KR20240064161A - 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물 및 이의 제조방법 - Google Patents
항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물 및 이의 제조방법과 용도에 관한 것이다. 본 발명에서 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 제조하는 방법은, 오림산을 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택된 용매로 추출하여 오림산 추출물을 얻는 단계와; 상기 오림산 추출물에 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 가하고 생물전환시켜 생물전환된 오림산 추출물을 얻는 단계와; 상기 생물전환된 오림산 추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 얻는 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 오림산 추출물의 생물전환 분획물은 우수한 항산화 및 항염활성을 지닌 새로운 소재로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물 및 이의 제조방법과 용도에 관한 것이다.
산화스트레스(Oxidative stress)는 활성산소의 생성과정에서 반응성 중간생성물을 해독하거나 활성산소로 인한 손상을 복구하는 생물학적 능력이 부족할 때 발생한다. 세포의 정상적인 산화환원상태가 교란되면 단백질, 지질 및 DNA를 포함한 세포의 모든 구성요소들을 손상시킬 수 있는 과산화물 및 자유라디칼이 생성되어 독성효과가 발생할 수 있다. 세포호흡으로 인한 산화스트레스는 DNA의 염기를 손상시키고 DNA 가닥을 파괴할 수 있다. 염기의 손상은 대부분 간접적이며 생성된 활성산소, 예를 들어 O2·-(초과산화물 라디칼), HO·(하이드록실 라디칼) 및 H2O2(과산화 수소)에 의해 발생한다. 또한 일부 활성산소는 산화환원 신호전달과정에서 메신저로 작용하므로 산화스트레스는 정상적인 세포신호전달의 메커니즘을 방해할 수 있다. 이러한 산화스트레스는 염증반응, 암세포성장촉진, 동맥경화유발 등 다양한 만성질환으로 이어지는 것으로 알려져 있다.
염증(inflammation)은 유해한 자극에 대한 생체조직의 방어반응 중 하나로 면역세포, 혈관, 염증 매개체들이 관여하는 보호반응이다. 염증의 목적은 세포의 손상을 초기 단계에서 억제하고, 상처부분의 파괴된 조직 및 괴사된 세포를 제거하는 동시에 조직을 재생하는 것이다. 염증반응을 일으키는 물질로는 병원체, 손상된 세포, 자극물질, 위험신호 등이 있다. 염증반응이 만성적으로 일어나게 되면 염증매개물질이 과도하게 분비되고 그 결과 암세포성장촉진, 인슐린저항성증가, 동맥경화유발 등 다양한 병리학적 기전을 초래한다고 보고되고 있다.
따라서 산화스트레스나 활성산소를 감소시키는 항산화활성을 가진 물질과 항염활성을 가지는 물질에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있다. 그러나 지금까지 개발된 항산화 및 항염제는 안전성 문제가 있어 사용이 일부 제한되고 있다. 이에 보다 안전한 천연물질 소재의 항산화 및 항염제의 개발이 요구되고 있으며 관련 연구가 진행되고 있다.
한약은 동물, 식물 또는 광물에서 채취되어 주로 원형대로 건조, 절단 또는 정제된 생약으로서 질병의 예방이나 치료를 위하여 천연물 또는 가공된 약제를 혼합하여 조제한 약물을 의미한다. 최근에는 한약재의 추출기술이 발전되고 각종 제형기술이 발달되면서 한약재의 약효가 향상되고 휴대가 용이하며 기호성이 강화된 한약 관련 제품이 개발되어 한약의 대중화 및 보급에 기여하고 있다.
오림산(五淋散, Ohrim-san)은 작약, 치자, 당귀, 복령, 감초 및 황금을 포함한 약재로 급성 방광염 또는 요도염 등에 처방된다. 많은 한약재나 생약이 항산화 또는 항염활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 관련 활성성분을 함유하는 것으로 밝혀진 경우도 많다. 그러나 한약재나 생약이 실제 동물실험 이상에서 단독으로 뚜렷하게 항산화나 항염 효과를 나타내는 경우는 많지 않으며, 한약재나 생약에서 항산화 및 항염 효과를 유의미할 정도로 증가시키는 것 또한 쉽지 않다.
생물전환(bioconversion)이란 미생물을 이용하여 전구물질로부터 새로운 산물을 제조하는 기술로 최근에 연구가 활발히 이루어지고 있다. 발효는 예로부터 이용되어진 친환경적인 공법이며, 이를 응용한 생물전환기술은 낮은 비용으로 생산량을 높일 수 있고, 전구물질로부터 효소의 기질특이성을 이용하여 새로운 산물을 제조할 수 있다. 따라서, 기존에 개발된 제재들의 안전성 문제가 대두되고 있는 시점에 생물전환과 같은 친환경적인 기술은 주목을 받고 있으며 이에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
생물전환에는 다양한 미생물들이 이용되고 있다. 생물전환에 이용되는 미생물들 중 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)는 흑국균으로 당화효소나 유기산 생산능력이 강하기 때문에 술을 양조하는데 많이 이용되고 있으며 탁주의 입국제조에 사용되고 있어 안정성 문제에서도 자유로운 장점이 있다.
본 발명은 오림산 추출물을 아스퍼질러스 카와치로 생물전환하고 에틸아세테이트로 분획한 생물전환 분획물이 오림산 추출물에 비해 크게 증가된 우수한 항산화활성과 항염활성이 있음을 확인하고, 이 생물전환 분획물을 오림산 유래의 항산화 및 항염활성을 지닌 새로운 소재로 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 이의 제조방법과 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,
오림산을 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택된 용매로 추출하여 오림산 추출물을 얻는 단계와;
상기 오림산 추출물에 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 가하고 20~40℃에서 10~30시간 동안 생물전환시켜 생물전환된 오림산 추출물을 얻는 단계와;
상기 생물전환된 오림산 추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 얻는 단계를 포함하는, 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는,
오림산을 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택된 용매로 추출하고 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환 한 후 에틸아세테이트로 분획하여 얻은, 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는, 상기 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 여기서 식품은 건강기능식품, 건강보조식품, 기능성 식품, 일반 식품을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물은, 생물전환하지 않은 오림산 추출물의 분획물에 비해 항산화 및 항염활성이 크게 증가되었다.
따라서 본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물은 우수한 항산화 및 항염활성을 지닌 새로운 소재로 이용될 수 있다. 특히 항산화 및 항염증용 조성물에 유효성분으로 사용되어, 산화스트레스와 염증반응에 의해 유발되는 다양한 질병에 대한 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 또한, 오림산에서 유래되고 세포독성 시험을 통해 안전성이 확인된 소재이므로 건강기능식품, 건강보조식품, 기능성 식품, 일반 식품을 포함하는 다양한 식품 조성물에 항산화 또는 항염 활성을 위한 유효성분 또는 첨가제로 이용될 수 있다.
도 1은 오림산 추출물을 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 에틸아세테이트 분획물에 대한 UPLC 크로마토그램을 비교한 것이다.
도 2는 오림산 추출물을 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 에틸아세테이트 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인한 결과이다. 도 2에서 B.B는 생물전환 전(비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액 처리), A.B는 생물전환 후(활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액 처리)를 나타낸다.
도 3의 (A)는 생물전환 전과 후의 오림산 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 대해 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서의 세포독성을 확인한 결과이고, (B)는 NO 생성량을 확인한 결과이다.
도 4는 오림산 추출물의 생물전환 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 오림산 추출물의 생물전환 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성을 억제하는 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 오림산 추출물을 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 에틸아세테이트 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인한 결과이다. 도 2에서 B.B는 생물전환 전(비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액 처리), A.B는 생물전환 후(활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액 처리)를 나타낸다.
도 3의 (A)는 생물전환 전과 후의 오림산 추출물의 에틸아세테이트 분획물에 대해 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서의 세포독성을 확인한 결과이고, (B)는 NO 생성량을 확인한 결과이다.
도 4는 오림산 추출물의 생물전환 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 오림산 추출물의 생물전환 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성을 억제하는 효과를 확인한 결과이다.
본 발명은 오림산 추출물을 생물전환 한 후 분획하여 얻은 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. 이하 각각에 대해 상세하게 설명한다.
오림산 추출물의 생물전환 분획물의 제조방법
항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물의 제조방법은, 오림산 추출물을 얻는 단계, 오림산 추출물을 생물전환하는 단계, 생물전환된 오림산 추출물을 분획하여 항산화 및 항염활성이 증가된 분획물을 얻는 단계를 포함한다. 이하 바람직한 구현예에 의거하여 각 단계별로 상세하게 설명한다.
오림산 추출물을 얻는 단계
오림산은 일반적인 한방 처방에 따라 작약, 치자, 당귀, 복령, 감초 및 황금을 배합하여 제조할 수 있다. 일반적으로 작약 85.68, 치자 85.68, 당귀 42.84, 복령 42.84, 감초 21.48, 황금 21.48의 중량비로 혼합하여 제조한다. 그러나 반드시 이 비율로만 한정되는 것은 아니고 목적하는 효능, 용도, 상황에 따라 성분이나 함량을 일부 조정할 수도 있으며, 추가적으로 다른 성분을 더 포함할 수도 있다.
상기 오림산에 용매를 가하고 추출한다. 이때 용매는 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택하여 사용한다. 바람직하게는 물 및 C2에서 C4의 탄소골격을 갖는 알코올 화합물 중에서 선택하여 사용하며, 더욱 바람직하게는 물, 30% 에탄올 및 70% 에탄올 중에서 선택하여 사용한다. 여기서 '물'은 증류수, 정제수, 생수 등을 모두 포함하는 개념이다. 바람직하게는 증류수나 정제수 같이 불순물을 제거한 물을 사용한다. 상기 추출은 바람직하게는 환류 추출 방법을 사용하나, 이에 한정되지는 않는다. 오림산과 용매는 1:8~15의 혼합비율(w/v)로 혼합하는 것이 바람직하고, 1:8~12의 혼합비율(w/v)로 혼합하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 환류 추출의 경우 바람직하게는 2~5시간 동안 이루어질 수 있으며 2회 이상 반복하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
필요에 따라, 위와 같이 얻어진 오림산 추출물을 감압농축하고 동결건조하여 오림산 분말 추출물을 얻는 단계와, 상기 오림산 분말 추출물에 증류수를 가하여 현탁액을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다. 현탁액을 제조할 때 오림산 추출물과 증류수는 1:8~15의 혼합비율(w/v)로 혼합하는 것이 바람직하고, 1:8~12의 혼합비율(w/v)로 혼합하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이렇게 분말형태의 오림산 추출물을 얻은 경우에는 증류수를 가한 현탁액을 다음 단계에서 생물전환에 사용한다.
생물전환하는 단계
상기 단계에서 얻은 오림산 추출물 또는 현탁액을 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii) 조효소액을 이용하여 생물전환한다.
본 발명에서 '아스퍼질러스 카와치 조효소액'은 아스퍼질러스 카와치를 배양한 배양액을 여과 및 원심분리하여 얻은 상등액으로 정의된다. 아스퍼질러스 카와치 조효소액은, 바람직하게는, 아스퍼질러스 카와치를 밀기울과 증류수를 포함하는 배지에서 2~15일 배양시키는 단계; 상기 배양액에 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)를 가하고 0~10℃에서 10~30시간 동안 방치하는 단계; 및 여과 및 원심분리하여 상등액인 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의하여 얻을 수 있다.
상기 단계에서 얻은 오림산 추출물 또는 현탁액에 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 가하고 일정 시간 효소반응시켜 생물전환이 일어나도록 한다. 바람직하게는, 오림산 추출물 중량의 8~12배 부피의 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 혼합하고 20~40℃에서 10~30시간 동안 반응시킬 수 있고, 더욱 바람직하게는 30±5℃ 정도에서 약 18시간 동안 반응시킬 수 있다. 그러나 온도와 시간이 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자는 효소반응이 잘 이루어지도록 온도와 시간을 적절하게 조절할 수 있다.
분획물을 얻는 단계
상기 단계에서 얻은 생물전환된 오림산 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc)로 분획하여 항산화 및 항염활성이 우수한 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 얻는다.
본 발명은 또한 상기와 같은 방법으로 얻은 오림산 추출물의 생물전환 분획물에 관한 것이다.
오림산 추출물의 생물전환 분획물
본 발명에서 오림산 추출물의 생물전환 분획물은, 오림산을 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택된 용매로 추출하고 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환 한 후 에틸아세테이트로 분획하여 얻은, 항산화 및 항염활성이 증가된 분획물이다.
용매 등 구성에 대한 설명은 위의 제조방법에서와 동일하다.
아래 시험예에서 확인되는 바와 같이, 오림산 추출물은 생물전환 한 후 에틸아세테이트로 분획한 생물전환 분획층에서 생물전환 전 분획층에 비해 항산화 및 항염활성이 크게 증가되었다.
항산화활성은 DPPH 라디칼 소거활성으로 평가하였다. 100ppm(100 ㎍/㎖)으로 처리했을 때, 비활성화된 조효소액을 처리한 분획물(비교예 1)에 비해 본 발명의 생물전환 분획물(실시예 1)이 약 29% 이상 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타냈다(도 2). 분획물의 처리 농도를 달리하여 12.5ppm, 25ppm, 50ppm으로 처리했을 때도 농도 의존적으로 소거활성이 증가했고, 생물전환 분획물이 모두 비활성화된 조효소액을 처리한 분획물에 비해 높은 DPPH 라디칼 소거활성을 나타냈다.
항염 활성은 NO 생성량으로 평가하였다. RAW 264.7 cell에 LPS를 처리했을 때, 생물전환되지 않은 분획물로 처리힌 경우는 NO의 생성량이 농도 의존적으로 약간 감소하는데 불과했으나, 본 발명의 생물전환 분획물로 처리한 경우는 NO 생성이 크게 감소하였다. 특히 본 발명의 생물전환 분획물을 50ppm으로 처리한 경우에 NO생성량은 3.56±1.01%까지 크게 감소하였다.(도 3B).
또한, RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 효과를 확인하였다. 오림산 추출물의 생물전환 전과 후의 분획물을 처리했을 때, 생물전환 분획물에서만 iNOS mRNA 발현 억제에 크게 관여하는 것으로 나타났다. 본 발명의 생물전환 분획물로 처리했을 때 COX-2생산 억제활성이 크게 증진되었는데, 이는 세포 내에 유발되는 일련의 염증반응이 억제되었음을 의미한다. 25ppm(㎍/㎖)으로 처리했을 때 iNOS의 발현량이 0.52배 감소했으며, 50ppm(50 ㎍/㎖)으로 처리했을 때는 0.13배까지 감소했다 (도 4). 이러한 결과는 본 발명의 생물전환 분획물이 iNOS와 COX-2의 발현 억제를 통해 NO의 생성 저해를 유도한다는 것을 의미한다.
또한, RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성을 억제하는 효과를 확인하였다. 생물전환 분획물은 LPS 처리 전에 25 및 50 ppm의 농도로 전처리하였을 때, IL-1β 농도는 대조군(LPS)에 비하여 현저하게 감소하였고, 시료농도가 높을수록 IL-1β 생성은 점차적으로 감소되는 결과를 보였다. 또한, 동일 농도에서 IL-6 및 TNF-α도 유의적으로 감소하였다 (도 5). 이러한 결과는 본 발명의 생물전환 분획물이 아스퍼질러스 카와치 조효소액에 의해 생물전환되면서 염증성 사이토카인 생산 억제활성이 증진되었음을 보여준다.
이상과 같이, 오림산 추출물은 생물전환 후 에틸아세테이트 분획으로 항산화 및 항염 활성이 크게 증가되었다. 따라서 오림산 추출물의 생물물전환된 에틸아세테이트 분획물은 우수한 항산화 및 항염활성을 지닌 새로운 소재이자 안전한 소재로 의약품, 한약제제, 건강기능식품, 건강보조식품, 일반식품 등을 포함한 여러 분야에서 다양하게 이용될 수 있다.
오림산
추출물의 생물전환
분획물의
용도
본 발명에서는, 상기 오림산 추출의 생물전환 분획물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 본 발명에서 '식품'은 건강기능식품, 건강보조식품, 기능성 식품, 일반 식품을 모두 포함하는 것으로 정의된다. 따라서 상기 식품 조성물은 건강기능식품, 건강보조식품, 기능성 식품, 일반 식품 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
식품 조성물에서 상기 분획물은 유효성분으로 단독으로 포함되거나 다른 유효성분에 첨가되거나 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 식품소재의 사용 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 오림산 추출물의 생물전환 분획물은 항산화 및 항염활성으로 식품 조성물에 항산화 또는 항염활성을 부여할 수 있으며, 또한 오림산으로부터 유래된 소재로서 안전하며 오림산의 효능도 일정 부분 기대할 수 있다.
상기 오림산 추출물의 생물전환 분획물이 포함되는 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합체 등이 있다.
또한, 본 발명에서는 상기 오림산 추출물의 생물전환 분획물의 용도의 하나로 이를 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물을 제공한다. 조성물은 한약제제, 약학 조성물, 건강기능식품, 건강보조식품 등의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 상기 분획물은 기존 한약제제나 건강기능식품, 건강보조식품 등에 항산화 또는 항염 활성을 부여하기 위한 용도의 첨가제로도 사용될 수 있다.
오림산 추출물의 생물전환 분획물을 조성물 중에 항산화 또는 항염을 위한 유효성분으로 사용할 때의 사용량은 그 사용 목적(예방, 건강 증진, 개선 또는 치료)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 약학 조성물, 건강기능식품에 포함되는 오림산 추출 분획물의 함량은 1회 복용량을 기준으로 1~1,000㎎으로 포함되는 것이 바람직하며, 음료 등의 식품 제조시의 함량은 1회 용량을 기준으로 10~5,000㎎으로 포함되는 것이 바람직하다. 그러나 예방 및 건강 증진을 목적으로 하거나 또는 이러한 목적으로 하는 장기간 복용 또는 섭취하는 경우 함량은 상기 범위 이하로도 가능하며, 필요 시에는 상기 범위를 초과한 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 음료 형태로 사용할 경우에는, 통상의 음료와 마찬가지로 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 텍스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 포함하는 조성물은, 필요에 따라 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 이 밖에도 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수도 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1>
오림산 추출물의 제조
작약, 치자, 당귀, 복령, 감초 및 황금을 하기 표 1의 배합비로 혼합하여 오림산을 준비하였다.
| 종류 | 함량(g) |
| 작약 | 85.68 |
| 치자 | 85.68 |
| 당귀 | 42.84 |
| 복령 | 42.84 |
| 감초 | 21.48 |
| 황금 | 21.48 |
| 계 | 300.00 |
오림산 300g을 70% 에탄올 3.5ℓ에 넣고 3시간 동안 2회 환류추출하였다. 추출 후 여과하고 감압농축한 후 동결건조하여 분말형태의 오림산 추출물을 얻었다.
<제조예 2>
아스퍼질러스 카와치 조효소액의 제조
500㎖ 삼각플라스크에 밀기울 10g과 증류수 10㎖를 넣어 밀기울에 수분이 잘 흡수되도록 혼합하고 121℃에서 30분 동안 멸균하였다. 멸균 후 된장으로부터 분리한 균주인 아스퍼질러스 카와치 균주를 접종하여 30℃에서 5일 동안 배양하였다.
배양한 밀기울에 100mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer)(pH 7.0) 100㎖를 넣고 충분히 혼합한 후 4℃에서 18시간 동안 방치하였다.
방치 후 반응액을 거즈로 여과하고 10,000rpm에서 15분 동안 냉장 원심분리하여 그 상등액인 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 얻었다.
<비교제조예 1>
비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액의 제조
제조예 2에서 얻은 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 121℃에서 30분 동안 멸균하여 비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 얻었다.
<실시예 1>
오림산 추출물의 생물전환 분획물 제조
제조예 1의 분말형태의 오림산 추출물 10g을 증류수 100㎖에 현탁시킨 현탁액에 제조예 2의 아스퍼질러스 카와치 조효소액 100㎖를 첨가하고 30℃에서 100rpm으로 18시간 동안 반응시켰다.
반응 후 반응물을 에틸아세테이트로 분획하고 분획층을 감압농축기를 이용하여 농축하여 70% 에탄올로 추출한 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 얻었다.
<비교예 1>
오림산 추출물의 분획물 제조
제조예 2의 아스퍼질러스 카와치 조효소액 대신 비교제조예 1의 비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 70% 에탄올로 추출한 오림산 추출물의 분획물을 얻었다.
[시험예]
세포배양
쥐(Murine)의 대식세포주인 RAW264.7 세포는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다. 10%(v/v) FBS(inactivated fetal bovine serum), 100units/㎖ 페니실린 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 배양액으로 사용하여 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 2일 간격으로 계대배양하였다.
통계처리
실험결과는 3회 반복하여 측정한 후 평균±표준편차로 나타내었다. 각 실험구를 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 Student' t-test로 p < 0.05수준에서 검정하였다.
<시험예 1>
UPLC 분석
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물의 분획물의 UPLC 패턴변화를 다음과 같이 확인하였다.
시료로는 실시예 1의 70% 에탄올로 추출한 오림산 추출물을 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환 한 후 에틸아세테이트로 분획한 오림산 추출물의 생물전환 분획물과, 비교예 1의 비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 사용한 오림산 추출물의 분획물을 사용하였다.
분석 기기는 ACQUITY UPLC H-Class (Waters, USA)를 이용하였다. 분석은 ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×50mm, 1.7㎛)의 역상 컬럼을 사용하였으며, 이동상으로는 0.1% 포름산을 각각 포함하는 물(H2O; solvent A)과 메탄올(MeOH; solvent B)을 사용하였다. 컬럼에 샘플을 2㎕로 주입하고 280nm의 파장으로 분석하였다. 분석조건은 하기 표 2에 나타내었다.
| 칼럼 | ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm, 1.7㎛) | |||
| 파장 | 280nm | |||
| 온도 | 25℃ | |||
| 주입부피 | 2㎕ | |||
| 이동상 |
시간 (분) |
유속 (㎖/min) |
Solvent A(%): 0.1% F.A in H2O |
Solvent B(%): 0.1% F.A in MeOH |
| 0 | 0.2 |
100 | 0 | |
| 9 | 0 | 100 | ||
| 10 | 0 | 100 | ||
| 11 | 100 | 0 | ||
| 13 | 100 | 0 | ||
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물을 분획한 분획물의 UPLC 분석결과를 도 1에 나타내었다.
도 1의 결과에서와 같이, 오림산 추출물을 생물전환하기 전과 후의 에틸아세테이트 분획물에 대하여 UPLC 분석을 실시한 결과, 생물전환하기 전에는 주로 9분대 피크가 존재하였지만 생물전환 후에는 동일 분석조건에서 9분대 앞쪽으로 다수의 피크가 새로 생성되는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 생물전환으로 성분 분포 및 함량이 달라지는 것을 보여준다.
<시험예 2>
DPPH 라디칼 소거활성 확인
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물을 분획한 분획물의 항산화활성을 DPPH 라디칼 소거활성으로 확인하였다.
DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrayl)는 불안정한 라디칼 화합물로 에탄올에 용해시켰을 때 보라색으로 발색되지만 항산화활성을 가지는 시료를 처리하였을 때 환원되어 밝은 노란색으로 탈색되는 특징을 가지고 있다. 이러한 원리를 이용하여 항산화물질을 탐색하는데 사용되는 비교적 간단한 방법이다.
시료로는 실시예 1의 생물전환 분획물과 비교예 1의 분획물을 각각 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 사용하였다.
DMSO에 용해시켜 12.5㎍/㎖, 25㎍/㎖, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖의 농도로 준비한 각 시료 10㎕를 96-웰 플레이트에 분주하고 150μM DPPH 용액 190㎕를 혼합하여 어두운 곳에서 30분 동안 상온에서 반응시켰다. 반응시킨 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 DMSO와 DPPH 용액의 혼합액을 처리하였다.
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물의 분획물에 대해 DPPH 라디칼 소거활성을 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 B.B는 생물전환 전(비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액 처리), A.B는 생물전환 후(활성 아스퍼질러스 카와치 조효소액 처리)를 나타낸다. 대조군과 비교하였을 때 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001이고 에틸아세테이트 생물전환 분획물과 비교하였을 때 # P<0.05, ## P<0.01, ### P<0.001이다.
도 2의 결과에서, 생물전환 한 오림산 추출물의 생물전환 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성이 생물전환하지 않은 오림산 추출물의 분획물에 비해 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있다. 특히 100㎍/㎖(100ppm)의 농도에서, 비활성화된 조효소액을 처리한 시료가 59.42±1.87%의 항산화활성을 나타낸 반면 활성 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 처리한 시료의 경우 경우 88.61±0.23%의 높은 항산화활성을 나타내어, 생물전환에 의하여 DPPH 라디칼 소거활성이 29% 이상 증가한 것을 확인할 수 있다.
<시험예 3>
세포독성 확인
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물을 분획한 분획물의 세포독성을 다음과 같이 MTT 분석법으로 확인하였다.
96-웰 플레이트의 각 웰에 RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well의 세포밀도로 20㎕씩 분주하여 37°C, 5% CO2의 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
24시간 후 각 웰에 실시예 1의 활성 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 처리한 오림산 추출물의 생물전환 분획물(AB)과 비교예 1의 비활성화된 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 처리한 오림산 추출물의 분획물(BB)을 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖의 농도로 각각 처리하고 1시간 후 1㎍/㎖의 LPS를 처리한 후 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고, 혈청(serum)이 포함되지 않은 DMEM 배지에 0.5mg/㎖ 농도로 용해시킨 MTT 용액을 각 웰당 100㎕씩 처리해주고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양하였다.
배양 후 상등액을 제거하고 형성된 포르마잔(formazan)을 100㎕의 DMSO에 용해시켜 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 575nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구에는 DMSO만을 처리하고, LPS 처리군에는 1㎍/㎖의 LPS를 처리하였다.
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물의 분획물에 대해 세포독성을 확인한 결과를 도 3의 (A)에 나타내었다.
RAW 264.7 세포에 각 시료를 처리한 결과, DMSO만을 처리한 대조구와 비교하였을 때 세포생존율의 변화가 크게 없었다. 따라서 생물전환 전과 후의 오림산 추출물의 분획물 시료는 모두 세포독성의 문제가 없는 것으로 확인되었다.
<시험예 4>
NO 생성량 확인
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물의 분획물에 대해 항염활성을 NO 생성량으로 확인하였다.
시료로는 실시예 1과 비교예 1의 시료를 사용하였다.
RAW 264.7 세포로부터 생성되는 NO의 양을 세포배양액 중 존재하는 NO2 -의 형태로 그리스 시약(Griess reagent) 반응을 이용하여 측정하였다. 96-웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 5×104 cells/well의 세포밀도로 200㎕씩 분주하고 24시간 동안 배양하였다.
24시간 후 각 웰에 실시예 1의 오림산 추출물의 생물전환 분획물(AB)과 비교예 1의 오림산 추출물의 분획물(BB)을 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖의 농도로 각각 1시간 동안 전처리하고 1시간 후 1㎍/㎖의 LPS를 처리하고 동일한 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
24시간 동안 배양한 후 새로운 96-웰 플레이트에 배양상등액 100㎕를 넣고 동량의 그리스 시약 [1% (w/v) sulfanilamide in 5% (v/v) phosphoric acid와 0.1% (w/v) naphtylethylenediamine-HCl)]을 혼합한 다음 10분 동안 암소에서 반응시켰다.
반응 후 ELISA 판독기(ELISA reader)를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군에는 무처리하였고, LPS 처리군에는 1㎍/㎖의 LPS만을 처리하였다.
그 결과를 도 3의 (B)에 나타내었다.
RAW 264.7 세포에 1㎍/㎖의 LPS를 처리하여 NO 생성량을 증가시켰을 때, 무처리 대조군에 비하여 NO 생성량이 100±4.06%까지 증가하였다. 비교예 1의 시료를 처리하였을 때 NO 생성량은 농도의존적으로 약간 감소하였다. 반면 활성 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 처리하여 생물전환한 오림산 추출물의 생물전환 분획물에서는 NO 생성량이 농도의존적으로 감소하였으며 50㎍/㎖ 농도에서 NO 생성량이 3.56±1.01%까지 감소하였다.
<시험예 5>
염증성 사이토카인의 mRNA 발현 측정
아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환하기 전과 후의 오림산 추출물을 에틸아세테이트로 분획한 분획물의 항염활성을 염증성 사이토카인의 mRNA 발현으로 확인하였다.
염증성 사이토카인의 mRNA 발현은 RT-PCR 실험으로 확인하였다.
시험예 4에서의 RAW 264.7 세포로부터 총 RNA(Total RNA)는 트리졸 시약(Trizol reagent)을 사용하여 추출하였다. PrimeScriptTM 1st 스트랜드 cDNA 합성키트(PrimeScriptTM 1st strand cDNA synthesis kit; Takara, Japan)를 사용하여 총 RNA에서 cDNA를 합성하였다.
추출된 전체 반응용량 20㎕를 42℃에서 45분 동안 반응시키고 95℃에서 5분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 20배 희석하여 사용하였다. iNOS(inducible NO synthase), COX-2, TNF-α, IL-6, IL-1β 및 β-액틴(β-actin) 유전자의 발현은 희석한 합성된 cDNA 2㎕에 10×ExTaq 버퍼(Takara, Japan) 5㎕, Taq DNA 폴리머라제(5U/㎕; Takara, Japan) 0.25㎕, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 및 IL-1β 유전자에 특이적인 센스(sense) 및 안티센스(antisense) 프라이머(10pM/㎕) 각각 1㎕, 2.5 mM dNTP 4㎕ 및 RNase 프리(RNase free) 증류수 36.75㎕를 넣어 전체 반응용량 50㎕를 핵산증폭기(Takara, Japan)를 사용하여 98℃에서 5초 동안 변성(denaturation)시켰다. 이어서 98℃에서 10초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 1분으로 이루어진 사이클 30회로 증폭시켰다. PCR 반응 후 증폭된 반응산물을 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 증폭유무를 확인하였다.
오림산 추출물의 생물전환 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 효과를 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.
iNOS의 경우, 비교예 1의 생물전환 전 오림산 추출물의 분획물을 처리하였을 때에도 LPS(1㎍/㎖) 처리군에 비해 iNOS mRNA 발현이 억제되는 효과가 약간 있었다. 그러나, 실시예 1의 생물전환 후 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 처리하였을 때 iNOS mRNA 발현량이 25㎍/㎖ 농도에서 0.52배 및 50㎍/㎖ 농도에서 0.13배까지 감소하여 iNOS mRNA 발현량을 농도의존적으로 현저하게 억제하는 것을 확인하였다.
COX의 경우, COX는 COX-1과 COX-2의 2가지 동형단백질(isoform) 형태로 존재하고 염증반응에는 COX-2가 작용을 하므로 COX-2의 생산을 억제하는 효과를 확인하였다. 그 결과, LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서는 다량의 COX-2가 생산되었으며, 비교예 1의 생물전환 전 오림산 추출물의 분획물은 25㎍/㎖ 및 50㎍/㎖의 농도에서 COX-2의 생산을 미약하게 억제하였지만, 실시예 1의 생물전환 후 오림산 추출물의 생물전환 분획물의 경우 50㎍/㎖ 농도에서 상대적으로 높은 COX-2 생산 억제효과를 나타냈다.
이와 같이 본 발명의 생물전환시킨 오림산 추출물의 생물전환 분획물은 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하여 NO의 생성 억제를 유도하는 것을 확인할 수 있었다.
또한 오림산 추출물의 생물전환 분획물이 RAW 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도된 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성을 억제하는 효과를 확인한 결과를 도 5에 나타내었다.
IL-1β, IL-6, TNF-α 등은 선천적 면역반응에서 나타나는 가장 중요한 염증매개물질로 과도하게 생성되면 전신적인 염증질환을 초래할 수 있다.
RAW 264.7 대식세포에 1㎍/㎖의 LPS를 처리한 LPS 처리군에서 염증촉진 매개물질인 IL-6, IL-1β와 및 TNF-α의 농도는 LPS 무처리군인 대조군(CNT)에 비하여 상당히 크게 증가하였다.
생물전환 후 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 LPS 처리 1시간 전에 25㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖의 농도로 전처리하였을 때, IL-1β 농도는 LPS 처리군에 비하여 현저하게 감소하였고 시료농도가 높을수록 IL-1β 생성이 점차적으로 감소되어 농도의존적으로 IL-1β의 생성을 감소시키는 것으로 확인되었다. 또한 IL-6 및 TNF-α의 생성도 동일 농도에서 유의적으로 감소하였다.
상기 도 4와 5의 결과에서, 본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물은 염증성 사이토카인인 iNOS, COX-2의 발현을 억제하고 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 억제하여 항염활성을 가진 것으로 확인되었다.
본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물은, 생물전환하지 않은 분획물에 비해 항산화활성 및 항염활성이 매우 우수하므로, 항산화 및 항염 활성을 지닌 새로운 소재로 이용될 수 있다. 본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물은, 의약품, 한약제제, 건강기능식품, 건강보조식품, 일반식품 등을 포함한 다양한 분야에서 항산화 또는 항염활성의 유효성분 또는 첨가제로 이용될 수 있다. 본 발명의 오림산 추출물의 생물전환 분획물은, 특히 항산화 및 항염증용 조성물의 유효성분으로 사용되어 산화스트레스와 염증반응에 의해 유발되는 다양한 질병에 대한 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
이상에서 설명된 본 발명의 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물 및 이의 제조방법과 용도는 예시적인 것이며, 본 발명이 속한 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 타 실시예가 가능하다는 점을 잘 알 수 있을 것이다. 그러므로 본 발명은 상기 발명의 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이고, 본 발명의 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신과 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
Claims (4)
- 오림산을 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택된 용매로 추출하여 오림산 추출물을 얻는 단계와;
상기 오림산 추출물에 아스퍼질러스 카와치 조효소액을 가하고 20~40℃에서 10~30시간 동안 생물전환시켜 생물전환된 오림산 추출물을 얻는 단계와;
상기 생물전환된 오림산 추출물을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 얻는 단계를 포함하는, 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물의 제조방법. - 오림산을 물 및 C1에서 C5의 탄소골격을 갖는 극성 유기용매 중에서 선택된 용매로 추출하고 아스퍼질러스 카와치 조효소액으로 생물전환 한 후 에틸아세테이트로 분획하여 얻은, 항산화 및 항염활성이 증가된 오림산 추출물의 생물전환 분획물.
- 제2항의 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항염증용 조성물.
- 제2항의 오림산 추출물의 생물전환 분획물을 포함하는 식품 조성물.
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