KR20180064103A - 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학적 조성물 - Google Patents
청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 청각(Codium fragile)의 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염 조성물을 제공함으로써 효과가 뛰어난 천연물 유래의 항염 조성물을 제공할 수 있어, 염증 개선의 효과를 기대하는 화장료, 음료, 기능성 식품 등에 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 청각(Codium fragile)의 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학적 조성물에 관한 것이다.
녹조류는 약리활성을 갖는 넓은 범위의 천연물을 공급하는 것으로 잘 알려져 있다. 녹조류에서 유래한 함황 다당류(Sulfated polysaccharides;SPs)는 항염, 항통증 약물의 개발에 이용될 수 있는 대단한 잠재력이 있음을 보여 왔다. 청각(Codium fragile) 은 Codiales 과에 속하는 식이 가능한 녹조류로, 동아시아, 오세아니아 및 북유럽의 해안을 따라 널리 분포하고 있다. 한국에서 청각은 요리에 사용되는 익숙한 해조류 중 하나이다.
또한, 청각은 동양의학에서 요충증, 부종 및 배뇨장애의 치료에 사용되어 왔다. 청각에서 분리한 피루빌 및 황 함유 갈락탄은 유도성 일산화질소 합성 과정에서 mRNA와 단백질의 수준을 증가시키는 것으로 알려졌다. 인터루킨-1β(interleukin;IL-1β), IL-6, 및 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α;TNF-α)와 같은 여러 전 염증성 사이토카인의 mRNA 발현을 유도할 수 있다. 이러한 함황 다당류는 과도한 대식세포 활성에 기인한, 잠재적으로 위험한 염증을 방지하는 과정에서 대식세포를 활성화시킴으로써 강력한 면역자극 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 최근 몇몇 연구는 청각 추출물이 건강에 도움이 되며, 항암, 항혈관신생 및 항산화 특성을 포함하고 있다고 보고하였다. 또한, 청각의 에탄올 또는 메탄올 추출물은 Raw264.7 세포주에서 세포독성 없이 NF-κB 활성을 저해하여 항염 효과를 나타내었다.
염증은 생물학적, 화학적 및 물리학적 자극에 노출되면서 외부 병원체, 손상 및 감염에 대해 인체 면역 시스템의 첫 번째 생물학적 복합반응이다. 박테리아 및 바이러스 감염에 맞서기 위해 인체는 염증이 필요하지만, 과도하거나 지속되는 염증은 염증성 관절염, 죽상경화증 및 천식 등의 만성질환 발병과 관련되어 있다. 염증과정은 일반적으로 백혈구와 대식세포가 모이는 것이 특징이다. 지질다당류(Lipopolysaccharides;LPS)는 재빨리 대식세포를 활성화시켜 염증반응 매개체인 NO 및 프로스타글란딘 E2(PGE2) 뿐만 아니라 IL-1β, IL-6 및 TNF-α과 같은전 염증성 사이토카인의 생성을 자극한다.
특히, 싸이클로옥시게네이즈 효소(cyclooxygenase-2;COX-2)는 염증반응에 중요하다. COX-2의 수준은 대식세포에서는 LPS, 전 염증성 사이토카인 및 성장인자와 같은 요인에 반응하여 빨리 증가할 수 있지만, 정상적인 생리 조건에서는 낮다. Nuclear factor-kappa B(NF-κB)는 여러 염증성 사이토카인의 분비에 반응하여 COX-2의 발현을 조절하는 양성 조절자이다. NF-κB 류는 Rel A (p65), Rel B, c-Rel, NF-κB1 (p50) 및 NF-κB2 (p52)인 다섯 개의 단백질로 구성되어 있으며, 각각은 동형이합체 또는 이형이합체로 형성될 수 있다. NF-κB는 염증, 산화 스트레스 및 세포자살을 포함하는 스트레스 반응 관련 유전자를 조절하는 이합체 전사조절자이다. NF-κB는 가장 흔한 전사인자 중 하나로, 염증과 면역반응의 조절에 중요하다. 생리 조건에서 NF-κB는 Rel A (p65) 와 NF-κB1 (p50)로 구성된 이형이합체로, κB 억제자(IκB)에 결합된 비활성화된 형태로 세포질에 위치한다. 그러나 염증과정에서 NF-κB는 인산화된 후, IκB의 분해에 의해 활성화된다. 그 후, NF-κB 이형이합체는 핵 내로 재빨리 이동하여 iNOS, COX-2 및 TNF-α 와 같은 염증 반응과 관련된 여러 유전자의 발현을 활성화시킨다.
MAPK 경로는 세포증식, 분화 및 생존과 같이 여러 세포외 자극을 특이적 세포반응으로 전환시키는 것을 조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 세 종류의 주요 MAPK가 포유류에서 밝혀져 있는데, 이름은 세포외 신호조절 인산화효소(extracellular signal-regulated kinases;ERK-1/2), c-Jun N-말단 인산화효소(c-Jun N-terminal kinase;JNK) 및 p38 이다.
JNK와 p38은 IL-1β 및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인, TNF-α, 세포 스트레스, 활성산소 및 자외선 조사에 의해 활성화되는 반면, ERKs는 마이토겐과 성장인자에 의하여 활성화된다. ERK, JNK 및 p38 의 활성화로 MAPK 신호폭포는 인산화를 조정하여 AP-1 (cFos/cJun), ETS, RUNX-2, HIF-2α 및 C/EBPβ와 같은 전사인자를 활성화시키고, 이들은 NF-κB와 함께 이화 및 염증반응에 관련된 유전자의 발현을 조절한다. 몇몇 연구는 NF-κB의 활성에 MAPKs가 중요한 역할을 하고 있음을 보여주고 있다. 따라서 이들 경로를 차단하면 만성 염증으로 인한 질병 발생을 효과적으로 감소시킬 수 있다.
본 발명은 종래 동아시아에서 요리의 양념으로 주로 사용되어 왔던 청각에서 염증 개선에 유효한 열수추출물을 수득하여 효과가 뛰어난 천연물 유래의 항염 조성물을 제공하는 데에 목적이 있다.
본 발명은 청각의 열수추출물을 50 내지 300 μg/ml 로 포함하는 것을 특징으로 하는 청각(Codium fragile)의 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공한다.
또한 청각의 열수추출물은 일산화질소(NO)의 생성과 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 싸이클로옥시게네이즈-2(COX-2) 유전자의 발현억제를 통해 프로스타글란딘 E2(PGE2 )의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하며, 전 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 또는 IL-6의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 청각 열수추출물은 IκB-α 의 인산화와 분해를 저해하여 p65의 핵 내로의 이동을 억제함으로써 NF-κB 신호전달 경로를 저해하는 것을 특징으로 하는 항염용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 이용함으로써 효과가 뛰어난 천연물 유래의 항염 조성물을 제공할 수 있어, 염증 개선의 효과를 기대하는 화장료, 음료, 기능성 식품 등에 이용할 수 있다.
도 1은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주의 생존력에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. RAW264.7 세포들은 여러 농도(50, 100, 200, 300, 500 mg/ml)의 WECF로 24시간 처리하였다. 세포 생존력은 MTT 분석으로 결정하였다. 결과는 대조구에 대한 백분율로 나타내었다. 각 결과값은 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다(** p < 0.01).
도 2는 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 일산화 질소 및 유도성 일산화질소의 수준에 미치는 저해효과를 나타낸다. (A) RAW264.7 세포에서 WECF는 LPS로 자극된 NO 수준을 저해하였다. 세포를 WECF(50, 100, 200, 300 mg/ml)를 한시간 동안 전처리한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 자극시켰다. 세포배양액 내의 NO 생산량은 Griess법에 따라 24시간 째에 측정하였다. (B, C) WECF는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 iNOS의 mRNA 및 단백질 수준을 저해하였다. 세포들을 WECF (100, 200 mg/ml)로 1 시간 전처리한 후, LPS(0.2 mg/ml)로 24시간 동안 자극시켰다. iNOS의 mRNA 및 단백질 발현은 RT-PCR과 웨스턴 블로팅 분석으로 결정하였다. GAPDH 및 b-actin 은 대조구로 사용되었다. (D, E) B 및 C의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계 분석은 Dunnett's t-test로 결정하였다(* Compared with the LPS, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 3은 청각 열수추출물의 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 프로스타글란딘E2(PGE2) 및 싸이클로옥시게네이즈-2에 대한 저해효과를 나타낸다. (A) WECF는 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 저해하였다. 세포들을 WECF(50, 100, 200 mg/ml)로 1시간 동안 전처리한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 자극시켰다. 세포배양액 내의 PGE2 생성은 Griess법으로 결정하였다. (B C) WECF는 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 cyclooxygenase (COX)-2의 mRNA 및 단백질 수준을 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 자극시켰다. COX-2의 mRNA 및 단백질 발현은 RT-PCR과 웨스턴 블로팅 분석으로 결정하였다. GAPDH 및 b-actin 은 대조구로 사용되었다. (D, E) B 및 C의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계 분석은 Dunnett's t-test로 결정하였다(* Compared with the LPS, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 4는 청각 열수추출물의 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 전-염증성 싸이토카인에 대한 저해효과를 나타낸다. (A, E) WECF는 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준을 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 동안 자극시켰다. GAPDH 및 b-actin 은 대조구로 사용되었다. (B, C, D, F, G, H) A 및 E의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하여 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *표는 LPS 처리군과의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(*** p < 0.001).
도 5은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 IκB-α 인산화 및 NF-κB의 핵으로의 이동 활성에 미치는 효과를 나타낸다. (A) WECF는 LPS에 의해 유도된 IκB-α 인산화를 저해하였다. IκB-α 및 p-IκB-α의 단백질 수준은 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. (B) A의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하였다. (C) WECF는 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 핵내로의 이동을 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 12시간 동안 자극시켰다. 핵 및 세포질에서의 단백질 추출물에서 NF-κB (p65)의 발현 수준은 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. b-actin 및 Lamin B1 는 대조구로 사용되었다. (D, E) C의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *표는 LPS 처리군과의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 6은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 ERK, JNK, p38 MAPKs의 인산화에 미치는 효과를 나타낸다. (A) WECF는 LPS로 유도된 ERK, JNK 및 p38 MAPKs의 인산화를 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 동안 자극시켰다. 전체 및 인산화된 ERK, JNK 및 p38는 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. (B, C, D) A의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *표는 LPS 처리군과의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 2는 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 일산화 질소 및 유도성 일산화질소의 수준에 미치는 저해효과를 나타낸다. (A) RAW264.7 세포에서 WECF는 LPS로 자극된 NO 수준을 저해하였다. 세포를 WECF(50, 100, 200, 300 mg/ml)를 한시간 동안 전처리한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 자극시켰다. 세포배양액 내의 NO 생산량은 Griess법에 따라 24시간 째에 측정하였다. (B, C) WECF는 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 iNOS의 mRNA 및 단백질 수준을 저해하였다. 세포들을 WECF (100, 200 mg/ml)로 1 시간 전처리한 후, LPS(0.2 mg/ml)로 24시간 동안 자극시켰다. iNOS의 mRNA 및 단백질 발현은 RT-PCR과 웨스턴 블로팅 분석으로 결정하였다. GAPDH 및 b-actin 은 대조구로 사용되었다. (D, E) B 및 C의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계 분석은 Dunnett's t-test로 결정하였다(* Compared with the LPS, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 3은 청각 열수추출물의 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 프로스타글란딘E2(PGE2) 및 싸이클로옥시게네이즈-2에 대한 저해효과를 나타낸다. (A) WECF는 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 저해하였다. 세포들을 WECF(50, 100, 200 mg/ml)로 1시간 동안 전처리한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 자극시켰다. 세포배양액 내의 PGE2 생성은 Griess법으로 결정하였다. (B C) WECF는 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 cyclooxygenase (COX)-2의 mRNA 및 단백질 수준을 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 자극시켰다. COX-2의 mRNA 및 단백질 발현은 RT-PCR과 웨스턴 블로팅 분석으로 결정하였다. GAPDH 및 b-actin 은 대조구로 사용되었다. (D, E) B 및 C의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계 분석은 Dunnett's t-test로 결정하였다(* Compared with the LPS, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 4는 청각 열수추출물의 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 전-염증성 싸이토카인에 대한 저해효과를 나타낸다. (A, E) WECF는 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 및 단백질 수준을 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 동안 자극시켰다. GAPDH 및 b-actin 은 대조구로 사용되었다. (B, C, D, F, G, H) A 및 E의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하여 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *표는 LPS 처리군과의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(*** p < 0.001).
도 5은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 IκB-α 인산화 및 NF-κB의 핵으로의 이동 활성에 미치는 효과를 나타낸다. (A) WECF는 LPS에 의해 유도된 IκB-α 인산화를 저해하였다. IκB-α 및 p-IκB-α의 단백질 수준은 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. (B) A의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하였다. (C) WECF는 LPS에 의해 유도된 NF-κB의 핵내로의 이동을 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 12시간 동안 자극시켰다. 핵 및 세포질에서의 단백질 추출물에서 NF-κB (p65)의 발현 수준은 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. b-actin 및 Lamin B1 는 대조구로 사용되었다. (D, E) C의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *표는 LPS 처리군과의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 6은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 ERK, JNK, p38 MAPKs의 인산화에 미치는 효과를 나타낸다. (A) WECF는 LPS로 유도된 ERK, JNK 및 p38 MAPKs의 인산화를 저해하였다. 세포들은 WECF (100, 200 mg/ml) 로 1 시간 전처리 한 후, LPS (0.2 mg/ml)로 24시간 동안 자극시켰다. 전체 및 인산화된 ERK, JNK 및 p38는 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅으로 결정하였다. (B, C, D) A의 결과를 이미지 J software를 이용하여 정량분석하였다. 결과는 독립적인 3반복 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *표는 LPS 처리군과의 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다(** p < 0.01, *** p < 0.001).
본 발명은 LPS로 자극시킨 RAW264.7 세포주에서 청각의 열수 추출물이 항염 효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 이의 작용 기작을 연구하는 과정에서 안출된 것이다. 즉, LPS로 자극한 RAW264.7 세포주의 대식세포에서 NF-κB의 활성 및 MAPK 인산화를 억제하여 전-염증성 사이토카인 및 매개체의 생산을 억제하는 것을 확인하고, 이를 통하여 청각 열수추출물의 항염 조성물을 완성하였다. 이하 본 발명을 구체적인 실시예를 들어 자세히 설명한다.
I. 재료 및 방법
1. 청각(
C. fragile
)의 수용성 함황다당류 추출물(
water-soluble sulfated polysaccharides extract of
C. fragile;
WECF)의 준비
2016년 6월 완도 해변에서 수집한 신선한 청각을 수돗물에 3번 세척하여 표면에 붙어있는 소금, 착생식물 및 모래를 제거한 후, 50℃에서 에어건조기를 이용하여 48시간동안 건조시켰다. 건조된 시료는 분쇄기로 분쇄한 후 10배 부피의 증류수를 넣고 95℃에서 1시간 동안 추출하였다. 이후, 10,000 g로 원심분리한 다음, 상층액을 증발, 동결건조시켰다. 건조된 추출분말은 100 mg/ml로 증류수에 용해시킨 다음, 사용하기 전, 0.2-μm 주사기 필터로 여과하였다.
2. 발명에 사용된 시약
LPS, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), sulfanilamide, N-(1-naphthyl) ethylendiamine dihydrochloride, 및 phosphoric acid 는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO)에서 구입하여 사용하였으며, Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM) 및 penicillin-streptomycin solution은 WelGene (Deagu, Republic of Korea)에서 구입하였다. Fetal bovine serum (FBS)은 Corning (Corning, NY)에서, anti-iNOS에 대한 항체는 Abcam(Cambridge, MA)에서, anti-iNOS를 제외한 1차 및 2차 항체는 Technology(Danvers, MA, USA)에서 구입하였다.
3. 세포 배양 및 생존력 측정
쥐의 대식세포 세포주인 RAW264.7 세포주는 한국생명공학연구원(KRIBB, Daejeon, Republic of Korea)에서 분양받아 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium) 배지로 습도가 조절되는 5% 이산화탄소 배양기 안에서 37℃에서 배양하였다.
세포 생존력 분석을 위하여 1Ⅹ106 cells/ml로 세포를 접종한 후, 6시간 동안 배양한 다음, 상기에서 제조한 WECF를 50, 100, 200, 300 및 500 μg/ml로 농도를 달리하여 24시간 동안 처리하였다. 청각 추출물의 처리 배양 후, MTT assay를 이용하여 세포 생존력을 측정하였다.
4. 일산화질소(NO)의 측정
RAW264.7 세포를 1Ⅹ106 cells/ml로 웰 플레이트에 접종하였다. RAW264.7 세포에 WECF를 50, 100, 200 and 300 μg/ml 로 농도를 달리하여 1시간 동안 처리한 다음, 이어서 LPS(0.2 μg/ml)와 함께 24시간 배양하였다. 세포 배지 내에 축적된 아질산염을 Griess 반응에 기초하여 NO 생성의 지표로 측정하였다. 간단히 설명하면, WECF 처리 플레이트의 상층액을 각 100 μL 취하여 동량의 Griess 시약(1% [w/v] sulfanilamide in 5% [v/v] phosphoric acid and 0.1% [w/v] naphthylethylenediamine)을 암실에서 10분간 혼합하였다. 그 다음, 마이크로플레이트 리더(Epoch Bioteck; Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT)로 540 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 아질산염의 농도는 아질산나트륨의 표준곡선과 비교하여 결정하였다.
5. 전체 RNA의 분리 및 역전사중합효소연쇄반응(RT-PCR)
Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 RAW264.7 세포로부터 전체 RNA를 분리하였다. Prime ScriptTM 1st strand cDNA 합성 키트(Takara Bio Inc., Otsu, Japan)를 이용하여 1 μg 의 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. cDNA는 표 1에 나타낸 각 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)으로 증폭시켰다.
| 번호 | 유전자명 | 방향 | 서열 |
| 1 | mouse TNF-α (283 bp) | sense | 5'- TGGAACTGGCAGAAGAGGCA -3' |
| 2 | mouse TNF-α (283 bp) | antisense | 5'-TGCTCCTCCACTTGGTGGTT-3' |
| 3 | mouse IL-1β (352 bp) | sense | 5'-GGCAGGCAGTATCACTCATT-3' |
| 4 | mouse IL-1β (352 bp) | antisense | 5'-CCCAAGGCCACAGGTATTT-3' |
| 5 | mouse IL-6 (359 bp) | sense | 5'-TGCAAGAGACTTCCATCCAGTTGC-3' |
| 6 | mouse IL-6 (359 bp) | antisense | 5'-CCAGGTAGCTATGGTACTCCAG-3' |
| 7 | mouse iNOS (732 bp) | sense | 5'-TTGTGCATCGACCTAGGCTGGAA-3' |
| 8 | mouse iNOS (732 bp) | antisense | 5'-GACCTTTCGCATTAGCATGGAAGC-3' |
| 9 | mouse COX-2 (395 bp) | sense | 5'-GTACTGGCTCATGCTGGACGA-3' |
| 10 | mouse COX-2 (395 bp) | antisense | 5'-CACCATACACTGCCAGGTCAGCAA-3' |
| 11 | GAPDH (382 bp) | sense | 5'-GGACTGTGGTCATGAGCCCTTCCA-3' |
| 12 | GAPDH (382 bp) | antisense | 5'-ACTCACGGCAAATTCAACGGCAC-3' |
PCR 산물은 아가로즈 전기영동을 통해 확인하였다. 각 실험구당 3개의 독립적 실험을 통해 편차를 표시하였다. GAPDH는 TNF-α, IL-1β, IL-6, iNOS 및 COX-2의 상대적 발현량 측정을 위한 내부 기준으로 사용하였다.
6. 핵 및 세포질 추출물의 준비
RAW264.7 세포에 WECF를 1시간 처리한 다음, 이어서 LPS(0.2 μg/ml)를 첨가하고 24시간 배양하였다. 상기 세포를 회수한 후, 차가운 PBS로 2번 세척하였다. 세포는 NEPER™ 핵 및 세포질 추출 시약키트(Thermo Scientific, IL, USA)를 사용하여 제품설명서에 따라 세포용해시켰다. 간단히 설명하면, 시약으로 재현탁시킨 세포를 4℃에서 15,000 g로 5분간 원심분리하였으며, 세포질 분획을 포함하는 상층액은 깨끗한 튜브로 옮겼다. 이어서 핵을 포함한 펠렛은 세포질막 등의 오염물을 제거하고, NER 시약에 재혼탁하여 4℃에서 15,000 g로 10분간 원심분리하였으며, 그 상층액을 핵 분획으로 사용하였다. 각 추출물의 단백질농도는 BCA 단백질 측정 키트(Pierce, Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 정량하였다.
7. 웨스턴 블로팅 분석
상기 세포를 단백질 추출 시약에 얼음 위에서 30분간 세포용해시켰다. 4℃에서 12,000 g로 15분간 원심분리(Sorvall centrifuge, Bad Homburg, Germany)한 후, 그 상층액을 새 튜브로 옮겼다. 단백질 농도는 BCA 단백질 측정 키트(Pierce, Thermo Scientific, IL, USA)를 이용하여 BSA 기준 곡선으로 정량하였다. 각 세포용해물로부터 약 30 μg 의 단백질을 Laemmli 샘플버퍼에 녹인 후, 3-8% 또는 4-20% 기울기 젤(Invitrogen Life Technologies)에 점적하 하였다. 단백질은 120 V에서 90분간 전기영동한 다음, 분리된 단백질은 polyvinylidene difluoride (Amomedi, Gwangju, Korea)을 포함하는 나노섬유 멤브레인에 옮겼다. 멤브레인은 실온에서 5% BSA로 1 시간 동안 블로킹한 후, anti- IL-1β, anti- IL-6, anti- TNF-α, anti- iNOS, anti- COX-2, anti-total MAPKs(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) 및 anti-β-actin (sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)에 대한 1차 항체와 함께 철야로 배양하였다. 그 후, TBS-T (0.1% Tween-20, 50 μM Tris-HCl pH 7.5, 150 μM NaCl)로 3회 세척한 다음, 멤브레인을 2차 항체와 1시간 동안 배양 하고, 다시 TBS-T로 3회 세척하였다. 그 다음, WestSave Up ECL 키트 (AB Frontier, Seoul, Korea)를 이용하여 단백질을 검출하고, Microchemi 4.2 device (DNR Bioimaging Systems, Jerusalem, Israel)를 이용하여 이를 가시화하였다.
8. 통계분석
결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 일원분산분석(One-way ANOVA)후, GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA, USA)을 이용하여 Dunnett's t-test로 다중비교를 실시하였다. 통계적 의의는 p < 0.05 일 때 *, p < 0.01 일 때, **, p < 0.001 일 때, ***로 표시하였다.
II. 항염 조성물로서 이용가능성 실험결과
1. RAW264.7 세포주의 세포 생존력에 WECF가 미치는 영향
RAW264.7 세포주의 세포 생존력에 WECF가 영향을 미치는지를 판단하기 위하여 0, 50, 100, 200, 300 및 500 μg/ml의 여러 농도로 WECF를 처리하고 MTT 어세이를 수행하였다.
도 1은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주의 생존력에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다. 도 1에서 보는 바와 같이, MTT 어세이 결과, 50, 100, 200 및 300 μg/ml 의 WECF 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. 그러나 WECF를 500 μg/ml의 고농도로 처리 했을 때 약 40%의 세포 생존율의 감소를 나타내었다. 따라서 이후의 모든 실험에서는 세포독성을 피하기 위하여 WECF는 최고 300 μg/ml까지 사용하였다.
2. RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 NO 생성 및 iNOS 발현에 대한 WECF의 저해효과
도 2는 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 일산화 질소 및 유도성 일산화질소의 수준에 미치는 저해효과를 나타낸다. RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 NO의 생성 및 iNOS의 발현에 대한 WECF의 잠재적 항염효과를 측정하기 위하여 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅 분석을 통하여 WECF가 NO 생성 및 iNOS 유전자 발현을 조절하는지를 조사하였다. 세포들을 WECF를 0~300 μg/ml로 1시간 동안 전처리하고, 0.2 μg/ml의 LPS로 24시간 처리하였다. 세포배양상층액의 NO는 Griess 시약을 이용하여 측정하였다.
0.2 μg/ml의 LPS는 RAW264.7 세포주에서 대조구(0.599 ± 0.495 μM)에 비하여 27배 (27.94 ± 0.48 μM) 높게 NO생성을 증가시켰다(도 2A). 게다가 RT-PCR과 웨스턴 블로팅 분석을 통하여 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 iNOS의 mRNA와 단백질 발현 수준을 측정하였는데, 0.2 μg/ml의 LPS 자체는 iNOS의 mRNA와 단백질 발현을 모두 증가시켰다. 특히 iNOS의 mRNA 수준은 LPS만 처리한 구에 비하여 200 μg/ml의 WECF를 처리한 군에서 73% 감소되었다(도 2B, D).
또한 LPS에 의해 유도된 iNOS의 단백질 발현은 WECF를 100 및 200 μg/ml로 처리한 실험군에서 45% 유의하게 감소하였다(도 2C, E). 밀도측정 분석 결과, WECF는 iNOS의 mRNA 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 저해하는 것으로 나타났다. 이들 결과를 종합하면, WECF는 RAW264.7 세포주에서 NO를 생성하여 LPS 유도에 의한 염증반응을 매개하는 iNOS의 유전자 발현을 저해하는 것으로 나타났다.
3. WECF의 RAW264.7 세포주에서 COX-2 유전자 발현 억제를 통해 LPS에 의해 유도된 PGE
2
생성에 대한 저해효과
도 3은 청각 열수추출물의 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 프로스타글란딘E2(PGE2) 및 싸이클로옥시게네이즈-2에 대한 저해효과를 나타낸다. COX-2는 PGE2의 생성에 중요한 효소이다. ELISA를 이용한 PGE2의 정량 분석은 LPS가 처리된 RAW264.7 세포가 PGE2의 생성 및 배양상층액으로 방출이 촉진되는 것을 보여준다. WECF를 1시간 동안 전처리한 결과, LPS에 의해 유도된 PGE2의 발현 수준이 유의하게 억제되어 대조구와 유사한 발현수준을 보였다(Fig. 3A).
RT-PCR과 웨스턴 블로팅 분석을 통하여 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 COX-2의 mRNA와 단백질 발현 수준을 측정하였다. 0.2 μg/ml의 LPS 자체는 COX-2의 mRNA와 단백질 발현을 모두 증가시켰다(도 3B, C). 그러나 WECF를 1시간 동안 전처리하면 LPS에 의해 유도되는 COX-2의 mRNA 수준은 농도 의존적으로 감소하였다(도 3B, D). 특히 COX-2의 mRNA 수준은 200 μg/ml의 WECF 전처리에 의하여 65%로 LPS만을 처리한 구에 비하여 매우 감소하였다(도 3B, D).
또한 COX-2의 단백질 발현 수준은 100 및 200 μg/ml의 WECF 전처리에 의하여 48%, 44% 각각 감소하였다. 밀도측정 분석 결과, WECF는 COX-2의 mRNA 및 단백질 발현을 농도 의존적으로 저해하는 것으로 나타났다. 이들 결과를 종합하면, WECF는 RAW264.7 세포주에서 염증의 주요 매개인자 역할을 하는 PGE2를 생성하는 COX-2의 유전자 발현을 저해하는 것으로 나타났다.
4. RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 전 염증성 사이토카인에 대한 WECF의 저해효과
상기 실험에서 WECF가 NO 및 PGE2를 저해하는 것으로 나타났기 때문에 본 발명자들은 여러 염증 자극에 대한 면역반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 전 염증성 사이토카인의 발현에 대해 조사하였다. LPS에 의하여 자극된 RAW264.7 세포주에서 전 염증성 사이토카인의 mRNA 수준을 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. RAW264.7 세포는 0.2 μg/ml의 LPS로 24시간 동안 자극하기 전, WECF를 1시간 동안 전처리하였다.
도 4는 청각 열수추출물의 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 전-염증성 싸이토카인에 대한 저해효과를 나타낸다. LPS 자극은 단독으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA와 단백질의 수준을 대조구와 비교하여 현저하게 증가시켰다. 그러나 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현은 100 μg/ml의 WECF 전처리에 의하여 각각 50% 로 저해되었으며, 300 μg/ml의 WECF 전처리에 의하여 TNF-α 단독은 40% 감소하였다(도 4A, B, C, D). 같은 조건에서 LPS만을 처리한 군과 비교하여 WECF 처리는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 단백질 수준 또한 농도 의존적으로 유의하게 저해하였다(도 4E, F, G, H). TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성 억제는 세포독성에 의한 것이 아닌 것으로 확인되었다(도 1). 따라서 이들 결과는 WECF가 LPS에 의하여 유도된 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성을 유의하게 억제하였음을 나타낸다.
5. LPS에 의해 유도된 RAW264.7 세포주에서 WECF에 의한 MAPKs/NF-κB 신호전달 경로의 억제
NF-κB는 LPS에 의해 유도된 iNOS, COX-2 및 TNF-α와 같은, 전 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 조절하는 중요한 전사인자이다. NF-κB의 활성을 측정하기 위하여 LPS에 의해 유도된 p65 NF-κB 서브유닛의 핵내으로의 이동, IκB-α의 인산화 및 분해에 대한 WECF의 효과를 웨스턴 블로팅을 통해 조사하였다.
도 5은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도된 IκB-α 인산화 및 NF-κB의 핵으로의 이동 활성에 미치는 효과를 나타낸다. 도 5A에서 보듯이, IκB-α는 0.2 μg/ml의 LPS를 12시간 동안 처리후에 인산화되고 분해된다. 그러나 WECF를 1시간 전처리하면 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IκB-α의 인산화 및 분해는 유의하게 감소된다(도 5A, B)
이를 입증하기 위하여, 더 나아가 NF-κB의 구성부인 p65의 핵내로의 이동을 측정해 보았다. LPS를 12시간 동안 처리하면 p65이 세포질에서 핵내로의 이동이 유의하게 증가하였다(도 5C, D, E). 또한, WECF로 1시간 전처리하면 p65의 핵내로의 이동이 200 μg/ml의 WECF에 의하여 약 2배 억제되었다. 이들 결과를 종합하면 WECF는 p65 NF-κB 서브유닛의 핵내로의 이동을 방지하고 IκB-α의 인산화 및 분해를 저해하여 NF-κB 신호전달경로를 억제하는 것으로 생각된다(도 5).
도 6은 청각 열수추출물이 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 ERK, JNK, p38 MAPKs의 인산화에 미치는 효과를 나타낸다. WECF의 항염효과가 MAPK 경로를 통해 매개되는 것인지를 결정하기 위하여 WECF가 RAW264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 ERK1/2, JPK 및 p38 MAPK의 인산화를 저해하는 능력을 측정하였다(도 6). RAW264.7 세포는 WECF에서 1시간 동안 전처리된 다음 이어서 0.2 μg/ml의 LPS로 12시간동안 자극되었다. 도 6에서 보는 바와 같이, LPS 자극만으로 대조구에 비하여 ERK1/2, JNK 및 p38 MAPK 의 인산화가 유의하게 증가하였다. 그러나, 100 μg/ml 의 WECF 전처리에 의하여 ERK1/2, JNK 및 p38 MAPK 의 인산화가 유의하게 감소하였다(도 6A, B, C, D). 또한 MAPK 동위체의 전체 발현 수준은 이들 군 간에 유의적인 차이가 없었다. 이들 결과는 WECF가 LPS에 의해 유도된 염증 반응 동안 MAPK 인산화를 효과적으로 저해한 것을 나타낸다.
III. 실험 결과의 항염조성물로서 이용가능성
본원발명은 청각(Codium fragile) 열수추출물의 LPS로 자극한 쥐의 대식세포 세포주인 RAW264.7 세포에서 WECF의 항염효과를 알아보고, 이의 가능한 작용기전을 시험해 보았다. 그 결과, WECF는 NF-κB 활성과 MAPK 신호전달 경로를 억제함으로써 LPS로 유도한 아질산염, iNOS, PGE2, COX-2 및 전 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 것을 보여주었다.
염증은 여러 외부 감염에 대한 면역 시스템의 초기 방어 반응이다. 염증 반응 동안, 전 염증 매개자인 NO 및 PGE2의 생성이 iNOS 및 COX-2에 의해 매개되며, 이는 항 박테리아 및 항 바이러스 기작에 있어서 중요하다. 그러나 과도한 iNOS 및 COX-2의 생성은 심각한 염증성 질병을 일으키게 된다. 그 결과, 이러한 전 염증성 매개자의 발현을 저해하는 것이 항염증 약제 및 기능성 식품의 개발의 잠재적 전략으로 생각되었다.
WECF의 잠재적 항염 효과를 연구하기 위하여 발명자들은 먼저 RAW264.7 세포주에서 이의 세포독성을 연구하였다. 그 결과 WECF는 300 μg/ml 보다 낮은 농도에서 세포의 생존력에 영향을 미치지 않는 것을 보여주었다. 따라서 모든 실험은 300 μg/ml 보다 낮은 농도에서 진행하였다.
WECF는 iNOS 및 COX-2의 단백질과 mRNA 모두의 수준을 농도 의존적으로 억제함으로써 LPS로 유도된 NO 및 PGE2의 생성을 저해하는 것이 관찰되었다. 또한 WECF의 전처리는 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 전 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 강하게 억제하였다. 이는 청각의 에탄올추출물이 LPS로 자극시킨 RAW264.7 세포가 배양액으로 TNF-α, IL-β 및 IL-6 의 분비를 억제한다는 보고와 유사하다. LPS에 반응하여 대식세포는 TNF-α를 방출하는데, TNF-α는 IL-1β 및 IL-6와 같은 또다른 전 염증성 사이토카인의 방출을 자극한다. IL-1β는 중요한 전 염증성 사이토카인으로, 세균 감염에 반응하여 염증반응을 개시하고 증진시킨다. IL-6는 또한 중요한 전 염증성 사이토카인으로 급성기 면역반응에 관련되어 있다. 상기의 결과는 NO 및 COX-2의 생성에 대한 WECF의 저해 활성이 iNOS 및 PGE2의 저해와 관련되고, 전 염증성 사이토카인의 생성에 의해 매개된 것을 보여준다. 이와 같이, 상기 결과는 WECF가 항염 활성이 있다는 가설을 뒷받침해준다. 따라서 이후 WECF의 항 염증 효과를 매개하는 주요 인자를 확인하는 연구가 필요하다.
또한 염증성 매개자 및 사이토카인의 억제제로서 WECF의 항염 효과를 확인하기 위하여 LPS로 자극한 대식세포에서 NF-κB 및 MAPK 신호전달 경로의 활성을 측정하였다. NF-κB는 iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 면역 반응 및 염증과 관련된 많은 유전자의 발현을 조절하는 잘 알려진 전사인자이다. 그러므로 NF-κB의 발현역제를 목표로 하는 것은 염증 질환 치료의 유용한 전략으로 고려될 수 있다. LPS에 의한 NF-κB 경로의 활성화는 세포질 내에서 IκB-α 의 인산화와 분해를 유도한다. 이는 NF-κB를 핵 내로 이동시키며, 핵 내에서 목표 지점에 결합하여 염증성 사이토카인의 전사를 유도하고 염증 관련 효소의 활성화를 유발한다.
상기 결과는 WECF의 전처리가 IκB-α의 인산화 및 분해를 억제함으로써 NF-κB Rel A (p65)가 핵 내로 이동하는 것을 저해하는 것을 보여준다. 이들 결과는 염증 매개자 및 사이토카인의 생성 저해에 대한 WECF의 효과가 적어도 부분적으로 NF-κB 신호전달 경로의 억제를 통해 매개된다는 것을 보여준다.
또한 ERK1/2, JNK 및 p38를 포함하는 MAPSs의 활성화에 대한 WECF의 효과를 연구하였다. 그 결과, 100 μg/ml의 WECF 전처리는 LPS에 의해 유도된 ERK1/2, JNK 및 p38의 인산화를 유의하게 감소시키는 것을 보여주었다. 이들 결과는 MAPS 인산화가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포주에서 WECF의 항염 효과와 관련되어 있음을 보여주었다. 따라서, WECF의 항염효과는 MPAK 및 NF-κB 신호전달 경로의 저해로 설명될 수 있을 것이다.
이후 다른 전사 인자, 활성인자 protein-1 및 CCAAT 인핸서 결합 단백질의 결합부위를 포함하는 유전자 프로모터 영역을 고려하여 NF-κB 이외에 다른 전사인자들의 역할을 구명하는 연구가 필요하다. 또한 IκB-α의 인산화 및 분해가 여러 상류 인산화효소, TAK1 및 IKKβ 자가-인산화에 의해 활성화되는 IKK 복합체의 촉매성 인산화효소에 의하여 조절된다. 그러므로 이후 WECF가 IKKβ 인산화 효소와 이의 상류 경로를 저해하는지, 그리고, WECF의 항염 활성을 설명하는 기전을 완전히 이해하기 위한 실험이 진행되어야 할 것이다.
결론적으로, 상기 결과는 WECF가 LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 IκB-α의 인산화 및 분해와 MAPK 인산화 차단을 통하여 NF-κB 활성화를 억제함으로써 염증 매개자인 NO 및 PGE2와 전 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생산을 저해하는 것을 보여주었다. 이들 결과는 WECF가 항염 제제 및 기능성 식품의 개발에 이용할 수 있는 잠재적인 후보물질인 것을 보여주고 있다. 상기 결과로 청각 추출물의 LPS 자극에 의한 염증에 WECF의 항염효과가 밝혀졌으며, 이후 WECF에서 항염 활성을 나타내는 활성 성분을 완전히 밝히는 연구가 필요하다.
본 발명에 따른 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 이용함으로써 효과가 뛰어난 천연물 유래의 항염 조성물을 제공할 수 있으며, 이를 이용하여 염증 개선의 효과를 기대하는 화장료, 음료, 기능성 식품 등에 이용할 수 있으므로 산업상 이용가능성이 있다.
Claims (5)
- 청각(Codium fragile)의 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 항염용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 청각의 열수추출물은 50 내지 300 μg/ml 로 포함하는 것을 특징으로 하는 항염용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 청각의 열수추출물은 일산화질소(NO)의 생성과 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS)의 발현을 억제하며, 싸이클로옥시게네이즈-2(COX-2) 유전자의 발현억제를 통해 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 청각의 열수추출물은 전 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 또는 IL-6의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항염용 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 청각의 열수추출물은 IκB-α 의 인산화와 분해를 저해하여 p65의 핵 내로의 이동을 억제함으로써 NF-κB 신호전달 경로를 저해하는 것을 특징으로 하는 항염용 약학적 조성물.
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| 그러나 상기 발명들은 청각의 열수추출물을 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 제공하는 본 발명과 그 구성 및 효과에서 차이를 보인다. |
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