WO2023136525A1 - 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust containing a matcha extract as an active ingredient. More specifically, it relates to a composition for preventing or treating respiratory diseases, brain nerve diseases, skin diseases, and intestinal diseases caused by ultrafine dust containing matcha extract as an active ingredient.
- the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust containing a matcha extract as an active ingredient, and examples of the inflammatory diseases include respiratory diseases, cranial nerve diseases, skin diseases, and intestinal diseases. .
- Ultrafine dust refers to fine dust with an aerodynamic diameter of 2.5 ⁇ m or less
- secondary air pollutants NO 3 - , SO 4 - , NH4 - , polyacromatichydrocarbon (PAH), quinone, etc.
- PAH polyacromatichydrocarbon
- PM 2.5 is a stronger risk factor than this. It has been reported to work as
- Dust with a diameter of 5 to 10 ⁇ g/m 3 or less can be absorbed into the body through the nasal mucosa, 2 to 5 ⁇ g/m 3 or less passes through the airway (respiratory tract), and 0.1 to 1 ⁇ g/m 3 to alveolar damage. it causes When fine dust is inhaled into the human body, it can be deposited in tissues by various mechanisms such as collision, gravitational sedimentation, diffusion, and electrostatic adsorption, and some circulate throughout the body along the blood.
- matcha a form of powdered green tea
- various physiologically active compounds such as tannins, phenolic acids and catechins in the form of green tea ( Camellia sinensis ) powder.
- EC epicatechin
- ECG epigallocatechin
- ECG epicatechin-3-gallate
- EGCG epigallocatechin-3-gallate
- Matcha catechins have various physiological activities such as anti-inflammatory effects, renal and neuroprotective effects, cholesterol accumulation inhibitory effects, and anti-diabetic effects.
- matcha contains polyphenolic compounds such as chlorogenic acid, gallic acid, quercetin, and kaempferol, and these compounds exhibit cognitive function-improving effects, non-alcoholic fatty liver disease inhibitory effects, and antibacterial effects. Therefore, in this study, matcha green tea was used to verify its protective effect in various cells and animal tissues exposed to ultrafine dust, thereby confirming its potential as a material for preventing or treating inflammatory diseases related to ultrafine dust, and using it as basic data for industrialization. intended to be used as
- respiratory diseases and cranial nerve diseases among inflammatory diseases caused by ultrafine dust containing matcha extract as an active ingredient were verified by verifying the cell protective effect against cytotoxicity generated in lungs, brain nerve cells, skin and intestinal tissues. , to complete a composition for preventing or treating skin diseases and lung diseases.
- an object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust containing a matcha extract as an active ingredient, and more specifically, a matcha extract is used to treat lung, lung, By verifying the cell protective effect against cytotoxicity generated in brain nerve cells, skin and intestinal cells, and suppression of inflammation-related protein expression in lung, brain tissue, skin tissue and intestinal tissue of animal models exposed to ultrafine dust, Among the inflammatory diseases caused by fine dust, the present invention was completed by confirming the preventive and therapeutic efficacy of respiratory diseases, cranial nerve diseases, skin diseases and intestinal diseases.
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, containing matcha extract as an active ingredient.
- the “extract” of the present invention may be characterized in that it is extracted by water or organic solvent extraction, but is not limited thereto.
- "inflammatory diseases caused by ultrafine dust" of the present invention may be characterized in that respiratory diseases, cranial nerve diseases, skin diseases, and intestinal diseases, but are not limited thereto.
- the "composition” of the present invention is ultrafine dust (PM 2.5 ) induced nasal cells (RPMI-2650), lung cells (A549), brain neurons (HT22), skin cells (Primary dermal fibroblast) and intestinal cells (HT29), but may be characterized by an effect of inhibiting the production of intracellular reactive oxygen species (ROS) in any one or more cells, but is not limited thereto.
- ROS reactive oxygen species
- the "composition" of the present invention is ultrafine dust (PM 2.5 ) induced nasal cells (RPMI-2650), lung cells (A549), brain neurons (HT22), skin cells (Primary dermal fibroblast) and intestinal cells (HT29) in any one or more cells may be characterized in that the cell survival rate against cytotoxicity due to ultrafine dust (PM 2.5 ) is increased, but is not limited thereto.
- the "composition" of the present invention increases the measured value of GSH activity in any one or more tissues of ultrafine dust (PM 2.5 ) induced lung tissue, brain tissue, skin tissue, and intestinal tissue. It can be characterized, but is not limited thereto.
- the "composition" of the present invention increases the SOD activity measurement value in any one or more tissues of ultrafine dust (PM 2.5 ) induced lung tissue, brain tissue, skin tissue and intestinal tissue. It can be characterized, but is not limited thereto.
- the "composition” of the present invention increases the MDA content measurement value in any one or more of ultrafine dust (PM 2.5 ) induced lung tissue, brain tissue, skin tissue and intestinal tissue. It can be characterized, but is not limited thereto.
- PM 2.5 ultrafine dust
- the “composition” of the present invention inhibits the expression of TNF- ⁇ , p-JNK, BAX, COX-2, and interleukin-1 ⁇ in a state in which ultrafine dust (PM 2.5 ) is treated.
- the effect can be characterized, but is not limited thereto.
- the present invention is a health functional food composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust containing matcha extract as an active ingredient, wherein the inflammatory disease is any one of respiratory diseases, cranial nerve diseases, skin diseases and intestinal diseases It provides a health functional food composition.
- the present invention is a cosmetic composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust containing matcha extract as an active ingredient, wherein the inflammatory disease is any one of respiratory diseases, cranial nerve diseases, skin diseases and intestinal diseases , It provides a cosmetic composition.
- the present invention is a method for preventing or treating an inflammatory disease caused by ultrafine dust comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject, wherein the inflammatory disease is any one of respiratory disease, cranial nerve disease, skin disease and intestinal disease It provides a preventive or therapeutic method that will be.
- the matcha extract of the present invention is excellent in preventing, improving, or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, and thus a pharmaceutical composition for preventing or treating respiratory diseases, brain nerve diseases, skin diseases, and intestinal diseases caused by ultrafine dust.
- a pharmaceutical composition for preventing or treating respiratory diseases, brain nerve diseases, skin diseases, and intestinal diseases caused by ultrafine dust Health functional food composition for preventing and improving respiratory diseases, brain nerve diseases, skin diseases and intestinal diseases caused by ultrafine dust, or prevention and prevention of respiratory diseases, brain nerve diseases, skin diseases and intestinal diseases caused by ultrafine dust It can be usefully used as a cosmetic composition for improvement.
- ROS reactive oxygen species
- FIG. 2 is a diagram showing the effect of improving intracellular reactive oxygen species (ROS) content in lung cells (A549) induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) of the matcha extract of the present invention.
- ROS reactive oxygen species
- FIG. 3 is TLR4, p-Akt, caspas-3, BCl-2, Nrf2, HO-1 and COX-2 proteins in nasal cells (RPMI-2650) induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) of matcha extract of the present invention It is a diagram showing the effect on expression.
- Figure 4 is a diagram showing the effect of the matcha extract of the present invention on the expression of TNF- ⁇ , TLR4, BCl-2, caspase-3 and COX-2 proteins in lung cells (A549) induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) .
- Figure 5 is a diagram showing the antioxidant system improvement effect [improvement of GSH (A), SOD (B) and MDA (C) activity] in lung tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 6 is a diagram showing the mitochondrial activity improving effect [mitochondrial ROS improvement (A), MMP improvement (B) and mitochondrial ATP improvement (C)] in lung tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention. .
- Figure 7 is TNF- ⁇ , p-JNK, p-I ⁇ B- ⁇ , p-NF- ⁇ B, BAX, Caspase-1, COX-2 in lung tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) matcha extract of the present invention And it is a diagram showing the effect on IL-1 ⁇ protein expression.
- ROS reactive oxygen species
- FIG. 9 is a diagram showing the effects of the matcha extract of the present invention on p-JNK, ChAT, TLR4, p-NF- ⁇ B and IL-1 ⁇ proteins in brain neurons (HT22) induced by ultrafine dust (PM 2.5 ).
- FIG. 10 is a diagram showing the spatial learning and memory ability improvement effect of the matcha extract of the present invention using the Y-maze test.
- FIG. 11 is a diagram showing the short-term learning and memory ability improvement effect of the matcha extract of the present invention using a passive avoidance test.
- FIG. 12 is a diagram showing the long-term learning and memory improvement effects of the matcha extract of the present invention using the Morris water maze experiment.
- FIG. 13 is a diagram showing the antioxidant system improvement effect [improvement of GSH (A), SOD (B) and MDA (C) activity] in brain tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- Figure 14 is a diagram showing the cholinergic system improving effect [ACh content improvement (A), AChE activity inhibition (B)] in brain tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) of the matcha extract of the present invention.
- FIG. 15 is a diagram showing the mitochondrial activity improving effect [mitochondrial ROS improvement (A), MMP improvement (B) and mitochondrial ATP improvement (C)] in brain tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha tea extract of the present invention. .
- FIG. 16 is a diagram showing the effect of improving inflammation and apoptosis in olfactory bulb tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha tea extract of the present invention.
- FIG. 17 is a diagram showing the effect of improving inflammation in hippocampus tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha tea extract of the present invention.
- FIG. 18 is a diagram showing the effect of improving apoptosis in hippocampus tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha tea extract of the present invention.
- FIG. 19 is a diagram showing the effect of improving cholinergic system damage in hippocampus tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 20 is a diagram showing the effect of improving cell viability and intracellular reactive oxygen species (ROS) content against oxidative stress in skin cells induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- ROS reactive oxygen species
- 21 is p-JNK, p-NF- ⁇ B, COX-2, p-AMPK, caspase-3, caspase-1, IL-1 ⁇ in skin cells induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by Matcha extract of the present invention. It is a diagram showing the effect on protein expression.
- FIG. 22 is a diagram showing the effect of improving reduced GSH activity in skin tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 23 is a diagram showing the effect of improving SOD activity in skin tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 24 is a diagram showing the effect of improving the MDA content activity in skin tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- 25 is a diagram showing the effect of improving inflammation and apoptosis in skin tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 26 is a diagram showing the effect of improving cell viability and intracellular reactive oxygen species (ROS) content against oxidative stress in intestinal cells (HT29) induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha tea extract of the present invention.
- ROS reactive oxygen species
- FIG. 27 is a diagram showing the effect of improving MPO activity in intestinal tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 28 is a diagram showing the antioxidant system improvement effect [improvement of GSH (A), SOD (B) and MDA (C) activity] in intestinal tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- 29 is a diagram showing the effect of improving close junctions in intestinal tissue induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- FIG. 30 is a diagram showing the effect of improving inflammation and apoptosis in intestinal tissues induced by ultrafine dust (PM 2.5 ) by the matcha extract of the present invention.
- 31 is a diagram showing the results of identifying microorganisms at the phylum level.
- 32 is a diagram showing the results of identifying microorganisms at the family level.
- 33 is a diagram showing the results of identifying microorganisms at the genus level.
- 34 is a diagram showing the yield and antioxidant activity of matcha extract by extraction time.
- An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising a matcha extract as an active ingredient.
- an object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust, including matcha extract as an active ingredient.
- an object of the present invention is to provide a cosmetic composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust, containing matcha extract as an active ingredient.
- an object of the present invention is to provide a method for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust comprising administering the pharmaceutical composition to a subject. More preferably, furthermore, the present invention aims to provide a method for preventing or treating respiratory diseases, brain nerve diseases, skin diseases and intestinal diseases caused by ultrafine dust comprising administering the pharmaceutical composition to a subject do.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising a matcha extract as an active ingredient.
- the inflammatory disease may be respiratory disease, cranial nerve disease, skin disease, and intestinal disease
- the respiratory disease is any one of pneumonia, asthma, chronic bronchitis, pneumoconiosis, tuberculosis, emphysema, chronic obstructive pulmonary disease, and cystic fibrosis.
- the cranial nerve disease may be any one of stroke, Alzheimer's disease, dementia, and Parkinson's disease
- the skin disease may be any one of dermatitis, atopic dermatitis, acne, athlete's foot, psoriasis, eczema, or rosacea.
- It may be one
- the intestinal disease may be any one of ulcerative colitis, Crohn's disease, intestinal Behçet's disease, bleeding rectal ulcer, intestinal lesions, and cosmetic pouchitis.
- the extract according to the present invention may be obtained by extraction and separation from nature using an extraction and separation method known in the art, and the "extract" defined in the present invention is extracted from matcha using an appropriate solvent, For example, a crude extract, a polar solvent-soluble extract, or a non-polar solvent-soluble extract are all included.
- a suitable solvent for extracting the extract from the matcha any organic solvent acceptable for food science/pharmaceutical/cosmetics may be used, and water or an organic solvent may be used, but is not limited thereto.
- Purified water alcohol having 1 to 4 carbon atoms including methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, etc., acetone, ether, benzene ), various solvents such as chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, hexane and cyclohexane may be used alone or in combination.
- an extraction method any one of methods such as hot water extraction, cold brew extraction, reflux cooling extraction, solvent extraction, steam distillation, ultrasonic extraction, elution, and compression may be selected and used.
- the desired extract may be additionally subjected to a conventional fractionation process or may be purified using a conventional purification method.
- the extract included in the composition of the present invention can be prepared in a powder state by additional processes such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying of the primary extract extracted by the above-described hot water extraction or solvent extraction method.
- a fraction further purified from the primary extract using various chromatography methods such as silica gel column chromatography, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography you can also get Therefore, in the present invention, the extract is a concept that includes all extracts, fractions, and purified products obtained in each step of extraction, fractionation, or purification, and dilutions, concentrates, or dried products thereof.
- the pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant in addition to the active ingredient. Any of the adjuvants known in the art may be used without limitation.
- the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared in the form of incorporating the active ingredient into a pharmaceutically acceptable carrier.
- the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
- Pharmaceutically acceptable carriers usable in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin , calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. there is.
- Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations contain at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and gelatin in addition to active ingredients. It can be prepared by mixing etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
- Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
- compositions for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories.
- Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
- a base for suppositories witepsol, tween 61, cacao paper, laurin paper, glycerogelatin, and the like may be used.
- composition according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration are contemplated, eg oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
- the pharmaceutical composition may be formulated into various oral or parenteral dosage forms.
- Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard and soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, etc. chlorose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants such as silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts thereof and/or polyethylene glycol.
- the tablet may contain a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and in some cases starch, agar, alginic acid or a disintegrant or effervescent mixture, such as its sodium salt, and/or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
- a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and in some cases starch, agar, alginic acid or a disintegrant or effervescent mixture, such as its sodium salt, and/or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
- the formulation may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
- a typical formulation for parenteral administration is an injection formulation, and water, Ringer's solution, isotonic physiological saline or suspension may be used as a solvent for the injection formulation.
- Sterile fixed oils of the above injectable preparations may be used as a solvent or suspending medium, and any bland fixed oil may be used for this purpose, including mono- and di-glycerides.
- the formulation for injection may use a fatty acid such as oleic acid.
- the present invention relates to a method for preventing or treating inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising administering the pharmaceutical composition to a subject.
- the term "subject” refers to a subject requiring a method for preventing, controlling, or treating a disease, and may be used without limitation, such as humans, dogs, monkeys, cats, rodents, such as mice and genetically engineered mice. . More specifically, it refers to mammals such as humans or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cows.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
- the term "therapeutically effective amount” refers to an amount of a pharmaceutically acceptable salt of a composition effective for preventing or treating a target disease
- a therapeutically effective amount of the composition of the present invention may include several factors, such as For example, it may vary depending on the administration method, the target site, the condition of the patient, and the like. Therefore, when used in the human body, the dosage should be determined in an appropriate amount considering both safety and efficiency. It is also possible to estimate the amount to be used in humans from the effective amount determined through animal experiments. These considerations in determining effective amounts are discussed, for example, in Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; and E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.
- the term "therapeutically effective amount” means an amount that is sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and does not cause side effects, and the effective dose level is the patient's health
- the condition, type of disease, severity, activity of the drug, sensitivity to the drug, method of administration, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrently, and other factors well known in the medical field can be determined according to
- the composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or in multiple doses. Considering all of the above factors, it is important to administer the amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
- the present invention relates to a health functional food composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising a matcha extract as an active ingredient.
- the health functional food composition of the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, like conventional food compositions, in addition to containing an extract as an active ingredient.
- natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrins, cyclodextrins, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
- natural flavoring agents thaumatin
- stevia extracts eg rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
- synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
- the food composition of the present invention can be formulated in the same way as the pharmaceutical composition and used as a functional food or added to various foods.
- Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes and health supplements, etc. there is
- the food composition includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, in addition to extracts that are active ingredients. , alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, and the like.
- the food composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages, and vegetable beverages.
- the functional food composition of the present invention can be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills and the like.
- 'health functional food composition' refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having useful functionalities for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6727, and the structure and function of the human body It refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients or physiological functions.
- the health functional food of the present invention may contain ordinary food additives, and the suitability as a food additive is determined according to the general rules of the Food Additive Code and General Test Methods approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. It is judged according to the relevant standards and standards.
- Examples of the items listed in the 'Food Additive Code' include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum; and mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
- chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
- natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum
- mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
- a health functional food in the form of a tablet is obtained by granulating a mixture obtained by mixing the active ingredient of the present invention with excipients, binders, disintegrants, and other additives in a conventional manner, and then adding a lubricant or the like to compression molding, or as described above.
- the mixture can be directly compression molded.
- the health functional food in the form of a tablet may contain a flavoring agent and the like as needed.
- hard capsules can be prepared by filling a mixture in which the active ingredient of the present invention is mixed with additives such as excipients in a normal hard capsule. It can be prepared by filling the mixture mixed with gelatin in a capsule base.
- the soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, if necessary.
- the health functional food in the form of a pill can be prepared by molding a mixture in which the active ingredient of the present invention, excipients, binders, disintegrants, etc. are mixed with a conventionally known method, and if necessary, it can be coated with white sugar or other coating agents, Alternatively, the surface may be coated with a material such as starch or talc.
- Health functional food in the form of granules can be prepared in granular form by a conventionally known method of mixing a mixture of excipients, binders, disintegrants, etc. of the active ingredients of the present invention, and if necessary, flavoring agents, flavoring agents, etc. can
- the present invention relates to a cosmetic composition for preventing or improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust, comprising a matcha extract as an active ingredient.
- the “cosmetic composition” of the present invention may be prepared by including a cosmetically effective amount of the extract extracted from matcha of the present invention and a cosmetically acceptable carrier.
- cosmetic effective amount refers to an amount sufficient to achieve the efficacy of improving inflammatory diseases caused by ultrafine dust of the composition of the present invention described above.
- the appearance of the cosmetic composition contains a cosmetic or dermatologically acceptable medium or base.
- a cosmetic or dermatologically acceptable medium or base e.g. solutions, gels, solids, anhydrous pasty products, emulsions obtained by dispersing an oily phase in an aqueous phase, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic forms (liposomes) and It may be provided in the form of a non-ionic follicular dispersant, or in the form of a cream, toner, lotion, powder, ointment, spray or conceal stick.
- These compositions can be prepared according to conventional methods in the art.
- the composition according to the invention can also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
- the cosmetic composition according to an embodiment of the present invention is not particularly limited in its dosage form, for example, softening lotion, astringent lotion, nutrient lotion, nutrient cream, massage cream, essence, eye cream, eye essence, cleansing It can be formulated into cosmetics such as cream, cleansing foam, cleansing water, pack, powder, body lotion, body cream, body oil and body essence.
- the formulation of the cosmetic composition of the present invention is a paste, cream or gel, animal fibers, vegetable fibers, wax, paraffin, starch, tracanth, cellulose derivatives, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc, zinc oxide, etc. this can be used
- lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component, and in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydro propellants such as carbon, propane/butane or dimethyl ether.
- a solvent, solvating agent or emulsifying agent is used as a carrier component, such as water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene fatty acid esters of glycol, 1,3-butylglycol oil, glycerol aliphatic esters, polyethylene glycol or sorbitan.
- a liquid diluent such as water, ethanol or propylene glycol, an ethoxylated isostearyl alcohol, a suspending agent such as polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracanth and the like may be used.
- the formulation of the cosmetic composition of the present invention is surfactant-containing cleansing, as carrier components, aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate , fatty acid amide ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, linolin derivatives, or ethoxylated glycerol fatty acid esters.
- carrier components aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyl taurate, sarcosinate , fatty acid amide ether sulfates, alkylamidobetaines, fatty alcohols,
- the cosmetic composition of the present invention can be applied to skin, lotion, cream, essence, pack, foundation, color cosmetics, sunscreen, two-way cake, face powder, compact, makeup base, skin cover, eye shadow, lipstick, lip gloss, lip fix, eyebrow pencil , It can be applied to cosmetics such as lotion and detergents such as shampoo and soap.
- the cosmetic composition according to an embodiment of the present invention may further include functional additives and components included in general cosmetic compositions in addition to the extract extracted from matcha.
- the functional additive may include a component selected from the group consisting of water-soluble vitamins, oil-soluble vitamins, high-molecular peptides, high-molecular polysaccharides, sphingolipids, and seaweed extracts.
- the cosmetic composition of the present invention may further contain components included in general cosmetic compositions as needed.
- Ingredients other than those included include fats and oils, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, bactericides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, pigments, fragrances, blood circulation accelerators, cooling agents, antiperspirants, purified water and the like.
- matcha tea used in this experiment was grown in shade for 3 weeks immediately before harvest, and the grown green tea was heated at 250 ° C for less than 1 minute and rapidly cooled (900K-1; Kawasaki Tea Machinery, Kakegawa, Japan).
- Matcha was prepared using a millstone bead mill (rotation speed 50-55 rpm, particle diameter 13-14 ⁇ m) (Kawasaki Tea Machinery), and matcha was freeze-dried at -80 ° C (Operon, Gimpo, Korea).
- matcha extract 2 g of freeze-dried matcha was extracted by reflux cooling in distilled water at 40° C. for 2 hours, and then lyophilized and used in the experiment.
- Nasal cells used in this experiment were purchased from the Korea Cell Line Bank (Seoul, Korea), 10% fetal bovine serum (FBS), 50 unit/mL penicillin and 100 ⁇ g/mL streptomycin.
- Nasal cells RPMI2650
- lung cells A549)
- brain nerve cells HT22
- skin cells primary dermal fibroblast
- enterocytes HT29
- the sample was treated by exchanging it with a medium containing 0.5% FBS, and after 30 minutes, ultrafine dust (PM 2.5 ) was treated and cultured for 24 hours.
- DCF-DA ultrafine dust
- cells were lysed in DMSO and analyzed at 570 nm in a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA).
- Nasal cells RPMI2650
- lung cells A549)
- brain nerve cells HT22
- skin cells primary dermal fibroblast
- enterocytes HT29
- the sample was treated by exchanging it with a medium containing 0.5% FBS, and after 30 minutes, ultrafine dust (PM 2.5 ) was treated and cultured for 24 hours.
- PM 2.5 ultrafine dust
- the cells were dissolved in DMSO and analyzed at 570 nm in a microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA).
- mice Male, 6 weeks old used in this experiment were purchased from Samtako (Osan, Korea). Experimental mice were randomly divided into 4 per cage and housed in standard laboratory conditions of 55% humidity and 22 ⁇ 2 °C. Each group was divided into 6 groups, sham control (Sham) group (chamber exposure-/sample intake-), normal control (NC) group (clean air+/sample intake-), normal+sample (NS) group (clean air+ /sample intake+; 40 mg/kg of body weight), PM 2.5 exposure (PM) group (dust air+/sample intake-), PM 2.5 exposure and sample intake (EM 20) group (dust air+/sample intake+; 20 mg/ kg of body weight), PM 2.5 exposure and sample intake (EM 40) group (dust air+/sample intake+; 40 mg/kg of body weight).
- lungs, cranial nerves, skin, Intestinal tissue was homogenized.
- GSH reduced glutathione
- lung, cranial nerve, skin, and intestinal tissues were homogenized in phosphate buffer (pH 6.0) using a bullet blender (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA).
- GSH reduced glutathione
- tissue homogenized in phosphate buffer was centrifuged at 10,000 ⁇ g at 4°C for 15 minutes, and the supernatant was used for analysis.
- the supernatant was reacted with 5% metaphosphoric acid and centrifuged at 2,000 ⁇ g.
- the supernatant was reacted with 0.26 M tris-HCl (pH 7.8), 0.65 N NaOH and 1 mg/mL of o-phthaldialdehyde at room temperature for 15 minutes.
- Fluorescence intensities were then measured at wavelengths of 320 nm (excitation) and 420 nm (emission) using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co., Mannedorf, Switzerland).
- the tissue homogenized in PBS was centrifuged at 400 ⁇ g for 10 minutes at 4° C., and the pellet was used for SOD analysis.
- 1 ⁇ cell extraction buffer [10% SOD buffer, 0.4% (v/v) triton X-100, and 200 ⁇ M phenylmethane sulfonylfluoride] and the pellet was centrifuged at 10,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 °C.
- SOD content was measured using a commercial SOD kit (Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan).
- the homogenized tissue in PBS was centrifuged at 5,000 rpm for 10 minutes at 4°C.
- the supernatant was incubated for 1 hour with 1% phosphoric acid and 0.67% TBA in a 95°C water bath.
- the reaction was spun at 600 ⁇ g for 10 minutes and the supernatant was measured at 532 nm.
- Lung and brain tissues were homogenized in 10-fold volume of mitochondrial isolation (MI) buffer (215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES sodium salt, pH 7.2) containing 1 mM EGTA.
- MI mitochondrial isolation
- the homogenate was centrifuged at 1,300 ⁇ g at 4 °C for 10 minutes, and the supernatant was centrifuged again at 4 °C and 13,000 ⁇ g for 10 minutes.
- Mitochondrial pellet was mixed with MI buffer containing 0.1% digitonin. After 5 minutes, the mixture was reacted with MI buffer containing 1 mM EGTA and centrifuged at 13,000 ⁇ g for 15 minutes at 4°C.
- the isolated mitochondria were prepared in KCl-based respiration buffer [125 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate monobabic, 20 mM HEPES, 1 mM magnesium chloride, 500 ⁇ M EGTA, 2.5 mM malate and 5 mM pyruvate] and 25 ⁇ M DCF-DA and 20 reacted for minutes.
- DCF fluorescence was measured at 485 nm (excitation) and 530 nm (emission) using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.).
- MI buffer containing 5 mM pyruvate and 5 mM malate and isolated mitochondria were reacted with 1 ⁇ M JC-1 in a black 96 well plate. After incubating the mixture at room temperature for 20 minutes in the dark, fluorescence was measured at 530 nm (excitation) and 590 nm (emission) using a fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.).
- ATP content was measured using the ATP bioluminescence assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) according to the manufacturer's protocol.
- the ATP content of the extracted mitochondria was measured using the value of luciferin oxidized when catalyzed by luciferasse, and the ATP content was calculated according to a standard curve performed in the same way.
- the tissue was homogenized for 10 minutes in an extraction solution (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea) containing 1% PI. After centrifugation at 13,000 ⁇ g at 4°C for 10 minutes, the supernatant was used for protein analysis. Proteins were separated by SDS-PAGE gel and transferred to PVDF membrane. The membrane was reacted with the primary antibody at 4°C, and reacted with the secondary antibody at room temperature for 1 hour. Immune complexes were detected using a Western blot imager (iBright Imager, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) and protein densities were calculated using ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).
- Example 1 Preventing and treating respiratory diseases caused by ultrafine dust (PM 2.5 ) of matcha extract
- the PM 2.5 treatment group had a 47.82% decrease in cell viability
- the vitamin C (200 ⁇ M) treatment group had a 51.92% decrease in cell viability (FIG. 1a).
- the viability of cells administered with the matcha extract at 200 ⁇ g/mL concentration was 83.65%, and at the concentration of 100 ⁇ g/mL it was 89.17%, showing excellent cell viability.
- the PM 2.5 treatment group had a 74.97% decrease in cell viability
- the vitamin C (200 ⁇ M) treatment group had a 87.69% decrease in cell viability (FIG. 2a).
- the viability of the cells administered with the matcha extract at 200 ⁇ g/mL concentration was 131.86%, and at the concentration of 100 ⁇ g/mL it was 112.86%, showing excellent cell viability.
- FIG. 3 The results of measuring the activity of reduced GSH in lung tissue are shown in FIG. 3 .
- Reduced GSH activity (75.51%) in the lung tissue of the PM group was significantly reduced compared to that of the NC group (100%).
- the EM group (EM20, 77.09%; EM40, 89.86%) showed improved reduced GSH activity than the PM group.
- the results of measuring SOD activity in lung tissue are shown in FIG. 4 .
- the SOD activity (29.52%) of the lung tissue of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (39.82%).
- the EM group (EM20, 37.53%; EM40, 41.65%) showed improved SOD activity than the PM group.
- MDA content (8.11 mmole/mg of protein) in the lung tissue of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (3.91 mmole/mg of protein).
- the EM group (EM20, 6.11 mmole/mg of protein; EM40, 5.01 mmole/mg of protein) showed an improved MDA content compared to the PM group.
- Matcha extract improves mitochondrial activity in ultrafine dust ( PM 2.5 ) induced lung tissue
- Mitochondrial ROS levels in lung tissue are shown in Figure 6a.
- the mitochondrial ROS content (181.28%) of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (100.00%).
- the EM group (184.92%, 132.29%) improved significantly more than the PM group.
- MMP levels in lung tissue are shown in Figure 6b.
- the MMP level in the PM group (78.69%) was significantly decreased compared to the NC group (100.00%).
- the EM group (77.47%, 102.53%) improved significantly more than the PM group.
- the ATP content of lung tissue is shown in Fig. 6c.
- the ATP content (211.83 nmole/mg of protein) of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (297.27 nmole/mg of protein).
- the EM group (231.63 nmole/mg of protein, 286.00 nmole/mg of protein) was significantly improved than the PM group.
- Matcha extract improves inflammation and apoptosis in ultrafine dust ( PM 2.5 )-induced lung tissue
- TNF- ⁇ (198.75%), p-JNK (139.54%), p-I ⁇ B- ⁇ (117.82%), p-NF- ⁇ B (148.01%), BAX (134.84%), Cas in lung tissue of PM group Expression levels of -1 (167.50%), COX-2 (183.80%), and IL-1 ⁇ (114.38%) were significantly increased compared to the NC group (100%).
- the protein expression of the EM 40 group was significantly higher in TNF- ⁇ (170.33%), p-JNK (92.30%), p-I ⁇ B- ⁇ (66.18%), p-NF- ⁇ B (76.26%), and BAX (86.87%). %), Cas-1 (98.94%), COX-2 (99.91%), and IL-1 ⁇ (100.87%) expressions were significantly improved.
- Example 2 Preventing and treating brain nerve disease caused by ultrafine dust (PM 2.5 ) of matcha extract
- the PM 2.5 treatment group had a 53.63% decrease in cell viability
- the vitamin C (200 ⁇ M) treatment group had a 53.33% decrease in cell viability (FIG. 8a).
- the viability of cells administered with matcha extract at 200 ⁇ g/mL concentration was 86.55%, and at 100 ⁇ g/mL concentration, it was 73.57%, showing excellent cell viability.
- the ROS content increased in the PM 2.5 treated group (425.84%), and the ROS content decreased in the vitamin C treated group (200 ⁇ M) treated group (56.25%) (FIG. 8b).
- matcha extract The ROS content in cells administered with matcha extract was 60.58% at 200 ⁇ g/mL and 58.06% at 100 ⁇ g/mL, showing excellent ROS inhibitory activity. Through in vitro evaluation, it was confirmed that matcha extract has an excellent protective effect against toxicity induced by PM 2.5 .
- Protein expression in HT22 cells related to the inflammatory and apoptotic pathways induced by PM 2.5 is shown in FIG. 9 .
- the expression levels of p-JNK (168.78%), TLR4 (170.95%), p-NF- ⁇ B (113.94%), and IL-1 ⁇ (147.03%) in HT22 cells of the PM 2.5 treatment group were compared to those of the control group (100%). significantly increased compared to Compared to the PM 2.5 treatment group, the protein expression of cells administered with matcha extract at a concentration of 20 ⁇ g/mL was p-JNK (118.79%), TLR4 (82.07%), p-NF- ⁇ B (58.80%), IL-1 ⁇ ( 52.21%) expression was significantly improved.
- the Y-maze was composed of 33 (length) cm ⁇ 15 (height) cm ⁇ 10 (width) cm, and the mouse was placed at the end of the designated arm and allowed to move freely on the arm for 8 minutes. Migration and route tracking were recorded using a video system (Smart 3.0, Panlab, Barcelona, Spain).
- the chamber used in the passive avoidance experiment is divided into a lighting part that can give electrical stimulation and a non-lighting part.
- the mouse was placed in a lighted area, and when all four feet of the mouse entered the dark room, an electric shock was applied at 0.5 mA for 3 seconds, and the avoidance time was measured. After 24 hours, the time to enter the darkroom was remeasured.
- the pool used in the underwater maze experiment consisted of a circular water tank (90 (diameter) cm ⁇ 30 (depth) cm) and was randomly divided into 4 areas: N, S, E, and W.
- N the number of areas in the water surface
- S the number of areas in the water surface
- E the number of areas in the water surface
- W the number of areas in the water surface
- a submerged platform was placed under the water surface, and the mouse was allowed to swim freely, and the movement of the mouse was recorded using a video system (Smart 3.0, Panlab).
- the test was performed without a platform and the retention time in the W region was measured.
- FIG. 13a The results of measuring reduced GSH activity in brain tissue are shown in FIG. 13a. Reduced GSH activity (82.09%) in brain tissue of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (100%). On the other hand, the EM group (EM20, 100.88%; EM40, 105.97%) showed improved reduced GSH activity than the PM group.
- FIG. 13B The results of measuring SOD activity in brain tissue are shown in FIG. 13B.
- the SOD activity (54.79%) of the brain tissue of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (64.45%).
- the EM group (EM20, 60.79%; EM40, 61.96%) showed improved SOD activity than the PM group.
- FIG. 13c The results of measuring the MDA content of brain tissue are shown in FIG. 13c.
- the MDA content (15.23 mmole/mg of protein) in the brain tissue of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (10.22 mmole/mg of protein).
- the EM group (EM20, 13.08 mmole/mg of protein; EM40, 8.09 mmole/mg of protein) showed an improved MDA content compared to the PM group. Therefore, it was confirmed that the intake of matcha extract has an excellent protective effect on the antioxidant system in brain tissue against chronically induced ultrafine dust toxicity.
- the brain homogenate homogenized in PBS was centrifuged at 14,000 ⁇ g at 4° C. for 30 minutes, and the supernatant was used for analysis. After mixing the supernatant with alkaline alkaline hydroxylamine reagent [2 M hydroxylamine hydrochloride, 3.5 N sodium hydroxide, 1:1 (v/v)] and allowing to stand at room temperature for 1 minute, 0.5 N hydrochloride and 0.3 M iron (III) chloride hexahydrate were mixed. added. Absorbance was measured at a wavelength of 540 nm using a microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA).
- acetylcholinesterase (AChE) activity To measure acetylcholinesterase (AChE) activity, the supernatant was left in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) at 37°C for 15 minutes, and then Ellman's reaction mixture was mixed at 37°C for 10 minutes. Absorbance was measured at a wavelength of 405 nm using a microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments Inc.).
- the results of measuring the ACh content in brain tissue are shown in FIG. 14a.
- the ACh content (2.15 mmole/mg of protein) of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (5.15 mmole/mg of protein).
- the EM group (4.00 mmole/mg of protein, 5.11 mmole/mg of protein) increased significantly more than the PM group.
- FIG. 14B The results of measuring AChE activity in brain tissue are shown in FIG. 14B.
- AChE activity in the PM group (129.55%) was significantly increased compared to the NC group (100.00%).
- the EM group (118.22%, 105.12%) improved significantly more than the PM group. Therefore, it was confirmed that the intake of matcha extract has an excellent protective effect on the cholinergic system by reducing the ACh content in brain tissue and inhibiting the activity of AChE against chronically induced ultrafine dust toxicity.
- Mitochondrial ROS levels in brain tissue are shown in FIG. 15A.
- the mitochondrial ROS content (163.02%) of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (100.00%).
- the EM group 99.33%, 99.33%) improved significantly more than the PM group.
- MMP levels are as shown in FIG. 15B.
- the MMP level in the PM group (66.00%) was significantly decreased compared to the NC group (100.00%).
- the EM group 108.72%, 139.35%) improved significantly more than the PM group.
- the ATP content of brain tissue is shown in FIG. 15C.
- the ATP content (616.77 nmole/mg of protein) of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (1,384.75 nmole/mg of protein).
- the EM group (704.89 nmole/nmole/mg of protein, 1,058.34 nmole/mg of protein) was significantly improved than the PM group. Therefore, it was confirmed that the intake of matcha extract has an excellent protective effect through the function protection of mitochondria that supplies energy to nerve cells in brain tissue against chronically induced ultrafine dust toxicity.
- FIG. 16 Expression of olfactory bulb proteins associated with inflammatory and apoptotic pathways is shown in FIG. 16 .
- the expression of p-JNK (84.84%), p-I ⁇ B- ⁇ (98.72%), Cas-1 (89.61%), and COX-2 (121.64%) were significantly higher than those in the PM group. Improved.
- the intake of matcha extract has an excellent protective effect through the evaluation of the mechanism of inhibiting olfactory nerve damage, an early symptom of Alzheimer's disease, by verifying the protective effect of the olfactory bulb tissue against chronically induced ultrafine dust toxicity. confirmed that
- the expression of hippocampus proteins related to inflammation is shown in FIG. 17 .
- the expression levels of p-JNK (128.15%), p-I ⁇ B- ⁇ (129.03%), and TNF- ⁇ (140.21%) in the hippocampus tissue of the PM group were significantly increased compared to the NC group (100%).
- the expression of p-JNK (120.80.34%), p-I ⁇ B- ⁇ (119.80%), and TNF- ⁇ (112.48%) were significantly improved compared to the PM group. Therefore, it was confirmed that the intake of matcha extract inhibits cognitive decline by having an excellent protective effect by improving the inflammatory response in hippocampus tissue related to cognitive function against chronically induced ultrafine dust toxicity.
- FIG. 18 Expression of hippocampus proteins related to neuronal cytotoxicity signal transduction is shown in FIG. 18 .
- the expression levels of BAX (126.34%), APP (102.83%), A ⁇ (195.51%), and p-tau (116.87%) in the hippocampus tissues of the PM group were significantly increased compared to the NC group (100%).
- BAX (61.55%), APP (89.72%), A ⁇ (157.37%), and p-tau (86.79%) were significantly improved compared to the PM group.
- the expression level of BCl-2 (78.51%) in the PM group was significantly decreased compared to the NC group (100%).
- the expression of BCl-2 (84.87%) was significantly improved compared to the PM group. Therefore, it was confirmed that the intake of matcha extract inhibits cognitive decline by having an excellent protective effect through the evaluation of the mechanism of cell death inhibition in hippocampus tissue related to cognitive function against chronically induced ultrafine dust toxicity.
- FIG. 19 Expression of hippocampus proteins related to the cholinergic system is shown in FIG. 19 .
- the expression level of AChE (130.15%) in the hippocampus tissue of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (100%).
- the expression of AChE (111.57%) was significantly improved compared to the PM group.
- the expression levels of AChR- ⁇ 3 (74.18%) and ChAT (80.07%) in the PM group were significantly decreased compared to the NC group (100%).
- the expression of AChR- ⁇ 3 (88.17%) and ChAT (91.57%) were significantly improved compared to the PM group. Therefore, it was confirmed that the intake of matcha extract inhibits cognitive decline by having an excellent protective effect through improvement of cholinergic system damage in hippocampus tissue related to cognitive function against chronically induced ultrafine dust toxicity.
- the PM 2.5 treatment group had a 44.45% decrease in cell viability
- the vitamin C (200 ⁇ M) treatment group had a 46.45% decrease in cell viability (FIG. 20a).
- the viability of cells administered with the matcha extract at 200 ⁇ g/mL concentration was 66.19%, and at the concentration of 100 ⁇ g/mL it was 57.18%, showing excellent cell viability.
- the PM 2.5 treatment group (416.85%) increased the ROS content
- the vitamin C treatment group (200 ⁇ M) treatment group decreased the ROS content (69.11%) (FIG. 20B).
- the ROS content in cells administered with matcha extract was 72.26% at 200 ⁇ g/mL concentration and 69.18% at 100 ⁇ g/mL concentration, showing excellent ROS inhibitory activity.
- Protein expression in primary dermal fibroblast cells related to the inflammatory and apoptotic pathways induced by PM 2.5 is shown in FIG. 21 .
- p-JNK 235.87%)
- p-NF- ⁇ B 315.40%
- COX-2 206.77%
- p-AMPK (123.14%
- caspase-3 250.01%) in primary dermal fibroblast cells of PM 2.5 treatment group
- caspase-1 269.11%)
- IL-1 ⁇ (199.34%) expression levels were significantly increased compared to the control group (100%).
- matcha extract Compared to the PM 2.5 treatment group, the protein expression of cells administered with matcha extract at a concentration of 20 ⁇ g/mL was p-JNK (121.87%), p-NF- ⁇ B (114.09%), COX-2 (159.11%), p- Expressions of AMPK (71.51%), caspas-3 (117.33%), caspase-1 (235.28%), and IL-1 ⁇ (34.90%) were significantly improved. Therefore, it was confirmed that matcha extract has an excellent protective effect by evaluating the mechanism of inflammation improvement and cell death in primary dermal fibroblast cells induced by PM 2.5 toxicity.
- the results of measuring SOD activity in skin tissue are shown in FIG. 23 .
- the SOD activity (16.14%) of the skin tissue of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (20.65%).
- the EM group (EM20, 16.91%; EM40, 22.07%) showed improved SOD activity than the PM group.
- the results of measuring the MDA content of skin tissue are shown in FIG. 24.
- the MDA content (3.01 mmole/mg of protein) in the skin tissue of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (2.22 mmole/mg of protein).
- the EM group (EM20, 2.56 mmole/mg of protein; EM40, 1.98 mmole/mg of protein) showed an improved MDA content compared to the PM group.
- Skin protein expression associated with inflammatory and apoptotic pathways is shown in FIG. 25 .
- Levels were significantly increased compared to the NC group (100%).
- the protein expression of the EM 40 group was significantly higher than that of the PM group, including TNF- ⁇ (95.57%), TLR4 (156.64%), TLR2 (157.62%), p-JNK (64.23%), BAX (101.35%), and COX-2 (115.42%). %) expression was significantly improved.
- the PM 2.5 treatment group had a 72.91% decrease in cell viability
- the vitamin C (200 ⁇ M) treatment group had a 74.41% decrease in cell viability (FIG. 26a).
- the viability of cells administered with matcha extract at 200 ⁇ g/mL was 154.61%, and at 100 ⁇ g/mL, 181.91% showed excellent cell viability.
- the PM 2.5 treatment group (375.01%) increased the ROS content
- the vitamin C treatment group (200 ⁇ M) treatment group decreased the ROS content (72.56%) (FIG. 26B).
- the ROS content in cells administered with matcha extract was 69.73% at 200 ⁇ g/mL concentration and 35.09% at 100 ⁇ g/mL concentration, showing excellent ROS inhibitory activity.
- Matcha extract improves Myeloperoxidase (MPO) activity in ultrafine dust ( PM 2.5 ) induced intestinal tissue
- Mouse intestinal tissue was homogenized in 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide (in 20 mM phosphate buffer, pH 6.0) using a bullet blender (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA) to obtain a homogenate, and the obtained homogenate was ultrasonically The supernatant was obtained by centrifugation at 15,000 ⁇ g for 15 minutes. The resulting supernatant was reacted with o-dianisidine dihydrochloride, H 2 O, and potassium phosphate buffer. The absorbance of the reaction solution was measured at a wavelength of 450 nm using a microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments Inc.).
- the results of measuring MPO activity in intestinal tissue are shown in FIG. 27 .
- the MPO activity (0.35 U/mg) of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (0.26 U/mg).
- the EM group (0.30 U/mg, 0.28 U/mg) showed improved MPO activity than the PM group.
- FIG. 28a The results of measuring reduced GSH activity in intestinal tissue are shown in FIG. 28a.
- Reduced GSH activity (88.19%) in intestinal tissue of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (100%).
- the EM group EM20, 99.08%; EM40, 1050.37%) showed improved reduced GSH activity than the PM group.
- the results of measuring SOD activity in intestinal tissue are shown in FIG. 28B.
- the SOD activity (20.64%) of the intestinal tissue of the PM group was significantly decreased compared to that of the NC group (33.65%).
- the EM group (EM20, 25.17%; EM40, 26.46%) showed improved SOD activity than the PM group.
- the results of measuring the MDA content of intestinal tissue are shown in FIG. 28c.
- the MDA content (1.51 mmole/mg of protein) in intestinal tissue of the PM group was significantly increased compared to that of the NC group (1.12 mmole/mg of protein).
- the EM group (EM20, 1.25 mmole/mg of protein; EM40, 1.08 mmole/mg of protein) showed an improved MDA content compared to the PM group.
- Intestinal protein expression related to the tight function protein pathway is shown in FIG. 29 .
- the expression levels of claudin-1 (81.10%) and occludin (78.08%) in intestinal tissue of the PM group were significantly decreased compared to those of the NC group (100%).
- the expression of claudin-1 (98.07%) and occludin (106.48%) were significantly improved compared to the PM group.
- Intestinal protein expression related to intestinal inflammation and apoptosis pathways is shown in FIG. 30 .
- p-JNK 111.57%), Cas-7 (131.87%), Cas-3 (132.05%), BAX (164.51%), Cas-1 (164.81%), TNF- ⁇ (134.84%) in intestinal tissue of PM group %), and the expression level of IL-1 ⁇ (120.33%) was significantly increased compared to the NC group (100%).
- the protein expression of the EM 40 group was p-JNK (88.79%), Cas-7 (112.35%), Cas-3 (113.08%), BAX (130.08%), Cas-1 (140.08%), TNF Expressions of - ⁇ (118.05%) and IL-1 ⁇ (111.80%) were significantly improved.
- NGS next generation sequencing
- concentration of DNA was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) to ensure that an appropriate amount of high-quality genomic DNA was extracted, and 16S rRNA gene amplification by PCR was performed. confirmed through.
- PCR was performed immediately after DNA extraction, and 16S rRNA V3-V4 amplicons were amplified using KAPA HIFI Hot Start Ready Mix (2x) (Cat. 07958935001, Roche, Basel, Switzerland). Universal bacterial 16S rRNA gene amplicon PCR primers containing Illumina overhang adapter sequences were used.
- the results of identifying microorganisms at the phylum level are shown in FIG. 31 . There was no significant difference in the total amount of all detected microorganisms. At the phylum level, the Firmicutes and Bacteroidota phyla accounted for about 95%. There was no significant difference between the NC group (1.89) and the PM group (1.80) in the ratio of Firmicutes and Bacteroidota , but a significant increase in the Bacteroidota/Firmicutes ratio was confirmed in the EM 40 group (3.64).
- Muribaculaceae, Prevotellaceae, Rikenellaceae, Ruminococcaceae, Tannerellaceae and Lactobacillaceae are microorganisms that play an anti-inflammatory role, and they were 0.78, 0.61, 0.70, 0.38, 0.41, and 0.28 in the PM group compared to the NC group, respectively, and in the EM 40 group, respectively. 1.36, 1.03, 1.08, 0.66, 1.02, and 0.59 were significantly improved compared to the PM group.
- the Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, and Oscillospiraceae families are microorganisms that promote inflammatory responses, and they were respectively 4.55, 1.41, and 1.66 in the PM group compared to the NC group, and 1.43, 1.11, and 0.84, respectively, in the EM 40 group, respectively, compared to the PM group. has been improved
- the top 25 species at the genus level were identified and shown in FIG. 33 .
- the genera Muribaculaceae, Alistipes, Ruminococcus, Parabacteroides, Alloprevotella, and Lactobacillus are microorganisms that play an anti-inflammatory role, and they were 0.75, 0.79, 0.31, 0.77, 0.55, and 0.30 in the PM group compared to the NC group, respectively, and in the EM 40 group, respectively. 1.27, 1.20, 0.52, 1.64, 2.18, and 0.44 were significantly improved compared to the PM group.
- Genus Oscillibacter, Helicobacter, and Bacteroides are microorganisms that promote inflammatory responses, and they were 1.89, 3.36, and 2.44 in the PM group compared to the NC group, respectively, and 1.12, 0.94, and 1.32, respectively, in the EM 40 group, which were significantly higher than the PM group. Improved.
- the extraction time and extraction temperature of the matcha extract of the present invention were set to 2 hours in distilled water at 40 ° C as in Preparation Example 1.
- matcha 40 g of matcha and unprocessed leaf green tea were extracted for 2 hours by reflux cooling at 40 ° C using 50 times distilled water, and the extract was No. It was filtered with 2 filter paper (Whatman PLC, Kent, UK) and concentrated with a vacuum concentrator (N-N series, Eyela Co., Tokyo, Japan). The concentrated sample was freeze-dried using a freeze dryer (Operon, Gimpo, Korea), and stored at -70 ° C for use in the experiment.
- catechin The content of catechin was shown using HPLC analysis (Table 2).
- the contents of catechin (EGC, EC, ECGC, ECG) contained in leaf green tea extract were 39.27, 5.22, 38.18, and 10.57 mg/g extract, respectively, and the catechin (EGC, EC, ECGC, ECG) content was 49.49, 8.74, 50.24, and 13.75 mg/g extract, respectively, and it was confirmed that the catechin content of matcha extract was 1.2, 1.6, 1.3, and 1.3 times superior to leaf green tea extract, respectively.
- 1 TPC total phenolic compound content
- 2 TFC total flavonoid compound content
- 3 ABTS ABTS radical scavenging activity
- 4 DPPH DPPH radical scavenging activity
- 5 MDA malondialdehyde (MDA) inhibitory activity.
Landscapes
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Abstract
본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 말차 추출물이 폐 세포, 뇌 신경 세포, 피부 세포 및 장 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과가 우수함 및 및 초미세먼지에 노출된 동물모델의 폐, 뇌, 피부 및 장 조직에서 염증 관련 단백질 발현량을 억제하는 것을 검증함으로써 초미세먼지로 인한 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 완성하였다. 이는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물, 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 염증성 질환의 종류로는 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 등이 있다.
한편, 최근 미세먼지(particulate matter, PM)의 농도가 증가하고 지속기간이 증가됨에 따라 미세먼지에 의한 인체영향성에 대한 관심이 증가되고 있는 추세이다(Kim 등, 2017). 미세먼지는 우리나라의 오랜 역사와 함께 해왔으며, 예로부터 몽고와 중국 사막지역 및 황화강 유역에서 발원된 황사의 영향을 받았고, 최근에는 우리나라 및 동북아시아 국가들의 급격한 산업화가 미세먼지의 주요 발생 원인으로 보고되고 있다(Myung, 2016).
초미세먼지(PM2.5)는 공기역학적 지름이 2.5 μm 이하인 미세먼지를 의미하며, 대기 오염 발생원에서 직접 배출되어지는 1차오염 물질과 대기에서 반응하여 생성되는 2차 대기오염 물질(NO3
-, SO4
-, NH4-, polyacromatichydrocarbon(PAH), quinone등)이 주를 이룬다(Kim 등, 2017). 세계보건기구(World Health Organization, 2013)에 의하면, PM10(공기역학적 지름이 10 μm 이하인 미세먼지)에 장기 노출될 경우 호흡기관 관련 질환과 사망률이 증가하게 되는데, PM2.5는 이보다 더 강한 위험 인자로 작용한다고 보고하였다.
지름 5~10 μg/m3이하의 먼지는 코 점막을 통해 체내에 흡수가 가능하며 2~5 μg/m3이하는 기도(호흡기)를 통과하고, 0.1~1 μg/m3는 폐포 손상까지 유발하게 된다. 미세먼지가 인체에 흡입되었을 경우, 충돌·중력침강·확산·정전기적 흡착 등과 같은 다양한 기전에 의해서 조직에 침착될 수 있으며, 일부는 혈액을 따라서 전신을 순환하기도 한다.
특히, 체내에 침착된 미세먼지는 산화적 스트레스와 염증 반응을 유도하고 호흡계 및 순환계 질환의 급성 악화 등을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Myung, 2016). 또한, 후각상피세포를 거치면 혈관 뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 거치지 않고도 뇌로 직접 도달할 수 있으며, 자성을 띄는 입자의 경우 뇌조직에 직접 침착됨으로써 미세아교세포(Microglia)를 활성화하여 pro-inflammatory cytokines(IL-1, TNF-a 및 IFN-r) 등을 생산함으로써 뇌신경 염증을 유도하고 더 나아가 인지장애를 유도하는 것으로 보고되었다(Block, 2004). 따라서, 이러한 미세먼지로 유도될 수 있는 인체 내 산화적 스트레스 억제 및 염증반응을 억제시켜 줄 수 있는 천연 식품 소재에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
한편, 가루녹차 형태인 말차(matcha)는 녹차(Camellia sinensis)의 분말 형태로 탄닌, 페놀산 및 카테킨과 같은 다양한 생리 활성 화합물을 함유하는 것으로 알려져 있다. 특히 (-)-epicatechin (EC), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin-3-gallate (ECG), (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG)와 같은 카테킨이 다량 함유되어 있다. 이러한 카테킨 화합물은 호지차(hojicha), 우롱차(oolong tea), 홍차(black tea)와 같은 다양한 녹차 가공품과 비교하였을 때 우수한 함량을 나타내며, 향과 맛이 우수한 것으로 알려져 있다. 말차 카테킨은 항염증 효과, 신장 및 신경 보호 효과, 콜레스테롤 축적 억제 효과 및 항당뇨병 효과와 같은 다양한 생리 활성을 가진다. 또한, 말차는 chlorogenic acid, gallic acid, quercetin, kaempferol과 같은 polyphenol성 화합물을 함유하고 있으며, 이들 화합물은 인지기능 개선 효과, 비알코올성 지방간질환 억제 효과, 항균 효과를 나타낸다. 따라서, 본 연구에서는 말차를 활용하여 초미세먼지에 노출된 다양한 세포 및 동물 조직에서 그 보호효과를 검증함으로써 초미세먼지 유도성 관련 염증성 질환 예방 또는 치료용 소재로의 가능성을 확인하고 이를 산업화 기초자료로 활용하고자 하였다.
따라서, 본 연구에서는 폐, 뇌신경세포, 피부 및 장 조직에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호효과 등을 검증함으로써 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 중 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부질환 및 폐 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 말차 추출물이 폐, 뇌신경세포, 피부 및 장 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호효과 및 초미세먼지에 노출된 동물모델의 폐, 뇌조직, 피부조직 및 장 조직에서 염증 관련 단밸질 발현량을 억제하는 것을 검증함으로써 초미세먼지로 이한 염증성 질환 중 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환의 예방 및 치료 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “추출물”은 물 또는 유기용매 추출법으로 추출되는 것을 특징으로 하는 것 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “초미세먼지로 인한 염증성 질환”은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 비강세포 (RPMI-2650), 폐세포 (A549), 뇌신경세포 (HT22), 피부세포(Primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29) 중 어느 하나 이상의 세포에서 세포 내 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시키는 효과를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 비강세포 (RPMI-2650), 폐세포 (A549), 뇌신경세포 (HT22), 피부세포(Primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29) 중 어느 하나 이상의 세포에서 초미세먼지 (PM2.5)로 인한 세포독성에 대한 세포 생존율이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 폐조직, 뇌조직, 피부조직 및 장조직 중 어느 하나 이상의 조직에서 GSH 활성 측정값을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 폐조직, 뇌조직, 피부조직 및 장조직 중 어느 하나 이상의 조직에서 SOD 활성 측정값을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 폐조직, 뇌조직, 피부조직 및 장조직 중 어느 하나 이상의 조직에서 MDA 함량 측정값을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지 (PM2.5)가 처리된 상태에서 TNF-α, p-JNK, BAX, COX-2, interleukin-1β의 발현을 억제시키는 효과를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 중 어느 하나인 것인, 건강기능식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에서, 상기 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 중 어느 하나인 것인, 화장료 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료방법에서, 상기 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 중 어느 하나인 것인, 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명의 말차 추출물은 초미세먼지로 인한 염증성 질환에 대해 예방, 개선 또는 치료 효과가 뛰어나므로 초미세먼지로 인한 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환에 대한 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 초미세먼지로 인한 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환에 대한 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물 또는 초미세먼지로 인한 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환에 대한 예방 및 개선용 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명인 말차 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 비강세포 (RPMI-2650)에서 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명인 말차 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐세포 (A549)에서 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명인 말차 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 비강세포 (RPMI-2650)에서 TLR4, p-Akt, caspas-3, BCl-2, Nrf2, HO-1 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명인 말차 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐세포 (A549)에서 TNF-α, TLR4, BCl-2, caspase-3 및 COX-2 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐조직에서 항산화 시스템 개선 효과[GSH(A), SOD(B) 및 MDA(C) 활성 개선]를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐조직에서 미토콘드리아 활성 개선 효과[미토콘드리아 ROS 개선(A), MMP 개선(B) 및 미토콘드리아 ATP 개선(C)]를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐조직에서 TNF-α, p-JNK, p-IκB-α, p-NF-κB, BAX, Caspase-1, COX-2 및 IL-1β 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명인 말차 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌신경세포(HT22)에서 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명인 말차 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌신경세포(HT22)에서 p-JNK, ChAT, TLR4, p-NF-κB 및 IL-1β 단백질에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명인 말차 추출물의 공간 학습 및 기억 능력 개선 효과를 Y-maze test를 이용해 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명인 말차 추출물의 단기 학습 및 기억 능력 개선 효과를 수동 회피 테스트를 이용해 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명인 말차 추출물의 장기 학습 및 기억능력 개선 효과를 Morris water maze 실험을 이용해 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 항산화 시스템 개선 효과[GSH(A), SOD(B) 및 MDA(C) 활성 개선]를 나타낸 도이다.
도 14는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 콜린성 시스템 개선 효과[ACh 함량 개선(A), AChE 활성 억제(B)]를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 뇌 조직에서 미토콘드리아 활성 개선 효과[미토콘드리아 ROS 개선(A), MMP 개선(B) 및 미토콘드리아 ATP 개선(C)]를 나타낸 도이다.
도 16은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 olfactory bulb 조직에서의 염증 및 세포 사멸 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 17은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 hippocampus 조직에서의 염증 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 18은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 hippocampus 조직에서의 세포 사멸 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 19는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 hippocampus 조직에서의 콜린성 시스템 손상 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 피부 세포에서 산화 스트레스에 대한 세포 생존율 및 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 피부 세포에서 p-JNK, p-NF-κB, COX-2, p-AMPK, caspase-3, caspase-1, IL-1β 단백질 발현에 미치는 효과를 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 피부 조직에서 환원형 GSH 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 23은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 피부 조직에서 SOD 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 피부 조직에서 MDA 함량 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 25는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 피부 조직에서 염증 및 세포 사멸 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 26은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 장 세포(HT29)에서 산화 스트레스에 대한 세포 생존율 및 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 27은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 장 조직에서 MPO 활성 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 28은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 장 조직에서 항산화 시스템 개선 효과[GSH(A), SOD(B) 및 MDA(C) 활성 개선]를 나타낸 도이
도 29는 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 장 조직에서 밀착연접 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 30은 본 발명인 말차 추출물이 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 장 조직에서 염증 및 세포 사멸 개선 효과를 나타낸 도이다.
도 31은 문(Phylum) 수준에서 미생물을 동정한 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 과(Family) 수준에서 미생물을 동정한 결과를 나타낸 도이다.
도 33은 속(Genus) 수준에서 미생물을 동정한 결과를 나타낸 도이다.
도 34는 말차 추출물의 추출시간별 수율과 항산화활성 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물 제공을 목적으로 한다.
아울러, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 또는 개선용 화장료 조성물 제공을 목적으로 한다.
나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 보다 바람직하게는, 나아가, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 초미세먼지로 인한 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 예방 또는 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w) %, 고체/액체는(w/v) %, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.
일 측면에서, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환일 수 있으며 상기 호흡기 질환은 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것일 수 있고, 상기 뇌 신경 질환은 뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하나인 것일 수 있으며, 상기 피부 질환은 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 무좀, 건선, 습진 또는 주사(rosacea) 중 어느 하나인 것일 수 있고, 상기 장 질환은 궤양성 대장염, 크론병, 장형 베체트병, 출혈성 직장 궤양, 장 병변 및 화장낭염 중 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 말차로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 말차로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 식품학/약학/화장품학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 약학적 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "개체"란 질병의 예방, 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 사람, 개, 원숭이, 고양이, 설치류, 예컨대 마우스, 유전자 조작된 마우스 등 제한 없이 사용될 수 있다. 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양 또는 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 조성물의 약학적으로 허용가능한 염의 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed. (2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능성식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능성식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강기능성식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강기능성식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 말차에서 추출한 추출물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 초미세먼지로 인한 염증성 질환 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 말차에서 추출한 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[준비예]
준비예 1. 말차 추출물의 제조
본 실험에 사용된 말차는 수확 직전 3주간 차광재배 한 것을 사용하였고, 재배된 녹차를 250℃에서 1분 이내로 가열한 뒤, 급속 냉각 시켰다(900K-1; Kawasaki Tea Machinery, Kakegawa, Japan). 이를 맷돌 비즈밀(회전수 50-55 rpm, 입경 13-14 μm) (Kawasaki Tea Machinery)을 이용하여 말차를 제조하였고, 말차는 -80℃에서 동결건조하였다(Operon, Gimpo, Korea). 말차 추출물은 2 g의 동결건조된 말차를 40℃의 증류수에서 2시간 동안 환류냉각 추출하였으며, 이를 동결건조하여 실험에 사용하였다.
준비예 2. 실험에 사용된 세포 배양
본 실험에 사용된 비강세포(RPMI-2650)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 50 unit/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI1640 배지에서 배양했다. 본 실험에 사용된 폐세포(A549), 뇌신경세포(HT22), 피부세포(primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)로부터 구입하였고, 10% FBS, 50 unit/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 배양했다. 세포는 5% CO2 및 37℃로 유지되는 인큐베이터에서 배양되었다.
준비예 3. 세포 내 ROS 생성 함량 측정 방법
비강세포(RPMI2650), 폐세포(A549), 뇌신경세포(HT22), 피부세포(primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29)를 96 well plate(1x104 cells/well)에 도말하였고, 배양 24시간 후 0.5% FBS가 포함된 배지로 교환하여 시료를 처리하고 30분 후 초미세먼지(PM2.5)를 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. DCF-DA를 처리하고, 30분 후, 세포를 DMSO에 용해시키고 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)에서 570 nm에서 분석하였다.
준비예 4. 세포 생존율 측정 방법
비강세포(RPMI2650), 폐세포(A549), 뇌신경세포(HT22), 피부세포(primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29)를 96 well plate(1x104 cells/well)에 도말하였고, 배양 24시간 후 0.5% FBS가 포함된 배지로 교환하여 시료를 처리하고 30분 후 초미세먼지(PM2.5)를 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. MTT를 처리하고 3시간 후, 세포를 DMSO에 용해시키고 microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)에서 570 nm에서 분석하였다.
준비예 5. in vivo 실험 디자인
본 실험에 사용된 BALB/c 마우스(수컷, 6주)는 Samtako(Osan, Korea)로부터 구입했다. 실험 마우스를 케이지당 4마리로 무작위로 나누었고 55% 습도 및 22 ± 2℃의 표준 실험실 조건에서 사육하였다. 각 그룹은 6개의 그룹으로 나누었고, sham control (Sham) 그룹 (chamber exposure-/sample intake-), normal control (NC) 그룹(clean air+/sample intake-), normal+sample (NS) 그룹 (clean air+/sample intake+; 40 mg/kg of body weight), PM2.5 노출 (PM) 그룹 (dust air+/sample intake-), PM2.5 노출 및 시료 섭취 (EM 20) 그룹 (dust air+/sample intake+; 20 mg/kg of body weight), PM2.5 노출 및 시료 섭취 (EM 40) 그룹 (dust air+/sample intake+; 40 mg/kg of body weight)으로 구분하였다. 말차 추출물은 식수에 녹인 후 위관을 이용하여 12주 동안 1일 1회 경구투여하였고, 마우스를 전신 노출 챔버에서 12주 동안 하루 500 μg/m3 농도의 PM2.5에 노출시켰다. 모든 동물실험 방법은 경상국립대학교 동물실험실 운영위원회(인증번호: GNU-200302-M0007)와 보건복지부 윤리위원회의 정책에 따라 수행되었다.
준비예 6. 조직 전처리
in vitro 실험 후, SOD 및 malondialdehyde (MDA) 함량 분석을 위해 phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4)에서 bullet blender (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA)를 사용하여 폐, 뇌 신경, 피부, 장 조직을 균질화했다. 환원형 glutathione (GSH) 함량 분석을 위해 phosphate buffer (pH 6.0)에서 bullet blender (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA)를 사용하여 폐, 뇌 신경, 피부, 장 조직 조직을 균질화했다.
준비예 7. 조직에서의 환원형 GSH 활성 측정
환원형 glutathione (GSH) 분석을 위해 인산염 완충액에 균질화된 조직을 4℃에서 10,000 × g에서 15분 동안 원심분리하고 상등액을 분석에 사용하였다. 상등액을 5% metaphosphoric acid과 반응시켰고 2,000 × g에서 원심분리하였고, 상등액을 0.26 M tris-HCl (pH 7.8), 0.65 N NaOH 및 1 mg/mL의 o-phthaldialdehyde와 실온에서 15분 동안 반응시켰다. 그런 다음 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co., Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 320 nm (excitation) 및 420 nm (emission)의 파장에서 형광 강도를 측정했다.
준비예 8. 조직에서의 SOD 활성 측정
SOD 함량을 확인하기 위해 PBS에서 균질화된 조직을 4℃에서 10분 동안 400 × g에서 원심분리하고, pellet을 SOD 분석에 사용하였다. 1×cell extraction buffer [10% SOD buffer, 0.4% (v/v) triton X-100, and 200 μM phenylmethane sulfonylfluoride]과 pellet을 4℃에서 10분 동안 10,000 × g에서 원심분리했다. SOD 함량은 상용 SOD kit(Dojindo Molecular Technologies, Kumamoto, Japan)를 사용하여 측정하였다.
준비예 9. 조직에서의 MDA 함량 측정
MDA 함량을 측정하기 위해 PBS에서 균질화된 조직을 4℃에서 5,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 95℃ water bath에서 1% phosphoric acid 및 0.67% TBA와 함께 1시간 동안 배양하였다. 반응물을 600 × g에서 10분 동안 회전시키고 상층액을 532 nm에서 측정했다.
준비예 10. 미토콘드리아 추출
폐, 뇌 조직을 1 mM EGTA가 포함된 10배 부피의 mitochondrial isolation (MI) buffer (215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES sodium salt, pH 7.2)으로 균질화했다. 균질액을 4℃에서 1,300 × g에서 10분간 원심분리시키고, 상층액을 다시 4℃에서 13,000 × g에서 10분간 원심분리하였다. 미토콘드리아 pellet을 0.1% digitonin을 포함하는 MI 완충액과 혼합하였다. 5분 후, 혼합물을 1 mM EGTA가 포함된 MI buffer와 반응시키고 4℃에서 15분 동안 13,000 × g에서 원심분리하였다.
준비예 11. 미토콘드리아 내 ROS 생성 함량 측정
분리된 미토콘드리아는 KCl-based respiration buffer [125 mM potassium chloride, 2 mM potassium phosphate monobabic, 20 mM HEPES, 1 mM magnesium chloride, 500 μM EGTA, 2.5 mM malate and 5 mM pyruvate] 및 25 μM DCF-DA와 20분 동안 반응시켰다. DCF 형광은 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.)를 사용하여 485 nm (excitation) 및 530 nm (emission)에서 형광을 측정했다.
준비예 12. 미토콘드리아 내 MMP 측정
5 mM pyruvate와 5 mM malate가 포함된 MI buffer와 분리된 미토콘드리아를 black 96 well plate에서 1 μM JC-1과 반응시켰다. 혼합물을 암실에서 20분 동안 실온에서 배양한 후 fluorescence microplate reader (Infinite 200, Tecan Co.)를 사용하여 530 nm (excitation) 및 590 nm (emission)에서 형광을 측정했다.
준비예 13. 미토콘드리아 내 ATP 함량 측정
ATP 함량은 제조업체의 프로토콜에 따라 ATP bioluminescence assay kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하였다. 추출된 미토콘드리아의 ATP 함량은 luciferasse에 의해 촉매될 때 산화되는 luciferin의 값을 사용하여 측정하고, ATP 함량은 동일한 방법으로 수행된 표준 곡선에 따라 계산되었다.
준비예 14. 웨스턴블롯팅
조직을 1% PI를 함유한 extraction solution (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)에서 10분 동안 균질화하였다. 4℃에서 13,000 × g에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 단백질 분석에 사용하였다. 단백질을 SDS-PAGE 겔로 분리하고 PVDF 막으로 transfer 하였다. membrane을 4℃에서 1차 항체에서 반응시키고, 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 면역 복합체는 Western blot imager (iBright Imager, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 검출되었고 단백질의 밀도는 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 계산했다.
준비예 15. 통게처리
모든 실험 결과는 평균±표준편차로 나타냈으며, Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s multiple range test)으로 각 시료 간의 유의차를 5% 수준(p < 0.05)와 1% 수준(p < 0.01)에서 검증하였다.
[실시예]
실시예 1. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 )로 인한 호흡기 질환 예방 및 치료 효과
1-1. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도 산화 스트레스에 대한 세포 생존율 및 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과
대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군은 47.82%의 세포 생존율이 감소했고, 비타민 C (200 μM) 투여군 처리군은 51.92%의 세포 생존율이 감소했다 (도 1a). 200 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 생존율은 83.65%, 100 μg/mL의 농도에서는 89.17%로 우수한 세포 생존율을 나타냈다.
정상 대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군(181.84%)은 ROS 함량이 증가했고, 비타민 C 투여군(200 μM) 처리군은 ROS 함량이 감소했다 (84.96%) (도 1b). 말차 추출을 투여한 세포 내 ROS 함량은 200 ㎍/mL 농도에서 130.86%, 100 μg/mL 농도에서 93.48%로 우수한 ROS 억제 활성을 보였다.
또한 대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군은 74.97%의 세포 생존율이 감소했고, 비타민 C (200 μM) 투여군 처리군은 87.69%의 세포 생존율이 감소했다 (도 2a). 200 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 생존율은 131.86%, 100 μg/mL의 농도에서는 112.86%로 우수한 세포 생존율을 나타냈다.
정상 대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군(135.29%)은 ROS 함량이 증가했고, 비타민 C 투여군(200 μM) 처리군은 ROS 함량이 감소했다 (117.49%) (도 2b). 말차 추출을 투여한 세포 내 ROS 함량은 200 ㎍/mL 농도에서 123.36%, 100 μg/mL 농도에서 120.66%로 우수한 ROS 억제 활성을 보였다.
1-2. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 폐 조직에서 항산화 시스템 개선 효과
폐 조직의 환원형 GSH 활성을 측정한 결과는 도 3과 같다. PM 그룹의 폐 조직의 환원형 GSH 활성(75.51%)은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. 반면, EM 그룹(EM20, 77.09%; EM40, 89.86%)은 PM 그룹보다 개선된 환원형 GSH 활성을 나타냈다.
폐 조직의 SOD 활성을 측정한 결과는 도 4와 같다. PM 그룹의 폐 조직의 SOD 활성(29.52%)은 NC 그룹(39.82%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 37.53%; EM40, 41.65%)은 PM 그룹보다 개선된 SOD 활성을 나타냈다.
폐 조직의 MDA 함량을 측정한 결과는 도 5와 같다. PM 그룹의 폐 조직의 MDA 함량(8.11 mmole/mg of protein)은 NC 그룹(3.91 mmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 6.11 mmole/mg of protein; EM40, 5.01 mmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 개선된 MDA 함량을 나타냈다.
1-3. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 폐 조직에서 미토콘드리아 활성 개선 효과
폐 조직의 미토콘드리아 ROS 수준은 그림 도 6a와 같다. PM 그룹의 미토콘드리아 ROS 함량(181.28%)은 NC 그룹(100.00%)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(184.92%, 132.29%)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다.
폐 조직의 MMP 수준은 그림 도 6b와 같다. PM 그룹의 MMP 수준(78.69%)은 NC 그룹(100.00%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(77.47%, 102.53%)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다.
폐 조직의 ATP 함량은 도 6c와 같다. PM 그룹의 ATP 함량(211.83 nmole/mg of protein)은 NC 그룹(297.27 nmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(231.63 nmole/mg of protein, 286.00 nmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다.
1-4. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 폐 조직에서 염증 및 세포 사멸 개선 효과
염증 및 세포 사멸 경로와 관련된 폐 단백질 발현은 도 7에 나타냈다. PM 그룹의 폐 조직에서의 TNF-α(198.75%), p-JNK(139.54%), p-IκB-α(117.82%), p-NF-κB(148.01%), BAX(134.84%), Cas-1(167.50%), COX-2(183.80%), IL-1β(114.38%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 TNF-α(170.33%), p-JNK(92.30%), p-IκB-α(66.18%), p-NF-κB(76.26%), BAX(86.87%), Cas-1(98.94%), COX-2(99.91%), IL-1β(100.87%)의 발현이 유의적으로 개선되었다.
실시예 2. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 )로 인한 뇌 신경 질환 예방 및 치료 효과
2-1. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도 산화 스트레스에 대한 세포 생존율 및 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과
대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군은 53.63%의 세포 생존율이 감소했고, 비타민 C (200 μM) 투여군 처리군은 53.33%의 세포 생존율이 감소했다 (도 8a). 200 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 생존율은 86.55%, 100 μg/mL의 농도에서는 73.57%로 우수한 세포 생존율을 나타냈다. 정상 대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군(425.84%)은 ROS 함량이 증가했고, 비타민 C 투여군(200 μM) 처리군은 ROS 함량이 감소했다 (56.25%) (도 8b). 말차 추출을 투여한 세포 내 ROS 함량은 200 ㎍/mL 농도에서 60.58%, 100 μg/mL 농도에서 58.06%로 우수한 ROS 억제 활성을 보였다. in vitro 평가를 통해 말차 추출물은 PM2.5로 유도된 독성에 대한 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-2. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도 산화 스트레스에 대한 세포 보호효과 기작 평가
PM2.5로 유도된 염증 및 세포 사멸 경로와 관련된 HT22 세포에서의 단백질 발현은 도 9에 나타냈다. PM2.5 처리군 그룹의 HT22 세포에서의 p-JNK(168.78%), TLR4(170.95%), p-NF-κB(113.94%), IL-1β(147.03%)의 발현 수준은 대조군(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. 20 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 단백질 발현은 PM2.5 처리군에 비해 p-JNK(118.79%), TLR4(82.07%), p-NF-κB(58.80%), IL-1β(52.21%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. 또한 PM2.5 처리군 그룹의 HT22 세포에서의 ChAT(90.27%)의 발현 수준은 대조군(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. 20 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 그룹(183.45%)에서 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물은 PM2.5의 독성으로 유도된 HT22 세포에서 염증개선 및 세포 사멸에 대한 기작 평가를 통해 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-3. 말차 추출물의 공간 학습 및 기억 능력 개선 효과
2-3-1. 실험 방법(Y-maze test)
Y-maze는 33(길이) cm × 15(높이) cm × 10(너비) cm으로 구성되어 있으며, 마우스는 지정된 팔의 끝에 위치시키고 8분 동안 팔에서 자유롭게 움직일 수 있도록 하였다. 이동 및 경로 추적은 비디오 시스템(Smart 3.0, Panlab, Barcelona, Spain)을 사용하여 기록하였다.
2-3-2. 실험 결과
공간 학습 및 기억 기능은 Y-maze test를 이용하여 측정하였다(도 10). Number of arm entries, mean speed 및 total distance 는 모든 군에서 유의한 차이가 없었다. EM 20 및 EM 40 그룹(35.82%, 41.73%)의 alternation behavior는 PM 그룹(21.13%)보다 증가했다. 또한 EM의 농도가 증가할수록 공간학습과 기억기능이 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 미세먼지 독성에 대한 공간 학습 및 기억 기능 손상에 대한 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-4. 말차 추출물의 단기 학습 및 기억 능력 개선 효과
2-4-1. 실험 방법[수동 회피 실험(passive avoidance test)]
수동 회피 실험에 사용된 챔버는 전기자극을 줄 수 있는 조명부와 비조명부로 구분되어 있다. 마우스는 조명이 있는 부분에 위치시키고, 마우스 네 발이 암실에 들어갔을 때 0.5 mA에서 3초 동안 전기 충격을 가하고 회피 시간을 측정하였다. 24시간 후, 암실에 들어가는 시간을 재측정하였다.
2-4-2. 실험 결과
단기 학습 및 기억 능력은 수동 회피 테스트를 이용하여 측정하였다(도 11). 1일 차에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다(도 11a). 반면 EM 그룹(199.12 s 및 296.25 s)의 step-through latency는 PM 그룹(128.29 s)보다 유의적으로 증가하였다(도 11b). 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 미세먼지 독성에 대한 단기 학습 및 기억 능력 손상에 대한 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-5. 말차 추출물의 장기 학습 및 기억 능력 개선 효과
2-5-1. 실험 방법[수중 미로 실험(Morris water maze test)]
수중 미로 실험에 사용된 풀은 원형 수조(90(직경) cm × 30(깊이) cm)로 구성되어 있으며 N, S, E, W의 4개 구역으로 무작위로 분리하였다. W 사분면의 중앙에는 수면 아래에 잠긴 플랫폼을 위치시켰고, 마우스는 자유롭게 헤엄칠 수 있도록 하여 마우스의 움직임을 비디오 시스템(Smart 3.0, Panlab)을 이용하여 기록되었다. Prove trial 실험에서 플랫폼 없이 테스트를 수행하였고 W 영역에서의 머무름시간을 측정했다.
2-5-2. 실험 결과
장기 학습 및 기억 능력은 Morris water maze 실험을 이용하여 측정하였다(도 12). Prove trial에서 EM 그룹(18.95 s, 18.06 s)의 탈출 지연 시간이 PM 그룹보다 유의적으로 감소하였다(30.64 s) (도 12a). EM 그룹(33.21%, 47.45%)의 W 영역의 머무름 시간은 PM 그룹(18.51%)에 비해 증가했다(도 12b). Tracing path를 비교하였을 때, EM 그룹에서 장기 학습 및 기억 능력이 상당히 개선되었다(도 12c). 타겟까지의 거리 측정 결과에서 EM 그룹(1,096.08 mm, 899.51 mm)은 PM 그룹(1,300,66 mm)에 비해 체류 시간이 증가하는 것으로 나타났다(도 12d). Target crossing 결과에서 EM 그룹(1.67, 4.14)은 PM 그룹(0.33)에 비해 증가했다(도 12e). 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 미세먼지 독성에 대한 장기 학습 및 기억 능력 손상에 대한 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-6. 말차 추출물의 뇌 조직에서의 항산화 시스템 개선 효과
뇌 조직의 환원형 GSH 활성을 측정한 결과는 도 13a와 같다. PM 그룹의 뇌 조직의 환원형 GSH 활성(82.09%)은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. 반면, EM 그룹(EM20, 100.88%; EM40, 105.97%)은 PM 그룹보다 개선된 환원형 GSH 활성을 나타냈다. 뇌 조직의 SOD 활성을 측정한 결과는 도 13b와 같다. PM 그룹의 뇌 조직의 SOD 활성(54.79%)은 NC 그룹(64.45%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 60.79%; EM40, 61.96%)은 PM 그룹보다 개선된 SOD 활성을 나타냈다. 뇌 조직의 MDA 함량을 측정한 결과는 도 13c와 같다. PM 그룹의 뇌 조직의 MDA 함량(15.23 mmole/mg of protein)은 NC 그룹(10.22 mmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 13.08 mmole/mg of protein; EM40, 8.09 mmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 개선된 MDA 함량을 나타냈다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 뇌 조직 내에서의 항산화 시스템에 대한 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-7. 말차 추출물의 뇌 조직에서의 콜린성 시스템 개선 효과
2-7-1. 실험 방법
ㄱ. 뇌 조직에서의 아세틸콜린 함량 측정 방법
PBS에 균질화한 뇌 균질액을 4℃에서 14,000 × g에서 30분간 원심분리한 후 상등액을 분석에 사용하였다. 상등액과 알칼리성 alkaline hydroxylamine reagent [2 M hydroxylamine·hydrochloride, 3.5 N sodium hydroxide, 1:1 (v/v)]을 혼합하여 상온에서 1분간 정치한 후 0.5 N hydrochloride과 0.3 M iron (Ⅲ) chloride hexahydrate을 첨가하였다. 흡광도는 microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 사용하여 540 nm의 파장에서 측정하였다.
ㄴ. 뇌 조직에서의 아세틸콜린 분해효소 활성 측정 방법
아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE) 활성을 측정하기 위해 상등액을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 37℃에서 15분 동안 방치한 다음, Ellman’s reaction mixture를 37℃에서 10분 동안 혼합하였다. 흡광도는 microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments Inc.)를 사용하여 405 nm 파장에서 측정하였다.
2-7-2. 실험 결과
뇌 조직에서의 ACh 함량을 측정한 결과는 도 14a와 같다. PM 그룹의 ACh 함량(2.15 mmole/mg of protein)은 NC 그룹(5.15 mmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(4.00 mmole/mg of protein, 5.11 mmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 유의적으로 증가했다. 뇌 조직에서의 AChE 활성을 측정한 결과는 도 14b와 같다. PM 그룹의 AChE 활성(129.55%)은 NC 그룹(100.00%)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(118.22%, 105.12%)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 뇌 조직 내에서의 ACh함량의 감소와 AChE의 활성을 억제하여 콜린성 시스템에 대한 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-8. 말차 추출물의 미토콘드리아 활성 개선 효과
뇌 조직의 미토콘드리아 ROS 수준은 도 15a와 같다. PM 그룹의 미토콘드리아 ROS 함량(163.02%)은 NC 그룹(100.00%)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(99.33%, 99.33%)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다. MMP 수준은 도 15b와 같다. PM 그룹의 MMP 수준(66.00%)은 NC 그룹(100.00%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(108.72%, 139.35%)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다. 뇌 조직의 ATP 함량은 도 15c와 같다. PM 그룹의 ATP 함량(616.77 nmole/mg of protein)은 NC 그룹(1,384.75 nmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(704.89 nmole/nmole/mg of protein, 1,058.34 nmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 뇌 조직 내에서의 신경세포에 에너지를 공급하는 미토콘드리아의 기능 보호를 통해 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-9. 말차 추출물의 olfactory bulb 조직에서의 염증 및 세포 사멸 개선 효과
염증 및 세포 사멸 경로와 관련된 olfactory bulb 단백질 발현은 도 16에 나타냈다. PM 그룹의 olfactory bulb 조직에서의 p-JNK(119.92%), p-IκB-α(163.94%), Cas-1(154.72%), COX-2(213.73%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 p-JNK(84.84%), p-IκB-α(98.72%), Cas-1(89.61%), COX-2(121.64%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 olfactory bulb 조직의 보호효과를 검증함으로써 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 초기 증상인 후각신경 손상을 억제하는 기작 평가를 통해 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
2-10. 말차 추출물의 hippocampus 조직에서의 염증 개선 효과
염증과 관련된 hippocampus 단백질 발현은 도 17에 나타냈다. PM 그룹의 hippocampus 조직에서의 p-JNK(128.15%), p-IκB-α(129.03%), TNF-α(140.21%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 p-JNK(120.80.34%), p-IκB-α(119.80%), TNF-α(112.48%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 인지기능과 관련 있는 hippocampus 조직 내에서의 염증반응 개선을 통해 우수한 보호효과를 가짐으로써 인지기능 저하를 억제하는 것을 확인하였다.
2-11. 말차 추출물의 hippocampus 조직에서의 세포 사멸 개선 효과
신경 세포 독성 신호 전달과 관련된 hippocampus 단백질 발현은 도 18에 나타냈다. PM 그룹의 hippocampus 조직에서의 BAX(126.34%), APP(102.83%), Aβ(195.51%), p-tau(116.87%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 BAX(61.55%), APP(89.72%), Aβ(157.37%), p-tau(86.79%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. PM 그룹의 BCl-2(78.51%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 BCl-2(84.87%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 인지기능과 관련 있는 hippocampus 조직 내에서의 세포 사멸 억제 기작 평가를 통해 우수한 보호효과를 가짐으로써 인지기능 저하를 억제하는 것을 확인하였다.
2-12. 말차 추출물의 hippocampus 조직에서의 콜린성 시스템 손상 개선 효과
콜린성 시스템과 관련된 hippocampus 단백질 발현은 도 19에 나타냈다. PM 그룹의 hippocampus 조직에서의 AChE(130.15%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 AChE(111.57%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. PM 그룹의 AChR-α3(74.18%), ChAT(80.07%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 AChR-α3(88.17%), ChAT(91.57%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물의 섭취는 만성으로 유도된 초미세먼지 독성에 대한 인지기능과 관련 있는 hippocampus 조직 내에서의 콜린성 시스템 손상에 대한 개선을 통해 우수한 보호효과를 가짐으로써 인지기능 저하를 억제하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 )로 인한 피부 질환 예방 및 치료 효과
3-1. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도 산화 스트레스에 대한 세포 생존율 및 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과
대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군은 44.45%의 세포 생존율이 감소했고, 비타민 C (200 μM) 투여군 처리군은 46.45%의 세포 생존율이 감소했다 (도 20a). 200 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 생존율은 66.19%, 100 μg/mL의 농도에서는 57.18%로 우수한 세포 생존율을 나타냈다.
정상 대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군(416.85%)은 ROS 함량이 증가했고, 비타민 C 투여군(200 μM) 처리군은 ROS 함량이 감소했다 (69.11%) (도 20b). 말차 추출을 투여한 세포 내 ROS 함량은 200 ㎍/mL 농도에서 72.26%, 100 μg/mL 농도에서 69.18%로 우수한 ROS 억제 활성을 보였다.
3-2. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도 산화 스트레스에 대한 세포 보호효과 기작 평가
PM2.5로 유도된 염증 및 세포 사멸 경로와 관련된 primary dermal fibroblast 세포에서의 단백질 발현은 도 21에 나타냈다. PM2.5 처리군의 primary dermal fibroblast 세포에서의 p-JNK(235.87%), p-NF-κB(315.40%), COX-2(206.77%), p-AMPK(123.14%), caspase-3(250.01%), caspase-1(269.11%), IL-1β(199.34%)의 발현 수준은 대조군(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. 20 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 단백질 발현은 PM2.5 처리군에 비해 p-JNK(121.87%), p-NF-κB(114.09%), COX-2(159.11%), p-AMPK(71.51%), caspas-3(117.33%), caspase-1(235.28%), IL-1β(34.90%)의 발현이 유의적으로 개선되었다. 따라서 말차 추출물은 PM2.5의 독성으로 유도된 primary dermal fibroblast 세포에서 염증개선 및 세포 사멸에 대한 기작 평가를 통해 우수한 보호효과를 가지는 것을 확인하였다.
3-3. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 피부 조직에서 항산화 시스템 개선 효과
피부 뇌 조직의 환원형 GSH 활성을 측정한 결과는 도 22와 같다. PM 그룹의 피부 조직의 환원형 GSH 활성(80.25%)은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. 반면, EM 그룹(EM20, 85.01%; EM40, 92.09%)은 PM 그룹보다 개선된 환원형 GSH 활성을 나타냈다.
피부 조직의 SOD 활성을 측정한 결과는 도 23과 같다. PM 그룹의 피부 조직의 SOD 활성(16.14%)은 NC 그룹(20.65%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 16.91%; EM40, 22.07%)은 PM 그룹보다 개선된 SOD 활성을 나타냈다.
피부 조직의 MDA 함량을 측정한 결과는 도 24와 같다. PM 그룹의 피부 조직의 MDA 함량(3.01 mmole/mg of protein)은 NC 그룹(2.22 mmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 2.56 mmole/mg of protein; EM40, 1.98 mmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 개선된 MDA 함량을 나타냈다.
3-4. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 피부 조직에서 염증 및 세포 사멸 개선 효과
염증 및 세포 사멸 경로와 관련된 피부 단백질 발현은 도 25에 나타냈다. PM 그룹의 피부 조직에서의 TNF-α(128.87%), TLR4(177.26%), TLR2(261.16%), p -JNK(115.99%), BAX(116.21%), COX-2(138.29%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 TNF-α(95.57%), TLR4(156.64%), TLR2(157.62%), p-JNK(64.23%), BAX(101.35%), COX-2(115.42%)의 발현이 유의적으로 개선되었다.
실시예 4. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 )로 인한 장 질환 예방 및 치료 효과
4-1. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도 산화 스트레스에 대한 세포 생존율 및 세포 내 활성산소종(ROS) 함량 개선 효과
대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군은 72.91%의 세포 생존율이 감소했고, 비타민 C (200 μM) 투여군 처리군은 74.41%의 세포 생존율이 감소했다 (도 26a). 200 μg/mL 농도의 말차 추출물을 투여한 세포의 생존율은 154.61%, 100 μg/mL의 농도에서는 181.91%로 우수한 세포 생존율을 나타냈다.
정상 대조군(100%)과 비교하였을 때, PM2.5 처리군(375.01%)은 ROS 함량이 증가했고, 비타민 C 투여군(200 μM) 처리군은 ROS 함량이 감소했다 (72.56%) (도 26b). 말차 추출을 투여한 세포 내 ROS 함량은 200 ㎍/mL 농도에서 69.73%, 100 μg/mL 농도에서 35.09%로 우수한 ROS 억제 활성을 보였다.
4-2. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 장 조직에서 Myeloperoxidase(MPO) 활성 개선 효과
4-2-1. 실험 방법
마우스의 장 조직을 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide (in 20 mM phosphate buffer, pH 6.0)에서 bullet blender (Next Advance Inc., Averill Park, NY, USA)를 사용하여 균질하여 균질액을 얻었고, 얻어진 균질액을 초음파 처리하여 15,000 × g에서 15분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 o-dianisidine dihydrochhloride, H2O, potassium phosphate buffer와 반응하였다. 반응액의 흡광도는 microplate reader (Epoch 2, BioTek Instruments Inc.)를 사용하여 450 nm 파장에서 측정하였다.
4-2-2. 실험 결과
장 조직의 MPO 활성을 측정한 결과는 도 27과 같다. PM 그룹의 MPO 활성(0.35 U/mg)은 NC 그룹(0.26 U/mg)에 비해 유의적으로 감소했다. 반면, EM 그룹(0.30 U/mg, 0.28 U/mg)은 PM 그룹보다 개선된 MPO 활성을 나타냈다.
4-3. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 장 조직에서 항산화 시스템 개선 효과
장 조직의 환원형 GSH 활성을 측정한 결과는 도 28a와 같다. PM 그룹의 장 조직의 환원형 GSH 활성(88.19%)은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. 반면, EM 그룹(EM20, 99.08%; EM40, 1050.37%)은 PM 그룹보다 개선된 환원형 GSH 활성을 나타냈다.
장 조직의 SOD 활성을 측정한 결과는 도 28b와 같다. PM 그룹의 장 조직의 SOD 활성(20.64%)은 NC 그룹(33.65%)에 비해 유의적으로 감소하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 25.17%; EM40, 26.46%)은 PM 그룹보다 개선된 SOD 활성을 나타냈다.
장 조직의 MDA 함량을 측정한 결과는 도 28c와 같다. PM 그룹의 장 조직의 MDA 함량(1.51 mmole/mg of protein)은 NC 그룹(1.12 mmole/mg of protein)에 비해 유의적으로 증가하였다. 반면, EM 그룹(EM20, 1.25 mmole/mg of protein; EM40, 1.08 mmole/mg of protein)은 PM 그룹보다 개선된 MDA 함량을 나타냈다.
4-4. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 장 조직에서 밀착연접 개선 효과
밀착연접(tight function) 단백질 경로와 관련된 장 단백질 발현은 도 29에 나타냈다. PM 그룹의 장 조직에서의 claudin-1(81.10%), occludin(78.08%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 감소했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 claudin-1(98.07%), occludin(106.48%)의 발현이 유의적으로 개선되었다.
4-5. 말차 추출물의 초미세먼지 (PM2.5 ) 유도성 장 조직에서 염증 및 세포 사멸 개선 효과
장 염증 및 세포 사멸 경로와 관련된 장 단백질 발현은 도 30에 나타냈다. PM 그룹의 장 조직에서의 p-JNK(111.57%), Cas-7(131.87%), Cas-3(132.05%), BAX(164.51%), Cas-1(164.81%), TNF-α(134.84%), IL-1β(120.33%)의 발현 수준은 NC 그룹(100%)에 비해 유의적으로 증가했다. EM 40 그룹의 단백질 발현은 PM 그룹에 비해 p-JNK(88.79%), Cas-7(112.35%), Cas-3(113.08%), BAX(130.08%), Cas-1(140.08%), TNF-α(118.05%), IL-1β(111.80%)의 발현이 유의적으로 개선되었다.
4-6. NGS
4-6-1. 실험방법
Next generation sequencing (NGS) 분석을 진행하기 위해 Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 DNA의 농도를 측정하여 고품질의 genomic DNA가 적정량 추출되었는지 PCR에 의한 16S rRNA 유전자 증폭을 통하여 확인하였다. DNA를 추출한 직후 PCR을 진행하였고, 16S rRNA V3-V4 amplicon은 KAPA HIFI Hot Start Ready Mix(2x) (Cat. 07958935001, Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 증폭되었다. Illumina overhang adapter sequences가 포함된 universal bacterial 16S rRNA gene amplicon PCR primers가 사용되었다. 16S 유전자 라이브러리 구축, 정량화 및 sequencing을 위하여 AMPure XP 비드(Cat. A63881, Beckman coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 amplicon 제품에서 유리 프라이머 및 프라이머 이량체 종을 정제했다. Amplicon을 sequencing하기 위해 Nextera XT 인덱스 키트(Cat. FC-131-2001, Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 이중 인덱스와 Illumina sequencing 어댑터를 연결하고 AMPure XP 비드를 사용하여 amplicon을 다시 정제했다. sequencing은 제조업체의 지침에 따라 Illumina MiSeq 시스템(Illumina MiSeq, USA)을 사용하여 수행되었다. 마지막으로 library prep 과정에서 PCR 과정에서 간섭효과를 나타내는 chimeric sequence를 제거하여 고품질의 sequence를 얻었다.
4-6-2. 실험결과
문(Phylum) 수준에서 미생물을 동정한 결과는 도 31에 나타냈다. 전체 검출된 미생물의 총량에는 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 문 수준에서 Firmicutes 문과 Bacteroidota 문이 약 95%를 차지하였다. Firmicutes 문과 Bacteroidota 문의 비율에는 NC 그룹(1.89)과 PM 그룹(1.80) 간의 큰 유의적인 차이가 나타나지 않았지만, EM 40 그룹(3.64)에서는 Bacteroidota/Firmicutes 비율에서 유의적으로 증가한 것을 확인하였다.
과(Family) 수준에서 상위 25종을 동정하여, 도 32에 나타냈다. Muribaculaceae, Prevotellaceae, Rikenellaceae, Ruminococcaceae, Tannerellaceae Lactobacillaceae 과는 항염증의 역할을 하는 미생물로 이들은 NC 그룹에 대비 PM 그룹에서 각각 0.78, 0.61, 0.70, 0.38, 0.41, 0.28로 나타났으며, EM 40 그룹에서는 각각 1.36, 1.03, 1.08, 0.66, 1.02, 0.59로 PM 그룹에 비해 유의적으로 개선되었다. Helicobacteraceae, Bacteroidaceae, Oscillospiraceae 과는 염증 반응을 촉진시키는 미생물로 이들은 NC 그룹에 대비 PM 그룹에서 각각 4.55, 1.41, 1.66으로 나타났으며, EM 40 그룹에서는 각각 1.43, 1.11, 0.84로 PM 그룹에 비해 유의적으로 개선되었다.
속(Genus) 수준에서 상위 25종을 동정하여, 도 33에 나타냈다. Muribaculaceae, Alistipes, Ruminococcus, Parabacteroides, Alloprevotella, Lactobacillus 속은 항염증의 역할을 하는 미생물로 이들은 NC 그룹에 대비 PM 그룹에서 각각 0.75, 0.79, 0.31, 0.77, 0.55, 0.30으로 나타났으며, EM 40 그룹에서는 각각 1.27, 1.20, 0.52, 1.64, 2.18, 0.44로 PM 그룹에 비해 유의적으로 개선되었다. Oscillibacter, Helicobacter, Bacteroides 속은 염증 반응을 촉진시키는 미생물로 이들은 NC 그룹에 대비 PM 그룹에서 각각 1.89, 3.36, 2.44로 나타났으며, EM 40 그룹에서는 각각 1.12, 0.94, 1.32로 PM 그룹에 비해 유의적으로 개선되었다.
실시예 5. 말차 추출물의 추출시간 및 추출온도에 따른 효과
말차 추출물의 추출시간별 수율과 항산화활성 효과를 실험한 결과 수율은 표 1과 같고 항산화활성 효과 차이는 도 34와 같다.
| 0.5 h | 1 h | 2 h | 6 h | |
| 20℃ | 25.88±0.63b | 26.53±2.52b | 26.75±1.61b | 29.48±2.27a |
| 40℃ | 28.17±2.10ab | 30.55±1.52a | 30.07±1.32a | 29.02±1.48a |
| 80℃ | 27.65±1.80ab | 30.62±1.83a | 32.92±2.09a | 31.79±2.08a |
이러한 결과를 바탕으로 본 발명의 말차 추출물의 추출시간 및 추출온도를 준비예 1에서와 같이 40℃의 증류수에서 2시간으로 설정하였다.
실시예 6. 말차 추출물과 녹차 잎 추출물의 비교실험
6-1. 실험방법
말차의 활성을 평가하기 위해 40 g의 말차와 가공 전의 잎 녹차를 50배의 증류수를 이용하여 40℃ 에서 환류 냉각하여 2시간 동안 추출한 후, 추출액을 No. 2 여과지(Whatman PLC, Kent, UK)로 여과하여 진공농축기(N-N series, Eyela Co., Tokyo, Japan)로 농축하였다. 농축된 시료는 동결건조기 (Operon, Gimpo, Korea)를 이용하여 동결건조하였고, 이를 -70℃에서 보관하여 실험에 사용하였다.
6-2. 실험결과
6-2-1. 카테킨 함량 비교
catechin의 함량을 HPLC 분석을 이용하여 나타내었다 (표 2). 잎 녹차 추출물에 함유되어 있는 catechin (EGC, EC, ECGC, ECG) 함량은 각각 39.27, 5.22, 38.18, 10.57 mg/g extract 으로 나타났으며, 말차 추출물에 함유되어 있는 catechin (EGC, EC, ECGC, ECG) 함량은 각각 49.49, 8.74, 50.24, 13.75 mg/g extract으로 확인되어 잎 녹차 추출물에 비해 말차 추출물의 catechin 함량이 각각 1.2, 1.6, 1.3, 1.3배 우수한 것을 확인하였다.
| EGC | EC | EGCG | ECG | Total catechin |
|
| 녹차잎 추출물 | 39.27±0.58b | 5.22±0.21b | 38.18±0.08b | 10.57±0.07b | 93.24±0.33b |
| 말차 추출물 | 49.49±0.12a | 8.74±0.06a | 50.24±0.57a | 13.75±0.11a | 122.22±0.21a |
6-2-2. 항산화 활성 비교
말차와 녹차 잎 추출물의 항산화 활성을 비교해 보고자 총 페놀성 화합물 함량, 총 플라보노이드 화합물 함량, ABTS 및 DPPH 라디칼 소거활성 및 말론다이알데하이드 (Malondialdehyde, MDA) 저해활성을 평가하였다 (표 3). 말차 추출물의 총 페놀성 화합물 함량은 325.00 mg of GAE/g로 녹차 잎 추출물(235.92 mg of GAE/g)보다 우수한 함량을 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량 역시 말차 추출물 (104.24 mg of RE/g)이 녹차 잎 추출물 (83.87 mg of RE/g)보다 우수한 함량을 보였다. 항산화 활성을 평가하고자 ABTS 및 DPPH 라디칼 소거 활성을 확인하였으며, 말차 추출물[ABTS (IC50=276.56 μg/mL) / DPPH (IC50=321.05 μg/mL) 라디칼 소거활성]이 녹차 잎 추출물[ABTS (IC50=310.48 μg/mL) / DPPH (IC50=380.98 μg/mL) 라디칼 소거활성] 보다 우수한 항산화 활성을 나타내었다. 또한, 말차 추출물(IC50=59.98 μg/mL)이 녹차 잎 추출물(IC50=68.15 μg/mL)보다 우수한 지질과산화물 억제 활성을 나타내었다.
| TPC1 | TFC2 | ABTS3 | DPPH4 | MDA5 | |
| Catechin | - | - | 157.25±3.57 | 128.21±5.18 | 22.78±1.01 |
| 녹차 잎 추출물 | 235.92±1.25b | 83.87±1.03b | 310.48±2.48a | 380.98±5.15a | 68.15±3.57a |
| 말차 추출물 | 325.00±7.35a | 104.24±5.17a | 276.56±4.25b | 321.05±3.24b | 59.98±2.48b |
1TPC, 총 페놀성 화합물 함량; 2TFC, 총 플라보노이드 화합물 함량; 3ABTS, ABTS 라디칼 소거 활성; 4DPPH, DPPH 라디칼 소거 활성; 5MDA, malondialdehyde (MDA) 억제 활성.
Claims (12)
- 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 추출물은 물 또는 유기용매 추출법으로 추출되는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 초미세먼지로 인한 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환인 것을 특징으로 하며,상기 호흡기 질환은 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만 성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것으로 하고,상기 뇌 신경 질환은 뇌졸중, 알츠하이머 병, 치매 및 파킨슨병 중 어느 하 나인 것으로 하며,상기 피부 질환은 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 무좀, 건선, 습진 또는 주사(rosacea) 중 어느 하나인 것으로 하고,상기 장 질환은 궤양성 대장염, 크론병, 장형 베체트병, 출혈성 직장 궤양, 장 병변 및 화장낭염 중 어느 하나인 것인, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 비강세포 (RPMI-2650), 폐세포 (A549), 뇌신경세포 (HT22), 피부세포(Primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29) 중 어느 하나 이상의 세포에서 세포 내 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시키는 효과를 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 비강세포 (RPMI-2650), 폐세포 (A549), 뇌신경세포 (HT22), 피부세포(Primary dermal fibroblast) 및 장세포(HT29) 중 어느 하나 이상의 세포에서 초미세먼지 (PM2.5)로 인한 세포독성에 대한 세포 생존율이 증가되는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 폐조직, 뇌조직, 피부조직 및 장조직 중 어느 하나 이상의 조직에서 GSH 활성 측정값을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 폐조직, 뇌조직, 피부조직 및 장조직 중 어느 하나 이상의 조직에서 SOD 활성 측정값을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 초미세먼지 (PM2.5) 유도성 폐조직, 뇌조직, 피부조직 및 장조직 중 어느 하나 이상의 조직에서 MDA 함량 측정값을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 조성물은 초미세먼지 (PM2.5)가 처리된 상태에서 TNF-α, p-JNK, BAX, COX-2, interleukin-1β의 발현을 억제시키는 효과를 특징으로 하는, 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 중 어느 하나인 것인, 건강기능식품 조성물.
- 말차 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물에서, 상기 염증성 질환은 호흡기 질환, 뇌 신경 질환, 피부 질환 및 장 질환 중 어느 하나인 것인, 화장료 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 질환 예방 또는 치료방법.
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