KR101719672B1

KR101719672B1 - 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 연 추출물 유래의 화합물을 함유하는 조성물

Info

Publication number: KR101719672B1
Application number: KR1020150068781A
Authority: KR
Inventors: 김순일; 장명진; 안용준
Original assignee: 김순일; 안용준
Priority date: 2015-05-18
Filing date: 2015-05-18
Publication date: 2017-03-27
Also published as: KR20160135881A

Abstract

본 발명은 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 연 추출물 유래의 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 연 추출물에서 분리된 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)을 함유하는 항산화 조성물과 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 연 추출물에서 분리된 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)은 우수한 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 나타내므로, 천연물 유래의 신규 항산화제 또는 기억력 증진제로 이용이 가능하다.

Description

항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 연 추출물 유래의 화합물을 함유하는 조성물 {Composition Containing Compounds Having Anti-oxidant Activity and Acetylcholinesterase Inhibition Activity Derived from Nelumbo nucifera}

본 발명은 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 연 추출물 유래의 화합물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 연 추출물에서 분리된 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)을 함유하는 항산화 조성물과 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.

다양한 활성산소는 호기성 메커니즘에서 생기는 부산물로, 만약 활성산소의 양이 증가하여 항산화 물질이 처리할 수 있는 범위를 벗어나게 되면 효소, DNA, 단백질 등이 파괴된다. 이로 인해 심장질병, 알츠하이머, 뇌질환을 초래하게 된다. 항산화 물질은 이러한 산화적 스트레스를 줄임으로써 다양한 질병을 예방할 수 있다.

호기성 조건에서 생명체는 자유 라디칼들의 지속적인 생성은 불가피한데, 세포 내 호기성 대사과정의 부산물로서 다양한 반응 산소종들(reactive oxygen species, ROS)이 생성되기 마련이다(Apel, K. and Hirt, H., Annu. Rev. Plant Biol. 55: 373~399, 2004). 반응 산소는 에너지 공급, 무독화, 화학신호 및 면역반응에서 중요하지만 자유 라디칼들의 생성이 생체계의 항산화력을 초과해서 생성되면 이들은 세포들을 공격해서 다양한 질병들을 일으키게 되는데, 특히 뇌에서는 알쯔하이머 병과 같은 뇌 기능저하를 일으킬 수 있다(Tuppo, E.E. and Forman, L.J., J. Am. Osteopath. Assoc. 101: S11~S15, 2001).

항산화제들은 산화적 손상을 억제시켜 다양한 질병 위험을 감소시키는데 기여한다. 즉, 이들은 자유라디칼과 반응해서 중요한 물질들이 손상되기 전 그 반응과정을 종결시켜 준다. 산화적 스트레스는 일반적으로 알쯔하이머 병과 높은 연관성을 보이기 때문에 학습과 기억에 중요한 역할을 한다(Zhao, Y. and Zhao, B., Med. Cell. Longev. Volume 2014, Article ID 316523).

화학합성 화합물인 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine)과 같은 아세틸콜린에스터라제(AChE) 저해제들은 알쯔하이머 병에 성공적으로 활용되고 있지만, 이들은 구토, 설사, 현기증과 같은 부작용이 있는 것으로 알려졌다(Terry, A.V. Jr., and Buccafusco, J.J., J. Pharmacol. Exp. Ther. 306: 821~827, 2003; Cummings, J.L., Mackell, J. and Kaufer, D., Alzheimers Dement. 4: 49~60, 2008).

따라서, 이와 같은 화학합성 항산화제들의 부작용을 줄여줄 대안으로 많은 천연 항산화제들에 대한 연구가 진행되고 있다(Rajani, M. 2004. Biotechnology of Medicinal Plants: Vitalizer and Ttherapeutic. Enfield, New Hampshire). 식물체 유래 항산화활성 물질들은 jateorrhizine과 groenlandicine 같은 알칼로이드계(Jung, H.A. et al., Biol. Pharm. Bull. 32: 1433-1438, 2009), 터피노이드계 및 비타민 E, 유제놀(eugenol) 같은 페닐프로마노이드계(Owena, R.W et al.,, Food Chem. Toxicol. 41:703~717, 2003), epigallocatechin, catechin, gallocatechin 등의 탄닌류 (Sasaki, N., et al., Chem. Biol. Interact. 145: 101~116, 2003)가 잘 알려져 있다.

한편, 연과(Nelumbonaceae)에 속하는 연(Nelumbo nucifera Gaertner)은 아시아 지역에서 다양한 식재료로 이용되고 있다. 연 전초(whole plant) 추출물은 항당뇨, 해열, 항염증, 항암, 항균, 항바이러스, 항비만 활성과 같은 다양한 약리 활성들이 있는 것으로 알려졌다(Kashiwada, Y., et al., Bioorg. Med. Chem. 13: 443~448, 2005).

한국 공개특허 제10-2014-0142630호는 연근 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선 기능성 식품 및 기억력 손상 치료용 약학적 조성물을 개시하였고, 한국공개특허 제2014-0018678호는 연근 또는 연근 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개시하였으나, 항산화 및 기억력 증진에 효과가 있는 활성 본체가 무엇인지는 알 수 없었다.

이에, 본 발명자들은 연(Nelumbo nucifera Gaertner) 유래의 항산화 및 기억력 증진 활성물질을 찾기 위하여 노력한 결과, 연 뿌리에서 분리된 3,4-dihydroxy benzoic acid와 luteolin 그리고 연 잎에서 분리된 isoquercetin이 우수한 항산화 및 기억력 증진능이 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 천연물인 연으로부터 분리된 항산화 활성이 우수한 화합물, 이들의 분리 방법 그리고 이들을 포함하는 기억력 증진용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적은 천연물인 연으로부터 분리된 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성이 우수한 화합물, 이들의 분리 방법 그리고 이들을 포함하는 기억력 증진용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 연(Nelumbo nucifera Gaertner)에서 분리된 항산화 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 항산화 활성을 갖는 화합물은 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid) 또는 루테올린(luteolin)은 (a) 마쇄된 연 뿌리를 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)를 통한 분획 및 DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계는 1~3회 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 이소쿼세틴(isoquercetin)은 (a) 마쇄된 연 잎을 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 아세토나이트릴과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 연(Nelumbo nucifera Gaertner)에서 분리된 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성을 갖는 루테올린(luteolin)을 유효성분으로 함유하는 기억력 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 루테올린(luteolin)은 (a) 마쇄된 연 뿌리를 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)를 통한 분획 및 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계는 1~3회 수행하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 연 추출물에서 분리된 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)은 우수한 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 나타내므로, 천연물 유래의 신규 항산화제 또는 기억력 증진제로 이용이 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 연 뿌리 유기용매 분획물로부터 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 연 잎 유기용매 분획물로부터 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 화합물을 분리하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 항산화 활성 및 아세틸콜린 에스터라제 억제 활성을 갖는 화합물의 HPLC 크로마토그램이다(A: 화합물 1, B: 화합물 2, C: 화합물 3).
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 1의 질량 스펙트럼이다(EI-MS).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 1의 DEPT 스펙트럼이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 2의 질량 스펙트럼이다(EI-MS).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 2의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 2의 DEPT 스펙트럼이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 3의 질량 스펙트럼이다(EI-MS).
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 3의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 3의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 화합물 3의 DEPT 스펙트럼이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 루테올린의 스코폴라민 유도 마우스에 대한 모리스 수중미로 탈출 지연시간 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 루테올린의 스코폴라민 유도 마우스에 대한 모리스 수중미로 이동거리 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리된 루테올린의 스코폴라민 유도 마우스에 대한 모리스 수중미로에서의 속도 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따라 실시된 모리스 수중미로 실험결과이다(A: 스코폴라민 처리구, B: 무 처리구, C: 타크린 처리구, D: 아스코빅산 처리구, E: 루테올린 처리구).

본 발명에서는 부작용 위험이 낮으면서, 효과가 우수한 천연물 유래의 항산화 활성물질 및 기억력 증진용 활성물질을 개발하고자 하였다.

본 발명에서는, 연 뿌리 및 연 잎 추출물에서 분리된 화합물이 항산화 및 아세틸콜린 에스터라제 억제활성을 가지고 있다는 것을 확인하였다.

즉, 본 발명의 일 실시예에서는 유기용매로 연 뿌리 및 연 잎을 추출하였고, 연 뿌리 추출물 및 연 잎 추출물을 중압용 크로마토그래피(MPLC), 박막크로마토그래피(TLC) 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 통하여 DPPH 라디칼 소거능, 즉 항산화 활성을 갖는 활성물질을 순차적으로 분리하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 연(Nelumbo nucifera Gaertner)에서 분리된 항산화 활성을 갖는 화합물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 연 뿌리 또는 연 잎 추출물은 연 뿌리 또는 연 잎을 마쇄시킨 후, 유기용매 또는 물로 추출하여 얻을 수 있다. 상기 유기 용매로는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 프로판올 등의 극성 용매; 헥산, 에테르, 벤젠, 톨루엔 등의 무극성 용매; 클로로포름, 에틸아세테이트, 아세톤, 멜틸렌클로라이드 등의 중간극성 용매를 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 연 뿌리 또는 연 잎 추출물은 에탄올 등의 유기용매 또는 물에 마쇄된 연 뿌리 또는 연 잎을 침지, 중탕, 증류시켜 추출하거나 초임계 추출 또는 마이크로파 추출법으로 추출할 수 있으며, 여과 및 농축과정을 통하여 획득할 수 있다.

한편, 항산화 활성을 가진 것으로 확인된 연 뿌리 또는 연 잎 추출물을 분획할 경우, 항산화 활성 성분을 함유하는 분획물을 분리할 수 있을 것으로 예측하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 연 뿌리 및 연 잎 추출물을 각각 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 순차분획하여 각각의 분획물을 획득하고, 획득한 분획물을 가지고 항산화 활성 실험을 수행하였다. 그 결과, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물이 우수한 항산화 활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 분획물은 유기용매의 극성에 따라 용해되는 화합물들을 분리하는 통상의 방법으로 획득할 수 있으며, 본 발명에서는 먼저 추출한 연 뿌리 및 연 잎 추출물에 각각 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획하여 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 물 분획물을 획득하였다.

본 발명에서는 또한, 항산화 활성이 가장 우수한 것으로 확인된 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 크로마토그래피를 수행하면 항산화 활성 본체를 분리 및 동정할 수 있을 것으로 예측하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 중압용 크로마토그래피(MPLC), 박막크로마토그래피(TLC) 및 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 항산화 활성 본체를 분리하고, 전자충격 질량분석(EI-MS), 핵자기공명(NMR) 및 DEPT(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer)을 수행하여 항산화 활성 본체가 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)이라는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid) 또는 루테올린(luteolin)은 (a) 마쇄된 연 뿌리를 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득할 수 있다.

또한, 상기 이소쿼세틴(isoquercetin)은 (a) 마쇄된 연 잎을 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;

(c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 아세토나이트릴과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득할 수 있다.

상기 중압용 크로마토그래피(MPLC) 수행시 이동상은 클로로포름 및 메탄올을 이용하는 것이 바람직하며, 클로로포름 : 메탄올의 비율이 100:0에서 순차적으로 0:100이 되도록 하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)를 통한 분획 및 DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계는 1~3회 반복 수행할 수 있다.

한편, 본 발명에서는 항산화 활성이 우수한 것으로 확인된 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)이 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성을 통하여 기억력 증진효과가 있을 것으로 예측하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)을 대상으로 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성 실험을 수행하였고, 3가지 화합물중 루테올린(luteolin)의 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 연(Nelumbo nucifera Gaertner)에서 분리된 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성을 갖는 루테올린(luteolin)을 유효성분으로 함유하는 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 루테올린(luteolin)은 (a) 마쇄된 연 뿌리를 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계; (b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계; (c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; (d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및 (e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물이 혼합된 용매를 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 항산화 조성물 및 기억력 증진용 조성물은 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin), 또는 이소쿼세틴(isoquercetin) 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 항산화 조성물 및 기억력 증진용 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

또한, 상기 항산화 조성물 및 기억력 증진용 조성물은 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 항산화 조성물 및 기억력 증진용 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 연 뿌리 및 연 잎 추출물 및 분획물 분리

연(Nelumbo nucifera) 뿌리와 잎은 서울관악구 신원시장에서 2013년 3월에 구입하였다. 이들 연 뿌리와 잎 시료는 각각 서울대학교 농생대 농생명과학연구원에 NN-R-01과 NN-L-01로 라벨하여 보관하였다.

먼저, 음건 한 연 뿌리(18.1 kg)와 연 잎(1.72 kg)을 마쇄기로 마쇄하여 에탄올 90 L에 48시간 간격으로 실온에서 3회 침지하여 여과(Whatman no.2, Maidstone, UK))한 후, 여과액을 회전진공농축기로 농축시켜 진한 노랑색의 연 뿌리 에탄올 추출물(약 324g)을 수득하였다.

다음으로 수득한 연 뿌리 에탄올 추출물을 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획하여 각각 헥산층(3.88 g), 클로로포름층(0.65 g), 에틸아세테이트층(2.79 g), 부탄올층(38.88 g) 및 물층(276.69 g)을 얻었다.

수득한 연 뿌리 에탄올 추출물 및 그 분획물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성법을 이용하여 확인하고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

Material	IC₅₀, mg/mL (95% CL^a)	Slope ± SE	χ^2b	P-value
Ethanol extract	0.805 (0.696~0.929)	1.8 ±0.29	3.70	0.987
Hexane-soluble fr.	1.287 (1.186~1.396)	0.4 ±0.22	1.89	0.997
Chloroform-soluble fr.	0.805 (0.670~0.960)	2.1 ±0.45	3.92	0.983
Ethyl acetate-soluble fr.	0.053 (0.037~0.049)	1.5 ±0.48	2.60	0.993
Butanol-soluble fr.	0.170 (0.130~0.224)	1.6 ±0.29	3.25	0.995
Water-soluble fr.	2.644 (2.112~3.309)	2.1 ±0.44	3.27	0.988
Ascorbic acid	0.049 (0.036~0.066)	2.0 ±0.47	4.14	0.984

^a CL은 신뢰한계를 의미

^b 적합도 검정을 위한 피어슨 카이자승 값(χ²)

표 1에 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트 층(IC₅₀ = 0.053 mg/mL)과 부탄올 층(IC₅₀ = 0.170 mg/mL)이 강한 항산화 활성을 나타냈다.

또한 연 잎 역시 연 뿌리와 동일한 추출 방법으로 실시하여 진한녹색의 에탄올 추출물 약 51.9g을 수득하고, 용매를 이용한 순차분획으로 헥산층(14.56 g), 클로로포름층(7.55 g), 에틸아세테이트층(2.59 g), 부탄올층(24.17 g), 물층(3.03g)을 얻었다.

수득한 연 잎 에탄올 추출물 및 그 분획물의 항산화 활성을 DPPH 라디칼 소거 활성법을 이용하여 확인하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

Material	IC₅₀, mg/mL (95% CL^a)	Slope ± SE	χ^2b	P-value
Ethanol extract	0.943 (0.793~.274)	1.4 ± 0.20	2.68	0.988
Hexane-soluble fr.	0.513(0.428~0.614)	2.6 ± 0.76	2.35	0.982
Chloroform-soluble fr.	0.653(0.538~0.793)	1.6 ± 0.34	2.56	0.972
Ethyl acetate-soluble fr.	0.071(0.065~0.077)	1.4 ± 0.12	2.01	0.997
Butanol-soluble fr.	0.173(0.153~0.196)	2.1 ± 0.20	2.29	0.997
Water-soluble fr.	1.291(0.766~2.173)	1.1 ± 0.29	2.94	0.993
Ascorbic acid	0.049 (0.036~0.066)	2.0 ± 0.47	4.14	0.984

^a CL은 신뢰한계를 의미

^b 적합도 검정을 위한 피어슨 카이자승 값(χ²)

표 2에 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트 층(IC₅₀ = 0.071 mg/mL)과 부탄올 층(IC₅₀ = 0.173 mg/mL)이 강한 항산화 활성을 나타내었다.

참고로, DPPH 라디칼 소거 활성은 시료의 정량을 50㎕ 메탄올에 녹여 0.4 mM DPPH 100㎕를 함유한 96-웰플레이트에 첨가한 후, 30분 동안 실온에서 반응시키고 그 혼합물을 VersaMAx 마이크로플레이트리더기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)의 518nm 파장에서 측정하였다. 이때 아스코빅산(ascorbic acid)를 양성대조구로 사용했고 음성대조구는 메탄올액 만을 사용하였다.

항산화 활성은 50% DPPH를 억제하는데 필요한 물질의 50% 저해농도(IC₅₀) 값으로 제시하였다. 시험물질들의 각 IC₅₀ 값은 Prism5 software program (Graph Pad Software, LaJolla, CA, USA)을 이용하여 산출하였고, IC₅₀ 값들의 95% 신뢰구간이 상호 중첩되지 않으면 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 간주하였다. DPPH 라디칼소거능은 하기 식을 이용하여 계산하였다.

DPPH 소거 활성 (%) = [(A0-A1)/A0]× 100

(A0; 무처리구 흡광도, A1; 처리구 흡광도)

그리고 억제능은 다음의 식으로 계산하였다.

억제능 (%) = [1-(S - S0)/(C - C0)] × 100,

(C; 반응 30분 후 대조구 흡광도, C0; 0 시점에서의 대조구 흡광도, S; 반응 30분 후 시료 처리구 흡광도, S0; 0 시점에서의 시료 처리구 흡광도)

별도 시험으로 진행된 3반복 처리 값들의 결과는 평균±표준오차(SE)로 제시하였고, 평균간 비교는 본페로니 다중검정법을 이용하였다(SAS Institute. 2004. SAS Online Doc^?, version 8.01, SAS Institute, Cary, NC, USA).

실시예 2: 항산화 활성물질 분리 및 정제

2-1: 연 뿌리로부터 활성물질 분리

실시예 1에서 가장 항산화 활성이 우수한 것으로 확인된 에틸아세테이트 분획물에 함유된 활성물질을 254 nm UV 검출기 및 실리카겔 칼럼 카트리지 SNAP(100 g silica gel, volume of 180 mL)을 장착한 중압용 크로마토그래피(MPLC)를 이용하여 더욱 분리하였다.

도 1에 도시된 바와 같이 에틸아세테이트 분획물(2.79 g)의 분획은 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가시켰다[100:0 (330 mL), 90:10 (440 mL), 80:20 (836 mL), 70:30 (924 mL), 40:60 (586 mL), 20:80 (982 mL), 0:100 (1 L), v/v]. 분당 이동상의 유량은 50mL/min으로 하여 총 52개 분획층(각각 약 22 mL)을 확보하였고, 이들 각 칼럼 분획물들은 TLC로 분석(chloroform:methanol = 80: 20, v/v)하였다.

TLC 상에서 비슷한 전개값(R _f)을 가진 분획물들은 2% 황산용액을 뿌리고 열을 가해 확인 후 하나로 합쳤다. 13번에서 38번 분획물(E3로 명명, 940 mg)이 활성을 보여 MPLC를 재실시하였다[클로로포름:메탄올, 100:0 (286 mL), 90:10 (968 mL), 85:25 (176 mL), 80:20 (176 mL), 70:30 (242 mL), 60:40 (1012 mL), 0:100 (1 L), v/v]. 분당 이동상의 유량은 50 mL/min으로 하여 65개 분획층(각각 약 22 mL)을 확보하였고, 앞서 언급한 바와 같이 TLC(클로로포름:메탄올=8:2, v/v)를 실시하여 활성 분획층 34번에서 49번 분획물(E34로 명명, 319 mg)을 확보하였다.

수득된 34번에서 49번 분획물(E34로 명명, 319 mg)을 다시 MPLC를 실시하였다[100:0 (44 mL), 90:10 (418 mL), 80:20 (902 mL), 75:25 (506 mL), 70:30 (902 mL), 60:40 (440 mL), 40:60 (462 mL), 20:80 (1056 mL), 0:100 (500 mL), v/v]. 이를 통해 92개의 분획층을 확보하였고(각 분획층 22 mL), 이들중 15번에서 25번 분획층(E342로 명명, 260 mg)이 활성을 나타내어 분취용 TLC를 이용하여 4개의 분획층을 얻었다[chloroform:methanol (70:30), v/v].

이들 4개 분획층들중 E3422 (44 mg, R _f = 0.51) 및 E3423 (40 mg, R _f = 0.76) 분획층이 우수한 항산화 활성을 나타냈다. 이들 활성층들로부터 활성물질을 분리 및 정제하기 위해 분취 HPLC를 실시하였다.

사용한 칼럼은 μBondapak C₁₈ (7.8mm i.d.*300 mm; Waters, Milford, MA, USA)이었고 이동상은 메탄올과 물을 80:20(v/v)으로 고정하여 분당 1.0 ml로 흘려주면서 분취하였다. UV 검출기는 259nm의 파장을 이용하여 최종적으로 E3422층에서 화합물 1 (14.2 mg)을 12.03분의 머무름 시간에서 얻었다(도 3). 또한 UV 검출기를 345 nm로 고정하여 최종적으로 활성층 E3423에서 화합물 2 (13.25 mg)을 11.25분의 머무름 시간에서 수득하였다(도 3).

중압용 크로마토그래피(MPLC) 및 박막 크로마토그래피(TLC)로 분획된 분획층들에 대해서는 실시예 1과 동일한 방법으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가하고, 그 결과를 표 3에 나타내었다.

No.	Fraction	Antioxidant activity (%)
No.	Fraction	50 g of sample	100 g of sample
1	E1	-	0.35
2	E2	28.12	58.46
3	E3	51.20	89.12
4	E4	29.53	66.10
No.	Fraction	100 g of sample
5	E31	-
6	E32	47.07
7	E33	77.12
8	E34	89.43
9	E35	62.27
10	E341	-
11	E342	90.37
12	E343	70.30
13	E344	37.80
14	E3421	-
15	E3422	44.09
16	E3423	82.74
17	E3424	90.16

표 3에 나타난 바와 같이, 연 뿌리 에틸아세테이트 분획층들 중에서 E3층, E34층, E342층, E3423층 및 E3424층의 항산화 활성이 높음을 알 수 있었다.

2-2: 연 잎으로부터 활성물질 분리

실시예 1에서 가장 항산화 활성이 우수한 것으로 확인된 에틸아세테이트 분획물에 함유된 활성물질을 254 nm UV 검출기 및 실리카겔 칼럼 카트리지 SNAP(100 g silica gel, volume of 180mL)을 장착한 중압용 크로마토그래피(MPLC)를 이용하여 더욱 분리하였다.

도 2에 도시된 바와 같이 에틸아세테이트 분획물(2.59 g)의 분획은 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가시켰다[100:0 (1464 mL), 90:10 (864 mL), 80:20 (568 mL), 70:30 (918 mL), 60:40 (1122 mL), 40:60 (516 mL), 80:20 (422 mL), 0:100 (1 L), v/v]. 분당 이동상의 유량은 50mL/min으로 하여 총 266개 분획층(각각 약 22 mL)을 확보하였고, 이들 각 칼럼 분획물들은 TLC로 분석(chloroform:methanol = 50:50, v/v)하였다.

TLC 상에서 비슷한 전개값(R _f)을 가진 분획물들은 2% 황산용액을 뿌리고 열을 가해 확인 후 하나로 합쳤다. 119번에서 168번 분획물(E4로 명명, 405 mg)이 활성을 보여 MPLC를 재실시하였다[클로로포름:메탄올, 100:0 (156 mL), 90:10 (113 mL), 80:20 (86 mL), 70:30 (124 mL), 60:40 (479 mL), 0:100 (1 L), v/v]. 분당 이동상의 유량은 50 mL/min으로 하여 89개 분획층(각 약 22 mL)을 확보하였고, 앞서 언급한 바와 같이 TLC(클로로포름:메탄올, 70:30, v/v)를 실시하여 활성 분획층 26번에서 78번 분획물(E42로 명명, 342 mg)을 확보하였다.

수득된 26번에서 78번 분획물(E42로 명명, 342 mg)을 다시 MPLC를 실시하였다[100:0 (54 mL), 90:10 (246 mL), 80:20 (190 mL), 75:25 (238 mL), 70:30 (246 mL), 60:40 (508 mL), 40:60 (260 mL) 20:80 (248 mL), 0:100 (500 mL), v/v]. 이를 통해 113개의 분획층을 확보하였고(각 분획층 22 mL), 이들중 35번에서 57번 분획층(E423로 명명, 241 mg)이 활성을 나타내어 분취용 TLC를 이용하여 5개의 분획층을 얻었다[chloroform:methanol (80:20), 4% 포름산 함유, v/v].

이들 5개 분획층들 중 E4232 (26 mg, R _f = 0.42) 분획층이 활성을 나타냈다. 이들 활성층들로부터 활성물질을 분리 및 정제하기 위해 분취 HPLC를 실시하였다.

사용한 칼럼은 μBondapak C₁₈ (7.8mm i.d.*300 mm; Waters, Milford, MA, USA)이었고 이동상은 아세토나이트릴과 물을 70:30(v/v)으로 고정하여 분당 1.0 ml로 흘려주면서 분취하였다. UV 검출기는 257 nm의 파장을 이용하여 최종적으로 화합물 3 (13.1 mg)을 10.22분의 머무름 시간에서 얻었다(도 3).

중압용 크로마토그래피(MPLC) 및 박막 크로마토그래피(TLC)로 분획된 분획층들에 대해서는 실시예 1과 동일한 방법으로 DPPH 라디칼 소거 활성을 평가하고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

No.	Fraction	Antioxidant activity (%)
No.	Fraction	50 g of sample	100 g of sample
1	E1	-	-
2	E2	-	2.80
3	E3	2.63	20.56
4	E4	62.74	88.93
5	E5	47.93	86.26
6	E6	46.50	86.00
7	E7	39.50	80.00
No.	Fraction	100 g of sample
8	E41	49.22
9	E42	85.33
10	E43	30.13
11	E421	5.06
12	E422	29.11
13	E423	81.43
14	E424	48.80
15	E425	41.00
16	E4231	3.60
17	E4232	87.55
18	E4233	47.05
19	E4234	46.53
20	E4235	70.7

표 4에 나타난 바와 같이, 연 잎 에틸아세테이트 분획층들 중에서 E4층, E42층, E423층 및 E4232층의 항산화 활성이 높음을 알 수 있었다.

실시예 3: 항산화 활성물질 동정

실시예 2에서 분리된 무색 액상의 화합물 1, 노랑색 분말의 화합물 2 및 노랑색 분말의 화합물 3을 동정하기 위하여 EI-MS, ¹H-NMR(600 MHz, Rheinstetten, Baden-Wurttemberg, Germany), ¹³C-NMR(150 MHz, Rheinstetten, Baden-Wurttemberg, Germany) 및 DEPT 분석을 서울대학교 농생명과학공동기기원(NICEM)에 의뢰하였다.

3-1: 화합물 1 동정

도 4에 나타난 바와 같이, EI-MS 결과, 화합물 1의 질량 스펙트럼은 154 m/z에서 가장 강한 피크[M]⁺를 보였다 (EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 154 [M]⁺(100), 13(10), 109(10), 81(10), 63(15)).

또한 화합물 1의 ¹H-NMR (MeOD, 600MHz) 및 ¹³C-NMR (MeOD, 150MHz)의 데이터 및 스펙트럼은 표 5와 도 5 및 도 6에 나타내었다.

Position	Partial Structure	δC,ppm(MeOD,150MHz)	δH,ppm (MeOD, 600 MHz)	δC(ppm) Syafni et al. (2012)	δH(ppm) Syafni et al. (2012)
1	C	123.5		123.28
2	CH	117.97	7.43 d (J = 2.0 Hz)	117.85	7.44 d (J = 2.0 Hz)
3	C	146.34		146.18
4	C	151.82		151.66
5	CH	116.02	6.80 d (J = 6.0 Hz)	124.03	6.79 d (J = 6.0 Hz)
6	CH	124.16	7.42 dd (J = 2.0, 6.0 Hz)	115.89	7.42 dd (J = 2.0, 6.0 Hz)
7	C=O	170.53		170.38
	OH		11.0		11.0
	OH		5.0		5.01
	OH		5.0		5.01

표 5에 나타난 바와 같이, 화합물 1은 먼저 발표된 논문(Syafni, N., Putra, D.P., and Arbain, D. 2012. 3,4-Dihydroxybenzoic acid and 3,4-Dihydroxybenzaldehyde from the fern Trichomanes chinense L.; isolation, antimicrobial and antioxidant properties. Indo. J. Chem., 12(3): 273-278)을 참조하여 기본적으로 7개의 탄소와 6개의 수소로 구성된 물질임을 확인할 수 있었으며, 도 7의 DEPT 결과를 통하여 3개의 메틸그룹과 1개의 카르복실 그룹 그리고 2개의 하이록실 카본을 갖고 있음을 확인하였다.

이상의 결과에 근간해서 화합물 1은 C₇H₆O₄ 분자식을 가지며, 화학식 1로 표시되는 3.4-dihydroxy benzoic acid이라는 것을 확인할 수 있었다.

3-2: 화합물 2 동정

도 8에 나타난 바와 같이, EI-MS 결과, 화합물 2의 질량 스펙트럼은 286m/z에서 가장 강한 피크[M]⁺를 보였다 (EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 286 [M]⁺ (100), 258 (15), 153 (20), 129 (9)).

또한 화합물 2의 ¹H-NMR (MeOD, 600MHz) 및 ¹³C-NMR (MeOD, 150MHz)의 데이터 및 스펙트럼은 표 6과 도 9 및 도 10에 나타내었다.

Position	Partial structure	δC,ppm (MeOD, 150MHz)	δH,ppm (MeOD, 600 MHz)	δC (ppm) Ozgen et al. (2011)	δH (ppm) Ozgen et al. (2011)
1'	C	123.81		123.1
2'	CH	114.27	7.40 d (J = 2.2 Hz)	113.5	7.51 d (J = 2.2 Hz)
3'	C	147.21		145.8
4'	C	151.15		149.4
5'	CH	116.91	6.91 d (J = 9.0 Hz)	116.0	7.00 d (J = 8.2 Hz)
6'	CH	120.44	7.39 dd (J = 8.2, 2.2 Hz)	119.5	7.48 dd (J = 8.2, 2.0 Hz)
2	C	166.50		164.2
3	CH	103.99	6.54 s	103.6	6.59 s
4	C=O	184.02		182.4
5	C=O	163.37		162.7
6	CH	100.25	6.21 d (J = 2.0 Hz)	99.0	6.25 d (J = 2.0 Hz)
7	C	166.20		164.5
8	CH	95.13	6.44 d (J = 2.0 Hz)	94.0	6.52 d (J = 2.0 Hz)
9	C	159.56		158.1
10	C	105.43		104.7
	OH		5.01		5.01
	OH		5.01		5.01
	OH		5.01		5.01
	OH		5.01		5.01

표 6에 나타난 바와 같이, 화합물 2는 먼저 발표된 논문(Ozgen, U. Mavi, A., Terzi, Z., Kazaz, C., A, A., Kaya, Y. and Seen, H. 2011. Relationship Between Chemical Structure and Antioxidant Activity of Luteolin and Its Glycosides Isolated from Thymus sipyleus subsp. sipyleus var. sipyleus. Rec. Nat. Prod. 5(1): 12-21)을 참조하여 2개의 벤젠고리, 탄소를 함유한 2-3번 이중결합, 5,7,3',4'번 탄소의 디하이드록실그룹을 갖는 물질임을 확인할 수 있었으며, 도 11의 DEPT 결과를 통하여 15개의 탄소를 갖는 하나의 케톤그룹과 4개의 디하이드록실 탄소를 갖고 있음을 확인하였다.

이상의 결과에 근간해서 화합물 2는 C₁₅H₁₀O₆ 분자식을 가지며, 화학식 2로 표시되는 luteolin (2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-4- chromenone)이라는 것을 확인할 수 있었다.

3-3: 화합물 3 동정

도 12에 나타난 바와 같이, EI-MS 결과, 화합물 1의 질량 스펙트럼은 69 m/z에서 가장 강한 피크[M]⁺를 보였다 (EI-MS (70 eV), m/z (% relative intensity): 69[M]⁺(100), 55(30), 57(42), 60(40), 71(27), 73(21), 81(62), 83(23), 95(26)).

또한 화합물 3의 ¹H-NMR (MeOD, 600MHz) 및 ¹³C-NMR (MeOD, 150MHz)의 데이터 및 스펙트럼은 표 7과 도 13 및 도 14에 나타내었다.

Position	Partial structure	δC,ppm(MeOD,150MHz)	δH,ppm (MeOD, 600 MHz)	δC(ppm) Boligon et al. (2010)	δH(ppm) Boligon et al. (2010)
2	C	158.63		158.44
3	C	135.76		135.64
4	C=O	179.65		179.48
5	C	163.21		162.99
6	CH	99.39	6.19 d (J = 2.0 Hz)	99.89	6.19 d (J = 2.0 Hz)
7	C	166.21		165.97
8	CH	94.86	6.38 d (J = 8.0 Hz)	94.73	6.38 d (J =2.0 Hz)
9	C	159.16		158.44
10	C	105.84		105.68
1'	C	123.34		123.08
2'	CH	117.70	7.72 d (J = 2.5 Hz)	117.59	7.71 d (J = 2.0 Hz)
3'	C	146.07		145.87
4'	C	150.01		149.83
5'	CH	116.37	6.88 d (J = 8.5 Hz)	116.01	6.87 d (J = 8.4 Hz)
6'	CH	123.23	7.56 dd (J = 8,5, 2.5 Hz)	123.20	7.58 dd (J = 8.5, 2.0 Hz)
1''	CH	104.44	5.25 d (J = 7.5 Hz)	104.39	5.23 d (J = 7.6 Hz)
2''	CH	75.88	3.48 m	75.73	3.48 t (J = 9.2 Hz)
3''	CH	78.27	3.35 m	78.11	3.35 t (J = 8.8 Hz)
4''	CH	71.37	3.45 m	71.22	3.43 t (J = 9.6 Hz)
5''	CH	78.55	3.22 m	78.35	3.24 m
6''	CH2	62.70	3.71 m, 3.57 m	62.58	3.73 dd (J = 2, 11.6 Hz), 3.56 dd (J =2, 11.6 Hz)
	OH		2.02		2.04
	OH		2.02		2.04
	OH		2.02		2.04
	OH		2.02		2.04
	OH		5.01		5.02
	OH	5.01			5.02
	OH	5.01			5.02
	OH	5.01			5.02

표 7에 나타난 바와 같이, 화합물 3은 먼저 발표된 논문(Boligon, A.A., Feltrin, A.C., Machado, M.M., Janovik, V. and Athayde, M.L. 2009. HPLC Analysis and phytoconstituents isolated from ethyl acetate fraction of Scutia buxifolia Reiss. leaves. Lat. Am. J. Pharm. 28(1):121-124)을 참조하여 21개의 탄소골격을 갖고, δ5.25 (diaxial coupling J = 7.5Hz)는 hexose의 아노머 탄소(카르보닐기)를 암시한다는 것을 확인할 수 있었으며, 도 15의 DEPT 결과를 통하여 8개의 하이록실 카본을 갖고 있음을 확인하였다.

이상의 결과에 근간해서 화합물 3은 C₂₁H₂₀O₁₂ 분자식을 가지며, 화학식 3으로 표시되는 isoquercetin (2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3-[(2S,3R,4S, 5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxyl-methyl)oxan-2-yl]oxychromen-4-one)이라는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1: 분리 화합물의 항산화 활성 확인

실시예 2에서 분리되고, 실시예 3에서 각각 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)으로 확인된 물질과 이들과 구조적으로 유사한 식물 유래 물질(피세틴(Fisetin), 쿼세틴(Quercetin), 캠프페롤(Kaemfperol), 갈랑진(Galangin), 아카세틴(Acacetin), 크리신(Chrysin)), 그리고 양성대조물질인 아스코빅산(Ascorbic acid)의 항산화 활성을 실시예 1에 기재한 DPPH 소거 활성법으로 평가하고, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

Compound	IC₅₀, μM (95% CL^a)	Slope ±SE	χ^2b	P-value	RT^c
3,4-DBAd	10.90 (8.76~12.40)	1.9 ±0.48	2.60	0.989	5.34
Luteolin	67.14 (63.89~70.53)	3.1 ±0.04	3.15	0.982	0.87
Fisetin	96.10 (55.96~165.10)	1.2 ±0.26	4.06	0.980	0.61
Isoquercetin	123.23 (93.15~153.45)	2.1 ±0.44	3.27	0.982	0.47
Quercetin	123.47 (103.06~147.96)	1.6 ±0.21	3.20	0.987	0.47
Kaemfperol	203.81 (162.06~256.25)	1.2 ±0.23	4.35	0.984	0.29
Galangin	855.90 (681.77~1060.20)	1.1 ±0.46	3.95	0.985	0.07
Acacetin	>1000	-	-	-	-
Chrysin	>1000	-	-	-	-
Ascorbic acid	58.19 (46.96~68.53)	2.0 ±0.47	4.14	0.984	1.00

^a CL은 신뢰한계를 의미

^b 적합도 검정을 위한 피어슨 카이자승 값(χ²)

^c 상대 독성값, ascorbic acid의 IC₅₀ / 시험물질의 IC₅₀

^d 3,4-Dihydroxy benzoic acid.

표 8로부터, IC₅₀ 값을 기준으로 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid)이 가장 강한 항산화력(10.90 μM)을 보였는데, 이는 양성대조물질인 아스코빅산(Ascorbic acid) 보다 5배 더 강한 활성을 나타내었다.

루테올린(luteolin)과 아스코빅산(Ascorbic acid)의 항산화 활성은 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았으며, 피세틴(Fisetin), 이소쿼세틴(isoquercetin), 쿼세틴(Quercetin)의 IC₅₀ 값은 96.10과 123.47 μM 사이였고, 갈랑진(Galangin)은 낮은 활성을 보였으며 아카세틴(Acacetin) 및 크리신(Chrysin)은 활성을 보이지 않았다.

실험예 2: 분리 화합물의 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제활성 확인

실시예 2에서 분리되고, 실시예 3에서 각각 3,4-디하드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid), 루테올린(luteolin) 및 이소쿼세틴(isoquercetin)으로 확인된 물질의 아세틸콜린에스터라제(AChE) 억제 활성을 기존에 알려진 방법(Ellman, G.I., Courtney, K.D., Andres, V. and Featherstone, R.M. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7:68-75)에 따라 수행 하였다.

반응액은 20㎕의 전기뱀장어 AChE (0.1 U/mL), 140㎕의 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0), 10㎕의 각 화합물을 에탄올 1% 또는 DMSO 1%에 녹인 시료액, 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0)에 녹인 10㎕의 1 mM DTNB 그리고 10㎕의 5 mM acetylcholine iodide로 구성하였다.

37℃에서 30분 동안 반응시키고 VersaMAx 마이크로플레이트리더기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)의 412nm 파장에서 흡광도를 측정하고, 그 결과를 표 9에 나타내었다.

Compound	IC₅₀, μM (95% CL^a)	Slope ±SE	χ^2b	P-value
Luteolin	9.35 (6.37~12.27)	2.1 ± 0.54	2.55	0.988
Isoquercetin	89.12(75.26~94.83)	3.0 ± 0.09	3.14	0.988
3,4-DBA^c	>500	-	-	-
Tacrine(대조)	0.76 (0.52~0.93)	2.3 ± 0.39	2.61	0.990

^a CL은 신뢰한계를 의미

^b 적합도 검정을 위한 피어슨 카이자승 값(χ²)

^c 3,4-Dihydroxy benzoic acid.

표 9에 나타난 바와 같이, 루테올린(luteolin) (9.35 μM)의 AChE 억제활성(IC₅₀ 값 기준)이 3종 활성물질들 중 가장 우수하였으나, 대조물질인 타크린(tacrine)에 비해서는 약 12배 낮은 활성을 보였다. 반면 isoquercetin은 89.12 μM의 IC₅₀ 값을 보였고, 3,4-Dihydroxy benzoic acid는 효과를 나타내지 않았다.

실험예 3: 연 뿌리 에탄올 추출물 및 루테올린의 스코폴라민(scopolamine)유도 마우스의 기억력에 미치는 효과 확인

기억력 증진효과 검정용으로 사용한 시험 동물은 ICR계 암컷 마우스(25~30g)로 폴리아크릴 케이지(38×23×10cm) 당 10마리로 12:12 광주기로 충분한 먹이와 물을 제공하면서 관리하였다. 시험동물의 관리는 시험동물윤리기준(NIH publication No. 85-23, 1985년 개정) 및 경희대학교 동물실험윤리가이드라인을 준수하였다. 마우스들은 각각 10개체씩 6개 그룹[대조군, 스코폴라민(scopolamine) 그룹, 연 뿌리 에탄올 추출물 처리 그룹(60mg/kg), 아스코빅산 처리 그룹(10 mg/kg), 타크린 처리 그룹(10mg/kg), 루테올린 처리 그룹(20mg/kg)]으로 구분하여 매일 모리스 수중 미로 검사 1시간 전에 처리하여 그 결과를 비교하였다. 기억 손상은 루테올린, 타크린 또는 아스코빅산 처리 30분 후 스코폴라민(1 mg/kg, i.p)으로 유도하였다. 대조군은 0.9% 식염수 만을 각 개체 체중에 따라 0.02 mL/g으로 처리하였다. 처리 평균간 비교(P=0.05)는 본페로니법을 이용하였다.

모리스 수중 미로(Harvard Bioscience, Holliston, Massachusetts, USA)(직경 90cm, 높이 45cm의 원형 수조)에 24~25℃의 물을 25cm로 채우고 무독성 먹물을 채웠다. 검은색 지지대(직경:10cm, 높이:23cm)를 수조 4분위 중 한 곳에 수면 2cm 아래에 육안으로 보이지 않도록 고정시켰다. 첫 실험일은 60초 동안 실험 마우스들이 탈출용 지지대로 자유로이 수영할 수 있도록 하였다. 마우스가 60초 내에 그 지지대를 찾지 못할 경우에는 10초 동안 그 지지대 위에 놓아두었다. 다음 훈련을 실시하기 전 20초 동안은 수조 밖으로 꺼내 휴식을 주었다. 이 과정은 매일 5회 반복되었다. 이와 같이 실험 마우스를 매일 5번의 60초 훈련시험으로 5일간 훈련시켰다. 훈련 후, 각기 다른 그룹 내 마우스들의 학습기억력을 모리스 수중 미로 검사를 통해 탈출 지연시간, 이동거리 및 속도를 평가하고 그 결과를 도 16~18에 나타내었다. 또한, 비디오 카메라(Harvard Bioscience video camera)를 수조 위에 고정하여 시험동물의 수영경로를 촬영한 기록은 도 19에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, 스코폴라민 유도 그룹(0.5mg/kg, i.p.)이 식염수를 처리한 무처리구 그룹에 비해 시험기간 5일 동안 미로를 탈출하는데 있어 더 긴 지연시간을 보였다. 하지만 루테올린(20mg/kg)이나 양성대조구인 타크린(10mg/kg)과 스코폴라민을 함께 처리한 그룹은 스코폴라민을 단독으로 처리한 그룹에 비해 훨씬 더 짧은 지연시간을 보였다.

도 17 및 도 19에 나타난 바와 같이, 이동거리에 있어서도 스코폴라민 단독 처리 그룹은 식염수를 처리한 무처리구 그룹에 비해 플랫폼으로의 이동 거리가 더 길었지만, 루테올린 또는 타크린을 스코폴라민과 함께 처리한 그룹들은 스코폴라민 단독처리 그룹에 비해 더 짧은 이동 거리를 나타냈다.

도 18에 나타난 바와 같이, 검정계에서의 속도 측면에서 스코폴라민 단독처리 그룹은 식염수를 처리한 무처리구 그룹에 비해 더 느렸다. 하지만, 루테올린 또는 타크린을 스코폴라민과 함께 처리한 그룹들은 스코폴라민 단독처리 그룹에 비해 검정계에서의 속도가 더 빠른 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

연(Nelumbo nucifera Gaertner) 뿌리에서 분리된 항산화 활성을 갖는 3,4-디하이드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid)을 유효성분으로 함유하는 연 음료.
삭제
제1항에 있어서, 상기 3,4-디하이드록시 벤조산(3,4-dihydroxy benzoic acid)은
(a) 마쇄된 연 뿌리를 유기용매에 침지시켜 추출하고, 농축시켜 추출물을 제조하는 단계;
(b) 상기 추출물에 순차적으로 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물로 분획시켜 분획물을 수득하는 단계;
(c) 수득된 에틸아세테이트 분획물을 클로로포름 이동상에 메탄올을 순차적으로 추가하면서 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계;
(d) 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 클로로포름과 메탄올이 혼합된 용매로 박막크로마토그래피(TLC)시켜 분획하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계; 및
(e) 상기 박막크로마토그래피(TLC)로 분획한 분획물중 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 메탄올과 물의 혼합액(80:20(v/v))을 이동상으로 하여 고성능액체크로마토그래피(HPLC)로 분리하고, DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 높은 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 분리방법으로 수득된 것을 특징으로 하는 연 음료.
제3항에 있어서, 상기 중압용 크로마토그래피(MPLC)를 통한 분획 및 DPPH 라디칼 소거 확인을 통하여 항산화 활성이 가장 높은 분획물을 분리하는 단계는 1~3회 수행하는 것을 특징으로 하는 연 음료.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제