREBP(Sterol regulatory element-binding protein: 스테롤 조절 인자-결합 단백질)는 소포체막에 결합한 불활성 전구체로 합성되고 N 말단이 잘려나간 후 활성화되어 핵으로 이동하여 조절 유전자 프로모터의 SRE(sterol regulatory element: 스테롤 조절인자)에 결합한다. 그 중 SREBP1은 중성지질의 합성을 주로 조절하는 것으로 알려져 있다. 지방생성을 조절하는 유전자는 SREBP1을 비롯해 FAS (fatty acid synthase: 지방산 합성효소), SCD1 (stearol CoA desaturase: 스테롤 코에이 탈포화효소), 및 GPAT (glycerol-3-phosphate acyltransferase: 글리세롤-3-인산 아실트랜스퍼라제)등이 있다. PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor-γ: 페록시좀 증식자-활성화 수용체-γ)는 지방세포 분화에 중요한 전사인자로 알려져 있다. PPARγ와 C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein: CCAAT/인핸서-결합 단백질)의 상호작용이 성숙한 지방세포에서 중요하며, 지방산 결합 단백질 aP2 (adipocyte protein 2: 지방세포 단백질 2)와 같은 지방세포 특이적 단백질 및 지방대사 효소의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.
본 발명은 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만 또는 지방간의 예방 또는 치료를 위한 약학적 또는 식품 조성물, 및 그의 용도를 제공하고자 한다.
놀랍게도, 본 발명자들은 리코찰콘 A가 간세포에서 AMPK 를 활성화하고, 지방분해를 촉진하고, 지방생합성을 저해하며, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고, 지방세포에서 지방생성을 억제하는 것을 최초로 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 한 구현 형태로써, 본 발명은 리코찰콘 A를 유효성분으로 함유하는, AMPK (AMP-activated protein kinase: AMP-활성화 단백질 키나아제) 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현 형태로써, 본 발명은 리코찰콘 A를 유효성분으로 함유하는, AMPK 관련 질환의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, AMPK 관련 질환은 지질대사 이상(lipid metabolism disorder), 고지혈증(hyperlipidemia), 대사증후군(metabolic syndrome), 비만(obesity), 지방간(fatty liver), 또는 퇴행성질환 (특히, 치매) 중에서 선택되는 하나 이상의 질환을 의미한다.
본 발명의 약학적 또는 식품 조성물의 유효성분인 리코찰콘 A {(2E)-3-[5-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-4-히드록시-2-메톡시페닐]-1-(4-히드록시페닐)-2-프로펜-1-온}는 감초(Glycyrrhizae radix)의 주요 플라보노이드의 하나로 (Saitoh & Shibata. Tetrahedron Lett. 50, pp4461-4462, 1975), 그 화학구조는 다음과 같다.
Figure PCTKR2012003066-appb-I000001
리코찰콘 A의 생리학적 기능은 잘 알려져 있지 않으나 오래전부터 강력한 항말라리아제로 사용되어오고 있으며 (Chen et al., Antimicrob Agents Chemother. 38(7) pp.1470-1475, 1994), 항암 효과 (E.J.Park et al., Planta Med. 64, pp.464, 1998), 항염증효과 (대한민국 공개특허공보 10-2010-0077553호), 당뇨병성 신증 예방·치료 효과 (대한민국 공개특허공보 10-2010-0135424) 등은 알려져 있으나, AMPK 활성화 효과, 및 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만 또는 지방간 치료 효과에 대해서는 밝혀진 바 없었다.
본 발명에서, 리코찰콘 A는 그의 약제학으로 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있으며, 그밖에 용매화물, 프로드럭의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명에서, 리코찰콘 A는 감초, 순무 등의 천연 재료로부터 당 분야에 널리 알려진 방법에 의하여 분리될 수 있으며, 또한, 당업자가 당 분야에서 통상 사용되는 방법으로 인위적으로 합성하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물 내 리코찰콘 A 함량은 질환의 증상, 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 5중량% 이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물 내 유효성분으로 함유되는 리코찰콘 A는 약제학적으로 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등과 함께 제제화할 수 있으며, 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.
본 발명의 구현형태로써, 본 발명에 따른 리코찰콘 A를 함유하는 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
여기에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제, 기타 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 포함할 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제로 제제화되는 경우, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 가능하며, 이러한 고형제제는 리코찰콘 A 이외에 적어도 한 가지 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 혼합하여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구투여를 위한 액상제제로 제제화되는 경우, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 가능하며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제로 제제화되는 경우, 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택되는 치료적 유효량일 수 있다. 바람직한 효과를 위하여, 본 발명의 조성물의 투여량은 유효성분인 리코찰콘 A 함량을 기준으로 성인 남성 기준 1일 10 mg/kg 내지 30 mg/kg으로, 바람직하게는 5 mg/kg 내지 10 mg/kg 이다.
투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 범주는 상기 투여량 및 투여횟수에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 랫트, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로, 예를 들면, 경구로, 또는 복강내, 직장내, 정맥내, 근육내, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular)로 주사 등에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매) 중에서 선택되는 하나 이상의 질환의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다. 여기서, 고지혈증은 고지혈증 관련 질환도 포함하며, 고지혈증 관련 질환은 죽상경화증, 협심증, 경동맥 질환, 뇌동맥경화증, 황색종, CHD, 허혈성 발작, 혈관성형술 후의 재협착, 말초 혈관 질환, 간헐파행증, 심근경색 (예를 들어 괴사의 감소), 이상지질혈증, 식후 지질혈증 등이 포함된다. 상기 퇴행성 질환은 치매, 바람직하게는 알츠하이머형 치매일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 리코찰콘 A의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 열거한 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조를 위한 리코찰콘 A의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 상기한 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체, 예컨대, 인간을 포함한 포유류에 치료적으로 유효한 양의 리코찰콘 A를 투여하는 것을 포함하는, 상기한 AMPK 관련 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 리코찰콘 A를 유효성분으로 함유하는, AMPK 관련 질환의 개선 또는 예방을 위한 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 대한민국 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 기재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 AMPK 관련 질환, 구체적으로, 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매)의 예방 또는 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 AMPK 관련 질환, 구체적으로, 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매)의 예방 또는 개선을 목적으로, 조성물 총 중량에 대하여 리코찰콘 A를 약 1 내지 50 중량%, 바람직하게는, 1 내지 5 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 AMPK 관련 질환, 구체적으로, 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매)의 예방 및/또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 리코찰콘 A, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
본 발명의 리코찰콘 A는 간세포에서 AMPK 를 활성화하고, 지방분해를 촉진하고, 지방생합성을 저해하며, 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하고, 지방세포에서 지방생성을 억제하는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 리코찰콘 A를 함유하는 약학적 또는 식품 조성물은 AMPK 관련 질환, 구체적으로, 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간, 또는 퇴행성질환 (특히, 치매)의 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낸다.
도 1은 약물 미처리군(con) 및 피오글리타존(Pio), 리코찰콘 A 처리군의 지방세포 분화 후 3T3-L1 지방세포의 모양을 나타낸 도이다.
도 2는 탈염색 후 540 nm에서 트리글리세리드 함량을 나타낸 그래프이다.
도 3은 3T3-L1 세포에서 리코찰콘 A가 지방분화 전사인자 (PPARγ, C/EBPα) 발현에 미치는 영향을 확인한 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 3T3-L1 세포에서 리코찰콘 A가 지방분화 전사인자(PPARγ, C/EBPα)의 발현 (도 4A) 및 지방생성 관련 유전자인 SREBP1, FAS, SCD1, GPAT, 지방산 산화 관련 유전자인 CPT-1의 발현 (도 4B)에 미치는 영향을 확인한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 리코찰콘 A에 의한 AMPK와 ACC 인산화 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 리코찰콘 A에 의한 지방생합성 전사인자(SREBP1, SCD1, FAS) 발현 억제 및 지방분해 유전자 (PPARα, CD36) 발현 촉진 효과를 확인한 RT-PCR 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
리코찰콘 A는 시그마-알드리치(제품번호 68783, MO, USA)에서 구입하여 하기 실험을 수행하였다.
[실시예]
실시예 1. 리코찰콘 A의 지방세포 분화 억제 및 지방세포에서 지방 생성 억제 효과 확인
(1) 지방전구세포의 배양
3T3-L1 지방전구세포(ATCC No. CL-173)는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. 10% 소태아 혈청 (FBS), 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100U/ml)을 포함한 둘베코 변형 이글 배지 (Gibco)를 사용하여 CO2 배양기에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
(2) 지방세포로의 분화 유도
3T3-L1 세포를 6 웰 플레이트에 씨딩하고 세포가 post-confluent시 호르몬 칵테일인 0.5 mM 덱사메타손, 10 μg/ml 인슐린, 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)를 처리하고 이틀에 한번 배지를 교체하였다. 4일 후에 배지를 인슐린 5 μg/ml으로 교체하고 이틀 뒤에 다시 정상배지로 교체하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 지방세포 분화시 리코찰콘 A 를 5, 10 μM로 처리하였으며, 양성 대조군으로 피오글리타존을 10 μM로 처리하였다.
(3) 리코찰콘 A에 의한 지방세포 분화 억제 효과 확인-지방세포의 형태학적 관찰
지방세포로 완전 분화 후, 1x PBS에 3번 세척하고 10% 포름알데히드로 1시간 고정하였다. 오일 레드 오(oil red O) 염료를 이용하여 2시간 동안 염색한 후 세포를 3차 증류수에 세척하고 현미경으로 관찰하였다 (도 1). 세포에 남아있는 물기를 제거한 후 100% 이소프로판올로 탈염색하여 540 nm에서 트리글리세리드 함량을 측정하였다 (도 2).
도 1 및 2에서 확인되는 바와 같이, 리코찰콘 A가 농도 의존적으로 지방세포의 분화를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
(4) 리코찰콘 A에 의한 지방분화 전사인자 발현 저해 효과 확인-단백질 추출 및 웨스턴 블롯팅
상기 분화 유도한 3T3-L1 지방세포를 라이시스 버퍼 (50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% 수크로스, 0.4 mg/ml digonin 및 1.5 mM PMSF)와 함께 균질화시킨 후 단백질을 4 ℃에서 20분간 12000 rpm 으로 원심 분리하였다.
단백질 정량은 바이오-래드 검정 시약 (Bio-Rad assay reagent: Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였고 분석한 단백질 30 μg을 SDS-PAGE로 분리한 후 젤 멤브레인에 트랜스퍼하고 5% 스킴 밀크로 상온에서 1시간 블록킹한 후 1:1000 비율로 희석시킨 1차 항체(PPAR-γ, Santa cruz, 7273; C/EBPα, Santa cruz, 61, Actin, Santa cruz, 1616)와 4 ℃에서 밤새 반응 하였다. 다음 트리스-완충 식염 트윈-20 (Tris-buffered saline tween-20: TBST)로 3번 세척한 후 1:2000 비율로 희석시킨 2차 항체(Santa Cruz, sc-2313; sc-2005; sc-2033)와 상온에서 1시간 반응시켰다.
이후 TBST로 3번 세척하고 ECL 용액 (Amersham, Sweden)을 이용하여 X-ray 필름에 인화하였다. 웨스턴 블롯팅 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인되는 바와 같이, 리코찰콘 A가 농도 의존적으로 지방분화 전사인자의 발현을 저해하여, 지방분화를 억제하는 것을 알 수 있었다.
(5) 리코찰콘 A에 의한 지방분화 전사인자 및 지방생성 유전자 발현 억제 효과 확인-RNA 추출 및 RT-PCR
상기 분화 유도한 3T3-L1 지방세포로부터 전체 RNA는 구아니딘 티오시아네이트-물 포화 페놀/클로로포름(guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chloroform) 분리 방법을 이용하여 분리하였다. 물 층에 있는 전체 RNA는 이소프로필 알콜을 이용하여 침전시키고 분리한 RNA는 260 nm와 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였으며 총 RNA 1㎍을 몰로니 백혈병 바이러스 유래 역전사효소 (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)와 올리고(dT)15 프라이머를 이용하여 역전사 하였다. 프라이머 종류 및 서열은 아래 표 1에 표시한 바와 같다.
[표 1] 프라이머 서열 및 어닐링 온도
[규칙 제26조에 의한 보정 01.06.2012]　
Figure WO-DOC-68
프라이머는 20 mM 트리스-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5mM dNTP, 5㎕ cDNA 및 2.5 유닛의 Taq DNA 폴리머라제가 포함되어 있는 25㎕의 반응 용액에 각각의 최종 농도가 0.5 μM이 되도록 첨가하였다. PCR 조건은 95 ℃에서 1분 동안 변성, 30초 동안 어닐링 (상응하는 어닐링 온도는 위 표 1에 표시), 72 ℃에서 1분 동안 연장을 하여 총 30 주기 수행하였다. 이후, 반응 생성물을 0.5 ㎍/㎖ 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색된 1% 아가로스 젤을 이용하여 100V에서 전기영동 하였다. β-액틴은 증폭된 유전자들의 대조군으로 사용되었다.
RT-PCR 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 확인되는 바와 같이, 리코찰콘 A가 농도 의존적으로 지방분화와 지방생성을 억제하며 지방산 산화를 촉진하는 효과가 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 리코찰콘 A의 간세포에서 지방 생성 억제 및 지방 분해 촉진 효과 확인
(1) 간세포의 배양
인간 간암세포 주 HepG2 (ATCC No. HB-8065)는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구입하여 사용하였다. 10% 소태아 혈청 (FBS: fetal bovine serum), 페니실린 (100U/ml), 스트렙토마이신 (100U/ml)을 포함한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM: Dulbecco's modified Eagle's medium) (Gibco)를 사용하여 CO2 배양기에 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
HepG2 세포를 6 웰 플레이트에 씨딩하고 이튿날 리코찰콘 A를 농도별(24시간 처리) 및 시간별 0,6, 12, 24 시간 (리코찰콘 A 20μM 처리)으로 각각 처리하여 시료를 준비하였다. 또한, 리코찰콘 A에 의한 AMPK 활성화와 지방 생성/분해 기전과의 연관성을 확인하기 위하여, 화합물 C (AMPK 억제제) (칼바이오캠, Darmstadt, Germany) 10μM로 전처리한 시료를 준비하였다.
(2) 리코찰콘 A의 HepG2 세포에서 AMPK 활성화 효과 확인-AMPK 및 ACC 인산화 확인
상기 HepG2 세포를 라이시스 버퍼 (50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.25% 수크로스, 0.4 mg/ml digonin 및 1.5 mM PMSF)와 함께 균질화시킨 후 단백질을 4 ℃에서 20분간 12000 rpm 으로 원심 분리하였다.
단백질 정량은 바이오-래드 검정 시약 (Bio-Rad assay reagent: Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였고 분석한 단백질 30 μg을 SDS-PAGE로 분리한 후 젤 멤브레인에 트랜스퍼하고 5% 스킴 밀크로 상온에서 1시간 블록킹한 후 1:1000 비율로 희석시킨 1차 항체(pAMPK: Cell signaling, 2531; AMPK: Cell signaling, 2532; pACC: Cell signaling, 3661; ACC: Cell signaling, 3662; Actin: Santa cruz, 1616)와 4 ℃에서 밤새 반응 하였다. 다음 TBST로 3번 세척한 후 1:2000 비율로 희석시킨 2차 항체(Santa Cruz, sc-2313; sc-2005; sc-2033)와 상온에서 1시간 반응시켰다. 이후 TBST로 3번 세척하고 ECL 용액 (Amersham, Sweden)을 이용하여 X-ray 필름에 인화하였다. 웨스턴 블롯팅 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 확인되는 바와 같이, 리코찰콘 A는 시간, 용량 의존적으로 AMPK와 ACC를 현저하게 인산화시켰다. 특히, 도 5C에서 확인되는 바와 같이, AMPK 억제제인 화합물 C를 전처리하였을 때 AMPK와 ACC 인산화가 억제됨을 확인하였다. 이 결과로부터 리코찰콘 A가 AMPK 경로를 통하여 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
(3) 리코찰콘 A에 의한 지방생합성 전사인자(SREBP1) 발현 억제 및 지방분해 유전자 발현 촉진 효과 확인-RNA 추출 및 RT-PCR
위에서 얻어진 인간 간암세포주 HepG2 세포 및 하기 표 2의 프라이머 서열 및 어닐링 조건을 사용한 것을 제외하고, 위 실시예 1-(5)와 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 결과를 도 6에 나타내었다.
[표 2] 프라이머 서열 및 어닐링 온도
[규칙 제26조에 의한 보정 01.06.2012]　
Figure WO-DOC-83
도 6에서 확인되는 바와 같이, 지방생합성 유전자(SREBP1, SCD-1, FAS)의 발현이 시간별 농도별로 리코찰콘 A에 의하여 감소되는 것을 알 수 있었고 (도 6A 및 6B), 지방분해에 관련된 유전자(PPARα, CD36)이 증가하는 것을 알 수 있었다 (도 6C 및 6D).
또한, 리코찰콘 A의 지방생합성과 지방분해 관련 유전자에 대한 효과들이 AMPK와 관련이 있는지를 알아보기 위해 HePG2 세포에 AMPK 억제제인 화합물 C를 전처리하였을때 지방생합성 유전자들인 SREBP-1, SCD1, FAS가 증가한 것을 알 수 있었고(도 6E), 지방분해 유전자들은 감소하는 것을 알 수 있었다(도 6F). 이 결과로부터 리코찰콘 A가 AMPK 경로를 통하여 활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. 리코찰콘 A를 유효성분으로 함유하는, AMPK (AMP-activated protein kinase) 관련 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, AMPK 관련 질환은 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간 또는 퇴행성질환인 약학적 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리코찰콘 A를 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 50 중량%로 함유하는 약학적 조성물.
  4. 리코찰콘 A를 유효성분으로 함유하는, AMPK 관련 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, AMPK 관련 질환은 지질대사 이상, 고지혈증, 대사증후군, 비만, 지방간 또는 퇴행성질환인 식품 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 리코찰콘 A를 조성물 전체 중량에 대하여 1 내지 50 중량%로 함유하는 식품 조성물.
  7. AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에 치료적으로 유효한 양의 리코찰콘 A를 투여하는 것을 포함하는, AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료방법.
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