KR20150088223A - 해당화 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용, 또는 숙취해소용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 해당화 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 상기 조성물은 DPPH 라디칼 및 ABTS† 라디칼 소거능면에서 상대적으로 높은 소거활성을 나타내고, 알콜성 분해효소 생성을 촉진시키는 아스파르트산, 아스파라긴, 세린, 글리신, 아르기닌 또는 알리신을 함유하며, 알코올성 간 손상을 일으키는 CYP2E1 효소의 활성을 억제하여 알코올에 의한 HepG2 세포 생존율 감소를 저해하는 효과를 나타낸다. 그리고, 알코올성 간 손상을 일으키는 간세포에 대한 세포독성이 없어 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용될 수 있다.

Description

해당화 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용, 또는 숙취해소용 조성물{Compositions for preventing or improving of alcoholic liver disease, or reducing alcoholic hangup comprising Rosa rugosa extracts}
본 발명은 알코올성 간질환 예방 또는 치료용, 또는 숙취해소용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 천연물을 이용하여 인체에 무해하고 안정성이 우수하여 안전하게 사용될 수 있으며, 알코올성 간세포 손상에 대한 개선효과 및 숙취해소 효과가 우수한 해당화 추출물을 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용, 및 숙취해소용 조성물에 관한 것이다.
간은 인체에서 혈액 저장 및 순환, 혈액량 조절과 방어해독작용을 하며 정신적 활동과도 밀접하게 관련되어 있다고 알려져 있는 장기이다. 구체적으로, 상기 간은 음식물에서 흡수된 모든 영양소들을 에너지를 생산할 수 있는 물질로 대사되어 전신에 공급하거나 저장하며, 약 2,000여종의 효소, 알부민, 혈청단백, 인지질, 콜레스테롤 등의 지방 등이 간에서 합성되고 저장 및 분비된다. 또한, 각종 대사산물들을 담관을 통해 십이지장으로 배설하는 기능, 해독, 분해 및 면역기능도 있어 인체에서 중요한 역할을 하고 있다.
그러나, 최근 사회의 다양화 및 경제성장과 더불어 현대인의 알코올 섭취량이 증가하고 있어 과음과 관련된 숙취나 알코올 중독 및 간 기능 저하, 간암 등과 같은 질병의 원인이 되고 있다.
구체적으로, 알코올의 섭취는 위나 장에서 흡수되어 간에서 알코올 가수분해효소(alcohol dehydrogenase, ADH), 카탈라아제(catalase) 또는 알코올 대사에 의해 유도되는 알데히드 산화효소(aldehyde oxidase) 등에 의하여 산화성 대사가 이루어져 아세트알데히드와 함께 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생산하는데, 장기적으로 과도한 알코올 섭취는 아세트알데히드와 ROS의 생성량이 증가하며, 순차적으로 대사되는 과정에서 세포막 지질의 과산화를 일으키고 DNA, 단백질 등 유전자 산물에 손상을 일으켜 간세포를 손상시켜 지방간, 알코올성 간염, 간경화 등을 유발한다.
근래에는 만성적인 알코올 섭취 시 유도되는 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1) 효소가 간 손상의 중요 인자로 주목받고 있으며, 실험적으로 CYP2E1의 유도가 감소됨으로써 간 손상의 정도가 감소되는 것으로 보고되고 있다(Caro AA et al., 2004; Mari M et al., 2011).
이에 음주 후 숙취해소 또는 간질환 치료를 위하여 아스파라긴산 또는 페놀계 합성 항산화제인 BHA(butylated hydroxyanisole), BHT(butylated hydroxy toluene) 등의 인공제제를 단독 또는 혼합제제로 사용하여 왔으며, 최근에는 간염, 간경화, 간지방증, 약품에 의한 간 손상과 같은 간질병의 치료제로써 효능이 입증된 약용식물로부터 추출된 생약제의 수요가 증가하는 경향을 보이고 있다. 그 한 예로, 밀크티슬(Silybum marianum)에서 추출된 실리빈(silybin), 실리디아민(silydiamine), 실리크리스틴(silycristine) 등의 이성체로 구성된 실리마린(silymarin) 제제가 임상에서 응용되고 있으나, 이외에 현재 치료제로 사용 중이거나 임상시험 중인 약용식물은 소수에 불과하다. 따라서, 간 기능 예방과 관련하여, 항산화 효과를 가지고 산화적 스트레스에 의한 간 손상 또는 간세포를 보호할 수 있으며, 내성이나 안정성에 대한 문제가 되지 않는 천연물질 유래 간 보호 또는 간 손상 예방용 조성물의 개발이 시급한 실정이다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허 제1117301호는 발효울금 추출물을 함유한 알코올성 간질환의 치료 및 예방용 조성물에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 등록특허 제1059075호는 비파엽 추출물을 함유한 알코올성 간질환의 치료 및 예방용 조성물에 대하여 개시하고 있으며, 대한민국 등록특허 제0657018호는 알코올에 의한 간 섬유화 또는 간경화 예방 및 보호효과를 보이는 산수유, 솔잎, 녹차의 메탄올 추출물에 관하여 개시하고 있다. 또한, 대한민국 등록특허 제1301190호는 알콜성 간손상에 대한 간보호 활성을 지닌 곰피 또는 감태의 주정 추출물과 그로부터 분리한 플로로탄닌류를 함유하는 간보호용 조성물에 대하여 개시하고 있고, 대한민국 공개특허 제2009-0018524호는 민들레 추출물을 포함하는 알코올성 간질환의 예방 및 치료용 조성물에 대하여 개시하고 있다. 그러나 본 발명에서와 같이 해당화 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료, 및 숙취해소 효과에 대하여서는 개시된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 천연물을 이용하여 인체에 무해하고 안정성이 우수하면서도 효과가 뛰어난 식물유래 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 조성물을 개발하기 위하여 노력한 결과, 해당화 추출물을 유효성분으로 하는 조성물이 알코올성 간질환 예방 또는 치료, 및 숙취해소 효과가 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 하나의 목적은 해당화 추출물을 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 해당화 추출물을 포함하는 숙취해소용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 해당화 추출물을 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 해당화 추출물을 포함하는 숙취해소용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 해당화 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 알코올성 간질환 예방 또는 치료용, 또는 숙취해소용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
상기 해당화(Rosa rugosa THUNB.)는 장미과에 속하는 낙엽관목 식물로서, 예로부터 꽃은 토혈, 하리, 월경불순 등에 이용되고, 열매는 피로회복, 뿌리는 당뇨병 치료에 사용되어져 왔다. 이와 관련한 연구로 해당화의 잎, 꽃, 열매, 뿌리 등의 성분 연구가 이루어져 있으며, 생물활성연구로는 항당뇨, 항암, 항산화, 항균, 항염증, 혈당강하, 간장 중의 중성지방 감소 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 아직까지 해당화 추출물의 알코올성 간 손상에 대한 보호 또는 회복 효과, 숙취해소 효과 등에 대하여서는 보고된 바가 없다.
본 발명에 있어서, 상기 해당화 추출물은 해당화의 잎, 꽃, 열매, 줄기, 뿌리 및 전초로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 추출하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잎 또는 열매, 보다 바람직하게는 잎이다.
본 발명에 있어서, 해당화 추출물은 물 또는 유기용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매는 반드시 이로 제한되는 것은 아니지만, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매이며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 부탄올, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 또는 이들의 혼합용매이며, 추출물의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 추출물의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 상기 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다.
상기 정제물은 추출물 또는 분획물로부터 부유하는 고체 입자를 제거하는 과정으로, 면, 나일론 등을 이용하여 입자를 걸러 내거나 한외여과법, 냉동여과법, 원심분리법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 크로마토그래피)에 의한 분리 과정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 농축 및/또는 건조 방법은, 이로 제한되는 것은 아니나, 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조, 감압건조, 포말건조, 고주파건조, 적외선건조 등의 방법을 포함한다. 경우에 따라, 최종 건조된 추출물을 분쇄하는 공정을 추가할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 해당화 추출물은 갈산, 4-히드록시벤조산, 카페산, 파라-쿠마르산, 트랜스-페룰산, 살리실산, 나린긴, 레스베라트롤, 트랜스-시남산 및 나린게린을 포함하는 폴리 페놀성 화합물; 및 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 시스테인 및 루신을 포함하는 유리 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명의 약제학적 조성물은 해당화 추출물 이외에 황칠나무 추출물 또는 꾸지뽕나무 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 황칠나무(Dendropanax morbifera)는 두릅나무과에 속하는 식물로서, 황칠나무의 수피에서 채취되는 수액인 황칠은 비휘발성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1%, 고형분 14.4%로 구성되어 있어, 과거에는 천연도료로 많이 사용되었으며, 최근의 연구 결과에 따르면 당뇨, 고혈압, 혈액순환장애, 골다공증, 치주질환, 면역력강화, 신경안정, 항균, 항암 등에 효능이 있다고 알려져 있다.
상기 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)는 쌍떡잎식물 쐐기풀목 뽕나무과에 속하는 소교목으로서, 비타민 A, B1, B2, C, 식이섬유, 플라보노이드, 감마아미노부티르산(가바), 루틴, 플라보노이드, 아스파라긴산, 글루타민산, 리포플라민 등이 함유되어 있어, 고혈압, 당뇨병, 콜레스테롤 개선, 배변활동 개선, 항암 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 황칠나무는 황칠나무의 잎, 줄기, 가지, 뿌리 및 나무껍질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잎이다.
본 발명의 꾸지뽕나무는 꾸지뽕나무의 나무껍질, 잎, 꽃, 열매, 종자, 줄기, 뿌리 및 전초로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잎이다.
본 발명에 있어서, 상기 황칠나무 추출물 또는 꾸지뽕나무 추출물은 물 또는 유기용매를 사용하여 추출할 수 있는데, 추출한 액은 액체 형태로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 상기 유기용매의 종류, 추출방법, 농축 및/또는 건조 방법은 상기 해당화 추출물에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분인 해당화 추출물에 의하여 알코올성 간질환 예방 또는 치료하는 용도를 갖는다. 하나의 예로, 본 발명의 해당화 잎 또는 열매 추출물은 황칠나무 잎 추출물 또는 꾸지뽕나무 잎 또는 열매 추출물에 비하여 우수한 자유라디칼 제거효과를 나타내고, 알코올성 분해효소를 생성하는 유리 아미노산인 아스파르트산, 아스파라긴, 세린, 글리신, 아르기닌 또는 알리신을 유리 아미노산의 총 중량 대비 8 내지 55중량%의 함량으로 포함하며, 알코올성 간 손상을 일으키는 CYP2E1의 활성을 억제하여 간세포의 사멸을 적어도 8% 이상, 바람직하게는 15% 이상, 보다 바람직하게는 30% 이상, 보다 더 바람직하게는 40% 이상, 보다 더 바람직하게는 45% 이상, 보다 더 바람직하게는 50% 이상 감소시킨다.
또한, 본 발명의 해당화 추출물과 알코올성 간 손상에 대하여 우수한 효과를 가지는 꾸지뽕나무 추출물의 부위별 추출수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 총 폴리 페놀화합물 함량 및 유리 아미노산 함량의 차이를 비교한 결과, 꾸지뽕나무 추출물에 비하여 부위별 추출수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, 총 폴리 페놀화합물 함량 및 유리 아미노산 함량의 차이가 크지 않으므로, 해당화로부터 알코올성 간 손상에 대하여 효과가 있는 물질을 경제적으로 얻을 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 알코올 대사를 조절하여 예방 또는 치료될 수 있는 다양한 알코올성 간질환, 질병 또는 이상 상태에 적용될 수 있다. 상기 알코올성 간질환은, 예를 들어, 간염, 간경변증, 영양결핍, 치매, 중추신경 장애, 말초신경 장애 또는 지방간 중 하나일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 유효성분인 해당화 추출물에 의하여 우수한 숙취해소 효과를 나타낸다.
하나의 구체적 실시에서, 본 발명의 해당화, 황칠나무 또는 꾸지뽕나무 추출물을 유효성분으로 첨가하여 제조한 환의 숙취해소 효과에 대한 관능평가 및 임상실험을 한 결과, 해당화, 황칠나무 또는 꾸지뽕나무 추출물을 포함한 환은 두통, 매스꺼움, 갈증, 피곤함 및 구토감 등의 숙취증상을 유의적으로 개선하는 효과를 나타내었고, 특히 해당화 추출물을 포함한 환은 황칠나무 또는 꾸지뽕나무 추출물을 포함한 환에 비하여 맛 및 향의 관능성이 좋음이 판명되었다.
본 명세서에서, 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 개체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서, 용어 "개선", "회복" 또는 "치료"는 개체에서 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제 (b) 질환 또는 질병의 경감 및 (c) 질환 또는 질병의 제거를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "개체"는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 래트, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
본 발명에 있어서, 약제학적 조성물은 상기 해당화 추출물 이외에 약제학적 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 담체를 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물로 적합한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
상기 약제학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.1-100 ㎎/kg(체중)이다. 또한, 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
상기 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 해당화 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 알코올성 간질환 예방, 개선 및 회복효과가 너무 미약하고, 10중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
상기 꾸지뽕나무 추출물 또는 황칠나무 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 5중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 3중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.00001중량% 미만인 경우에는 해당화 추출물만 포함된 조성물과 유사한 알코올성 간질환 예방, 개선 및 회복효과를 나타내고, 5중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하여 비경제적이다.
또한, 본 발명은 해당화 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 개선용, 또는 숙취해소용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 있어서, 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물은 포도당 및 과당 당의 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스 및 올리고당 등의 디사카라이드, 덱스트린 및 사이클로덱스트린 등의 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 향미제는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 해당화 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품이 음료일 경우 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기의 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
상기 해당화 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 10중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 5중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.0001중량% 미만인 경우에는 알코올성 간질환 예방, 개선 및 회복효과가 너무 미약하고, 10중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하고 제형상 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
상기 꾸지뽕나무 추출물 또는 황칠나무 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 0.00001 내지 5중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 3중량%의 함량으로 포함될 수 있다. 상기 함량이 0.00001중량% 미만인 경우에는 해당화 추출물만 포함된 조성물과 유사한 알코올성 간질환 예방, 개선 및 회복효과를 나타내고, 5중량%를 초과하는 경우에는 함량의 증가에 따른 효과의 증가가 미비하여 비경제적이다.
한편, 본 발명의 해당화 추출물에 대한 세포독성 시험 결과, 해당화 추출물은 독성이 거의 없으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같이 약제학적 및 식품 조성물에 적용할 수 있다.
본 발명의 해당화 추출물은 DPPH 라디칼 및 ABTS† 라디칼 소거능면에서 상대적으로 높은 소거활성을 나타내고, 알코올성 분해효소 생성을 촉진시키는 아스파르트산, 아스파라긴, 세린, 글리신, 아르기닌 또는 알리신을 함유하며, 알코올성 간 손상을 일으키는 CYP2E1 효소의 활성을 억제하여 알코올에 의한 HepG2 세포 생존율 감소를 저해하는 효과를 나타낸다. 그리고, 알코올성 간 손상을 일으키는 간세포에 대한 세포독성이 없어 약제학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 꾸지뽕나무의 잎 및 열매 추출물, 해당화의 잎 및 열매 추출물, 또는 황칠나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 꾸지뽕나무의 잎 및 열매 추출물, 해당화의 잎 및 열매 추출물, 또는 황칠나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과이다.
도 3은 폴리페놀성 화합물 표준물질의 조성 및 함량을 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명의 꾸지뽕나무의 잎 및 열매 추출물, 해당화의 잎 및 열매 추출물, 또는 황칠나무 잎 추출물의 폴리페놀성 화합물의 조성 및 함량을 측정한 결과이다.
도 5는 유리 아미노산 표준물질의 조성 및 함량을 측정한 결과이다.
도 6은 본 발명의 꾸지뽕나무의 잎 및 열매 추출물, 해당화의 잎 및 열매 추출물, 또는 황칠나무 잎 추출물의 유리 아미노산의 조성 및 함량을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 CYP2E1 유전자를 발현하는 HepG2 세포(HepG2/2E1)에 대한 꾸지뽕나무의 잎 및 열매 추출물, 해당화의 잎 및 열매 추출물, 또는 황칠나무 잎 추출물의 농도에 따른 세포독성을 측정한 결과이다.
도 8은 본 발명의 꾸지뽕나무의 잎 및 열매 추출물, 해당화의 잎 및 열매 추출물, 또는 황칠나무 잎 추출물의 알코올 처리에 따른 CYP2E1 유전자를 발현하는 HepG2 세포(HepG2/2E1)의 생존율을 측정한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물 제조
1-1. 황칠나무(Dendropanax morbifera) 추출물 제조
황칠나무의 잎(Dendropanax morbifera leaves, DL) 10g을 채취하여 세척, 건조한 후 분쇄하여 분말화하였다. 그 다음 80% 메탄올 100ml을 넣고 추출하였다. 상기 추출원액은 와트만(Whatman, Advantes, No.2) 여과지로 여과한 후 감압농축 및 동결건조하여 황칠나무 잎 추출물을 제조하였다.
1-2. 해당화(Rosa rugosa) 추출물 제조
해당화의 잎(Rosa rugosa leaves, RL) 및 열매(Rosa rugosa fruits, RF) 각각 30g을 이용하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 해당화 잎 및 열매 추출물을 제조하였다.
1-3. 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 추출물 제조
꾸지뽕나무의 잎(Cudrania tricuspidata leaves, CL) 및 열매(Cudrania tricuspidata fruits, CF) 각각 50g을 이용하여 상기 실시예 1-1과 동일한 방법으로 꾸지뽕 잎 및 열매 추출물을 제조하였다.
실시예 2 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물 추출 수율 비교
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무, 해당화 및 꾸지뽕나무 추출물을 하기 실험식 1을 이용하여 추출수율을 조사하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
[실험식 1]
추출수율(%) = {(추출 후 시료 중량)/(추출 전 시료 중량)} × 100
부위 추출 전 건조 시료(g) 추출 후 시료(g) 수율(%)
황칠나무 잎(DL) 10 0.81 8.1
해당화 잎(RL) 30 5.91 19.7
열매(RF) 30 5.80 19.3
꾸지뽕나무 잎(CL) 50 15.68 31.4
열매(CF) 50 23.60 47.2
실험결과, 꾸지뽕나무의 열매 부위가 47.2%로 추출수율이 가장 높았으며, 황칠나무 잎 부위가 8.1%로 가장 낮은 값을 나타내었다. 한편, 해당화의 잎과 열매의 추출수율은 19.7%, 19.3%로 큰 차이를 보이지 않았으나, 꾸지뽕나무의 잎 및 열매의 추출수율은 31.4% 및 47.2%로 부위간의 추출수율이 큰 차이를 보였다.
실시예 3 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 총 폴리페놀 함량 측정
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF) 5g을 증류수 10ml에 녹인 후, 상기 희석된 용액 0.5ml에 25% 탄산나트륨 0.5ml을 각각 첨가하여 3분 동안 정치시켰다. 그 다음 2N 폴린-시오칼토 시약(Folin-Ciocalteu reagent) 0.25ml을 첨가하여 혼합한 다음 상온에서 1시간 동안 정치시켜 발색시켰다. 그 후, 상기 발색된 시료는 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, OPTIZEN 3220 UV)를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하고 갈산(gallic acid)의 검량선을 기준으로 각각의 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
실험결과, 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물의 총 폴리페놀 함량이 해당화 열매(RF) 및 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물의 총 폴리페놀 함량에 비하여 높은 함량을 나타내었다. 구체적으로, 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물의 총 폴리페놀 함량은 116.9 mg/g으로 황칠나무 잎(DL) 추출물 및 해당화 잎(RL) 추출물의 총 폴리페놀 함량에 비하여 약 1.7배 높은 함량을 나타내었다.
한편, 해당화 열매(RF) 추출물의 총 폴리페놀 함량은 34.53 mg/g이고, 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물의 총 폴리페놀 함량은 18.17 mg/g으로 해당화 열매 추출물의 총 폴리페놀 함량이 더 높게 측정되었다.
실시예 4 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 총 플라보노이드 함량 측정
상기 실시예 1에서 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF) 5g을 증류수 10ml에 녹인 후, 상기 희석된 용액 300㎕를 증류수 1.2ml과 혼합한다. 그 다음 5% 아질산나트륨(sodium nitrite) 90㎕를 각각 혼합한 후 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 다음으로, 90㎕의 10% 염화알루미늄(aluminium chloride)을 첨가한 다음 25℃에서 5분간 반응시킨 후, 1M 수산화나트륨 200㎕을 첨가하여 각 시료를 잘 혼합한 다음 10분 동안 반응시켰다. 그 후, 분광광도계를 이용하여 510nm에서 흡광도를 측정하고, 수화 루틴(rutin hydrate)의 검량선을 기준으로 하여 각각의 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실험결과, 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물의 총 플라보노이드 함량이 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF) 추출물의 총 플라보노이드 함량에 비하여 높은 함량을 나타내었다. 구체적으로, 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매(CF) 추출물의 총 플라보노이드 함량은 각각 209.1 mg/g, 31.1 mg/g이고, 황칠나무 잎(DL) 추출물의 총 플라보노이드 함량은 122.5 mg/g, 해당화 잎(RL) 및 열매(RF) 추출물의 총 플라보노이드 함량은 각각 110.9mg/g, 79.5 mg/g으로 분석되었다. 한편, 각 부위별 추출물에 따른 총 플라보노이드 함량은 잎 추출물이 열매 추출물에 비하여 높게 측정되었다.
실시예 5 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 유리당(자당, 과당, 포도당 및 맥아당) 함량 분석
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF) 20g에 증류수 50ml을 가하여 추출한 후 아세토나이트릴(acetonitrile)을 가하여 최종 용량을 100ml로 맞추었다. 그 다음 상기 용액을 4℃에서 16,000 ×g에서 30분 동안 원심분리한 후 상층액을 Sep-Pak C18 cartridge(WAT023501, Waters, USA)와 0.45㎛ 일회용 필터(syringe filter, PVDF, Whatman, Japan)로 여과, 정제하였다. HPLC(Model 9300, Younglin, Korea) 분석에 이용된 컬럼은 Sugar-pak(6.5×300mm, Alltech, USA), 이동상은 HPLC용 증류수를 사용하였고, 이동속도는 0.5ml/min- 1이였으며, 굴절률검출기(Triathlon M730D, Younglin, Korea)를 이용하여, 자당, 과당, 포도당 및 맥아당의 함량을 분석하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.
부위 유리당 함량(mg/100g 추출물) 합계
과당 포도당 자당 맥아당
황칠나무 잎(DL) 267 114 - 176 556
해당화 잎(RL) 292 225 - 42 560
열매(RF) 324 202 738 103 1,368
꾸지뽕나무 잎(CL) 22 17 3 21 62
열매(CF) 423 391 14 10 837
실험결과, 해당화 열매(RF) 추출물의 유리당 함량이 1,368 mg/100g로 가장 높은 값을 나타내었고, 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물의 유리당 함량이 837 mg/100g, 황칠나무 잎(DL) 및 해당화 잎(RL) 추출물의 유리당 함량이 각각 556mg/100g와 560 mg/100g으로 나타났으며, 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물의 유리당 함량이 가장 낮은 값을 나타내었다.
실시예 6 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 항산화 활성 측정
6-1. DPPH 라디칼 소거능 측정
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)을 각각 100, 500 및 1,000 ㎍/ml로 희석하였다. 그 다음 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl, Sigma) 30mg을 50% 에탄올 400ml에 녹인 용액 1ml에 상기 희석된 용액 0.4ml을 첨가하여 5초 동안 혼합하고, 암소에서 30분 동안 방치하여 반응시킨 후 517nm에서 흡광도(O.D)를 측정한 후 하기 실험식 2를 이용하여 DPPH 라디칼 소거능을 백분율로 표시하였다. 대조군으로는 증류수를 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 매 시료마다 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 측정하였다. 유의성 검정은 SAS(Statistis analytical system, USA) 프로그램(ver. 9.3)을 사용하여 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 행하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.
[실험식 2]
DPPH 라디칼 소거능(%) = {(대조군 흡광도- 시료 흡광도)/대조군 흡광도} × 100
부위 시료 농도(㎍/ml 추출물) EC50(㎍/ml)
100 500 1,000
황칠나무 잎(DL) 22.09±0.004 65.02±0.005 64.46±0.000 150
해당화 잎(RL) 77.76±0.004 87.23±0.000 88.38±0.003 30
열매(RF) 25.61±0.004 87.66±0.018 93.47±0.002 130
꾸지뽕나무 잎(CL) 62.77±0.022 82.50±0.003 81.99±0.002 <100
열매(CF) 5.67±0.012 16.57±0.009 34.79±0.001 >1,000
실험결과, 잎 부위의 DPPH 라디칼 소거능 활성은 해당화 잎(RL) 추출물 > 황칠나무 잎(DL) 추출물 > 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물 순으로 나타났으며, 열매 부위의 DPPH 라디칼 소거능 활성은 해당화 열매(RF) 추출물 > 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물 순으로 나타났다. 또한, 추출물의 농도가 높아질수록 항산화 활성 또한 높아졌다. 특히, 해당화 잎(RL) 추출물의 경우 EC50값이 30 ㎍/ml로 가장 낮은 값을 나타내어 활성이 강한 것으로 조사되었다.
6-2. ABTS+ 라디칼 소거능 측정
7.4 mM ABTS(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)와 2.45mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 1 : 1로 혼합하여 실온 및 암소에서 12 내지 16시간 동안 방치하여 ABTS 라디칼을 형성시킨 다음 실험 직전에 ABTS 용액을 732 nm에서 흡광도가 0.7±0.02가 되도록 PBS(phosphate buffer saline, pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 상기 희석된 용액에 상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)을 각각 500, 1,000 및 5,000 ㎍/ml을 첨가하여 암소에서 10분 동안 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도를 측정한 후 하기 실험실 3을 이용하여 ABTS 라디칼 소거능을 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 증류수를 사용하였다. ABTS+ 라디칼 소거능은 매 시료마다 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 측정하였다. 유의성 검정은 SAS(Statistis analytical system, USA) 프로그램(ver. 9.3)을 사용하여 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 행하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
[실험식 3]
ABTS+ 라디칼 소거능(%) = {(대조군 흡광도 - 시료 흡광도)/(대조군 흡광도)} × 100
부위 시료 농도(㎍/ml 추출물) EC50(㎍/ml)
500 1,000 5,000
황칠나무 잎(DL) 23.50±0.002 37.68±0.001 51.79±0.000 3,400
해당화 잎(RL) 52.23±0.003 70.86±0.002 76.11±0.001 470
열매(RF) 21.13±0.001 36.11±0.001 47.61±0.002 >5,000
꾸지뽕나무 잎(CL) 26.17±0.002 47.58±0.001 57.01±0.002 1,170
열매(CF) 16.85±0.001 32.65±0.003 51.51±0.000 3,900
실험결과, 모든 처리군에서 추출물의 농도가 높아짐에 따라 라디칼 소거능이 높아졌으며 해당화 잎(RF) 추출물에서 DPPH 라디칼 활성과 유사하게 가장 높은 활성을 나타내었다. 각각의 시료에 대한 5,000 ㎍/ml 농도 추출물의 ABTS+ 라디칼 소거능은 해당화 잎(RF) 추출물이 76.11%로 가장 높았으며, 황칠나무 잎(DL) 추출물, 꾸지뽕나무 잎(CF) 추출물이 각각 51.79%, 57.01%로 유사하게 나타났으며, 해당화 열매(RF) 추출물과 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물은 47.61%, 51.51%로 낮게 조사되었다. 또한, 추출물의 농도가 높아질수록 항산화 활성 또한 높아졌다. 특히, 해당화 잎(RL) 추출물의 경우 EC50값이 470 ㎍/ml로 가장 낮은 값을 나타내어 활성이 강한 것으로 조사되었다.
실시예 7 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 아질산염 소거능 측정
1 mM NaNO2 용액 10 ㎖에 상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)을 각각 100, 1,000 및 10,000 ㎍/ml을 가하고 0.1 N HCl과 0.2 M citrate buffer(pH 2.5)를 가하여 총 부피를 10 ㎖로 조성하였다. 다음에 37℃에서 1시간 반응시킨 후 1 ㎖를 취하여 2% 초산용액 3 ㎖와 30% 초산용액으로 용해한 Griess reagent(1% sulfanilic acid : 1% naphthylamine = 1:1) 0.4 ㎖를 순차적으로 가한 후 실온에서 15분 동안 방치하고 520 nm에서 흡광도를 측정하여 하기 실험식 4를 이용하여 아질산염 소거능을 백분율로 나타내었다. 대조군는 Griess reagent 대신 증류수를 사용하였다. 아질산염 소거능은 매 시료마다 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 측정하였다. 유의성 검정은 SAS(Statistis analytical system, USA) 프로그램(ver. 9.3)을 사용하여 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 행하였다. 그 결과를 표 5 나타내었다.
시료 부위 pH 시료 농도(㎍/ml 추출물)
100 1,000 10,000
황칠나무 잎(DL) 1.2 31.36±0.012 49.69±0.007 70.63±0.009
3.0 23.85±0.005 36.39±0.006 55.14±0.004
4.2 12.91±0.003 36.99±0.001 46.46±0.027
해당화 잎(RL) 1.2 42.84±0.005 57.37±0.005 78.17±0.003
3.0 28.99±0.012 37.54±0.002 63.33±0.004
4.2 16.03±0.002 25.19±0.004 45.71±0.013
열매(RF) 1.2 44.44±0.002 56.87±0.002 82.11±0.003
3.0 29.46±0.004 41.35±0.007 57.78±0.003
4.2 18.09±0.002 29.81±0.022 42.53±0.014
꾸지뽕나무 잎(CL) 1.2 25.82±0.007 48.99±0.001 66.18±0.002
3.0 31.20±0.008 35.60±0.001 40.61±0.006
4.2 19.43±0.002 39.87±0.007 19.55±0.024
열매(CF) 1.2 44.44±0.003 51.71±0.003 79.28±0.002
3.0 31.20±0.003 33.40±0.005 48.01±0.001
4.2 18.65±0.003 28.27±0.003 35.91±0.063
실험결과, pH 1.2, 3.0, 4.2에 대한 아질산염 소거능은 pH 1.2 처리구가 가장 높게 측정되었으며, pH 4.2가 낮게 측정되어 강산성에서 높은 결과를 나타내었다. 추출물 농도에 따른 아질산염 소거능은 추출물의 농도 의존적으로 높은 농도에서 높은 값을 나타내었다. 해당화 잎(RL) 추출물과 해당화 열매(RF) 추출물 그리고 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물에서 각각 78.17%, 82.11%, 79.28%로 높게 측정되었다.
실시예 8 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 폴리 페놀성 화합물 함량 측정
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)을 HPLC(High pressure liquid chromatography,1200 series, agilent technologies, USA)를 이용하여 페놀성 화합물 함량을 분석하였다. 폴리 페놀성 화합물의 정성 및 정량분석은 18종의 페놀성 화합물의 표준물질을 일정비율로 희석하여 HPLC를 통해 각각의 피크면적(peak area)을 얻어 희귀곡선식을 이용하여 농도를 측정하였다. HPLC용 컬럼은 shiseido(Tokyo, Japan) Capcell Pak C18 컬럼(4㎛, 250mm × 4.6mm)을 사용하고, 이동상의 흐름속도는 1.0mL/min 이였다. 표준물질의 정성분석 결과는 도 3에 나타내었다. 그 결과를 표 6 및 도 4에 나타내었다.
(단위: ㎍/g)
표준물질 황칠나무 해당화 꾸지뽕나무
잎(DL) 잎(RL) 열매(RF) 잎(CL) 열매(CF)
갈산(Gallic acid) - 2,607.11 1,988.46 - 209.75
카테킨(Catechin) 4,124.81 2,040.10 2,054.10 1,490.15 988.77
4-히드록시벤조산
(4-Hydroxybenzoic acid)		 23,930.49 42,432.49 21,731.91 9,872.09 -
클로로겐산
(Chlorogine acid)		 18,008.64 9,659.39 9,012.92 10,390.10 8,045.93
카페산(Caffeic acid) 4,317.28 2,495.03 1,834.73 2,129.06 660.79
시링산(Syringic acid) 1,076.54 - 2,045.21 2,042.98 1,129.22
파라-쿠마르산
(ρ-Coumaric acid)		 1,567.90 2,224.06 1,321.21 1,128.61 326.25
트랜스-페룰산
(trans-Ferulic acid)		 5,854.32 3,192.89 1,843.73 547.47 286.05
살리실산
(Salicylic acid)		 6,351.60 9,282.23 6,768.87 9,004.02 1,318.10
나린긴(Naringin) 2,264.20 8,394.42 2,585.98 2,354.01 428.28
레스베라트롤
(Resveratrol)		 1,402.47 1,027.41 519.47 1,411.72 159.90
트랜스-시남산
(trans-Cinnamic acid)		 371.60 238.58 59.44 577.31 12.00
나린게닌(Naringenin) 14,083.95 20,300.36 4,869.99 35,248.92 1,069.65
합계 83,353.83 103,894.06 56,636.01 76,196.44 14,634.70
실험결과, 각 부위별 총 페놀성 화합물 함량은 잎에서 높게 조사되었으며, 해당화 잎(RL) 추출물에서 가장 높은 103,894.06 ug/g의 함량을 나타내었고, 해당화 열매(RF) 추출물의 경우 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물에 비하여 조금 낮은 값을 나타냈다.
실시예 9 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 유리 아미노산 함량 측정
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF) 2g에 에탄올에 넣어 유리 아미노산을 추출한 후 에테르로 지방 등의 기타성분을 제거하고 55℃의 항온수조에서 감압 농축하였다. 상기 농축된 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF) 약 10mg을 취하여 PITC를 부착한 후 HPLC(Waters 510 system, USA)를 이용하여 유리 아미노산 함량을 분석하였다. HPLC 컬럼은 Pico-Tag 컬럼(3.9×300 mm, Waters, USA)을 사용하였고, 검출기는 포토 다이오드 어레이 검출기(photodiode array detector)를 이용하여 254nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질의 정성분석 결과는 도 5에 나타내었다. 그 결과를 표 7 및 도 6에 나타내었다.
(단위: ng/mg)
유리 아미노산 황칠나무 해당화 꾸지뽕나무
잎(DL) 잎(RL) 열매(RF) 잎(CL) 열매(CF)
아스파르트산(Asp) 346.71 244.73 239.88 1,420.19 723.35
글루타민산(Glu) 94.80 364.97 549.64 491.57 1,681.38
아스파라긴(Asn) 536.60 53.44 3,420.50 1,480.26 6,490.27
세린(Ser) 56.01 17.96 292.78 107.09 835.07
글루타민(Gln) 124.83 68.67 188.16 286.39 1,699.68
글리신(Gly) 26.72 9.87 23.40 53.75 149.93
히스티딘(His) 22.98 - 612.05 108.62 136.95
아르기닌(Arg) 91.74 - 359.20 151.29 2,383.73
트레오닌(Theronine) 69.67 37.68 101.02 116.83 259.87
알라닌(Ala) 138.98 46.79 84.91 332.21 851.34
프롤린(Proline) 128.02 102.09 123.56 845.65 2,086.45
티로신(Tyrosine) 65.59 135.82 75.81 90.06 201.85
발린(Valine) 93.57 - 103.06 254.94 261.14
메티오닌(Methionine) - - 34.68 62.29 60.91
시스테인(Cys2) - 122.69 - 196.50 -
이소루신(Isoleucine) 57.58 65.93 66.95 87.68 213.71
루신(Leucine) 87.13 50.37 43.52 116.31 191.40
페닐알라닌(Pheylalanine) 58.99 42.34 36.86 44.46 142.90
트립토판(Trptophan) 44.89 - 325.58 103.78 550.14
리신(lysine) 51.30 20.60 40.17 22.17 203.75
합계 2,096.11 1,383.95 6,721.73 6,372.04 19,123.82
실험결과, 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물이 19,123.82 ng/mg으로 가장 많은 유리 아미노산 함량을 나타냈고, 다음으로는 해당화 열매(RF) 추출물이 6,721.73 ng/mg, 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물이 6,372.04 ng/mg, 황칠나무 잎(DL) 추출물이 2,096.11 ng/mg, 해당화 잎(RL) 추출물이 1,383.95 ng/mg 순으로 유리 아미노산 함량을 나타내었다. 구체적으로, 꾸지뽕나무 열매(CF) 추출물은 유리 아미노산 중 아스파라긴(Asn) 함량이 6,490.27 ng/mg으로 가장 높았으며, 해당화 열매(RF), 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 황칠나무 잎(DL) 추출물의 경우도 아스파라긴(Asn) 함량이 가장 높았다. 해당화 잎(RL) 추출물은 글루타민산(Glu)이 364.97 ng/mg로 가장 많이 함유되어 있음을 확인하였다.
실시예 10 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물에 따른 CYP2E1(Cytochrome P450 2E1 ) 유전자가 발현되는 간세포의 세포독성 및 알코올 손상 간세포의 보호효과 측정
10-1. CYP2E1 유전자 발현 벡터 제작 및 간세포에 CYP2E1 유전자 형질전환
인간의 CYP2E1 cDNA의 주형을 유전자은행(Gene bank)으로부터 분양 받아 전방향 5′-CAG CAG GGC CCC AGC GCA CCA TGR C-3' 프라이머와 역방향 5'-TTC AGG GTG ACC TCC ACT CAC TCA TG-3' 프라이머를 사용하여 PCR를 통해 CYP2E1의 전체 서열을 합성하였다. 상기 합성된 PCR 산물은 pCR2.1-TOPO 벡터(invitrogen, San Diego, CA)를 이용하여 일차적으로 클로닝한 후 이를 다시 pcDNA3.1-His6-V5 벡터(invitrogen, San Diego, CA)에 클로닝 하였다. 그 다음 상기 형질전환된 HepG2 세포로부터 DNeasy plant maxi kit(Qiagen, Hilden ,Germany)를 이용하여 총 게놈성 DNA(genome DNA)를 분리한 후 상기 프라이머를 이용하여 CYP2E1 유전자 삽입 여부를 확인하였고, 상기 CYP2E1 유전자가 삽입된 방향성 및 염기서열의 정확여부는 DNA 시퀀싱(seqeunceing)을 통하여 확인하였다. 그 다음 상기 CYP2E1 유전자가 클로닝된 벡터를 인간 간암 세포인 HepG2(American type culutre collection, ATCC, Rockvelle, MD)에 형질전환 시켰다. 그 다음 CYP2E1 유전자를 포함하는 HepG2 세포를 20% FBS, 0.5% 스트렙토마이신(streptomycin, 50 g/ml), 0.5% 페니실린(penicillin, 50 units/ml)을 포함하는 액체배지(RPMI 1640 medium, invitrogen, San Diego, CA)를 이용하여 37℃, 5% CO2, 95% 습도로 조절된 배양기에서 배양하였다.
상기 CYP2E1 유전자를 발현하는 HepG2 세포를 이하 HepG2/2E1 세포라 하겠다.
10-2. 황칠나무, 해당화 및 꾸지뽕나무 추출물의 농도에 따른 HepG2/2E1 세포에 대한 세포독성 측정
상기 실시예 10-1에서 형질전환된 HepG2/2E1 세포를 24-웰 플레이트에 5 × 104 cells/well 가 되도록 분주하고 3% 우혈청(FBS)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지에 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)을 각각 100, 250 및 500 ㎍/ml의 농도로 첨가하고, 37℃, 5% CO2, 95% 습도로 조절된 배양기에서 6일 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 세포는 PBS로 세척하고 MTT(2.5mg/ml)를 DMEM 배지에 10배 희석시켜 그 희석액 1ml을 세포에 첨가하여 37℃에서 4시간 동안 배양시킨 후 배지를 제거하고 DMSO를 첨가하여 상온에서 10분 동안 녹인 다음, 570nm에서 흡광도를 측정하여 세포생존율을 백분율로 측정하였다. 세포생존율은 매 시료마다 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 측정하였다. 유의성 검정은 SAS(Statistis analytical system, USA) 프로그램(ver. 9.3)을 사용하여 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 행하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실험결과, 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)은 모든 농도에서 세포 독성을 나타내지 않았다.
10-3. 황칠나무, 해당화 및 꾸지뽕나무 추출물의 알코올 손상된 간세포의 보호효과 측정
상기 실시예 10-1에서 형질전환된 HepG2/2E1 세포를 24-웰 플레이트에 5 × 104 cells/well 가 되도록 분주하고 3% 우혈청(FBS)이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지에 접종하고, 상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF)을 각각 100 ㎍/ml의 농도로 처리하여 1시간 동안 배양한 후 300 mM 알코올을 처리하여 24시간 동안 배양하였으며, 5일 동안 동일한 처리를 하였다. 5일 배양 후 PBS로 세척한 다음 50% 트리클로로아세트산(tricholoroacetic acid, TCA)를 첨가하여 4℃의 온도에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 TCA를 제거하고 증류수로 5번 세척하고 실온에서 건조시킨 후 0.4% 술포로다민 B(sulforohodamine B, SRB) 100㎕를 첨가하여 30분 동안 염색하였다. 그 다음 1% 아세트산으로 5번 세척하고 실온에서 건조시킨 후 0.01M 완충액 150㎕를 첨가한 다음 510nm에서 흡광도를 측정하여 하기 실험실 4를 이용하여 세포생존율을 백분율로 나타내었다. 대조군으로는 알코올 대신 증류수를 처리한 HepG2/2E1 세포를 사용하였다. 세포생존율은 매 시료마다 3회 반복 측정하여 평균과 표준편차를 측정하였다. 유의성 검정은 SAS(Statistis analytical system, USA) 프로그램(ver. 9.3)을 사용하여 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)을 행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
[실험식 4]
세포보호활성(%) = {(대조군 흡광도 - 시료 흡광도)/(대조군 흡광도)} × 100
실험결과, 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물의 세포 생존율이 78.6%로 CYP2E1에 의한 알코올성 세포독성 증가를 감소시키는 효과가 가장 높은 것으로 확인하였으며, 그 다음으로 해당화 잎(RL) 추출물(69.3%), 황칠나무 잎(DL) 추출물(60.2%) 순으로 높은 간세포 보호효과를 나타내었다.
실시예 11 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 관능검사
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF), 또는 이들의 혼합물 0.8kg에 각각 꿀 1kg을 혼합하여 환 형태로 제조하고, 관능검사를 실시하였다.
관능검사 요원은 성인 남성 10명과 성인 여성 10명을 대상으로 교육과정을 통하여 평가할 특성에 대한 식별력과 특성, 맛에 대한 안정된 판단기준을 확립한 후 관능검사에 임하였다. 관능검사 항목은 색, 향, 맛 및 전체적인 기호도의 총 4가지를 10점 만점 기준으로 평가하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.
채점 기준은 다음과 같다.
아주 좋다 : 10점
좋다 : 8점
보통이다 : 6점
나쁘다 : 4점
아주 나쁘다 : 2점
부위 색 향 맛 기호도
황칠나무 잎(DL) 6.8 7.1 5.8 6.7
해당화 잎(RL) 6.5 6.9 8.4 7.8
열매(RF) 8.2 8.5 8.6 8.2
꾸지뽕나무 잎(CL) 6.4 7.0 6.2 7.2
열매(CF) 8.5 8.6 8.4 8.4
실험결과, 꾸지뽕나무 열매(CF) 또는 해당화 열매(RF) 추출물을 포함하여 제조한 환은 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 또는 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물을 포함하여 제조한 환에 비하여 전체적인 관능성이 좋은 것으로 확인되었다. 한편, 해당화 잎(RL) 추출물을 포함하여 제조한 환은 황칠나무 잎(DL) 또는 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물을 포함하여 제조한 환에 비하여 맛이 좋게 평가되었다.
실시예 12 : 황칠나무, 해당화 또는 꾸지뽕나무 추출물의 임상실험
상기 실시예 1에서 추출한 황칠나무 잎(DL), 해당화 잎(RL) 및 열매(RF), 및 꾸지뽕나무 잎(CL) 및 열매 추출물(CF), 또는 이들의 혼합물 0.8kg에 각각 꿀 1kg을 혼합하여 환 형태로 제조하였다. 그 다음 상기 환 형태로 제조한 조성물의 알코올에 대한 간 보호 효능을 알아보기 위한 임상실험을 실시하였다.
유의차를 줄이기 위하여 동일 나이인 40세의 남성 55명(대조군 5명, 실험군 50명)을 실험대상으로 하였으며, 실험의 정확도를 가하기 위하여 본 실험이 있기 10일 전부터 음주를 경험하지 못하게 하였다. 실험 그룹은 음주 10분 전에 복용하도록 한 25명(그룹 1) 및 음주 10 내지 30분 후 복용하도록 한 25명(그룹 2)로 분류하였다. 또한, 취하는 정도를 동일하게 하기 위하여, 음주량이 소주 반병(120ml)을 1시간에 걸쳐 먹도록 하였으며, 음주 후 6시간 이후에 숙취효능을 평가하였다. 숙취평가 항목은 두통, 매스꺼움, 갈증, 피곤함 및 구토감의 총 5가지의 숙취가 해소되는 정도를 10점 만점 기준으로 평가하였다. 대조군으로는 본 발명의 조성물을 포함한 환을 복용하지 않고 소주를 마신 남성 5명을 대상으로 하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.
채점 기준은 다음과 같다.
아주 좋다 : 10점
좋다 : 8점
보통이다 : 6점
나쁘다 : 4점
아주 나쁘다 : 2점
부위 두통 속매스꺼움 갈증 피곤함 구토감
대조군 4.0 2.0 4.0 3.0 4.4
그룹 1 황칠나무 잎(DL) 6.8 4.5 7.1 8.2 7.8
해당화 잎(RL) 7.7 7.2 7.2 9.0 8.9
열매(RF) 5.6 5.0 7.0 7.5 6.4
꾸지뽕나무 잎(CL) 7.8 7.5 8.2 8.9 8.4
열매(CF) 5.8 4.8 6.8 7.7 6.7
그룹 2 황칠나무 잎(DL) 8.2 7.8 8.5 8.9 8.8
해당화 잎(RL) 8.2 8.2 7.9 9.3 9.0
열매(RF) 6.1 5.4 6.9 7.2 7.0
꾸지뽕나무 잎(CL) 8.5 8.1 8.6 9.2 8.5
열매(CF) 6.2 5.0 6.8 6.9 6.8
실험결과, 음주 전 또는 음주 후에 해당화 잎(RL) 또는 꾸지뽕나무 잎(CL) 추출물을 포함하여 제조한 환을 복용한 그룹에서 숙취증상을 해소하는 효과가 가장 높은 것으로 관찰되었으며, 그 다음으로 황칠나무 잎(DL), 꾸지뽕나무 열매(CF), 해당화 열매(RF) 순으로 숙취해소 효과가 있는 것으로 관찰되었다.

Claims (8)

  1. 갈산, 4-히드록시벤조산, 카페산, 파라-쿠마르산, 트랜스-페룰산, 살리실산, 나린긴, 레스베라트롤, 트랜스-시남산 및 나린게린을 포함하는 폴리 페놀성 화합물; 및 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 시스테인 및 루신을 포함하는 유리 아미노산을 포함하는 해당화 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 알코올성 간질환은 간염, 간경변증 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 황칠나무 또는 꾸지뽕나무 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  4. 갈산, 4-히드록시벤조산, 카페산, 파라-쿠마르산, 트랜스-페룰산, 살리실산, 나린긴, 레스베라트롤, 트랜스-시남산 및 나린게린을 포함하는 폴리 페놀성 화합물; 및 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 시스테인 및 루신을 포함하는 유리 아미노산을 포함하는 해당화 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 약제학적 조성물.
  5. 갈산, 4-히드록시벤조산, 카페산, 파라-쿠마르산, 트랜스-페룰산, 살리실산, 나린긴, 레스베라트롤, 트랜스-시남산 및 나린게린을 포함하는 폴리 페놀성 화합물; 및 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 시스테인 및 루신을 포함하는 유리 아미노산을 포함하는 해당화 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 알코올성 간질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알코올성 간질환은 간염, 간경변증 또는 지방간인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 식품 조성물은 황칠나무 또는 꾸지뽕나무 추출물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  8. 갈산, 4-히드록시벤조산, 카페산, 파라-쿠마르산, 트랜스-페룰산, 살리실산, 나린긴, 레스베라트롤, 트랜스-시남산 및 나린게린을 포함하는 폴리 페놀성 화합물; 및 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 시스테인 및 루신을 포함하는 유리 아미노산을 포함하는 해당화 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 숙취해소용 식품 조성물.
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