KR20200092712A

KR20200092712A - 생물전환된 생약조성물을 포함하는 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200092712A
Application number: KR1020190009966A
Authority: KR
Inventors: 박효현; 소재현; 김선건; 손은경; 김보미; 강혜령; 박지은
Original assignee: 한약진흥재단
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2020-08-04
Also published as: KR102227242B1

Abstract

본 발명은 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 포함하는 생약조성물을 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액으로 생물전환시켜 얻은 생물전환 조성물을 유효성분으로 포함하는, 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물 및 생물전환 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생물전환 조성물은 대장염에 대한 항염 및 대장암에 대한 항암활성이 우수하므로 대장염 및 대장암의 개선 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

생물전환된 생약조성물을 포함하는 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법 {Composition for improving or treating colitis and colorectal cancer comprising bioconverted herbal composition, and its preparation method}

본 발명은 생물전환된 생약조성물을 포함하는 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 포함하는 생약조성물을 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액으로 생물전환시켜 얻은 생물전환 조성물을 유효성분으로 포함하는, 대장염과 대장암을 개선하거나 치료하는 효과가 우수한 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

대장암은 전세계적으로 성인 남녀의 암 발생률 및 사망률의 주요원인이며, 식생활방식의 서구화로 인하여 최근 국내에서도 대장암 발병률이 급격히 증가하고 있다.

대장암은 주로 노령인구에서 발생이 증가하는 것으로 알려져 있으며 우리나라의 인구가 점차 고령화되고 음식문화가 서구화 되어감에 따라 사회적으로 매우 주목 받고 있는 질환으로서 이를 예방하고 치료하기 위한 방법을 찾는 연구에 대한 관심이 높아지고 있다.

대장암의 예방과 치료를 위한 많은 새로운 표적과 약물들이 개발되고 있으며 그 중에서 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX) 효소인 COX-1과 COX-2를 표적으로 하는 비선택적 NSAIDs(nonselective nonsteroidal antiinflammatory drugs, 비스테로이드성 항염증제)가 대장암의 발생위험을 줄여줄 수 있다는 보고가 있다.

NSAIDs는 메스꺼움(nausea), 소화불량(dyspepsia), 위염(gastritis), 급경련 복통(abdominal pain), 소화성 궤양(peptic ulcer), 위장관 출혈(gastrointestinal bleeding), 십이지장 궤양 천공(perforation of gastroduodenal ulcers) 등 다양한 부작용이 있음에도 불구하고 전세계적으로 가장 많이 사용되고 있다.

COX는 프로스타노이드(prostanoid)라고 불리는 중요한 생물학적 매개체의 형성을 위한 효소로서, 프로스타글란딘(prostaglandin)의 합성에 COX의 두가지 아형(isoform)인 COX-1과 COX-2가 관여한다. COX-1은 대부분의 조직에서 하우스키퍼 효소(housekeeper enzyme)로 항상성 유지기능에 관여한다. COX-2는 IL-1(interleukin-1)과 같은 사이토카인, 다양한 성장인자와 종양 촉진인자 등의 자극에 의해 과발현되며 특히 암 조직이나 염증조직에서 높게 나타난다. 또한 COX-2는 대장암세포의 생존에 관여하는 주요 단백질로 알려져 있으므로 COX-2의 저해는 대장암을 조절하는 효과적인 방법 중의 하나로 밝혀졌다.

세포에서 세포자살이 일어나는 것을 저해하고 염증과 면역기능에 관여하는 COX-2의 발현은 50%의 선종(adenomas)과 85%의 선암(adenocarcinomas)에서 증가한다고 보고되고 있으며, 대장암 환자의 생존율을 악화시킨다는 보고가 있다.

일반적인 NSAID의 부작용은 COX-1을 저해함으로써 발생된다고 보고되고 있어, COX-2 특이적인 억제제의 부작용에 대한 위험성을 피하기 위해 NSAID를 최대한 낮은 농도로 사용하기 위해 다른 약물과의 복합용법에 대한 연구가 필요한 상황이다.

당귀육황탕은 황기(黃耆) 8g, 생지황(生地黃) 4g, 숙지황(熟地黃) 4g, 당귀(當歸) 4g, 황금(黃芩) 2.8g, 황련(黃連) 2.8g 및 황백(黃柏) 2.8g을 혼합한 약재이다. 동의보감에 따르면 당귀육황탕은 잠잘 때마다 식은땀이 나면서 열이 나는 음허도한(陰虛盜汗)에 사용되고, 오후마다 미열이 나고 얼굴이 붉고 입이 마르고 가슴이 답답하며 손발이 달아오르거나 대변이 잘 나오지 않고 소변색이 붉은 데 사용되며, 병 회복기, 만성 소모성 질병 특히 폐결핵, 신경쇠약 등에 사용된다. 보통 위의 약을 1첩으로 하여 물에 달여서 먹는다.

대한민국 특허등록 제10-0425978호 대한민국 특허등록 제10-0516351호 대한민국 특허등록 제10-0950564호 대한민국 특허등록 제10-1442141호 대한민국 특허공개 제10-2015-0117943호 대한민국 특허공개 제10-2017-0100845호 대한민국 특허공개 제10-2017-0109703호

본 발명은 당귀육황탕에 사용되는 한약재들인 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 포함하는 생약조성물을 생물전환시켜 얻은, 독성이 없으면서도 대장염에 대한 항염 및 대장암에 대한 항암활성이 우수한 조성물과 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,

황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 포함하는 생약조성물을 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액으로 생물전환시켜 얻은 생물전환 조성물을 유효성분으로 포함하는 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 개선 또는 치료용 조성물에서, 상기 생약조성물은 황기 10~30 중량부, 당귀 5~20 중량부, 생지황 5~20 중량부, 숙지황 5~20 중량부, 황백 2~10 중량부, 황련 2~10 중량부 및 황금 2~10 중량부를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 생약조성물은 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 20:10:10:10:7:7:7의 중량비로 혼합한 당귀육황탕인 것이 특히 바람직하다.

상기 개선 또는 치료용 조성물에서, 상기 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액은, 아스퍼질러스 카와치를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 배양체를 얻는 단계; 상기 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24시간 방치하는 단계; 및 여과 및 원심분리하여 상등액인 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은,

황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 혼합하여 생약조성물을 얻는 단계;

상기 생약조성물에, 100g을 기준으로 70% 에탄올 500~1,000㎖를 혼합하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는 단계;

상기 에탄올 추출물을 동결건조하여 추출물 분말을 얻는 단계;

상기 추출물 분말에, 1g을 기준으로 증류수 8~12㎖를 혼합하여 충분히 용해시켜 용해된 추출물을 얻는 단계; 및

상기 용해된 추출물에, 10㎖를 기준으로 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액 8~12㎖ 첨가하여 28~32℃에서 20~28시간 동안 진탕하면서 생물전환시키는 단계를 포함하는, 생물전환 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 제조방법은, 생물전환시킨 후 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 제조방법에서, 상기 생약조성물은 황기 10~30 중량부, 당귀 5~20 중량부, 생지황 5~20 중량부, 숙지황 5~20 중량부, 황백 2~10 중량부, 황련 2~10 중량부 및 황금 2~10 중량부를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 생약조성물은 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 20:10:10:10:7:7:7의 중량비로 혼합한 당귀육황탕인 것이 특히 바람직하다.

상기 제조방법에서, 상기 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액은,

아스퍼질러스 카와치를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 배양체를 얻는 단계; 상기 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24시간 방치하는 단계; 및 여과 및 원심분리하여 상등액인 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 당귀육황탕에 사용되는 한약재들로 구성된 생약조성물을 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액으로 생물전환시켜 얻은 생물전환 조성물은 대장염에 대한 항염 및 대장암에 대한 항암활성이 우수하다. 따라서 이 생물전환 조성물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물은 대장염 및 대장암의 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 생물전환 여부에 따른 성분변화를 확인한 결과이다.
도 2는 생물전환 여부에 따른 세포증식 억제활성을 확인한 결과이다.
도 3은 생물전환 여부에 따른 세포콜로니 형성 억제활성을 확인한 결과이다.
도 4는 생물전환 여부에 따른 세포이동 억제활성을 확인한 결과이다.
도 5는 생물전환 여부에 따른 세포자멸사 유도활성을 확인한 결과이다.
도 6은 생물전환 여부에 따른 COX-2 저해기전을 확인한 결과이다.
도 7은 생물전환 여부에 따른 염증성 사이토카인 발현량을 확인한 결과이다.
도 8은 생물전환 여부에 따른 NF-kB 활성화 억제기전을 확인한 결과이다.
도 9는 동물실험에서 생물전환여부에 따른 효능을 확인한 결과이다.

본 발명의 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물은, 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 포함하는 생약조성물을 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액으로 생물전환시켜 얻은 생물전환 조성물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명에서 "생물전환(Bio Conversion)"은 미생물이 가지고 있는 효소적 기능을 이용해 기존 생체물질로부터 원하는 물질을 강화시키는 과정으로 정의된다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물에서, 상기 생약조성물은 황기 10~30 중량부, 당귀 5~20 중량부, 생지황 5~20 중량부, 숙지황 5~20 중량부, 황백 2~10 중량부, 황련 2~10 중량부 및 황금 2~10 중량부를 포함하는 것이 바람직하다. 상기 생약조성물로 특히 바람직하게는 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 20:10:10:10:7:7:7의 중량비로 혼합한 당귀육황탕을 사용할 수 있다.

상기와 같은 비율로 혼합한 생약조성물에, 이 생약조성물 100g을 기준으로 70% 에탄올 500~1,000㎖를 혼합하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는다. 4시간 동안 추출하는 것이 보다 바람직하다.

상기 에탄올 추출물을 동결건조하여 추출물 분말을 얻는다.

얻어진 추출물 분말에, 분말 1g을 기준으로 증류수 8~12㎖를 혼합하여 충분히 용해시킨다.

증류수에 용해된 추출물에 10㎖를 기준으로 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액 8~12㎖를 첨가하여 28~32℃에서 진탕하면서 20~28시간 동안 생물전환시켜 본 발명의 생물전환 조성물을 얻는다. 이때 200rpm으로 진탕하는 것이 바람직하다.

상기 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액은, 아스퍼질러스 카와치를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 배양체를 얻는 단계; 상기 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24시간 방치하는 단계; 및 여과 및 원심분리하여 상등액인 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조되는 것이 바람직하다.

필요에 따라 상기 생물전환 후 동결건조하여 생물전환 조성물을 분말화하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 생물전환 조성물은 대장염에 대한 항염효과가 우수하고 대장암에 대한 항암효과가 우수하다.

본 발명의 생물전환 조성물은 대장염 및 대장암 개선 또는 치료를 위해 사용할 때 성인을 기준으로 하루 1㎍~10㎎/㎏ 범위에서 투여할 수 있으며 필요에 따라 적절하게 분할 투여할 수 있다. 마우스를 이용한 동물실험을 실시한 아래 실험예 9에서 200㎍/㎏로 하루 한번 경구 투여했을 때 사망이나 간 및 신장 독성은 관찰되지 않았다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

1. 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액의 제조

밀기울 10 g을 기준으로 1 % glucose 용액 또는 증류수 10ml을 첨가하여 밀기울에 물이 잘 스며들도록 혼합 후 121℃에서 15분간 멸균한다.

멸균 후 상온으로 식힌 다음 아스퍼질러스 가와치를 접종하고 30℃에서 5일간 정치배양을 한다. 배양 후 10mM농도의 인산나트륨 버퍼용액 (pH 7.0)을 밀기울 10 g을 기준으로 50 ~ 100 ml 첨가하여 5℃에서 overnight 침지시켜 효소액을 용출해 낸다. 위 시료를 여과 및 원심분리를 통해 여과액을 분리하여 생물전환을 위한 효소액으로 이하 실험예에서 사용하였다.

2. 생물전환 조성물의 제조

황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 20:10:10:10:7:7:7의 중량비로 혼합하였다. 모든 약재는 옴니허브에서 구입하였으며, 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황금은 한국산이고 황백과 황련은 중국산이었다.

삼각플라스크에 상기 혼합된 생약 200g과 70% 에탄올 2,000㎖를 넣고 4시간 동안 추출하였다. 추출물을 농축한 후 동결건조하여 추출물 분말을 얻었다.

상기 추출물 분말 2g을 증류수 20㎖에 충분히 녹인 다음 위에서 준비한 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii) 유래 조효소액을 20㎖ 첨가하고 30℃에서 200rpm으로 진탕(shaking)하면서 24시간 동안 생물전환을 하였다. 생물전환 후 동결건조를 실시하여 분말형태로 만든 생물전환 조성물을 이하 실험예에서 사용하였다.

<비교예>

생물전환 되지 않은 조성물의 제조

[ 실험예 ]

세포 및 시약

생물전환 조성물의 활성을 확인하기 위한 세포로는 인간 대장암세포인 HCT-116 세포, LoVo 세포 및 HT-29 세포를 사용하고, 비교를 위한 세포로는 래트 정상 세포주인 IEC-6 세포를 사용하였다.

본 실험에 사용된 세포주는 모두 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았으며, 인간 대장암 세포주인 HCT-116과 HT-29는 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)과 1% 항생제(100mg/ℓ 스트렙토마이신, 100U/㎖ 페니실린)가 포함된 RPMI 1640 배지(WelGENE lnc., Seul, Korea)를 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 매 48시간마다 트립신-EDTA(WelGENE lnc., Seul, Korea)를 이용하여 세포를 부유상태로 만든 다음 세포를 1×10⁵cells/㎖로 분주하여 계대하였다.

래트(Rat) 정상 장세포주인 IEC-6세포는 DMEM(Dulbecco’s modified Eagel's medium; Thermo, Waltham, MA, USA)에 10% 우태아혈청(FBS)과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 배지를 사용하였고, 대장암 세포주와 같은 조건에서 배양하고 유지하였다.

실시간 PCR(Real Time-PCR)에 사용한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)에서 구입하였고, 웨스턴 블랏(Western blot)용 항체는 Cell signaling Technology(Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다.

시료

실험을 위한 시료로는 실시예 1에서 얻어진 생물전환 조성물(분말형태)을 사용하였고, 비교를 위한 시료로는 비교예의 생물전환 되지 않은 조성물(분말형태)을 사용하였다. 각 분말시료에 DMSO를 첨가하여 시료로 사용하였다.

<실험예 1>

생물전환 여부에 따른 성분변화

생물전환 여부에 따른 성분변화를 확인하기 위하여 HPLC-DAD로 시료를 분석하였다.

실험을 위한 시료로는 실시예 1에서 얻은 생물전환 조성물 분말을 사용하였고, 비교를 위한 시료로는 비교예의 생물전환 되지 않은 조성물 분말을 사용하였다. 각 분말시료에 DMSO를 첨가하여 시료로 사용하였다.

시료의 분석은 애질런트 1260 인피니티(Agilent 1260 infinity) 장비에서 Phenomenex사 Kinetex C18 칼럼(150×4.6mm I.D., 2.6㎛)을 사용하여 진행하였다. 이동상 용매로는 물(A)과 아세토니트릴(B)을 사용하였고, 아세토니트릴(B)의 조성을 20%에서 100%로 바꾸어가며 농도구배 용리법을 사용하여 분석하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1의 3번째 결과에서 푸른색 그래프는 비교예의 생물전환 되지 않은 조성물이고, 붉은색 그래프는 실시예 1의 생물전환 조성물이다.

도 1에서 확인되는 바와 같이, 시료를 HPLC로 비교해본 결과, 생물전환 되지 않은 시료에서는 보이지 않던 성분이 생물전환한 시료에서는 검출되었다.

<실험예 2>

생물전환 여부에 따른 생약 추출물의 세포증식 억제활성

생물전환 여부에 따른 생약 추출물이 암의 생성 및 전이에 관련된 과정인 세포증식을 억제하는 활성을 다음과 같이 확인하였다.

실험을 위한 세포로는 인간 대장암 세포주인 HCT-116 세포와 HT-29 세포 및 래트 정상 장세포주인 IEC-6 세포를 사용하였다.

세포배양용 96웰 플레이트에 HCT-116 세포, HT-29 세포 및 IEC-6 세포를 1×10⁵cells/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 실시예 1의 시료와 비교예의 시료를 각각 0㎍/㎖, 16㎍/㎖, 31㎍/㎖, 63㎍/㎖, 125㎍/㎖, 250㎍/㎖, 500㎍/㎖ 및 1000㎍/㎖의 농도로 각각 처리하였다.

추출물을 처리한 후 각 웰에 분석키트(CellTiter 96 Aqueous One Solution Assay kit; Promega, Madison, WI, U.S.A)를 20㎕씩 첨가하여 CO₂ 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하였다. 웰에 생성된 포르마잔(formazan)을 모두 녹인 후, 마이크로플레이트 판독기(microplate Reader; Tecan Systems, San Jose, CA, U.S.A.)로 490nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과를 도 2의 (A)에 나타내었다. 도 2의 (A)에서 BE는 실시예 1에서 얻은 생물전환 조성물 시료이고 E는 비교예에서 얻은 생물전환 되지 않은 조성물 시료이다. 도 2의 (A)의 결과와 같이 모든 세포에서 생물전환 조성물이 생물전환 되지 않은 조성물에 비해 세포의 증식을 억제하는 활성이 높았다.

또 다른 세포 증식 어세이(cell proliferation assay) 중 하나인 BrdU 어세이는 세포 분열시 새롭게 합성되는 DNA에 T 대신 표지된 U를 혼입하여 표지시키고, BrdU-특이적 항체를 이용하여 면역염색하는 비색 방식(colorimetric method)을 통해 세포증식을 측정하는 원리이다.

세포배양용 96웰 플레이트에 HT-29 세포 및 IEC-6 세포를 1×10⁵cells/㎖로 분주하고 24시간 동안 배양한 후 생물전환된 당귀육황탕 추출물과 생물전환되지 않은 당귀육황탕 추출물을 상기의 농도로 각각 처리한 후, BrdU-특이적 항체를 이용한 염색을 통해 새롭게 합성된 DNA의 양을 측정함으로써 대장암 세포 및 정상 장세포의 증식 활성 유무를 확인 및 측정하였다.

그 결과를 도 2의 (B)에 나타내었다. 도 2의 (B)의 결과에서와 같이 대장암 세포에서 생물전환된 당귀육황탕 추출물이 생물전환되지 않은 당귀육황탕 추출물에 비해 세포의 증식을 억제하는 활성이(높았으며, 같은 처리농도의 조건에서 정상 장세포의 증식 억제 활성보다 더 높았다.

<실험예 3>

생물전환 여부에 따른 세포콜로니 형성 억제활성

암의 생성 및 전이에 관련된 과정인 세포 콜로니 형성을 억제하는 활성을 생물전환 여부에 따라 다음과 같이 확인하였다.

실험을 위한 세포로는 인간 대장암 세포주인 HCT-116 세포, LoVo 세포 및 HT-29 세포와 래트 정상 장세포주인 IEC-6 세포를 사용하였다.

세포배양용 6-웰 플레이트에 HCT-116 세포, HT-29 세포, LoVo 세포 및 IEC-6 세포를 1×10⁵cells/㎖로 각각 분주하고 다음 날 실시예 1의 시료와 비교예의 시료를 각각 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 대조를 위하여 COX-II 저해제로 알려진 셀레콕시브(celecoxib)를 HT-29 세포에 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 처리하여 동일하게 배양하였다.

배양 후 PBS로 세척하고 얼음처럼 차가운(ice-cold) 100% 메탄올로 10분 동안 고정한 후 25% 메탄올이 포함된 크리스탈 바이올렛 용액(crystal violet solution)을 이용하여 10분 동안 염색하였다.

물로 세척하여 말린 후 역상현미경(phase contrast microscope; Nikon, Tokyo, Japan)으로 형성된 콜로니의 양을 관찰하였다. 또한 세포와 콜로니의 수를 정량적으로 분석하기 위하여 각 웰의 세포를 30% 아세트산에 용해시켜 마이크로플레이트 판독기로 550nm에서의 흡광도를 측정하였다.

콜로니를 현미경으로 관찰한 결과(상확대배율은 40×) 및 550nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3의 결과와 같이, 실시예 1의 생물전환 조성물 시료(DYT-BE)는 비교예의 생물전환 되지 않은 조성물 시료(DYT-E)에 비해 세포 콜로니 형성을 억제하는 효과가 우수하였다. 특히 HT-29 세포에서의 억제활성이 가장 높은 것으로 확인되었다.

<실험예 4>

생물전환 여부에 따른 세포이동 억제활성

암의 생성 및 전이에 관련된 과정인 세포이동을 억제하는 활성을 생물전환 여부에 따라 다음과 같이 확인하였다.

실험을 위한 세포로는 인간 대장암 세포주인 HCT-116 세포와 래트 정상 장세포주인 IEC-6 세포를 사용하였다.

세포배양용 6-웰 플레이트에 HCT-116 세포와 IEC-6 세포를 1×10⁵cells/㎖로 각각 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 플라스틱 1000㎕ 팁(tip)을 이용하여 단일 세포층을 스크래치한 후 실시예 1과 비교예의 시료를 각각 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 처리하고 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 대조를 위하여 COX-II 저해제인 셀레콕시브(CC)를 50μM의 농도로 처리하여 동일하게 배양하였다. 음성대조구(NC)에는 아무 것도 처리하지 않았다.

세포이동성은 0시간 및 48시간에 역상현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다(상확대배율은 40×).

도 4의 결과에서와 같이, 실시예 1의 시료(DYT-BE)는 비교예의 시료(DYT-E)에 비해 세포 이동을 억제하는 활성이 우수하였다. 특히 HT-29 세포에서의 억제활성이 가장 높은 것으로 확인되었다.

<실험예 5>

생물전환 여부에 따른 세포자멸사 ( apoptosis ) 유도활성

암의 생성 및 전이에 관련된 과정인 세포자멸사를 유도하는 활성을 생물전환 여부에 따라 다음과 같이 확인하였다.

실험을 위한 세포로는 인간 대장암 세포주인 HCT-116 세포와 HT-29 세포를 사용하였고, FACS(Fluorescence-activated cell sorting)에 의하여 세포주기를 관찰하였다.

시료 처리에 따른 세포주기의 변화는 프로피듐 요오드화물 염색(propidiuom iodide staining, PI staining)과 유세포분석기(flow cytometry)를 사용하여 측정하였다.

HCT-116 세포와 HT-29 세포에 실시예 1과 비교예 시료를 각각 0㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 처리된 세포는 PBS로 세척한 후 트립신-EDTA로 모은 다음, 1×10⁶cells/㎖의 농도에서 바인딩 버퍼(binding buffer)로 현탁(suspension)하였다. 현탁된 세포를 PI로 15분 동안 염색한 후, 유세포분석기(Becton-Dickinson Bidsciences, Drive Frankline Lages, NJ, USA)를 이용하여 분석하였다.

본 발명의 생물전환 조성물이 세포사멸에 미치는 효과를 확인한 결과를 도 5의 (A)에 나타내었다. 도 5의 (A)에서 G₀/G₁기(G₀/G₁ phase) 세포(%)는 프로피움 요오도화물로 염색한 후 FACS 분석을 이용하여 확인하였다. 생물전환 조성물의 처리에 의한 apoptosis의 과정을 관찰한 결과, HCT-116 세포에서는 apoptosis로 인해 증가하는 G₀/G₁기, 즉 sub G₁ phase 세포의 비율이 생물전환 조성물의 처리 전 세포인 대조군(40.8%)보다 50, 100 ㎍/㎖ 농도별 각각 50.6% 와 61.7%였으며, HT-29세포에서는 대조군(71.1%)보다 73.9% 와 82.5%로 증가됨을 확인할 수 있었다.

또한 생물전환 조성물과 생물전환되지 않은 조성물이 HT-29 세포에서 다양한 세포자멸 단백질(apoptosis protein) 발현의 변화에 미치는지를 확인하기 위해 생물전환 전후 조성물 각각 0, 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 24시간이 지난 후 단백질 발현량의 차이를 웨스턴 블랏으로 확인하였고, 그 결과를 도 5의 (B)에 나타내었다.

생물전환되지 않은 조성물의 고농도군(100 ㎍/㎖) 및 생물전환 조성물의 모든 농도군에서 apoptosis protein인 PARP, Caspase-3의 clavege를 확인 할 수 있었고, BCL-2의 발현 감소, BAX의 발현 증가 및 미토콘드리아에서의 cytochrom의 방출량 증가 또한 생물전환 조성물의 24시간 처리에 의해 나타남을 확인할 수 있었다.

<실험예 6>

생물전환 조성물의 작용기전 확인

생물전환 여부에 따라 HT-29 세포에서 항증식효과, 세포자멸사 유도 및 대장암 성장의 주요인자인 COX-2를 저해하는 기전을 웨스턴 블랏팅(Western blotting)으로 확인하였다.

HT-29 세포와 IEC-6 세포에 실시예 1과 비교예의 시료를 각각 0㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다.

단백질을 추출하기 위하여 RIPA 라이시스 버퍼[50mM Tris-HCL(8.0), 150mM NaCl, 1% NP 40, 0.5% sodium deoxycholate, 1mM phenylmethylsulfonyl]를 각 웰에 150㎕씩 첨가하여 반응시킨 후, 14,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하여 상등액을 취하여 단백질 농도를 결정하였다.

그 후에 8% 아크릴아미드 겔에 시료를 로딩하여 전기영동을 실시하고 글리신 트랜스퍼 버퍼(20% methanol/25mM Tris/192mM glycine)을 이용하여 폴리비닐리덴 플루오라이드[polyvinylidene fluoride(PVDF)] 막으로 단백질을 트랜스퍼하는 과정을 거친 다음 2% BSA(bovine serum albumin)를 이용하여 블로킹하였다. 블로킹한 후, 1차, 2차 항체를 반응시키고 ECL 시스템(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 이용하여 시각화 하였고, 단백질 발현의 이미지 분석과 정량을 하였다[ImageQuant LAS 4000 luminescent image analyzer와 ImageQuant TL software system (GE Healthcare, Little Chalfont, U.K.)을 이용].

미처리 CRC 세포주인 HT-29 세포 및 정상 장세포주인 IEC-6 세포에서 COX-2 단백질 발현과 AKT와 ERK의 인산화 수준을 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 표준물질로 GAPDH 단백질 발현을 사용하였다.

COX-2의 발현수준과 COX-2/GAPDH의 상대강도를 확인한 결과를 도 6의 (A)에 나타내었고, AKT와 ERK의 인산화수준(Phosphorylation level)을 확인한 결과를 도 6의 (B)에 나타내었다(*P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001는 시료를 처리하지 않은 대조구와 비교할 때 유의적인 차이가 있음을 나타낸다).

도 6의 COX-2 단백질의 발현수준 및 AKT와 ERK의 인산화수준을 볼 때 HT-29세포에서 생물전환 조성물의 COX-2 저해 활성 및 세포의 자멸사 유도와 관련된 기전에 AKT와 ERK의 인산화 억제가 관련되어 있는 것으로 확인되었다.

<실험예 7>

염증성 사이토카인 발현 억제기전 확인

생물전환 여부에 따라 HT-29 세포에서 염증유발을 억제하는 기전을 확인하기 위하여, TNF-α로 염증을 유도한 후 염증성 사이토카인의 발현량을 확인하였다.

HT-29 세포에 10ng/㎖의 TNF-α를 처리하고 시간의 경과에 따라 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-8, COX-2가 발현되는 양을 확인하였고, 그 결과를 도 7의 (A)에 나타내었다.

도 7의 (A)에서와 같이, TNF-α와 IL-1β의 발현량은 처리 1시간 후에 가장 높고, COX-2의 발현량은 처리 3시간 후에 가장 높았으며, IL-8의 발현양은 처리 1시간 및 3시간 후에 모두 높았으나 1시간 후의 발현량이 조금 더 높았다.

실시예 1과 비교예의 시료를 처리한 후 TNF-α를 처리하였을 때 TNF-α, IL-1β, IL-8, COX-2의 발현량을 다음과 같이 확인하였다.

HT-29 세포에 실시예 1과 비교예의 시료를 각각 0㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 1시간 동안 처리한 후 10ng/㎖의 TNF-α를 처리하여 1시간 또는 3시간 동안 각각 배양하였다.

TNF-α 처리 후 발현량이 가장 높은 시간을 기준으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-8의 발현량은 TNF-α를 처리하여 1시간 동안 배양한 후 확인하였고, COX-2의 발현량은 TNF-α를 처리하여 3시간 동안 배양한 후 확인하였다.

배양 후 HT-29 세포의 mRNA는 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 추출하였다. COX-2 등의 mRNA의 측정은 RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction) 방법을 이용하였다. 총 mRNA를 OligodT15와 Goscript^TM 역전사 시스템 키트(Goscript^TM Reverse transcription system kit; Promega)를 사용하여 cDNA로 역전사시키고, PCR 반응은 HotStart® SYBR® Green qPCR Master Mix (USB, Cleveland, OH, U.S.A.)를 이용하여 StepOne Plus^TM (Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.)에서 수행하였다.

실시예 1과 비교예의 시료를 처리한 후 TNF-α를 처리하였을 때 TNF-α, IL-1β, IL-8, COX-2의 발현량을 확인한 결과를 도 7의 (B)에 나타내었다(*P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001는 각 대조구 그룹과 비교할 때 유의적인 차이가 있음을 나타낸다).

도 7의 결과에서와 같이, TNF-α로 처리하여 유도된 염증성 반응에 따라 증가된 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-8 및 COX-2의 발현량은 실시예 1의 생물전환 조성물의 처리에 의해 농도의존적으로 현저히 감소하였다.

<실험예 8>

NF - kB 활성화 억제기전 확인

생물전환 여부에 따라 HT-29 세포에서 염증유발을 억제하는 기전을 확인하기 위하여, TNF-α로 염증을 유도한 후 NF-kB 활성화를 확인하였다.

HT-29 세포를 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖ 농도의 실시예 1 시료 또는 비교예의 시료 존재하에서 10ng/㎖ TNF-α로 6시간 동안 자극한 후 웨스턴 블랏을 이용하여 COX-2 단백질을 검출하였다. 표준물질로 GAPDH 단백질 발현을 사용하였으며, 그 결과를 도 8의 (A)에 나타내었다.

TNF-α로 자극된 HT-29 세포에서 시간경과에 따른 P-IKKαβ, IκBα 및 NF-kB 활성화를 도 8의 (B)에 나타내었고, 15분 동안 TNF-α로 자극된 후 P-IKKαβ, IκBα 및 NF-kB의 변화수준을 도 8의 (C)에 나타내었다(*P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001는 TNF-α 처리된 대조구와 비교할 때 유의적인 차이가 있음을 나타낸다.)

도 8의 결과를 볼 때, 실시예 1의 생물전환 조성물이 염증유발을 억제하는 기전은 세포질 내 NF-kB가 핵으로 이동하는 것을 차단하는 과정과 관련이 있는 것으로 보인다.

<실험예 9>

대장암유발 마우스를 이용한 동물실험

대장암세포인 HCT-116 세포를 매트리젤(matrigel)과 혼합하여 마우스의 결장(colon)에 주입하여 대장암을 인위적으로 유발하였다. 주입 2주 후 대장에 종괴가 생성됨을 육안적으로 확인하였다.

대장에 종괴가 생성된 마우스에 실시예 1과 비교예의 시료를 각각 200㎍/㎖ 농도로 7일 동안 경구투여하였다. 대조약으로 카페시타빈(Capecitabine; CAP.)을 100㎍/㎖ 농도로 7일 동안 경구투여하였다. 음성대조구(NC)로는 대장암을 유발하지 않은 마우스를 사용하였고, 양성대조구(PC)로는 대장암을 유발한 후 아무 것도 처리하지 않은 무처리 마우스를 사용하였다.

각 실험군별 결장의 크기 및 무게를 확인하고 간기능을 측정하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9의 결과에서와 같이, 실시예 1의 생물전환 조성물을 처리하였을 때 마우스 결장의 크기와 무게가 감소하였고, AST와 ALT의 농도가 크게 감소하였다. 이러한 결과에 비추어볼 때 본 발명의 생물전환 조성물이 대장암의 개선 및 치료에 매우 효과적이라는 것을 알 수 있다.

Claims

황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 포함하는 생약조성물을 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액으로 생물전환시켜 얻은 생물전환 조성물을 유효성분으로 포함하는 대장염 및 대장암 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생약조성물은 황기 10~30 중량부, 당귀 5~20 중량부, 생지황 5~20 중량부, 숙지황 5~20 중량부, 황백 2~10 중량부, 황련 2~10 중량부 및 황금 2~10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 개선 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 생약조성물은 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 20:10:10:10:7:7:7의 중량비로 혼합한 것임을 특징으로 하는 개선 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 생물전환은, 상기 생약조성물에 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액을 첨가하고 28~32℃에서 20~28시간 동안 진탕하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 개선 또는 치료용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액은,
아스퍼질러스 카와치를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 배양체를 얻는 단계;
상기 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24시간 방치하는 단계; 및
여과 및 원심분리하여 상등액인 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조된 것임을 특징으로 하는 개선 또는 치료용 조성물.
황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금을 혼합하여 생약조성물을 얻는 단계;
상기 생약조성물에, 100g을 기준으로 70% 에탄올 500~1,000㎖를 혼합하여 3~5시간 동안 추출하여 에탄올 추출물을 얻는 단계;
상기 에탄올 추출물을 동결건조하여 추출물 분말을 얻는 단계;
상기 추출물 분말에, 1g을 기준으로 증류수 8~12㎖를 혼합하여 충분히 용해시켜 용해된 추출물을 얻는 단계; 및
상기 용해된 추출물에, 10㎖를 기준으로 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액 8~12㎖ 첨가하여 28~32℃에서 20~28시간 동안 진탕하면서 생물전환시키는 단계를 포함하는, 대장염 및 대장암 개선 또는 치료를 위한 생물전환 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 생약조성물은 황기 10~30 중량부, 당귀 5~20 중량부, 생지황 5~20 중량부, 숙지황 5~20 중량부, 황백 2~10 중량부, 황련 2~10 중량부 및 황금 2~10 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물전환 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 방법은, 생물전환시킨 후 동결건조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물전환 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 황기, 당귀, 생지황, 숙지황, 황백, 황련 및 황금은 20:10:10:10:7:7:7의 중량비로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 생물전환 조성물의 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액은,
아스퍼질러스 카와치를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시켜 배양체를 얻는 단계;
상기 배양체에 인산나트륨 완충용액을 가하고 0~10℃에서 1~24시간 방치하는 단계; 및
여과 및 원심분리하여 상등액인 아스퍼질러스 카와치 유래 조효소액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조하는 것은 특징으로 하는, 생물전환 조성물의 제조방법.