WO2022203440A1 - 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2022203440A1
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ultrafine dust
extract
preventing
group
inflammatory diseases
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PCT/KR2022/004199
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허호진
김태윤
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경상국립대학교산학협력단
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient. More specifically, it relates to a composition for preventing or treating respiratory diseases or cranial nerve diseases caused by ultrafine dust comprising an auditory extract as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an auditory ( Codium fragilea ) extract as an active ingredient, and more particularly, an inflammatory respiratory disease caused by ultrafine dust containing an auditory extract or It relates to a composition for preventing or treating inflammatory cranial nerve disease.
  • the types of respiratory diseases include pneumonia, asthma, chronic bronchitis, pneumoconiosis, tuberculosis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease and cystic fibrosis
  • the types of cranial nerve diseases include stroke, Alzheimer's disease (AD), Dementia and Parkinson's disease (PD).
  • Ultrafine dust means fine dust with an aerodynamic diameter of 2.5 ⁇ m or less, and secondary air pollutants (NO 3 - , SO 4 - , NH4 - , polyacromatichydrocarbon (PAH), quinone, etc.) are predominant (Kim et al., 2017, Lippmann et al., 2003). According to the World Health Organization (World Health Organization, 2013), long-term exposure to PM 10 (fine dust with an aerodynamic diameter of 10 ⁇ m or less) increases respiratory tract-related diseases and mortality, with PM 2.5 being a stronger risk factor. has been reported to act as a (Block et al., 2009).
  • Dust with a diameter of 5-10 ⁇ g/m 3 or less can be absorbed into the body through the nasal mucosa, 2-5 ⁇ g/m 3 or less passes through the respiratory tract, and 0.1-1 ⁇ g/m 3 causes alveolar damage. will cause When fine dust is inhaled into the human body, it can be deposited in tissues by various mechanisms such as collision, gravitational sedimentation, diffusion, and electrostatic adsorption, and some of it circulates throughout the body along with blood.
  • seaweed is a food material containing various physiologically active substances, and the importance of research is emerging (Lee et al., 2017).
  • Codium fragile is called deer antlers in Korea because it resembles deer horns. In Japan, it is called 'Miru' ( ⁇ , pine of the sea), and in English, it is called 'Sea staghorn' (sea staghorn).
  • Hear Codium fragile
  • nasal RPMI- 2650
  • lung A549
  • cranial nerve MC-IXC
  • hippocampus HT-22
  • the purpose of this study was to determine the physiologically active effect of hearing as a preventive material for toxicity on five types of microglia (BV-2) and ultrafine dust-induced diseases.
  • the present invention aims to provide a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient in order to solve the above problems, more specifically, hearing
  • a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient in order to solve the above problems, more specifically, hearing
  • the present invention was completed by confirming the prevention or treatment efficacy of respiratory diseases or cranial nerve diseases among inflammatory diseases caused by fine dust.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising an extract of Codium fragile extract as an active ingredient.
  • the extract is extracted using an organic solvent extraction method using water or a volatile solvent, but is not limited thereto.
  • the organic solvent extraction method uses 30 to 50% ethanol, but is not limited thereto.
  • the auditory extract inhibits the generation of active oxygen induced by ultrafine dust (PM 2.5 ), but is not limited thereto.
  • the auditory extract increases the cell viability against cytotoxicity induced by ultrafine dust (PM 2.5 ), but is not limited thereto.
  • the auditory extract inhibits the generation of malondialdehyde induced by ultrafine dust (PM 2.5 ), but is not limited thereto.
  • the inflammatory disease caused by the ultrafine dust (PM 2.5 ) may be a cranial nerve disease.
  • the cranial nerve disease is any one of stroke, Alzheimer's disease, dementia, and Parkinson's disease, but is not limited thereto.
  • the auditory extract but is not limited to improving spatial cognition or memory ability.
  • the inflammatory disease caused by the ultrafine dust (PM 2.5 ) may be a respiratory disease.
  • the respiratory disease is one of pneumonia, asthma, chronic bronchitis, pneumoconiosis, tuberculosis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, and cystic fibrosis, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a health functional food composition for protecting cells from damage caused by ultrafine dust, comprising a hearing extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising an auditory extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising administering the composition to an individual.
  • the present invention aims to provide a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient in order to solve the above problems, more specifically, hearing
  • a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient in order to solve the above problems, more specifically, hearing
  • the present invention was completed by confirming the prevention or treatment efficacy of respiratory diseases or cranial nerve diseases among inflammatory diseases caused by fine dust.
  • FIG. 1 is a diagram showing (a) total phenolic compound content and (b) total polysaccharide content of an auditory extract according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is PM 2.5 in (a) RPMI-2650, (b) A549, (c) MC-IXC, (d) HT-22 and (e) BV-2 cells of the auditory extract according to an embodiment of the present invention; - A diagram showing the intracellular ROS content of the Codium fragile extract against induced oxidative stress.
  • FIG. 3 shows PM 2.5 in (a) RPMI-2650, (b) A549, (c) MC-IXC, (d) HT-22 and (e) BV-2 cells of the auditory extract according to an embodiment of the present invention; - It is a diagram showing the cell viability of water and 40% ethanol extract of Codium fragile for induced cytotoxicity.
  • FIG. 4 is a diagram showing the lipid peroxidation inhibitory effect of the auditory extract in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a diagram showing the effect of improving spatial cognition of the mouse according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a diagram showing the effect of improving memory according to the short-term learning of the mouse according to the auditory extract processing according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a diagram showing the effect of improving the long-term memory and learning ability of the mouse according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view confirming the SOD content of mouse brain tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view confirming the MDA content of the mouse brain tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a view confirming the GSH content of the mouse brain tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a diagram illustrating (a) ACh content in mouse brain tissue and (b) AChE activity in mouse brain tissue according to an auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a view confirming the ROS content in the mitochondria of mouse brain tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a view confirming the mitochondrial membrane potential of the mouse brain tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a view confirming the expression of proteins related to apoptosis and inflammation in mouse brain tissue according to an auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a view confirming the SOD content of mouse lung tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • 16 is a view confirming the MDA content of mouse lung tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is a view confirming the GSH content of mouse lung tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 is a view confirming the ROS content in mitochondria of mouse lung tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 is a view confirming the mitochondrial membrane potential of the mouse lung tissue according to the auditory extract treatment according to an embodiment of the present invention.
  • 20 is a diagram showing the results of UPLC-Q-TOF/MS analysis of the physiologically active substances of the auditory extract according to an embodiment of the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient.
  • the present invention aims to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising an extract extracted from Codium fragile as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a method for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising administering the composition to an individual.
  • a health functional food composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient.
  • the extract according to the present invention may be obtained by extraction and separation from nature using extraction and separation methods known in the art, and "extract" as defined in the present invention is auditory ( Codium fragile ) using an appropriate solvent. It is extracted from, for example, includes all of the crude extract, polar solvent-soluble extract or non-polar solvent-soluble extract.
  • any food/pharmaceutically acceptable organic solvent may be used, and water or an organic solvent may be used, but is not limited thereto, for example, purified water, methanol (Methanol), ethanol (Ethanol), propanol (Propanol), isopropanol (Isopropanol), alcohols having 1 to 4 carbon atoms, including butanol (Butanol), acetone (Acetone), ether (Ether), benzene (Benzene), chloroform (Chloroform), ethyl acetate (Ethyl acetate), methylene chloride (Methylene chloride), hexane (Hexane) and various solvents such as cyclohexane (Cyclohexane) can be used alone or in combination.
  • purified water methanol (Methanol), ethanol (Ethanol), propanol (Propanol), isopropanol (Isopropanol), alcohols having 1 to 4 carbon
  • any one of methods such as hot water extraction, cold extraction, reflux cooling extraction, solvent extraction, steam distillation, ultrasonic extraction, elution, and compression may be selected and used.
  • the desired extract may be further subjected to a conventional fractionation process, and may be purified using a conventional purification method.
  • the extract included in the composition of the present invention may be prepared in a powder state by an additional process such as distillation under reduced pressure and freeze-drying or spray-drying the primary extract extracted by the hot water extraction or solvent extraction method described above.
  • the first extract was further purified using various chromatography methods such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography. you may get Therefore, in the present invention, the extract is a concept including all extracts, fractions, and purified products obtained in each step of extraction, fractionation or purification, and dilutions, concentrates, or dried products thereof.
  • the health functional food composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like a conventional food composition in addition to containing the extract as an active ingredient.
  • Examples of the above-mentioned natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the above-described flavoring agent may advantageously use a natural flavoring agent (taumatine), a stevia extract (eg, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.), and a synthetic flavoring agent (saccharin, aspartame, etc.).
  • the food composition of the present invention may be formulated in the same manner as the following pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes and health supplements. There is this.
  • the food composition contains various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavoring agents, colorants and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, in addition to the active ingredient extract. , alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the food composition of the present invention may contain natural fruit juice and pulp for the production of fruit juice beverages and vegetable beverages.
  • the health functional food composition of the present invention may be manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, and the like.
  • the term 'health functional food composition' refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients useful for the human body according to Act No. 6727 of the Health Functional Food Act, and It refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes, such as regulating nutrients or physiological effects.
  • the health functional food of the present invention may contain normal food additives, and whether or not it is suitable as a food additive is evaluated on the item according to the general rules and general test methods of food additives approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. It is judged according to the relevant standards and standards.
  • the items listed in the 'Food Additives Code' include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, high pigment, and guar gum; Mixed preparations, such as a sodium L-glutamate preparation, a noodle-added alkali agent, a preservative preparation, and a tar dye preparation, etc. are mentioned.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, high pigment, and guar gum
  • Mixed preparations such as a sodium L-glutamate preparation, a noodle-added alkali agent, a preservative preparation, and a tar dye preparation, etc. are mentioned.
  • a health functional food in tablet form is granulated by a conventional method by mixing the active ingredient of the present invention with an excipient, a binder, a disintegrant and other additives, followed by compression molding by adding a lubricant, etc., or The mixture can be compression molded directly.
  • the health functional food in the form of tablets may contain a corrosive agent or the like, if necessary.
  • hard capsules can be prepared by filling a mixture of the active ingredient of the present invention with additives such as excipients in ordinary hard capsules. It can be prepared by filling the mixture mixed with the capsule base such as gelatin.
  • the soft capsules may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, if necessary.
  • a health functional food in the form of a ring can be prepared by molding a mixture of the active ingredient of the present invention and an excipient, a binder, a disintegrant, etc. by a known method, and if necessary, it can be coated with sucrose or other skinning agent, Alternatively, the surface may be coated with a material such as starch or talc.
  • a health functional food in the form of granules can be prepared in a granular form by a conventionally known method by mixing a mixture of an excipient, a binder, a disintegrant, etc. of the active ingredient of the present invention, and may contain a flavoring agent, a flavoring agent, etc., if necessary. can
  • compositions for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising an extract of Codium fragile as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant in addition to the active ingredient. Any adjuvant known in the art may be used without limitation.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared in a form in which the active ingredient is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient in the active ingredient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin. It can be prepared by mixing and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • base of the suppository Witepsol, TweenW 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, etc. may be used.
  • composition according to the present invention may be administered to an individual by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in various oral or parenteral dosage forms.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard, soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, and the like. crose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants (eg silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and/or polyethylene glycol).
  • the tablet may contain a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and optionally starch, agar, alginic acid. or disintegrants such as sodium salts thereof or effervescent mixtures and/or absorbents, coloring, flavoring and sweetening agents.
  • the formulation may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • a representative formulation for parenteral administration is an injection formulation
  • examples of the solvent for the injection formulation include water, Ringer's solution, isotonic saline or suspension.
  • the sterile, fixed oil of the injectable preparation can be used as a solvent or suspending medium, and any non-irritating fixed oil including mono- and di-glycerides can be used for this purpose.
  • the injection preparation may use a fatty acid such as oleic acid.
  • Codium fragile in this experiment was collected from Wando-gun, Jeollanam-do. After washing with water to remove salt and impurities, dried in a freeze dryer (Ilshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea), it was powdered and stored frozen. 20 g of the dried sample was added with water (distilled water), 20, 40, 60, 80 or 95% ethanol, respectively, and extracted under reflux for 2 hours at 40 ° C. 2 After filtration and concentration using filter paper (Whatman Inc, Kent, UK), and freeze-drying, it was used in the experiment while stored at -20 °C (Park et al., 2019).
  • the total polysaccharide content was measured by mixing 0.2 mL of sample solution, 0.2 mL of 5% phenol solution, and 1 mL of sulfuric acid, reacting at room temperature for 10 minutes, and measuring absorbance at 490 nm using UV-spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu). did.
  • the total polysaccharide content was calculated using a calibration curve of glucose measured in the same way (Park et al., 2020).
  • the total phenolic compound content showed the highest content at 376.33 mg GAE / g of dried weight in 40% ethanolic extract of H., 60% ethanol extract (201.33 mg GAE / g of dried weight), 80% ethanol extract (143.00 mg) GAE/g of dried weight), 20% ethanol extract (124.66 mg GAE/g of dried weight), water extract (118.00 mg GAE/g of dried weight), 95% ethanol extract (38.00 mg GAE/g of dried weight) showed the highest content.
  • the water extract and 20% ethanol extract which showed relatively low total phenolic compound content, showed high content of 46.31% and 29.86%, respectively, and 13.47% and 40% in the 60% ethanol extract.
  • % ethanol extract showed a high content in the order of 12.28%, 95% ethanol extract 6.16%, and 80% ethanol extract 4.87% (FIG. 1b).
  • Lung cells (A549) and nasal cells (RPMI-2650) used in this experiment were purchased from the Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea), and brain neurons (MC-IXC) were obtained from the American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA) was purchased and used.
  • BV-2 cells were purchased from the Korea Food Research Institute, and HT-22 cells were purchased from the Histology Laboratory, Gyeongsang National University, College of Veterinary Medicine, 10% fetal bovine serum, 1% 50 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (P/S).
  • the included Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM) medium was used.
  • RPMI-2650 cells Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 1% 50 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (P/S) was used.
  • RPMI 1640 medium containing 10% fetal bovine serum, 1% 50 units/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin (P/S) was used.
  • P/S streptomycin
  • A549 cells DMEM medium containing 10% bovine calf serum and 1% P/S was used.
  • MC-IXC cells were cultured using Minimum Essential medium (MEM) medium containing 10% fetal bovine serum and 1% P/S as a culture medium.
  • MEM Minimum Essential medium
  • the ultrafine dust treatment group (695.15%) showed an approximately 6.9-fold increase in the intracellular ROS content compared to the control group (100%), and the positive control group (ascorbic acid) effectively increased the cells to about 112.05%. It was found to inhibit my ROS production. Both the water extract and 40% ethanol extract showed a tendency to decrease the intracellular ROS content as the concentration increased, and at the concentration of 100 ⁇ g/mL, they were 221.49% and 202.71%, respectively (FIG. 2a).
  • the ultrafine dust treatment group (1329.13%) showed increased intracellular ROS content compared to the control group (100%).
  • the ROS content showed a tendency to decrease as the concentration increased in the water extract and 40% ethanol extract.
  • the 40% ethanol extract 100 ⁇ g / mL concentration reduced the ROS production to 299.50%, which showed a high ROS production inhibitory effect even compared to the positive control (518.54%) (Fig. 2b).
  • the ultrafine dust treatment group (465.66%) showed an increased intracellular ROS content compared to the control group (100.00%), and the positive control group showed a high inhibitory effect at 119.78% (Fig. 2c).
  • both extracts showed lower ROS content than the ultrafine dust treatment group, and the water extract (216.60%) and 40% ethanol extract (125.69%) at 100 ⁇ g/mL in the ultrafine dust treatment group It exhibited an excellent ROS generation inhibitory effect compared to that.
  • the ultrafine dust treatment group (800.77%) showed increased ROS production compared to the control group (100%), and ascorbic acid used as a positive control group showed intracellular ROS similar to that of the control group at 97.65%.
  • the production amount was shown (Fig. 2d).
  • the content was reduced by 44.93% compared to the ultrafine dust group to 440.96% at 100 ⁇ g/mL.
  • the 40% ethanol extract showed a tendency to decrease at a concentration of 10 ⁇ g/mL or more, and at a concentration of 100 ⁇ g/mL, it showed an inhibitory effect of about 59.64% compared to the ultrafine dust treatment group.
  • the ultrafine dust treatment group (312.15%) showed an approximately 3.12 times higher ROS production compared to the control group (100%), and the positive control group showed significantly higher intracellular ROS production inhibition (78.54%).
  • Fig. 2e The auditory extract showed a tendency to decrease the intracellular ROS content as the concentration increased, and the water extract showed 136.27% at 20 ⁇ g/mL, and the 40% ethanol extract suppressed high intracellular ROS production by 144.83% at 100 ⁇ g/mL. showed effect.
  • Cell viability was measured by treating the pretreated cells with 10 ⁇ L of MTT stock solution and reacting for 2 hours, removing all the medium, adding dimethyl sulfoxide and reacting at room temperature for 20 minutes, then 570 nm (determination wavelength) and 690 nm (reference wavelength) was measured (Park et al., 2019).
  • the ultrafine dust treatment group (65.06%) showed a reduced cell viability of about 34.94% compared to the control group (100.00%), and the positive control group showed an increased cell viability to 90.74%.
  • the water extract showed relatively superior cell viability compared to the 40% ethanol extract, and the water extract was 5 ⁇ g/mL (118.93%), and the 40% ethanol extract was 20 ⁇ g/mL (99.60%) at a concentration of 20 ⁇ g/mL (99.60%).
  • the survival rate was similar to that of the control group (Fig. 3c).
  • the ultrafine dust treatment group (80.57%) showed a decrease in cell viability by about 19.43% compared to the control group, and the positive control group showed a cell viability similar to the control group at 96.21%.
  • the auditory water extract showed a tendency to increase the cell viability as the concentration increased, and the cell viability was similar to that of the control at the concentration of 5 ⁇ g/mL (97.71%).
  • the cell viability was 97.82% at 1 ⁇ g/mL, which was similar to that of the control group, but showed a tendency to decrease as the concentration increased ( FIG. 3D ).
  • the ultrafine dust treatment group (22.40%) showed a cell viability that was about 77.60% lower than that of the control group (100%), and the positive control group (17.77%) showed cell viability, and 40% ethanol. It was found that the extract did not affect the cell viability regardless of the concentration (Fig. 3E). In the water extract, the cell viability increased as the concentration increased, and the cell viability was as high as 96.25% at 100 ⁇ g/mL ( FIG. 3e ).
  • lipid peroxide (malondialdehyde, MDA) production a 4-week-old male ICR mouse (Samtako, Osan, Korea) was purchased, and brains were extracted and used in the experiment. This experiment was carried out with approval from the Animal Ethics Review Committee of Gyeongsang National University (approval number: GNU-181019-M0054).
  • the extracted brain tissue was homogenized by adding 20 mM Tris hydrochloric acid buffer (pH 7.4) and using a tissue shredder (Next Advance Inc., Troy, NY, USA), and the supernatant was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes. was used.
  • Brain tissue supernatant, 10 ⁇ M FeSO 4 (II), and 0.1 mM ascorbic acid were mixed with the extract and reacted at 37° C. for 1 hour. After the reaction, 30% trichloroacetic acid and 1% thiobarbituric acid were added and heated in a constant temperature water bath at 95° C. for 20 minutes. The final reaction was centrifuged (10,000 ⁇ g, 10 min), and the absorbance of the supernatant was measured at 532 nm using a UV-spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu).
  • UV-spectrophotometer UV-spectrophotometer
  • the 40% ethanol extract and 60% ethanol extract showed high activity as 54.46% and 52.57%, and the water extract, 20% ethanol extract and 95% ethanol The extract showed little activity.
  • Fine dust is known to exhibit oxidative cytotoxicity when introduced into the human body, and as a result, it is reported that lipid peroxide is produced in various tissues (brain, liver, kidney) (Araujo et al., 2008; Hajipour et al., 2020).
  • Kim et al. (2015) the in vitro antioxidant activity (ABTS/DPPH radical scavenging activity, superoxide dismutase activity, reducing power, MDA production inhibition) of ethanol extract was highly correlated with the total phenolic compound content. did.
  • the MDA production inhibitory effect of water extract was relatively insufficient, according to a study by Kolsi et al.
  • the main mechanism of cytotoxicity caused by fine dust is reported to be DNA oxidation and protein damage caused by ROS generation.
  • Organic carbon compounds such as quinones and polycyclic aromatic hydrocarbons form ROS as oxygen radicals by cytochrome P450 reductase as major oxidation-reduction activators of fine dust.
  • potential metals that can be included in fine dust can contribute to overproduction of ROS inside and outside cells, and they cause DNA oxidation and protein damage, thereby causing cell damage and functional deterioration (Valavandis et al., 2008; Xia et al. , 2007).
  • the 40% ethanol extract of chrysanthemum was superior to the water extract in total phenolic substance content and lipid peroxidation inhibitory effect.
  • cell viability was not affected in all cells except brain neurons (MC-IXC) or treated (RPMI-2560, BV-2 cell) As the concentration increased, it was confirmed that a certain level of cytotoxicity (A549, HT-22 cell) was exhibited.
  • RPMI-2650 a distinct apoptosis inhibitory effect in all cells except for nasal cells
  • mice Male 6-week-old BALB/c mice were purchased from Samtako (Osan, Korea). Mice were randomly assigned to 5 mice per cage and bred in standard laboratory conditions of 55% humidity and 22 ⁇ 2°C. They were classified into 7 groups.
  • Angelica gigas Nakai root extract powder an individually recognized health functional food material that shows improvement in cognitive function registered in the Ministry of Food and Drug Safety, was used. After dissolving in drinking water, the extracts of water extract and Angelica serrata root were orally administered once a day for 12 weeks, and the mice were exposed to PM 2.5 at a concentration of 500 ⁇ g/m 3 per day for 12 weeks in a systemic exposure chamber.
  • the Y-maze is 33 cm long, 15 cm high and 10 cm wide in black plastic, divided into three sections. After dividing each zone into A, B, and C, a mouse was placed in one zone and the movement path of the mouse was measured for 8 minutes with a video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain). One point (actual alteration) is given when consecutively entering three different zones, and the change action is calculated as actual alteration / number of possible triads ⁇ 100.
  • SMART v3.0 Panlab SL, Barcelona, Spain
  • FIG. 5 The results of evaluating spatial cognitive ability through the Y-maze are shown in FIG. 5 .
  • Changed behavioral ability indicating spatial cognitive ability did not show any difference between groups in Sham group (24.98%), NC group (26.54%), and NS group (26.54%), and decreased in PM group (17.05%).
  • spatial cognitive ability was improved in the PC group (29.66%), the CF50 group (23.38%), and the CF100 group (30.95%) (FIG. 5a).
  • FIG. 5b The results of evaluating spatial cognitive ability through the Y-maze are shown in FIG. 5 .
  • Changed behavioral ability indicating spatial cognitive ability did not show any difference between groups in Sham group (24.98%), NC group (26.54%), and NS group (26.54%), and decreased in PM group (17.05%).
  • spatial cognitive ability was improved in the PC group (29.66%), the CF50 group (23.38%), and the CF100 group (30.95%) (FIG. 5a).
  • the PM group showed reduced spatial cognitive ability compared to the Sham group, NC group, and NS group, but the PC, CF50, and CF100 groups improved spatial cognitive ability. was confirmed to be (Fig. 5c).
  • the passive avoidance experiment was conducted in a chamber that divided a dark space without lighting and a bright space with lighting, and the two spaces consist of a small opening and closing passageway. Mice were acclimatized in a bright space without the light turned on for 1 minute, and then acclimated for 2 minutes after the light was turned on. After that, when the passage was opened and the mouse moved to the dark chamber, an electric shock (0.5 mA, 1 second) was applied to teach fear learning. One day after learning, a memory test was performed on the mouse, and the time it took for all four legs of the mouse to enter the chamber was measured up to 300 seconds.
  • FIG. 6 shows the results of evaluating short-term learning and memory through the passive avoidance experiment.
  • the time to enter the dark zone on the first day of the experiment did not differ significantly between groups (Fig. 6a).
  • the time increased in the PC group (284.50 s), CF50 group (275.67 s), and CF100 group (300 s) confirming that the memory was improved according to short-term learning.
  • a circular water tank with a radius of 75 cm and a height of 60 cm was filled with water at a temperature of 23 ⁇ 2 °C to a height of 30 cm, and the tank was divided into quadrants (N, S, E, W).
  • squid ink (Cebesa, Valencia, Spain) was used to contrast the water color of the tank with the color of the mouse.
  • adaptive training was conducted by swimming freely without an escape platform for 60 seconds. After that, the shelter was placed 1 cm below the surface of the water for four days, and the shelter was installed so that it was not visible.
  • the training was repeated 4 times a day for 4 days, and if the mouse found an escape zone within 60 seconds, it was allowed to stay in the shelter for 15 seconds. trained to On the fifth day of the experiment (probe test), the time the mouse stayed in the W area after removing the escape belt was recorded using a video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain) for 90 seconds.
  • SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain video tracking system
  • FIG. 7 The results of evaluating long-term memory ability through the Morris water maze are shown in FIG. 7 .
  • the delay time to find the platform increased in the PM group (54.82 s), and decreased in the PC group (39.66 s), CF50 group (39.57 s), and CF100 group (34.69 s) (Fig. 7a).
  • mice were sacrificed and brain tissue was collected to determine the effect of the auditory water extract treatment on the brain tissue.
  • the results of measuring the SOD content in brain tissue are shown in FIG. 8 .
  • the content of SOD in brain tissue did not show a significant difference between the groups in the Sham group (10.72 unit/mg of protein), the NC group (11.03 unit/mg of protein), and the NS group (11.34 unit/mg of protein).
  • the content of SOD in the tissue showed a tendency to decrease in the PM group (10.23 unit/mg of protein).
  • the SOD content was increased in the PC group (11.14 unit/mg of protein), the CF50 group (11.21 unit/mg of protein), and the CF100 group (11.01 unit/mg of protein).
  • Brain tissue was homogenized in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). The homogenized brain tissue was centrifuged at 5,000 rpm and 4° C. for 10 minutes at 400 ⁇ g, and the supernatant was reacted with 1% phosphoric acid and 0.67% TBA in a 95° C. water bath for 1 hour. The reaction mass was centrifuged at 600 ⁇ g for 10 minutes to recover the supernatant, and absorbance was measured at 532 nm.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the results of measuring the MDA content in brain tissue are shown in FIG. 9 .
  • the MDA content in brain tissue was not significantly different between the groups in the Sham group (0.50 nmole/mg of protein), the NC group (0.50 nmole/mg of protein), and the NS group (0.55 nmole/mg of protein), and there was no significant difference between the groups in the PM group. (0.63 nmole/mg of protein) significantly increased the MDA content.
  • the MDA content was effectively decreased in the PC group (0.40 nmole/mg of protein), the CF50 group (0.45 nmole/mg of protein), and the CF100 group (0.45 nmole/mg of protein).
  • the results of measuring reduced glutathione (GSH) content in brain tissue are shown in FIG. 10 .
  • the content of reduced GSH in brain tissue was found in Sham group (101.97%), NC group (100%), and NS group (98.86%), and there was no significant difference between groups.
  • the content of reduced GSH in brain tissue was decreased in the PM group (83.19%) than in the NC group (100%), and in the PC group (92.52%), CF50 group (87.13%), and CF100 group (100.52%) in the PM group. Compared to that, it was confirmed that the reduced GSH content was improved.
  • FIG. 11A The results of measuring the ACh content of brain tissue are shown in FIG. 11A .
  • ACh content in brain tissue did not differ significantly between Sham group (2.35 mmole/mg of protein), NC group (2.56 mmole/mg of protein) and NS group (2.56 mmole/mg of protein).
  • the ACh content was significantly decreased in the PM group (1.78 mmole/mg of protein), the PC group (2.60 mmole/mg of protein), the CF50 group (1.75 mmole/mg of protein), and the CF100 group (2.02 mmole/mg of protein) protein) showed a tendency to increase ACh content.
  • the supernatant used for ACh content analysis was reacted with 50 mM phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) at 37° C. for 10 minutes. After adding Ellman's reaction mixture, absorbance was measured at 405 nm to measure AChE activity.
  • PBS phosphate buffered saline
  • FIG. 11B The results of measuring AChE activity in brain tissue are shown in FIG. 11B . There were no significant differences in Sham group (102.05%), NC group (100%), and NS group (100.06%). On the other hand, it was confirmed that AChE activity was increased in the PM group (125.87%), and AChE activity was decreased in the PC group (85.41%), CF50 group (85.80%), and CF100 group (90.38%).
  • the brain tissue was homogenized using a 10-fold volume of a mitochondrial extraction solution (215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES sodium salt, pH 7.2) containing 1 mM EGTA.
  • the homogenized solution was centrifuged at 4° C. and 1,300 ⁇ g for 10 minutes, and then the supernatant was further centrifuged at 4° C. and 13,000 ⁇ g for 10 minutes. After removing the supernatant, the pellet was mixed with mitochondrial extraction buffer containing 0.1% digitonin. After 5 minutes, the mixture was reacted with mitochondrial extraction buffer containing 1 mM EGTA and centrifuged at 4° C. and 13,000 ⁇ g for 15 minutes.
  • KCl-based respiration buffer containing 25 ⁇ M DCF-DA of isolated mitochondria [125 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate monobabic, 20 mM HEPES, 1 mM magnesium chloride, 500 ⁇ M EGTA, 2.5 mM malate and 5 mM pyruvate] and reacted for 20 minutes.
  • DCF fluorescence the excitation wavelength at 485 nm and the emission wavelength at 530 nm were measured using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.).
  • the content of mitochondria-derived ROS in brain tissue is shown in FIG. 12 .
  • the mitochondrial ROS content in brain tissue did not show a significant difference in Sham group (94.17%), NC group (100%), and NS group (111.93%).
  • it was significantly increased in the PM group (223.12%), and the ROS content was significantly decreased in the PC group (95.18%), CF50 group (72.85%), and CF100 group (73.46%).
  • the mitochondrial extraction buffer containing 5 mM pyruvate and 5 mM malate and the isolated mitochondria were reacted with 1 ⁇ M JC-1 in a 96 well black plate. After the mixture was incubated in the dark for 20 minutes, the excitation wavelength at 530 nm and the emission wavelength at 590 nm were measured using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.).
  • the mitochondrial membrane potential of brain tissue is shown in FIG. 13 . There was no significant difference between groups in the Sham group (119.16%), the NC group (100%), and the NS group (103.35%), and there was a significant decrease in the PM group (77.15%). On the other hand, it was confirmed that the mitochondrial membrane potential increased in the PC group (129.77%), the CF50 group (63.99%), and the CF100 group (77.35%).
  • FIG. 14 The expression of proteins related to the apoptosis pathway and inflammation in brain tissue is shown in FIG. 14, and the band image in which the protein expression level is measured is shown in FIG. 14A.
  • ⁇ -actin is an indicator protein for converting the expression level of the protein.
  • the contents of p-JNK and COX-2 in the PM group 120.80%, 145.32%) increased compared to the NC group (100%), and decreased in the CF100 group (97.11%, 99.59%) (Fig. 14b). , Figure 14d).
  • the BCl-2 content was decreased in the PM group (69.30%) compared to the NC group (100%), and the expression was increased in the CF 100 group (112.37%) (Fig. 14c).
  • the mouse was sacrificed to collect lung tissue, and the effect of the auditory water extract treatment on the lung tissue was confirmed.
  • Lung tissue was homogenized in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). The homogenized lung tissue was centrifuged at 4° C. for 10 minutes under 400 ⁇ g conditions, and the pellet from which the supernatant was removed was used to measure the SOD content. Pellet and 1 ⁇ cell extraction buffer [10% SOD buffer, 0.4% (v/v) triton X-100, 200 ⁇ M phenylmethane sulfonylfluoride] were centrifuged at 4°C for 10 minutes under 10,000 ⁇ g conditions, followed by a commercial SOD kit (Dojindo). The SOD content was measured using Molecular Technologies, Kumamoto, Japan).
  • the results of measuring the SOD content in the lung tissue are shown in FIG. 15 .
  • the content of SOD in lung tissue did not show a significant difference between groups in the Sham group (7.62 unit/mg of protein), NC group (7.81 unit/mg of protein), and NS group (6.39 unit/mg of protein).
  • the content of SOD in the tissue showed a tendency to decrease in the PM group (4.56 unit/mg of protein).
  • the SOD content was increased in the PC group (7.51 unit/mg of protein), the CF50 group (7.59 unit/mg of protein), and the CF100 group (9.08 unit/mg of protein).
  • Lung tissue was homogenized in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). The homogenized lung tissue was centrifuged at 5,000 rpm and 4° C. for 10 minutes at 400 ⁇ g, and the supernatant was reacted with 1% phosphoric acid and 0.67% TBA in a 95° C. water bath for 1 hour. The reaction mass was centrifuged at 600 ⁇ g for 10 minutes to recover the supernatant, and absorbance was measured at 532 nm.
  • PBS phosphate buffered saline
  • MDA content in the lung tissue was not significantly different between the groups in the Sham group (0.03 nmole/mg of protein), the NC group (0.30 nmole/mg of protein), and the NS group (0.04 nmole/mg of protein), and there was no significant difference between the groups in the PM group. (0.10 nmole/mg of protein) significantly increased the MDA content.
  • the MDA content was effectively decreased in the PC group (0.07 nmole/mg of protein), the CF50 group (0.07 nmole/mg of protein), and the CF100 group (0.06 nmole/mg of protein).
  • Lung tissue was homogenized in phosphate buffer (pH 6.0) (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). After centrifugation of the homogenized lung tissue for 15 minutes at 10,000 ⁇ g conditions, the supernatant was recovered. The supernatant was reacted with 5% metaphosphoric acid, centrifuged at 2,000 ⁇ g, and the supernatant was reacted with M tris-HCl (pH 7.8), 0.65 N NaOH, and 1 mg/mL of o-phthaldialdehyde at room temperature for 15 minutes. Thereafter, fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 420 nm using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co., Mannedorf, Switzerland).
  • the results of measuring reduced glutathione (GSH) content in lung tissue are shown in FIG. 17 .
  • the content of reduced GSH in lung tissue was found in Sham group (119.04%), NC group (100%), and NS group (97.87%), and there was no significant difference between groups.
  • the content of reduced GSH in the lung tissue was decreased in the PM group (49.6%) than in the NC group (100%), and in the PC group (89.39%), CF50 group (82.24%), and CF100 group (116.00%) in the PM group. Compared to that, it was confirmed that the reduced GSH content was improved.
  • Lung tissue was homogenized using a 10-fold volume of mitochondrial extraction solution (215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES sodium salt, pH 7.2) containing 1 mM EGTA.
  • the homogenized solution was centrifuged at 4° C. and 1,300 ⁇ g for 10 minutes, and then the supernatant was further centrifuged at 4° C. and 13,000 ⁇ g for 10 minutes. After removing the supernatant, the pellet was mixed with mitochondrial extraction buffer containing 0.1% digitonin. After 5 minutes, the mixture was reacted with mitochondrial extraction buffer containing 1 mM EGTA and centrifuged at 4° C. and 13,000 ⁇ g for 15 minutes.
  • KCl-based respiration buffer containing 25 ⁇ M DCF-DA of isolated mitochondria [125 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate monobabic, 20 mM HEPES, 1 mM magnesium chloride, 500 ⁇ M EGTA, 2.5 mM malate and 5 mM pyruvate] and reacted for 20 minutes.
  • DCF fluorescence the excitation wavelength at 485 nm and the emission wavelength at 530 nm were measured using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.).
  • the mitochondrial-derived ROS content of lung tissue is shown in FIG. 18 .
  • the mitochondrial ROS content did not show a significant difference in Sham group (104.30%), NC group (100%), and NS group (87.06%).
  • the mitochondrial extraction buffer containing 5 mM pyruvate and 5 mM malate and the isolated mitochondria were reacted with 1 ⁇ M JC-1 in a 96 well black plate. After the mixture was incubated in the dark for 20 minutes, the excitation wavelength at 530 nm and the emission wavelength at 590 nm were measured using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.).
  • the mitochondrial membrane potential of lung tissue is shown in FIG. 19 . There was no significant difference between groups in the Sham group (103.68%), the NC group (100%), and the NS group (100.88%), and there was a significant decrease in the PM group (83.75%). On the other hand, it was confirmed that the mitochondrial membrane potential increased in the PC group (106.92%), CF50 group (85.37%), and CF100 group (86.26%).
  • methanol was added to the lyophilized ear to be homogenized, and the supernatant was collected after centrifugation and used for analysis.
  • the supernatant was subjected to ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight / mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) equipped with a BEH C 18 column (100 ⁇ 2.1 mm, 1.7 ⁇ L; Waters, Milford, MA, USA). analysis was carried out using The column temperature was 40 °C, and acetonitrile containing 0.1% formic acid and distilled water were used as the solvent.
  • the bioactive substances separated through the column were analyzed by Q-TOF/MS.
  • Q-TOF analysis positive conditions were used, capillary voltage was 2.5 kV, sampling cone voltage was 40 V, source temperature was 100°C, desolvation temperature was 400°C, and desolvation flow rate was set to 900 L/h.
  • Table 3 shows the results of polysaccharide and sulfate content analysis.
  • the lyophilized auditory was pyrolyzed with oxygen using a mercury analyzer (DMA-80, Milestone). After forming an amalgam with vaporized mercury through thermal decomposition, the absorbance was measured at 254 nm to measure the mercury content.
  • a mercury analyzer DMA-80, Milestone
  • the lyophilized auditory meat was hydrolyzed using nitric acid, and then filtered through a syringe filter (Sterile Acrodisc Syringe Filters with Supor Mebrane Prod. No. 4614, PALL Life Sciences).
  • the acid-decomposed sample was analyzed for heavy metals using ICP-MS (NexION 350D, PerkinElmer, Waltham, MA, USA), AsO analysis was performed in Dynamic Reaction Cell (DRC) mode, and Cd, Pb analysis was performed in standard mode.
  • Table 4 lists the heavy metal content analysis results.
  • Cd was not detected in the lyophilized hearing, and Pb was analyzed at 0.04 mg/kg and Hg at 0.09 ⁇ g/kg (w/w). This is lower than Cd: 0.3 mg/kg or less [laver (including seasoned laver) or seaweed (including seaweed)], and Pb: 0.5 mg/kg or less [seaweed (including seaweed)], which are the heavy metal tolerance standards prescribed by the Ministry of Food and Drug Safety. confirmed numerically.

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Abstract

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 청각 추출물이 비강 세포, 폐 세포 및 뇌신경 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과가 우수함 및 초미세먼지에 노출된 동물모델의 뇌조직에서 지질과산화 억제효과 및 염증 관련 단백질 발현량을 억제하는 것을 검증함으로써 초미세먼지로 인한 호흡기 질환 또는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 완성하였다. 이는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 호흡기 질환 또는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 청각(Codium fragilea) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 청각 추출물을 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 호흡기 질환 또는 염증성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 호흡기 질환의 종류로는 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 등이 있으며, 상기 뇌신경 질환의 종류로는 뇌졸중, 알츠하이머병(Alzheimer’s disease; AD), 치매(Dementia) 및 파킨슨병(Parkinson’s disease; PD) 등이 있다.
한편, 최근 미세먼지(Particulate Matter, PM)의 농도가 증가하고 지속기간이 증가됨에 따라 미세먼지에 의한 인체영향성에 대한 관심이 증가되고 있는 추세이다(Kim 등, 2017). 미세먼지는 우리나라의 오랜 역사와 함께 해왔으며, 예로부터 몽고와 중국 사막지역 및 황화강 유역에서 발원된 황사의 영향을 받았고, 최근에는 우리나라 및 동북아시아 국가들의 급격한 산업화가 미세먼지의 주요 발생 원인으로 보고되고 있다(Myung, 2016).
초미세먼지(PM2.5)는 공기역학적 지름이 2.5 μm 이하인 미세먼지를 의미하며, 대기 오염 발생원에서 직접 배출되어지는 1차 오염물질과 대기에서 반응하여 생성되는 2차 대기오염 물질(NO3 -, SO4 -, NH4-, polyacromatichydrocarbon(PAH), quinone 등)이 주를 이룬다(Kim 등, 2017, Lippmann 등, 2003). 세계보건기구(World Health Organization, 2013)에 의하면, PM10(공기역학적 지름이 10 μm 이하인 미세먼지)에 장기 노출될 경우 호흡기관 관련 질환과 사망률이 증가하게 되는데, PM2.5는 이보다 더 강한 위험 인자로 작용한다고 보고하였다(Block 등, 2009).
지름 5~10 μg/m3이하의 먼지는 코 점막을 통해 체내에 흡수가 가능하며 2~5 μg/m3이하는 기도(호흡기)를 통과하고, 0.1~1 μg/m3은 폐포 손상까지 유발하게 된다. 미세먼지가 인체에 흡입되었을 경우, 충돌·중력침강·확산·정전기적 흡착 등과 같은 다양한 기전에 의해서 조직에 침착될 수 있으며, 일부는 혈액을 따라서 전신을 순환하기도 한다.
특히, 체내에 침착된 미세먼지는 산화적 스트레스와 염증 반응을 유도하고 호흡계 및 순환계 질환의 급성 악화 등을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Myung, 2016). 또한, 후각상피세포를 거치면 혈관 뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 거치지 않고도 뇌로 직접 도달 할 수 있으며, 자성을 띄는 입자의 경우 뇌조직에 직접 침착됨으로써 미세아교세포(Microglia)를 활성화 하여 pro-inflammatory cytokines 등을 생산함으로써 뇌신경 염증을 유도하고 더 나아가 인지장애를 유도하는 것으로 보고되었다(Block, 2004). 따라서, 이러한 미세먼지로 유도될 수 있는 인체내 산화적 스트레스 억제 및 염증반응을 억제시켜 줄 수 있는 천연 식품 소재에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
최근 육상자원고갈로 해양자원을 활용한 연구가 주목을 받고 있으며, 특히 해조류는 다양한 생리활성물질의 함유한 식품소재로서 연구 중요성이 대두되고 있다(Lee 등, 2017). 청각(Codium fragile)은 대한민국에서는 사슴의 뿔을 닮았다는 점에서 청각채(靑角菜)나 녹각채(鹿角菜)로 일컫는다. 일본에서는 '미루'(海松, 해송. 바다의 소나무)로 칭하며, 영어로는 '시 스태그혼'(Sea staghorn, 바다의 사슴뿔)이라고 한다. 청각(Codium fragile)은 깃털말목 청각과에 속하는 녹조류의 일종으로 동아시아, 오세아니아 및 북유럽 해안에 널리 분포하는 것으로 알려져 있다(Lee 등, 2013). 청각은 우리나라에서 과거부터 식용, 약용으로 사용됐으며, 오늘날에도 한국, 중국, 일본, 하와이, 그리고 아프리카 등에서 식용으로 사용되고 있다. 청각 물 추출물은 항부종, 항염증, 피부보호 등 다양한 생리 활성을 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(Lee 등, 2017; Moon 등, 2018). Yoon 등(2011)의 연구에 따르면 청각 96% 에탄올 추출물은 대식세포(Raw264.7)에서 지질다당류에 의해 발현된 고리형 산화효소-2(Cyclooxygenase-2, COX-2), 산화질소 합성효소(inducible nitiric oxide synthase, iNOS), 및 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)와 같은 전염증성 사이토카인과 프로스타글란딘 E2(PGE2) 및 산화질소(NO)와 같은 전 염증 매개체 수준을 효과적으로 억제하는 것으로 보고되었다. 청각이 갖는 일부 염증 모델에 대한 연구가 나타나고 있지만, 미세먼지로 유도될 수 있는 산화적 스트레스와 호흡기 및 뇌 세포 등에서의 보호효과에 대한 연구는 상대적으로 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 초미세먼지(PM2.5)로 발생되는 산화적 독성이 중요한 유입경로에 해당되는 비강(RPMI-2650), 폐(A549), 뇌신경(MC-IXC), 해마(HT-22) 및 미세아교세포(BV-2) 5종의 세포에 대해 미치는 독성과 초미세먼지 유도성 질환에 대한 예방 소재로서의 청각의 생리활성 효과를 확인하고자 하였다.
즉, 본 연구에서는 초미세먼지에 노출된 다양한 세포 및 동물 조직에서 그 보호효과를 검증함으로써 청각이 초미세먼지 유도성 관련 염증성 질환 예방 또는 치료의 효과가 있음을 본 발명을 통해 제공하고자 한다.
이에 따라 본 연구에서는 비강, 폐 및 뇌신경세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과 등을 검증함으로써 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 중 호흡기 질환 또는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 청각 추출물이 비강, 폐 및 뇌신경 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과 및 초미세먼지에 노출된 동물모델의 폐 및 뇌조직에서 지질과산화 억제효과 및 염증 관련 단백질 발현량을 억제하는 것을 검증함으로써 초미세먼지로 인한 염증성 질환 중 호흡기 질환 또는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출한 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 유기용매 추출법은, 30 내지 50% 에탄올을 이용한 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 청각 추출물은, 초미세먼지(PM2.5)에 의해 유도되는 활성산소의 생성을 억제하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 청각 추출물은, 초미세먼지(PM2.5)에 의해 유도되는 세포독성에 대한 세포 생존율을 증가시키는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 청각 추출물은, 초미세먼지(PM2.5)에 의해 유도되는 말론디알데히드(malondialdehyde)의 생성을 억제하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 질환은 뇌신경 질환인 것일 수있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 뇌신경 질환은, 뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 청각 추출물은, 공간인지능력 또는 기억능력을개선하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 질환은 호흡기 질환인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 호흡기 질환은, 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 세포손상 보호용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 청각 추출물이 비강, 폐 및 뇌신경 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과 및 초미세먼지에 노출된 동물모델의 폐 및 뇌조직에서 지질과산화 억제효과 및 염증 관련 단백질 발현량을 억제하는 것을 검증함으로써 초미세먼지로 인한 염증성 질환 중 호흡기 질환 또는 뇌신경 질환의 예방 또는 치료 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물의 (a) 총 페놀성 화합물 함량 및 (b) 총 다당체 함량을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물의 (a) RPMI-2650, (b) A549, (c) MC-IXC, (d) HT-22 및 (e) BV-2 세포에서 PM2.5-유도된 산화 스트레스에 대한 청각(Codium fragile) 추출물의 세포 내 ROS 함량을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물의 (a) RPMI-2650, (b) A549, (c) MC-IXC, (d) HT-22 및 (e) BV-2 세포에서 PM2.5-유도된 세포 독성에 대한 청각(Codium fragile)의 물 및 40 % 에탄올 추출물의 세포 생존력을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물의 지방질과산화 억제효과에 대해 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스의 공간인지능력 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스의 단기학습에 따른 기억력 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스의 장기기억 및 학습능력 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 뇌 조직의 SOD 함량을 확인한 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 뇌 조직의 MDA 함량을 확인한 도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 뇌 조직의 GSH 함량을 확인한 도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 (a) 마우스 뇌 조직의 ACh 함량, (b) 마우스 뇌 조직의 AChE 활성을 확인한 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아 내 ROS 함량을 확인한 도이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 뇌 조직의 미토콘드리아 막 전위를 확인한 도이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 뇌 조직에서 세포 사멸 및 염증 관련 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 폐 조직의 SOD 함량을 확인한 도이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 폐 조직의 MDA 함량을 확인한 도이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 폐 조직의 GSH 함량을 확인한 도이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 폐 조직의 미토콘드리아 내 ROS 함량을 확인한 도이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물 처리에 따른 마우스 폐 조직의 미토콘드리아 막 전위를 확인한 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 있어서 청각 추출물의 생리활성 물질에 대하여 UPLC-Q-TOF/MS 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 청각(Codium fragile)으로부터 추출된 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료 방법 제공을 목적으로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
일 측면에서, 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 청각(Codium fragile)으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 청각(Codium fragile)으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학/약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(Methanol), 에탄올(Ethanol), 프로판올(Propanol), 이소프로판올(Isopropanol), 부탄올(Butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알콜, 아세톤(Acetone), 에테르(Ether), 벤젠(Benzene), 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 헥산(Hexane) 및 시클로헥산 (Cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서, 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
일 측면에서, 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(Adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(TweenW) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<실시예 1> 청각(Codium fragile) 추출물의 제조 및 함량분석
1.1 청각(Codium fragile) 추출물의 제조
본 실험의 청각(Codium fragile)은 전남 완도군에서 채취된 것을 사용하였다. 염분 및 불순물을 제거하기 위하여 수세하고 동결건조기(Ilshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)에서 건조한 후, 분말화하여 냉동보관하였다. 건조된 시료 20 g을 각각 물(증류수), 20, 40, 60, 80 또는 95% 에탄올을 가한 뒤, 40℃에서 2시간 동안 환류 냉각 추출하였고, 이를 No. 2 거름종이(Whatman Inc, Kent, UK)를 이용하여 여과 및 농축하여 동결건조한 뒤 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다(Park 등, 2019).
1.2 총 페놀성 화합물(Phenolic compound) 함량 측정
총 페놀성 화합물 함량은 시료액 1 mL과 증류수 9 mL을 혼합한 후 Folin & Ciocalteu's phenol reagent 1 mL를 넣고 실온에서 5분간 반응시킨 뒤 7% 탄산나트륨 용액 10 mL를 넣고 25 mL 정용 플라스크를 이용하여 증류수로 정용하였다. 반응액을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 뒤, UV-spectrophotometer(UV-1201, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 동일한 방법으로 측정된 gallic acid의 검량곡선을 이용하여 계산하였고, 이를 mg gallic acid equivalents GAE/g of dried weight로 나타내었다(Kim 등, 2003).
1.3 총 다당체(Polysaccharide) 함량 측정
총 다당체 함량은 시료액 0.2 mL, 5% phenol 용액 0.2 mL, sulfuric acid 1 mL을 혼합하여 실온에서 10분간 반응시킨 뒤, UV-spectrophotometer(UV-1201, Shimadzu)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 다당체 함량은 동일한 방법으로 측정된 glucose의 검량곡선을 이용하여 계산하였다(Park 등, 2020).
1.4 측정 결과
총 페놀성 화합물 함량 측정 결과이다(도 1a). 총 페놀성 화합물 함량은 청각 40% 에탄올 추출물에서 376.33 mg GAE/g of dried weight으로 가장 높은 함량을 나타냈으며, 60% 에탄올 추출물(201.33 mg GAE/g of dried weight), 80% 에탄올 추출물(143.00 mg GAE/g of dried weight), 20% 에탄올 추출물(124.66 mg GAE/g of dried weight), 물 추출물(118.00 mg GAE/g of dried weight), 95% 에탄올 추출물(38.00 mg GAE/g of dried weight) 순으로 높은 함량을 나타냈다.
총 다당체 함량을 분석한 결과 총 페놀성 화합물 함량에서 상대적으로 낮은 함량을 나타냈던 물 추출물과 20% 에탄올 추출물에서 각각 46.31%, 29.86%로 높은 함량을 나타냈으며, 60% 에탄올 추출물에서 13.47%, 40% 에탄올 추출물에서 12.28%, 95% 에탄올 추출물에서 6.16%, 80% 에탄올 추출물에서 4.87% 순으로 높은 함량을 나타냈다(도 1b).
<실시예 2> 초미세먼지(PM2.5) 유도성 ROS 함량과 세포 생존률 측정
2.1 세포 배양
본 실험에 사용된 폐세포(A549)와 비강세포(RPMI-2650)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 구입하였으며, 뇌신경세포(MC-IXC)는 American Type Culture Collection (Manasas, VA, USA)로부터 구매하여 사용하였다. BV-2세포는 한국식품연구원으로부터 HT-22세포는 경상대학교 수의과대학 조직학실험실에서 분양받았으며, 10% 소태아혈청, 1% 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(P/S)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM)배지를 사용하였다. RPMI-2650세포는 10% 소태아혈청, 1% 50 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(P/S)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640 배지를 사용하였다. A549세포는 10% 새끼소혈청(Bovine calf serum), 1% P/S가 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 그리고 MC-IXC 세포는 10% 소태아혈청, 1% P/S가 포함된 Minimum Essential medium(MEM) 배지를 배양액으로 하여 배양하였다.
2.2 초미세먼지(PM2.5) 유도성 세포 내 ROS 생성 억제 효과
세포 내 산화적스트레스를 측정하기 위해 96 well에 세포를 분주하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 청각추출물 처리 30분 후, 초미세먼지(PM2.5)를 전처리하였다. 초미세먼지 처리 24시간 후, 50 μM DCF-DA를 처리하여 40분간 배양하고 형광광도계(Infinite F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 들뜸 파장 485 nm 및 방출 파장 535 nm에서 형광강도를 측정하였다(Park 등, 2019).
비강세포(RPMI-2650)에서 초미세먼지 처리 군(695.15%)에서는 대조군(100%) 대비 약 6.9배 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군(ascorbic acid)은 약 112.05%로 효과적으로 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 확인되었다. 청각 물 추출물과 40% 에탄올 추출물 모두 농도가 증가함에 따라 세포 내 ROS 함량이 감소하는 경향을 보였으며, 100 μg/mL 농도에서는 각각 221.49%, 202.71%로 나타났다(도 2a).
폐세포(A549)에서 초미세먼지 처리군(1329.13%)은 대조군(100%) 대비 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈다. 반면, 청각 물 추출물 및 40% 에탄올 추출물에서는 농도가 증가함에 따라 ROS 함량이 감소하는 경향을 보였다. 특히, 40% 에탄올 추출물 100 μg/mL 농도에서는 299.50%로 ROS 생성량을 감소하는 것으로 확인되었으며, 이는 양성대조군(518.54%)과 비교시에도 높은 ROS 생성 억제효과를 나타냈다(도 2b).
뇌신경세포(MC-ⅨC)에서 초미세먼지 처리군(465.66%)은 대조군(100.00%) 대비 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군에서는 119.78%로 높은 억제 효과를 나타냈다(도 2c). 20 μg/mL이상 농도에서 두 가지 추출물 모두 초미세먼지 처리군보다 낮은 ROS 함량을 나타냈으며, 물 추출물(216.60%)과 40% 에탄올 추출물(125.69%)은 100 μg/mL에서는 초미세먼지 처리군 대비 우수한 ROS 생성 억제 효과를 나타냈다.
뇌 해마세포(HT-22)에서 초미세먼지 처리군(800.77%)은 대조군(100%) 대비 증가된 ROS 생성량을 보였으며, 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid에서는 97.65%로 대조군과 유사한 세포 내 ROS 생성량을 나타냈다(도 2d). 청각 물 추출물에서는 100 μg/mL에서 440.96%로 초미세먼지군 대비 44.93% 감소된 함량을 나타냈다. 청각 40% 에탄올 추출물에서는 10 μg/mL 농도 이상에서 감소하는 경향을 나타냈으며, 100 μg/mL 농도에서는 초미세먼지 처리군 대비 약 59.64% 억제되는 효과를 나타냈다.
미세아교세포(BV-2)에서 초미세먼지 처리군(312.15%)은 대조군(100%) 대비 약 3.12배 높은 ROS 생성량을 보였으며, 양성대조군에서는 78.54%로 유의적으로 높은 세포 내 ROS 생성억제 효과를 나타냈다(도 2e). 청각 추출물은 농도가 증가함에 따라 세포 내 ROS 함량이 감소하는 경향을 보였으며, 물 추출물은 20 μg/mL에서 136.27%, 40% 에탄올 추출물은 100 μg/mL에서 144.83%로 높은 세포내 ROS 생성 억제효과를 나타냈다.
2.3 초미세먼지(PM2.5) 유도성 세포독성에 대한 세포사멸 억제 효과
세포 생존율 측정은 전처리된 세포에 MTT stock 용액 10 μL를 처리하여 2시간 동안 반응시키고, 배지를 모두 제거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 20분간 상온에서 반응시킨 뒤 570 nm (determination wavelength)와 690 nm (reference wavelength)에서 흡광도를 측정하였다(Park 등, 2019).
비강세포(RPMI-2650)에서 초미세먼지 처리군(63.37%)에서는 대조군(100.00%)대비 약 36.63%의 세포 사멸이 유도되었다. 양성대조군(Ascorbic acid)과 청각 추출물(물, 40% 에탄올)에서는 초미세먼지 처리군 대비 유의적인 세포 생존율의 증가는 확인되지 않았다(도 3a).
폐세포(A549)에서 초미세먼지 처리군(74.59%)에서는 대조군(100%) 대비 약 25.41% 세포 사멸이 유도되었으며, 양성대조군은 102.31%로 대조군과 유사한 세포 생존율을 나타냈다. 청각 물 추출물에서는 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하는 경향을 보였으며 100 μg/mL농도에서 132.05%를 나타냈다. 40% 에탄올 추출물에서는 20 μg/mL 농도에서 세포 생존률 119.95%를 나타냈다(도 3b).
뇌신경세포(MC-ⅨC)에서 초미세먼지 처리군(65.06%)은 대조군(100.00%) 대비 약 34.94% 감소된 세포 생존율을 나타냈으며, 양성대조군에서는 90.74%로 증가한 세포 생존율을 나타냈다. 청각 추출물 처리군에서는 40% 에탄올 추출물 대비 상대적으로 물 추출물이 우수한 세포 생존율을 나타냈으며, 물 추출물은 5 μg/mL(118.93%), 40% 에탄올 추출물은 20 μg/mL(99.60%)의 농도에서 대조군과 유사한 생존율을 나타냈다(도 3c).
해마세포(HT-22)에서 초미세먼지 처리군(80.57%)은 대조군 대비 약 19.43% 세포 생존율이 감소하였으며, 양성대조군에서는 96.21%로 대조군과 유사한 세포 생존율을 나타냈다. 청각 물 추출물은 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하는 경향을 보였고, 5 μg/mL(97.71%)농도에서 대조군과 유사한 세포 생존율을 나타냈다. 반면 40% 에탄올 추출물의 경우에는 1 μg/mL에서는 97.82%로 대조군과 유사한 세포 생존율을 보였지만, 농도가 증가함에 따라서 감소되는 경향을 보였다(도 3d).
미세아교세포(BV-2)에서 초미세먼지 처리군(22.40%)은 대조군(100%) 대비 약 77.60% 낮은 세포 생존율을 보였고, 양성대조군(17.77%)에서는 세포 생존율을 나타냈으며 청각 40% 에탄올 추출물은 농도에 상관없이 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다(Fig. 3E). 물 추출물에서는 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 증가하였고, 100 μg/mL에서 96.25%로 높은 세포 생존율을 나타냈다(도 3e).
2.4 말론디알데히드(Malondialdehyde; MDA) 생성 억제 효과 분석
지방질 과산화물(malondialdehyde, MDA) 생성 억제 효과는 4주령 수컷 ICR 마우스(Samtako, Osan, Korea)를 구입후, 뇌를 적출하여 실험에 사용하였다. 본 실험은 경상대학교 동물윤리심의위원회로부터 승인(인가번호: GNU-181019-M0054)을 받아 진행하였다. 적출한 뇌 조직은 20 mM 트리스 염산 완충용액(pH 7.4)을 가하고 조직파쇄기(Next Advance Inc., Troy, NY, USA)를 사용하여 균질화한 뒤, 10,000 ×g에서 10분동안 원심분리한 상등액을 이용하였다. 추출물에 뇌 조직 상등액, 10 μM FeSO4(II), 0.1 mM ascorbic acid을 혼합하여 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 30% trichloroacetic acid와 1% thiobarbituric acid를 첨가하여 95℃의 항온 수조에서 20분 동안 가열하였다. 최종 반응물은 원심분리(10,000 ×g, 10 min)하여 상층액을 UV-spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu)를 이용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
청각 추출물의 지질과산화물 생성 억제효과를 측정한 결과(도 4) 청각 40% 에탄올 추출물과 60% 에탄올 추출물에서 54.46%, 52.57%로 높은 활성을 나타냈으며, 물 추출물, 20% 에탄올 추출물 및 95% 에탄올 추출물에서는 활성이 거의 나타나지 않았다.
미세먼지는 인체 내 유입 시 산화적 세포 독성을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 그 결과로써 다양한 조직(뇌, 간, 신장)에서 지질과산화물 생성하는 것으로 보고되고 있다(Araujo 등, 2008; Hajipour 등, 2020). Kim 등(2015)의 연구에 따르면, 청각 에탄올 추출물의 in vitro 항산화 활성(ABTS/DPPH 라디칼 소거활성, superoxide dismutase 활성, reducing power, MDA 생성억제)은 총 페놀성 화합물 함량과 높은 관련성이 있는 것으로 보고하였다. 비록 물 추출물에서의 MDA 생성억제 효과가 상대적으로 미흡하였지만, Kolsi 등(2017)의 연구에 따르면 물 추출물에서 높은 함량을 나타내는 sulfated polysaccharide의 식이가 고지방 식이로 유도된 비만 wistar rats 모델에서 간과 신장에서의 지질과산화물 생성을 효과적으로 억제한다고 보고하였다. 이에 따라, 청각의 주요 생리활성물질인 polysaccharide 함량이 우수하게 나타난 물 추출물과 총 페놀성 화합물 함량 및 지질과산화 활성이 우수하게 나타난 40% 에탄올 추출물의 미세먼지 유도성 산화적 손상에 대한 세포 보호효과를 확인하였다.
2.5 통계처리
모든 실험은 mean±SD로 나타냈으며, 각 평균값에 대한 유의성 검증은 SAS software 9.4(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 실시하고, Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 각 시료 간의 유의차를 5% 수준(P<0.05)에서 검증하였다.
2.6 실험 데이터 총 분석결과
미세먼지로 인한 세포독성의 주요 메커니즘은 ROS 생성에 의한 DNA 산화 및 단백질 손상 등으로 보고되고 있다. 퀴논 및 다환 방향족 탄화수소와 같은 유기 탄소 화합물은 미세먼지의 주요 산화-환원 활성 인자로써 cytochrome P450 환원 효소에 의해 산소라디칼과 같은 ROS를 형성한다. 또한, 미세먼지에 포함될 수 있는 전위 금속들은 세포 내·외부에서 ROS 과잉 생산에 기여할 수 있으며, 이들은 DNA 산화 및 단백질 손상을 유발함으로써 세포 손상 및 기능 저하를 유발하게 된다(Valavandis 등, 2008 ; Xia 등, 2007).
본 연구에서 청각 40% 에탄올 추출물은 총 페놀성 물질 함량, 지질과산화 억제 효과에서 물 추출물 대비 우수했고, 미세먼지 유도성 세포 내 ROS생성 억제 효과에서는 물 추출물과 유사하거나 더 높은 활성을 보였다. 하지만, 미세먼지로 유도되는 세포사멸 억제효과 측정에서 40% 에탄올 추출물의 경우 뇌 신경세포(MC-IXC)를 제외한 모든 세포에서 세포 생존률에 영향을 미치지 않거나(RPMI-2560, BV-2 cell) 처리 농도가 높아짐에 따라서 오히려 일정 수준의 세포독성(A549, HT-22 cell)을 나타내는 것으로 확인되었다. 반면, 물 추출물의 경우, 비강세포(RPMI-2650)를 제외한 모든 세포에서 뚜렷한 세포사멸 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다. 일반적으로 해조류의 생리활성은 dieckol과 같은 polyphenol로 부터 기인하는 것으로 추정되어 왔지만, 최근 연구에서는 해조류가 포함하고 있는 다양한 polysaccharide 또한 해조류의 주요 생리활성물질로 밝혀지고 있고 그로 인해 다양한 연구가 진행되고 있는 추세이다(Juarez-Portilla 등, 2019). Wang 등(2020)의 연구에서 청각 효소 분해물로부터 분리한 sulfated polysaccharide는 신장(Vero)세포에서 H2O2로 유도된 산화적 스트레스로 인한 세포 사멸 및 ROS 함량을 유의적으로 감소시켜 주었으며, zebrafish 배아를 이용한 in vivo 모델에서 H2O2로 유도된 ROS 함량 수준, 세포사멸 및 지질 과산화를 유의적으로 감소시키는 것으로 확인되었다. 이러한 물 추출물의 우수한 세포보호 효과는 청각의 sulfated polysaccharide와 같은 생리활성물질에서 기인된 효과로 유추된다.
본 실험의 결과를 종합하여 볼 때, 청각은 초미세먼지의 유입경로에 해당하는 비강, 폐 또는 뇌(신경, 해마 또는 미세아교) 조직의 세포보호 및 기능 개선 등에 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 다만, 청각 40% 에탄올 추출물의 경우 고농도에서 일부 세포독성이 나타남에 따라 물 추출물에 대한 잠재적 활용 가치가 높을 것으로 판단되며, 이는 in vivo 동물모델 연구 및 생리활성 물질분석과 같은 추가적인 연구를 통해 밝혀질 필요가 있다.
<실시예 3> in vivo 동물모델에서 청각 추출물의 효과 확인
수컷 6주령의 BALB/c 마우스를 Samtako(Osan, Korea)로부터 구매하였다. 마우스를 케이지 당 5 마리씩 무작위로 분류하여, 55% 습도 및 22±2℃의 표준 실험실 조건에서 사육하였다. 이들을 7개의 그룹으로 분류하였다.
Figure PCTKR2022004199-appb-img-000001
각 그룹을 sham control(Sham) 그룹(chamber exposure-/sample intake-), normal control(NC) 그룹(clean air+/sample intake-), normal+sample(NS) 그룹(clean air+/sample intake+; 100 mg/kg of body weight), PM2.5 노출(PM) 그룹(dust air+/sample intake-), PM2.5 노출 및 시료 섭취(CF50) 그룹(dust air+/sample intake+; 50 mg/kg of body weight), PM2.5 노출 및 시료 섭취(CF100) 그룹(dust air+/sample intake+; 100 mg/kg of body weight), positive control(PC) 그룹(dust air+/positive control intake+; 50 mg/kg of body weight)으로 하였다. positive control은 식품의약품안전처에 등재된 인지기능 장애 개선을 나타내는 개별인정형 건강기능식품 소재인 참당귀(Angelica gigas Nakai) 뿌리 추출물 분말을 사용하였다. 청각 물 추출물과 참당귀 뿌리 추출물은 음용수에 녹인 후 12주 동안 1일 1회 경구 투여 하였으며, 마우스는 전신 노출 챔버에서 12주 동안 하루 500 μg/m3 농도의 PM2.5에 노출시켰다.
모든 동물실험은 경상국립대학교 동물실험실 운영위원회(인증번호 : GNU-210803-M0069, 2021-08-03 승인)와 보건복지부 윤리위원회의 승인을 받아 수행되었다.
3.1 Y 미로 실험
Y-미로는 길이 33 cm, 높이 15 cm, 넓이 10 cm인 검은색 플라스틱으로 3개의 구역으로 구분되어 있다. 각 구역을 A, B, C로 구분한 후 한쪽 구역에 마우스를 놓고 8분간 마우스의 이동 경로를 video tracking system(SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain)으로 측정하였다. 3개의 서로 다른 구역에 연속적으로 들어가면 1점 (actual alteration)을 부여하고 변경 행동력은 actual alteration / number of possible triads × 100으로 계산하였다.
Y-미로를 통해 공간인지능력을 평가한 결과를 도 5에 나타내었다. 공간인지능력을 나타내는 변경 행동능력은 Sham 그룹(24.98%), NC 그룹(26.54%), NS 그룹(26.54%)에서 그룹 간 차이를 보이지 않았으며 PM 그룹(17.05%)에서 감소하였다. 반면 PC 그룹(29.66%), CF50 그룹(23.38%), CF100 그룹(30.95%)에서는 공간인지능력이 개선되었다(도 5a). 각 구역을 통과한 횟수를 측정하였을 때 실험 시간 동안 마우스의 운동성의 차이는 보이지 않았다(도 5b). 또한, Y-미로에서 실험 간 마우스의 경로를 추적하였을 때, Sham 그룹, NC 그룹, NS 그룹에 비해 PM 그룹은 감소된 공간인지능력을 보였으나, PC, CF50, CF100 그룹은 공간인지능력이 개선되는 것으로 확인되었다(도 5c).
3.2 수동 회피 실험
수동회피실험은 조명이 없는 어두운 공간과 조명이 있는 밝은 공간을 나누고 두 공간은 작은 개폐가 가능한 통로로 이루어져 있는 챔버에서 수행되었다. 마우스를 밝은 공간에서 1분간 조명을 켜지 않은 채로 적응시킨 후, 조명을 켠 후 2분간 적응시켰다. 이후 통로를 개방하고 마우스가 어두운 챔버로 이동하면 전기충격(0.5 mA, 1초)을 가하여 공포학습을 시켰다. 학습시킨 후 하루 뒤, 마우스에 기억시험을 실시하였으며, 마우스의 네 발이 챔버 내로 모두 들어가는데 걸리는 시간을 300초까지 측정하였다.
수동회피실험을 통한 단기학습과 기억력을 평가한 결과를 도 6에 나타내었따. 실험 첫날 어두운 구역으로 들어가는 시간은 그룹 간의 유의적인 차이가 없었다(도 6a). 실험 둘째 날에 어두운 구역으로 들어가는 지연시간을 측정하였을 때 Sham 그룹(300 s), NC 그룹(300 s), NS 그룹(300 s)에서 그룹 간 차이는 없었다. 반면 PM 그룹(155.17초)에서 유의적으로 감소하였으며, PC 그룹(284.50 s), CF50 그룹 (275.67 s), CF100 그룹(300 s)에서 시간이 증가하여 단기학습에 따른 기억력이 개선된 것을 확인하였다(도 6b).
3.3 Morris 수중 미로 실험
Morris 수중 미로 실험은 반지름 75 cm, 높이 60 cm의 원형 수조에 물을 23 ± 2℃의 온도로 30 cm 높이로 채운 후, 수조를 사분면(N, S, E, W)으로 나누었다. 사분면 중 한 구역(W 구역)에 도피대를 설치한 후 오징어먹물(Cebesa, Valencia, Spain)을 이용하여 수조의 물색과 마우스의 색을 대조되도록 하였다. 실험 첫날에는 도피대 없이 자유롭게 60초간 수영하여 적응훈련을 시켰고, 그 후 나흘 동안 도피대를 수면 아래 1 cm로 놓아 도피대가 보이지 않게 설치한 후 매번 입수하는 위치를 다르게 하였다. 1일 4회씩 4일간 반복 훈련하였으며, 마우스가 60초안에 도피대를 찾을 경우에는 도피대에 15초간 머물게 하였으며, 도피대를 찾지 못할 경우에는 손으로 도피대의 위치를 안내해 주어 도피대에 20초간 머물도록 훈련시켰다. 실험 5일째(probe test)에는 도피대를 제거한 후 W 구역에서 마우스가 머무르는 시간을 90초간 video tracking system (SMART v3.0, Panlab SL, Barcelona, Spain)을 이용하여 기록하였다.
Morris 수중 미로를 통해 장기 기억능력을 평가한 결과를 도 7에 나타내었다. 훈련 4번째 날, Sham 그룹(33.32 s), NC 그룹(37.27 s), NS 그룹(33.85 s)에서 그룹 간 차이는 나타나지 않았다. 반면 PM 그룹(54.82 s)에서 플랫폼을 찾아 올라가는 지연시간은 증가하였으며, PC 그룹(39.66 s), CF50 그룹(39.57 s), CF100 그룹(34.69 s)에서 감소하는 경향을 보였다(도 7a). 훈련 5번째 날 진행한 probe test에서는 Sham 그룹(13.00 s), NC 그룹(13.61 s), NS 그룹(29.61 s)보다 PM 그룹(4.39 s)이 W 구역에 머무르는 시간이 유의적으로 감소하였다. 반면 PC 그룹(22.44 s), CF50 그룹(13.00 s), CF100 그룹(24.78 s)에서는 W 구역에 머무르는 시간이 유의적으로 증가하였다(도 7b). 또한, 마우스가 움직인 경로를 비교해 보았을 때, 장기기억과 학습능력은 PM 그룹보다 PC, CF50, CF100 그룹에서 향상되는 것으로 확인되었다(도 7c).
<실시예 4> 청각 추출물 처리에 따른 뇌 조직 분석
상기 실험 종료 후 마우스를 희생하여 뇌 조직을 채취하여 청각 물 추출물 처리가 뇌 조직에 미치는 영향을 확인하였다.
4.1 초과산화물 제거효소(Superoxide dismutase; SOD) 함량 분석
phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에서 뇌 조직을 균질화하였다(Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). 균질화된 뇌 조직을 4℃에서 10분간 400×g 조건으로 원심분리한 후, 상등액을 제거한 pellet을 SOD 함량 측정에 사용하였다. Pellet과 1×cell extraction buffer[10% SOD buffer, 0.4% (v/v) triton X-100, 200 μM phenylmethane sulfonylfluoride]를 4℃에서 10분간 10,000×g 조건으로 원심분리한 후 상용 SOD kit(Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan)를 사용하여 SOD 함량을 측정하였다.
뇌 조직에서의 SOD 함량을 측정한 결과는 도 8에 나타내었다. 뇌 조직에서 SOD의 함량은 Sham 그룹(10.72 unit/mg of protein), NC 그룹(11.03 unit/mg of protein), NS 그룹(11.34 unit/mg of protein)에서 그룹 간 유의적인 차이는 나타나지 않았으며 뇌 조직에서 SOD의 함량은 PM 그룹(10.23 unit/mg of protein)에서 감소하는 경향을 보였다. 반면 PC 그룹(11.14 unit/mg of protein), CF50 그룹(11.21 unit/mg of protein), CF100 그룹(11.01 unit/mg of protein)에서는 SOD 함량이 증가하는 것으로 확인되었다.
4.2 초미세먼지 (PM2.5)에 노출된 마우스 뇌 조직 지질과산화 억제효과
phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에서 뇌 조직을 균질화하였다(Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). 균질화된 뇌 조직을 5,000 rpm 및 4℃에서 10분간 400×g 조건으로 원심분리한 후, 상등액을 95℃ 항온수조에서 1% phosphoric acid 및 0.67% TBA와 함께 1시간 반응시켰다. 반응물을 600 × g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
뇌 조직에서의 MDA 함량을 측정한 결과를 도 9에 나타내었다. 뇌 조직에서 MDA 함량은 Sham 그룹(0.50 nmole/mg of protein), NC 그룹(0.50 nmole/mg of protein), NS 그룹(0.55 nmole/mg of protein)에서 그룹 간 유의적인 차이가 없었으며, PM 그룹(0.63 nmole/mg of protein)에서 MDA 함량은 유의적으로 증가하였다. 반면 PC 그룹(0.40 nmole/mg of protein), CF50 그룹(0.45 nmole/mg of protein), CF100 그룹(0.45 nmole/mg of protein)에서는 MDA 함량이 효과적으로 감소하였다.
4.3 환원형 글루타치온(Reduced glutathione; GSH) 함량 분석
phosphate buffer(pH 6.0)에서 뇌 조직을 균질화하였다. 균질화된 뇌 조직을 10,000×g 조건에서 15분 동안 원심분리 후 상등액을 회수하였다. 상등액을 5%　metaphosphoric acid와 반응시킨 후 2,000×g에서 원심분리하고, 상등액을 M tris-HCl(pH 7.8), 0.65 N NaOH 및 1 mg/mL의 o-phthaldialdehyde와 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 이 후, fluorescence microplate reader(Infinite 200, Tecan Co., Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 들뜸 파장 320 nm, 방출 파장 420 nm에서 형광 광도를 측정하였다.
뇌 조직에서의 reduced glutathione (GSH) 함량을 측정한 결과를 도 10에 나타내었다. 뇌 조직에서 reduced GSH의 함량은 Sham 그룹(101.97%), NC 그룹(100%), NS 그룹(98.86%)으로 나타났으며 그룹 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 반면 뇌 조직에서 reduced GSH의 함량은 PM 그룹(83.19%)은 NC 그룹(100%)보다 감소하였으며, PC 그룹(92.52%), CF50 그룹(87.13%), CF100 그룹(100.52%)에서는 PM 그룹에 비해 reduced GSH 함량이 개선된 것을 확인하였다.
4.4 아세틸콜린(Acetylcholine; ACh) 함량 분석
뇌 조직 중량 대비 10배의 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)으로 균질화한 후 4℃, 12,000×g 조건에서 30분간 원심분리하였다. 상등액을 0.1 M HCl과 3.5 N NaOH를 포함하는 hydroxylamine 시약과 혼합하여 상온에서 1분간 반응시켰다. 반응시킨 후 0.5 N NaOH과 0.3 M ferric chloride를 첨가하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
뇌 조직의 ACh 함량을 측정한 결과는 도 11a에 나타내었다. 뇌 조직에서 ACh 함량은 Sham 그룹(2.35 mmole/mg of protein), NC 그룹(2.56 mmole/mg of protein) NS 그룹(2.56 mmole/mg of protein)에서 유의적인 차이가 나지 않았다. 반면 PM 그룹(1.78 mmole/mg of protein)에서 유의적으로 감소한 ACh 함량을 나타내었으며 PC 그룹(2.60 mmole/mg of protein), CF50 그룹(1.75 mmole/mg of protein) CF100 그룹 (2.02 mmole/mg of protein)에서는 ACh 함량이 증가하는 경향을 나타내었다.
4.5 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholine esterase; AChE) 활성 분석
ACh 함량 분석에 사용된 상등액을 50 mM phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)과 37℃에서 10분간 반응시켰다. 이후 Ellman’s reaction mixture를 첨가한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 AChE 활성을 측정하였다.
뇌 조직의 AChE 활성을 측정한 결과를 도 11b에 나타내었다. Sham 그룹(102.05%), NC 그룹(100%), NS 그룹(100.06%)에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 반면 PM 그룹(125.87%)에서 AChE 활성이 증가하였으며, PC 그룹(85.41%), CF50 그룹(85.80%), CF100 그룹(90.38%)에서 AChE 활성이 감소하는 것으로 확인되었다.
4.6 미토콘드리아 내 ROS 생성 함량 분석
뇌 조직을 1 mM EGTA가 포함된 미토콘드리아 추출 용액(215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES sodium salt, pH 7.2) 10배 부피를 사용하여 균질화하였다. 균질화된 용액을 4℃ 및 1,300×g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 추가로 4℃ 및 13,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후 pellet을 0.1% digitonin을 포함하는 미토콘드리아 추출 buffer와 혼합하였다. 5분 후, 혼합물을 1 mM EGTA가 포함된 미토콘드리아 추출 buffer와 반응시키고 4℃ 및 13,000×g에서 15분간 원심분리하였다.
분리된 미토콘드리아를 25 μM DCF-DA를 포함하는 KCl-based respiration buffer [125 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate monobabic, 20 mM HEPES, 1 mM magnesium chloride, 500 μM EGTA, 2.5 mM malate and 5 mM pyruvate]와 20분간 반응시켰다. DCF 형광은 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.)을 사용하여 485 nm에서 들뜸 파장을, 530 nm에서 방출 파장을 측정하였다.
뇌 조직의 미토콘드리아 유래 ROS 함량을 도 12에 나타내었다. 뇌 조직에서 미토콘드리아 ROS 함량은 Sham 그룹(94.17%), NC 그룹(100%), NS 그룹(111.93%)에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 반면 PM 그룹(223.12%)에서 유의적으로 증가하였으며, PC 그룹(95.18%), CF50 그룹(72.85%), CF100 그룹(73.46%)에서 ROS 함량이 유의적으로 감소하였다.
4.7 미토콘드리아 내 mitochondrial membrane potential(MMP) 분석
5 mM pyruvate 및 5 mM malate를 포함하는 미토콘드리아 추출 버퍼와, 분리된 미토콘드리아를 96 well black plate에서 1 μM JC-1과 반응시켰다. 혼합물을 20분간 암실 조건에서 배양한 후 fluorescence microplate reader(Infinite 200, Tecan Co.)를 사용하여 530 nm에서 들뜸 파장을, 590 nm에서 방출 파장을 측정하였다.
뇌 조직의 미토콘드리아 막 전위를 도 13에 나타내었다. Sham 그룹(119.16%), NC 그룹(100%), NS 그룹(103.35%)에서 그룹 간 유의적인 차이가 나지 않았으며, PM 그룹(77.15%)에서 유의적으로 감소하였다. 반면 PC 그룹(129.77%), CF50 그룹(63.99%), CF100 그룹(77.35%)에서는 미토콘드리아 막 전위가 증가하는 것으로 확인되었다.
4.8 세포 사멸 및 염증 관련 단백질 발현 확인(Western blot)
뇌 조직을 1%의 PI를 포함하는 추출 용액(GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)과 함께 균질화시킨 후 4℃, 13,000×g 조건에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 조직의 단백질을 SDS-PAGE gel로 분리하였으며 PVDF membrane으로 transfer 하였다. Transfer된 membrane을 4℃에서 1차 항체와 12시간 반응시키고, 2차 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이렇게 생성된 항체 복합체는 ECL 용액으로 반응시켜 발색시켰으며, ChemiDoc(ibrightTM CL1000 instrument, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 검출하였다. 검출된 단백질의 밀도는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 사용하여 계산되었다.
뇌 조직에서 세포 사멸 경로 및 염증과 관련된 단백질 발현을 도 14에 나타내었으며 단백질 발현량을 측정한 band image는 도 14a와 같다. β-actin은 단백질의 발현량을 환산하기 위한 지표 단백질이다. 미세먼지에 노출될 경우, p-JNK와 COX-2의 발현이 증가하고, BCl-2의 발현이 감소한다. 실험 결과, p-JNK와 COX-2의 PM 그룹(120.80%, 145.32%)에서의 함량은 NC 그룹(100%)에 비해 증가하였으며, CF100 그룹(97.11%, 99.59%)에서 감소하였다(도 14b, 도 14d). 또한, BCl-2 함량은 PM 그룹(69.30%)에서 NC 그룹(100%)에 비해 감소하였으며, CF 100 그룹(112.37%)에서 발현이 증가하였다(도 14c).
<실시예 5> 청각 추출물 처리에 따른 폐 조직 분석
상기 실험 종료 후 마우스를 희생하여 폐 조직을 채취하여 청각 물 추출물 처리가 폐 조직에 미치는 영향을 확인하였다.
5.1 초과산화물 제거효소(Superoxide dismutase; SOD) 함량 분석
phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에서 폐 조직을 균질화하였다(Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). 균질화된 폐 조직을 4℃에서 10분간 400×g 조건으로 원심분리한 후, 상등액을 제거한 pellet을 SOD 함량 측정에 사용하였다. Pellet과 1×cell extraction buffer[10% SOD buffer, 0.4% (v/v) triton X-100, 200 μM phenylmethane sulfonylfluoride]를 4℃에서 10분간 10,000×g 조건으로 원심분리한 후 상용 SOD kit(Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan)를 사용하여 SOD 함량을 측정하였다.
폐 조직에서의 SOD 함량을 측정한 결과는 도 15에 나타내었다. 폐 조직에서 SOD의 함량은 Sham 그룹(7.62 unit/mg of protein), NC 그룹(7.81 unit/mg of protein), NS 그룹(6.39 unit/mg of protein)에서 그룹 간 유의적인 차이는 나타나지 않았으며 폐 조직에서 SOD의 함량은 PM 그룹(4.56 unit/mg of protein)에서 감소하는 경향을 보였다. 반면 PC 그룹(7.51 unit/mg of protein), CF50 그룹(7.59 unit/mg of protein), CF100 그룹(9.08 unit/mg of protein)에서는 SOD 함량이 증가하는 것으로 확인되었다.
5.2 초미세먼지 (PM2.5)에 노출된 마우스 폐 조직 지질과산화 억제효과
phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4)에서 폐 조직을 균질화하였다(Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). 균질화된 폐 조직을 5,000 rpm 및 4℃에서 10분간 400×g 조건으로 원심분리한 후, 상등액을 95℃ 항온수조에서 1% phosphoric acid 및 0.67% TBA와 함께 1시간 반응시켰다. 반응물을 600×g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하고 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
폐 조직에서의 MDA 함량을 측정한 결과를 도 16에 나타내었다. 폐 조직에서 MDA 함량은 Sham 그룹(0.03 nmole/mg of protein), NC 그룹(0.30 nmole/mg of protein), NS 그룹(0.04 nmole/mg of protein)에서 그룹 간 유의적인 차이가 없었으며, PM 그룹(0.10 nmole/mg of protein)에서 MDA 함량은 유의적으로 증가하였다. 반면 PC 그룹(0.07 nmole/mg of protein), CF50 그룹(0.07 nmole/mg of protein), CF100 그룹(0.06 nmole/mg of protein)에서는 MDA 함량이 효과적으로 감소하였다.
5.3 환원형 글루타치온(Reduced glutathione; GSH) 함량 분석
phosphate buffer(pH 6.0)에서 폐 조직을 균질화하였다(Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA). 균질화된 폐 조직을 10,000×g 조건에서 15분 동안 원심분리 후 상등액을 회수하였다. 상등액을 5%　metaphosphoric acid와 반응시킨 후 2,000×g에서 원심분리하고, 상등액을 M tris-HCl(pH 7.8), 0.65 N NaOH 및 1 mg/mL의 o-phthaldialdehyde와 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 이 후, fluorescence microplate reader(Infinite 200, Tecan Co., Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 들뜸 파장 320 nm, 방출 파장 420 nm에서 형광 광도를 측정하였다.
폐 조직에서의 reduced glutathione (GSH) 함량을 측정한 결과를 도 17에 나타내었다. 폐 조직에서 reduced GSH의 함량은 Sham 그룹(119.04%), NC 그룹(100%), NS 그룹(97.87%)으로 나타났으며 그룹 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 반면 폐 조직에서 reduced GSH의 함량은 PM 그룹(49.6%)은 NC 그룹(100%)보다 감소하였으며, PC 그룹(89.39%), CF50 그룹(82.24%), CF100 그룹(116.00%)에서는 PM 그룹에 비해 reduced GSH 함량이 개선된 것을 확인하였다.
5.4 미토콘드리아 내 ROS 생성 함량 분석
폐 조직을 1 mM EGTA가 포함된 미토콘드리아 추출 용액(215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES sodium salt, pH 7.2) 10배 부피를 사용하여 균질화하였다. 균질화된 용액을 4℃ 및 1,300×g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 추가로 4℃ 및 13,000×g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 제거한 후 pellet을 0.1% digitonin을 포함하는 미토콘드리아 추출 buffer와 혼합하였다. 5분 후, 혼합물을 1 mM EGTA가 포함된 미토콘드리아 추출 buffer와 반응시키고 4℃ 및 13,000×g에서 15분간 원심분리하였다.
분리된 미토콘드리아를 25 μM DCF-DA를 포함하는 KCl-based respiration buffer [125 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate monobabic, 20 mM HEPES, 1 mM magnesium chloride, 500 μM EGTA, 2.5 mM malate and 5 mM pyruvate]와 20분간 반응시켰다. DCF 형광은 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.)을 사용하여 485 nm에서 들뜸 파장을, 530 nm에서 방출 파장을 측정하였다.
폐 조직의 미토콘드리아 유래 ROS 함량을 도 18에 나타내었다. 폐 직에서 미토콘드리아 ROS 함량은 Sham 그룹(104.30%), NC 그룹(100%), NS 그룹(87.06%)에서 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 반면 PM 그룹(179.70%)에서 유의적으로 증가하였으며, PC 그룹(66.68%), CF50 그룹(87.19%), CF100 그룹(90.52%)에서 ROS 함량이 유의적으로 감소하였다.
5.5 미토콘드리아 내 mitochondrial membrane potential(MMP) 분석
5 mM pyruvate 및 5 mM malate를 포함하는 미토콘드리아 추출 버퍼와, 분리된 미토콘드리아를 96 well black plate에서 1 μM JC-1과 반응시켰다. 혼합물을 20분간 암실 조건에서 배양한 후 fluorescence microplate reader(Infinite 200, Tecan Co.)를 사용하여 530 nm에서 들뜸 파장을, 590 nm에서 방출 파장을 측정하였다.
폐 조직의 미토콘드리아 막 전위를 도 19에 나타내었다. Sham 그룹(103.68%), NC 그룹(100%), NS 그룹(100.88%)에서 그룹 간 유의적인 차이가 나지 않았으며, PM 그룹(83.75%)에서 유의적으로 감소하였다. 반면 PC 그룹(106.92%), CF50 그룹(85.37%), CF100 그룹(86.26%)에서는 미토콘드리아 막 전위가 증가하는 것으로 확인되었다.
<실시예 6> 청각 추출물의 생리활성 물질 분석
수세하여 염을 제거한 후 동결건조시킨 청각에 메탄올을 첨가하여 균질화한 후 원심분리 후 상등액을 취하여 분석에 사용하였다. 상등액은 BEH C18 column (100×2.1 mm, 1.7 μL; Waters, Milford, MA, USA)가 장착되어 있는 ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight / mass spectrometry(UPLC-Q-TOF/MS)를 이용하여 분석을 진행하였다. 컬럼 온도는 40℃, 용매는 0.1% formic acid를 함유한 acetonitrile과 증류수를 사용하였다. 컬럼을 통해 분리된 생리활성 물질을 Q-TOF/MS로 분석하였다. Q-TOF의 분석조건은 positive 조건을 사용하였으며, Capillary 전압은 2.5 kV, sampling cone 전압은 40 V. source 온도는 100℃, desolvation 온도는 400℃, desolvation 유량은 900 L/h 로 설정하였다.
UPLC-Q-TOF/MS 분석 결과, xanthin, 18:1 Lysophosphatidylcholine (LPC), Oleamide, 7,8 7',8'-tetradehydroastaxanthin으로 동정되었다. 분석 결과를 도 20에 나타내었다.
Figure PCTKR2022004199-appb-img-000002
<실시예 7> 청각 추출물의 다당체, 황산염, 수은, 중금속 함량 분석
7.1 다당체 및 황산염 함량 분석
동결건조된 청각 물 추출물을 5%의 페놀과 95% 황산과 혼합한 후 상온에서 20분간 반응시켜 490 nm에서 흡광도를 측정하여 총 다당체 함량을 분석하였으며, 표준 곡선은 glucose를 이용하여 작성되었다.
한편, 동결건조된 청각 물 추출물에 1 M HCl을 첨가하여 105℃에서 5시간 동안 가수분해 시켰다. 이후 4% TCA 용액, 황산바륨-젤라틴 용액과 혼합하여 실온에서 20분간 반응시켜 360 nm에서 흡광도를 측정하여 총 황산염 함량을 분석하였으며. 표준 곡선은 Fe2SO4를 이용하여 작성되었다.
다당체와 황산염 함량 분석 결과를 표 3에 기재하였다.
Figure PCTKR2022004199-appb-img-000003
7.2 중금속 함량 분석
수세하여 염을 제거한 후 동결건조시킨 청각을 수은분석기(DMA-80, Milestone)를 이용하여 산소와 함께 열분해하였다. 열분해를 통해 증기화 된 수은으로 아말감을 형성시킨 후 254 nm에서 흡광도를 측정하여 수은함량을 측정하였다.
수세하여 염을 제거한 후 동결건조시킨 청각을 질산을 이용하여 가수분해시킨 후 주사기 필터(Sterile Acrodisc Syringe Filters with Supor Mebrane Prod. No. 4614, PALL Life Sciences)로 여과하여 정용하였다. 산분해된 시료를 ICP-MS (NexION 350D, PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 중금속 분석하였으며, AsO분석은 Dynamic Reaction Cell (DRC) mode, Cd, Pb분석은 standard mode를 사용하였다.
표 4에 중금속 함량 분석 결과를 기재하였다.
Figure PCTKR2022004199-appb-img-000004
동결건조한 청각에서 Cd는 검출되지 않았으며, Pb는 0.04 mg/kg, Hg는 0.09 μg/kg으로 분석되었다(w/w). 이는 식품 의약품 안전처가 규정하는 중금속 허용 기준치인 Cd: 0.3 mg/kg 이하[김(조미김 포함) 또는 미역(미역귀 포함)], 그리고 Pb: 0.5 mg/kg 이하 [미역(미역귀 포함)]보다 낮은 수치로 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (14)

  1. 청각(Codium fragile) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 청각 추출물은,
    물 또는 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출한 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 유기용매 추출법은,
    30 내지 50% 에탄올을 이용한 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 청각 추출물은,
    초미세먼지(PM2.5)에 의해 유도되는 활성산소의 생성을 억제하는 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 청각 추출물은,
    초미세먼지(PM2.5)에 의해 유도되는 세포독성에 대한 세포 생존율을 증가시키는 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 청각 추출물은,
    초미세먼지(PM2.5)에 의해 유도되는 말론디알데히드(malondialdehyde)의 생성을 억제하는 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 질환은 뇌신경 질환인 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 뇌신경 질환은,
    뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 청각 추출물은,
    공간인지능력 또는 기억능력을 개선하는 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 질환은 호흡기 질환인 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 호흡기 질환은,
    폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 세포손상 보호용 건강기능식품 조성물.
  13. 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2022/004199 2021-03-25 2022-03-25 청각 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 WO2022203440A1 (ko)

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