WO2023096326A1 - Lgk974를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Lgk974를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023096326A1
WO2023096326A1 PCT/KR2022/018564 KR2022018564W WO2023096326A1 WO 2023096326 A1 WO2023096326 A1 WO 2023096326A1 KR 2022018564 W KR2022018564 W KR 2022018564W WO 2023096326 A1 WO2023096326 A1 WO 2023096326A1
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preventing
lgk974
ccl
kidney disease
inflammatory kidney
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PCT/KR2022/018564
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윤유식
오동진
심인애
이종규
임혜미
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중앙대학교 산학협력단
의료법인 명지의료재단
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating inflammatory kidney disease comprising LGK974.
  • the kidneys in our body are organs that perform several functions and are one of the representative excretory organs.
  • As an excretory organ it regulates the amount of water, waste products, and electrolyte concentration.
  • As an endocrine organ it produces erythropoietin (red blood cell production hormone) and renin (blood pressure regulating hormone), and controls parathyroid function and calcium metabolism by regulating vitamin D3 metabolism. perform the function of In addition, it also functions as a metabolic organ, such as destruction of peptide hormones, reabsorption of low-molecular-weight proteins, and regulation of glucose/lipid metabolism.
  • nephritis Diseases occurring in the kidney include nephritis, acute renal injury, renal failure, renal cancer, and the like. If nephritis persists, diseases such as chronic renal failure or hypertension due to loss of renal function are induced, and complications such as damage to other organs and metabolic abnormalities are induced. For the treatment of this, immunosuppressants, anti-inflammatory drugs, and vascular/hypertensive agents are mainly prescribed. In addition, in the case of pyelonephritis caused by infection, quinolone antibiotics are used.
  • tacrolimus, eculizumab, mycophenolate mofertil, and cyclosporine A are used, and as anti-inflammatory agents, dexametasone and prednisolone ( prednisolone) has been used.
  • candesartan is used as a vaso/hypertensive agent, and rituximab and abatacept, which have antitumor activity, are also used as therapeutic agents for glomerulonephritis.
  • long-term use of anti-inflammatory drugs or immunosuppressants causes side effects such as ulceration, edema, increased infection, high blood pressure, and liver toxicity, which limits their use. The situation is.
  • acute kidney injury includes ischemia-reperfusion-related renal injury, sepsis-related renal injury, nephrotoxic renal injury, and the like.
  • inflammatory cytokines and chemokines are involved in the etiology of acute renal injury, no drug has been developed to effectively reduce them in patients with acute renal injury.
  • acute renal injury patients maintained conservative treatment without drug treatment, but when complications occur, the situation remains at the level of applying renal replacement therapy (dialysis). Therefore, the development of effective and safe inflammatory kidney disease treatment is expected to play a significant role in the treatment of acute kidney injury.
  • Sepsis is an uncontrolled inflammatory response to infection that results in life-threatening organ failure.
  • a cytokine storm which means a rapid increase in cytokines generated in the blood and organs, is a major characteristic of sepsis.
  • Kidney damage is a typical example of organ failure due to sepsis, leading to death or lifelong dialysis.
  • drug repositioning refers to an attempt to review existing drugs and medicines and apply them to new indications (diseases), which can reduce the time and cost of drug development and reduce drug toxicity and clinical research. It has a low failure rate and is used as a new drug development strategy.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for inflammatory kidney disease with excellent safety and therapeutic activity through drug repositioning.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory kidney disease comprising a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving inflammatory kidney disease comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a method for preventing or treating inflammatory kidney disease comprising administering the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • LGK974 inhibits TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4 and CCL-5 in the kidney.
  • inflammatory cytokines or chemokines and reducing renal damage biomarkers such as serum creatinine, serum cystatin C or serum blood urea nitrogen (Blood Urea Nitrogen: BUN)
  • BUN serum Urea Nitrogen
  • it By suppressing the amplification of inflammation caused by the interaction between p-I ⁇ B (NF- ⁇ B pathway protein) and ⁇ -TrCP (Wnt pathway protein), it can be usefully used as a pharmaceutical composition or health food for preventing or treating inflammatory kidney disease there is.
  • LGK974 is currently undergoing clinical trials in patients with pancreatic cancer, colon cancer, melanoma, breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer, esophageal cancer and lung cancer, so it has fewer side effects than existing nephritis treatments in a short time through drug repositioning. It has the advantage of being able to develop a safe treatment for inflammatory kidney disease.
  • Figure 1 analyzes the effect of increasing survival rate according to 2-hour pre-treatment, co-treatment or 1-hour post-treatment of LGK974 in LPS-treated mice (LGK974: 0, 20, 40 or 60 mg/Kg treatment, LPS: 0 or 25 mg/Kg treatment),
  • Figure 2 is an analysis of the effect of LGK974 treatment on inflammatory cytokine and chemokine mRNA in the kidneys of LPS-treated mice by RT-qPCR (LGK974: 0, 20, 40 or 60 mg/Kg treatment, LPS: 0 or 25 mg/Kg treatment),
  • Figure 3 analyzes the effect of LGK974 treatment on serum biomarkers for kidney damage in LPS-treated mice by serum biochemical analyzer (LGK974: 0, 20, 40 or 60 mg/Kg treatment, LPS: 0 or 25 mg /Kg processing).
  • Figure 4 analyzes the effect of LGK974 treatment on the renal histology of LPS-treated mice (LGK974: 0 or 60 mg/Kg treatment, LPS: 0 or 25 mg/Kg treatment),
  • Figure 5 shows the interaction of p-I ⁇ B (phospho-I ⁇ B; NF- ⁇ B pathway protein) and ⁇ -TrCP ( ⁇ -transducin repeat-keeping protein; Wnt pathway protein) in the kidney tissue of LPS-treated mice by immunoprecipitation (Immunoprecipitation). ) and analyzed by western blotting (LGK974: 0 or 60 mg/Kg treatment, LPS: 0 or 25 mg/Kg treatment),
  • LGK974 0, 20 or 60 mg/kg treatment
  • LGK974 is Escherichia coli ( Escherichia coli )
  • the effect of LGK974 treatment on renal inflammatory cytokine and chemokine mRNA in mice injected with tail vein of 10 9 cfu was analyzed by RT-qPCR (LGK974: 0 or 60 mg/Kg treatment).
  • pancreatic cancer, colorectal cancer, black LGK974 which is undergoing clinical trials in patients with breast cancer, head and neck cancer, cervical cancer, esophageal cancer, and lung cancer, increases the survival rate of mice inflamed by intraperitoneal injection of LPS (lipopolysaccaride) and increases TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL- It reduces inflammatory cytokines or chemokines such as 1 ⁇ , IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, and CCL-5, and reduces serum creatinine, serum cystatin C, or serum blood urea nitrogen (Blood Urea Nitrogen: By reducing renal damage biomarkers such as BUN) and suppressing histological inflammatory findings in the
  • LGK974 has been reported as a Wnt pathway inhibitor, it does not simply suppress renal inflammation by inhibiting the Wnt pathway.
  • LGK974 inhibits the interaction between p-I ⁇ B (NF- ⁇ B pathway protein) and ⁇ -TrCP (Wnt pathway protein).
  • P-I ⁇ B is a key protein in the NF- ⁇ B pathway that causes an inflammatory response
  • ⁇ -TrCP is a protein induced by Wnt pathway activation. The interaction between P-I ⁇ B and ⁇ -TrCP activates the pro-inflammatory NF- ⁇ B pathway.
  • NF- ⁇ B activates the Wnt pathway because it increases Wnt expression
  • ⁇ -TrCP induced by the Wnt pathway activates the NF- ⁇ B pathway by interacting with p-I ⁇ B, so synergy between the two pathways It can be seen that inflammation causes amplification by
  • LGK974 inhibits the interaction between p-I ⁇ B and ⁇ -TrCP, thereby reducing the interaction between the NF- ⁇ B pathway and the Wnt pathway, thereby suppressing the amplification of inflammation.
  • the inventors of the present invention found that LGK974 suppresses the rapid increase of cytokines and chemokines according to the amplification of inflammation in the kidney, and consequently treats and improves kidney damage.
  • LGK974 inhibits mortality and rapid increase in serum cytokines (cytokine storm) in mice induced sepsis by intravenous injection of live Escherichia coli , and renal TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5, etc., by reducing inflammatory cytokines or chemokines, thereby completing the present invention by identifying that there is an inhibitory effect on sepsis-related renal damage.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory kidney disease comprising a compound represented by Formula 1 (LGK974) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • LGK974 a compound represented by Formula 1, is (2-(2',3-dimethyl-[2,4'-bipyridin]-5-yl)-N-(5-(pyrazin-2-yl)pyridin- 2-day) acetamide), and has been developed as a candidate drug for various cancers such as ovarian cancer, lung cancer, squamous cell carcinoma, glioblastoma or colon cancer, and is currently undergoing clinical trials in various cancer patients.
  • LGK974 has been reported as a Wnt pathway inhibitor, it does not simply suppress renal inflammation by inhibiting the Wnt pathway.
  • LGK974 inhibits the interaction between p-I ⁇ B (NF- ⁇ B pathway protein) and ⁇ -TrCP (Wnt pathway protein) in kidney tissue. Inhibiting the interaction between p-I ⁇ B and ⁇ -TrCP can suppress the rapid increase of inflammatory cytokines and chemokines following the amplification of inflammation caused by the interaction between the NF- ⁇ B pathway and the Wnt pathway.
  • LGK974 is known to improve kidney function in a mouse model of polycystic kidney disease
  • polycystic kidney disease is an autosomal dominant genetic disease caused by gene mutation. It is characterized by the formation of cysts in the kidneys due to inheriting one mutant gene. Polycystic kidney disease is distinctly different from inflammatory kidney disease, which occurs regardless of gene mutation, in its cause. No research results on inflammatory kidney disease of LGK974 have been reported.
  • the 'pharmaceutically acceptable salt' may be used in the form of any one of a pharmaceutically acceptable basic salt or acid salt.
  • the basic salt may be used in the form of any one of an organic base salt and an inorganic base salt, and examples thereof include sodium salt, potassium salt, calcium salt, lithium salt, magnesium salt, cesium salt, aminium salt, and ammonium salt. , triethylaminium salts and pyridinium salts, etc. may be used, but are not limited thereto.
  • an acid addition salt formed by a free acid may be useful as the acid salt.
  • Inorganic and organic acids can be used as free acids, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, sulfurous acid and phosphoric acid can be used as inorganic acids, and citric acid, acetic acid, maleic acid, fumaric acid, glucoic acid, and methanesulfonic acid can be used as organic acids.
  • benzenesulfonic acid camphorsulfonic acid, oxalic acid, malonic acid, glutaric acid, acetic acid, glycolic acid, succinic acid, tartaric acid, 4-toluenesulfonic acid, galacturonic acid, embonic acid, glutamic acid, citric acid and aspartic acid etc.
  • hydrochloric acid may be used as an inorganic acid and methanesulfonic acid may be used as an organic acid.
  • composition according to the present invention may include not only pharmaceutically acceptable salts, but also all salts, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods.
  • the addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method.
  • LGK974 is dissolved in a water-miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile, and an excess of an organic base is added or an inorganic base is added.
  • a water-miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile
  • an excess of an organic base is added or an inorganic base is added.
  • It can be prepared by adding an aqueous base solution followed by precipitation or crystallization.
  • the solvent or excess base may be evaporated from the mixture and then dried to obtain an addition salt, or the precipitated salt may be suction filtered.
  • the inflammatory kidney disease may be selected from the group consisting of glomerulonephritis, pyelonephritis, interstitial nephritis, lupus nephritis, diabetic nephropathy, tubular atrophy, glomerulosclerosis, renal failure, sepsis-related renal injury and renal toxic renal injury, but is limited thereto. it is not going to be
  • the LGK974 is TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-1 ⁇ , which are caused by amplification of inflammation caused by the interaction between p-I ⁇ B (NF- ⁇ B pathway protein) and ⁇ -TrCP (Wnt pathway protein) in the kidney.
  • NF- ⁇ B NF- ⁇ B pathway protein
  • ⁇ -TrCP Wnt pathway protein
  • serum creatinine, serum cystatin C or serum Inflammatory kidney disease can be treated or improved by reducing renal damage biomarkers selected from blood urea nitrogen (BUN).
  • the pharmaceutical composition may be provided in one or more formulations selected from the group consisting of gels, emulsions, injections, powders, granules, aerosols, pastes, percutaneous absorbents, and patches according to conventional methods, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition is a suitable carrier, excipient, disintegrant, sweetener, coating agent, expanding agent, lubricant, lubricant, flavoring agent, antioxidant, buffer, bacteriostatic agent commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions , Diluents, dispersants, surfactants, binders and may further include one or more additives selected from the group consisting of lubricants.
  • carriers, excipients and diluents are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline Cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil may be used, and solid dosage forms for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules.
  • solid preparations may be prepared by mixing at least one or more excipients, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc., with the composition.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for internal use, emulsions, and syrups, and may include various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base material of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, and glycerogeratin may be used.
  • the present invention provides a method for preventing or treating inflammatory kidney disease comprising administering the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the preferred dosage of LGK974 may vary depending on the condition and body weight of the subject, the type and severity of the disease, the type of drug, the route and duration of administration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. According to one embodiment of the present invention, but not limited thereto, the daily dosage may be 0.01 to 200 mg/kg, specifically 0.1 to 200 mg/kg, and more specifically 0.1 to 100 mg/kg. Administration may be administered once a day or divided into several administrations, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • the 'subject' may be a mammal including a human, but is not limited to these examples.
  • the present invention provides a health food composition for preventing or improving inflammatory kidney disease comprising the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the health food may be provided in the form of powder, granule, tablet, capsule, syrup or beverage, and the health food may be used with other foods or food additives in addition to the compound as an active ingredient, and may be appropriately used according to a conventional method. there is.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use thereof, for example, prevention, health or therapeutic treatment.
  • the effective dose of the compound contained in the health food may be used according to the effective dose of the pharmaceutical composition, but may be less than the above range in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, Since the active ingredient has no problem in terms of safety, it is certain that it can be used in an amount greater than the above range.
  • the inflammatory kidney disease is the same as described above, so a repetitive description is omitted.
  • Lipolysaccharide was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) and Escherichia coli coli ) was purchased from ATCC (Manassas, VA, USA). LGK974 was obtained from MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA).
  • mice intraperitoneally injected with saline were used as controls.
  • mice Six hours after LPS intraperitoneal injection, mice were anesthetized with 50 mg/kg alpaxalone (Jurox, Rutherford, Australia) via intraperitoneal injection, and blood samples were collected from the heart and stored at 4 °C for 16 hours, followed by 2,000 xg for 10 minutes. Serum was collected by centrifugation. And kidney tissue was collected for RT-qPCR and histological examination.
  • RT-qPCR reaction was performed using TaqMan Gene Expression Master Mix (cat# 43-690-16) and the corresponding gene primer/probe set [tumor necrosis factor (TNF)- ⁇ (cat# Mm00443258_m1), interferon (IFN)- ⁇ (cat# Mm00443258_m1) # Mm01168134_m1), interleukin (IL) -1 ⁇ (CAT# MM00439620_M1), IL-1 ⁇ (CAT# MM00434228_M1), IL-6 (CAT# MM00446190_M1) TIF Chemokine Ligand (CCL) 2 (cat# Mm00441242_m1), CCL3 (cat# Mm00441259_m1), CCL4 (cat# 00443111_m1), CCL5 (cat# Mm01302428_m1) and 18S ribosomal RNA (cat# Hs99999901_s1)].
  • TIF Tumor necrosis factor
  • Kidney tissue collected from each mouse was fixed with 4% formalin, and the fixed tissue was subjected to general tissue processing such as dehydration, paraffin embedding, and dissection to prepare a specimen for histopathological examination and then hematoxylin-eosin (Hematoxylin-Eosin). Eosin) staining was performed for histological analysis.
  • P-I ⁇ B is a key protein of the NF- ⁇ B pathway that causes an inflammatory response
  • ⁇ -TrCP is a protein induced by Wnt pathway activation.
  • the interaction between p-I ⁇ B and ⁇ -TrCP in the kidney was analyzed by immunoprecipitation. Kidney tissue was immunoprecipitated with an antibody against ⁇ -TrCP, and Western blotting was performed with an antibody against p-I ⁇ B to measure the amount of p-I ⁇ B precipitated together with ⁇ -TrCP.
  • mice In order to analyze the cytokine storm in the blood of sepsis-induced mice, 10 9 cfu of E. coli was injected into the tail vein, and 4 hours later, the mice's blood was collected and serum was separated. Serum concentrations of major inflammatory cytokines, Tumor necrosis factor (TNF)- ⁇ , interleukin (IL)-6, and IL-1 ⁇ , were analyzed by ELISA (Enzyme linked immuno-sorbant assay) method.
  • TNF Tumor necrosis factor
  • IL-6 interleukin-6
  • IL-1 ⁇ IL-1 ⁇
  • LGK974 dose-dependently increased the survival rate of mice in which inflammation was induced by LPS intraperitoneal injection, and showed a clear survival rate increase effect in all cases of LPS intraperitoneal injection pretreatment, simultaneous treatment, and posttreatment.
  • TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , IL-1 ⁇ , IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL in the kidney by the induction of inflammation by intraperitoneal injection of LPS
  • various inflammatory cytokines and chemokines, such as -5 were rapidly increased, they were significantly suppressed in a dose-dependent manner by treatment with LGK974.
  • serum creatinine, serum cystatin C, or serum blood urea nitrogen (BUN), which are serum biomarkers for renal damage, were significantly increased by intraperitoneal injection of LPS, but treatment with LGK974 It was significantly inhibited in a dose-dependent manner.
  • LGK974 can effectively treat or improve renal inflammation, kidney damage, and sepsis caused by LPS intraperitoneal injection and E. coli intravenous injection, so LGK974 is effective in treating or improving inflammatory kidney disease.
  • As a very effective drug it can be used as a pharmaceutical or health functional food.
  • a powder was prepared by mixing 20 mg of LGK974, 100 mg of lactose, and 10 mg of talc and filling in an airtight bag.
  • Tablets were prepared by mixing 10 mg of LGK974, 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose, and 2 mg of magnesium stearate, and then tableting according to a conventional tablet manufacturing method.
  • LGK974 1 mg appropriate amount of vitamin mixture (vitamin A acetate 70 ⁇ g, vitamin E 1.0 mg, vitamin B1 0.13 mg, vitamin B2 0.15 mg, vitamin B6 0.5 mg, vitamin B12 0.2 ⁇ g, vitamin C10 mg, biotin 10 ⁇ g, nicotinamide 1.7 mg, folic acid 50 ⁇ g, calcium pantothenate 0.5 mg) and appropriate amount of mineral mixture (ferrous sulfate 1.75 mg, zinc oxide 0.82 mg, magnesium carbonate 25.3 mg, monopotassium phosphate 15 mg, dicalcium phosphate 55 mg, potassium citrate 90 mg, calcium carbonate 100 mg, and magnesium chloride 24.8 mg) were mixed, then granules were prepared and health food was prepared according to a conventional method.
  • vitamin mixture vitamin A acetate 70 ⁇ g, vitamin E 1.0 mg, vitamin B1 0.13 mg, vitamin B2 0.15 mg, vitamin B6 0.5 mg, vitamin B12 0.2 ⁇ g, vitamin C10 mg, biotin 10

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Abstract

본 발명은 LGK974를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 조성물 및 치료방법에 관한 것으로, 상기 LGK974는 신장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5 등의 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 감소시키며, 혈청 크레아티닌, 혈청 시스타틴 C 또는 혈청 혈중요소질소(Blood Urea Nitrogen : BUN)에서 선택된 신장손상 바이오마커를 감소시키고, p-IκB(NF-κB pathway의 단백질)와 β-TrCP(Wnt pathway 단백질) 간의 상호작용에 의한 염증의 증폭을 억제함으로써 탁월하게 우수한 염증성 신장질환 예방 또는 치료 효과를 나타낼 뿐 아니라, LGK974는 현재 췌장암, 대장암, 흑색종, 유방암, 두경부암, 자궁경부암, 식도암 및 폐암 환자에서 임상시험을 진행 중이므로, 신약재창출(drug repositioning)을 통해 단시간 내에 부작용이 적고 안전성이 확보된 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 의약품의 개발에 활용될 수 있다.

Description

LGK974를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 LGK974를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
우리 몸의 신장은 여러 기능을 수행하는 기관으로, 대표적 배설기관의 하나이다. 배설 기관으로서 수분 양 조절과 노폐물 배출, 전해질 농도 조절을 수행하며, 내분비 기관으로서 에리스로포이에틴(적혈구 생산 호르몬)과 레닌(혈압 조절 호르몬)을 생산하며 비타민 D3의 대사를 조절하여 부갑상선 기능 및 칼슘 대사를 조절하는 기능을 수행한다. 아울러, 펩티드 호르몬 파괴와 저분자 단백질 재흡수, 포도당/지질 대사 조절 등 대사기관으로서의 기능도 수행한다.
이러한 신장에 발생하는 질환은 신장염, 급성신손상, 신부전, 신장암 등이 있다. 신장염이 지속될 경우, 신기능 상실에 의한 만성 신부전이나 고혈압 등의 질환이 유발되며, 기타 장기의 손상 및 대사 이상 등의 합병증을 유발한다. 이의 치료를 위하여 면역억제제, 항염증 치료제, 혈관/고혈압 작용제를 위주로 처방되고 있다. 이외에 감염에 의해 발생하는 신우 신염의 경우에는 퀴놀론계 항생제가 사용되고 있다. 면역억제제로는 타크롤리무스(tacrolimus), 에쿨리주맙(eculizumab), 마이코페놀레이트 모페르틸(mycophenolate mofertil), 사이클로스포린에이(cyclosporine A) 등이 사용되고 있으며, 항염증제로는 덱사메타손(dexametasone), 프레드니솔론(prednisolone) 등이 사용되고 있다. 또한, 혈관/고혈압 작용제로 칸데사르탄(candesartan)이 사용되며, 항종양 활성이 있는 리툭시맙(rituximab)과 아바타셉트(abatacept)도 사구체 신염의 치료제로서 사용되고 있다. 하지만, 항염증제나 면역억제제는 장기간 사용할 경우 궤양, 부종, 감염증 증가, 고혈압, 간 독성 등의 부작용이 발생하여 사용이 제한되기 때문에 기존 신장염 치료제보다 부작용이 적고 치료 활성이 우수한 신규 신장염 치료제의 개발이 필요한 실정이다.
또한, 급성신손상(acute kidney injury)은 허혈-재관류 연관 신손상, 패혈증 연관 신손상, 신독성 신손상 등을 포함한다. 급성신손상의 병인론에 염증성 사이토카인 및 케모카인이 관여하는 증거들이 있으나 현재까지도 급성신손상 환자에서 이를 효과적으로 감소시키는 약물이 개발되지 못하고 있다. 최근까지도 급성신손상 환자에서는 약물 치료 없이 보존적인 치료를 유지하다가 합병증이 발생하면 신대체요법(투석)을 적용하는 수준에 머물러 있는 실정이다. 따라서, 효과적이고 안전한 염증성 신장질환 치료제의 개발은 급성신손상 치료에 의미 있는 역할을 할 것으로 기대된다.
패혈증(sepsis)는 감염에 대한 염증반응이 조절되지 않아서 생명을 위협하는 장기부전을 유발하는 현상이다. 혈액과 장기에서 발생하는 사이토카인의 급격한 증가를 의미하는 사이토카인 폭풍(cytokine storm)은 패혈증의 주요한 특성이다. 신장 손상은 패혈증에 의한 장기 부전의 대표적인 사례로서 사망 또는 평생 투석을 해야 하는 상황에 이르게 한다. 현재 항생제와 혈압조절제를 사용하고 있을 뿐, 패혈증 연관 신장손상을 예방 및 치료할 수 있는 방법은 없다.
한편, 신약재창출(drug repositioning)은 기존의 약물 및 의약품들을 재검토하여 새로운 적응증(질병)에 적용하고자 하는 시도를 일컫는데, 약물개발에 소요되는 시간과 비용을 줄일 수 있고 약물 독성 및 임상 연구의 실패도가 낮아 신약개발 전략으로 사용되고 있다.
본 발명의 목적은 신약재창출 (drug repositioning)을 통해 안전성과 치료 활성이 우수한 염증성 신장질환 치료제를 제공하는 데에 있다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022018564-appb-img-000001
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, LGK974는 신장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4 및 CCL-5 등의 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 감소시키며, 혈청 크레아티닌, 혈청 시스타틴 C 또는 혈청 혈중요소질소(Blood Urea Nitrogen : BUN)와 같은 신장손상 바이오마커를 감소시킴으로써 탁월하게 우수한 염증성 신장질환 치료 또는 개선 효과를 나타내며, p-IκB(NF-κB pathway의 단백질)와 β-TrCP(Wnt pathway 단백질) 간의 상호작용에 의한 염증의 증폭을 억제함으로써, 염증성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다. 특히, LGK974는 현재 췌장암, 대장암, 흑색종, 유방암, 두경부암, 자궁경부암, 식도암 및 폐암 환자에서 임상시험을 진행 중이므로 신약재창출(drug repositioning)을 통해 단시간 내에 기존 신장염 치료제보다 부작용이 적고, 안전성이 확보된 염증성 신장질환의 치료제를 개발할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 LPS-처리 마우스에서 LGK974의 2시간 전처리, 동시처리 또는 1시간 후처리에 따른 생존률 증가 효과를 분석한 것이며 (LGK974: 0, 20, 40 또는 60 mg/Kg 처리, LPS: 0 또는 25 mg/Kg 처리),
도 2은 LPS-처리 마우스의 신장에서 염증성 사이토카인 및 케모카인 mRNA에 대한 LGK974 처리 효과를 RT-qPCR에 의해 분석한 것이며 (LGK974: 0, 20, 40 또는 60 mg/Kg 처리, LPS: 0 또는 25 mg/Kg 처리),
도 3는 LPS-처리 마우스의 신장 손상에 대한 혈청 바이오마커에 대한 LGK974 처리 효과를 혈청 생화학 분석기에 의해 분석한 것이며 (LGK974: 0, 20, 40 또는 60 mg/Kg 처리, LPS: 0 또는 25 mg/Kg 처리).
도 4은 LPS-처리 마우스의 신장 조직학에 대한 LGK974 처리 효과를 분석한 것이며 (LGK974: 0 또는 60 mg/Kg 처리, LPS: 0 또는 25 mg/Kg 처리),
도 5은 LPS-처리 마우스의 신장 조직에서 p-IκB(phospho-IκB; NF-κB pathway 단백질)와 β-TrCP(β-transducin repeat-keeping protein; Wnt pathway 단백질)의 상호작용을 면역침강 (Immunoprecipitation) 및 웨스턴블롯팅 (western blotting)으로 분석한 것이며 (LGK974: 0 또는 60 mg/Kg 처리, LPS: 0 또는 25 mg/Kg 처리),
도 6는 그람음성균의 일종인 대장균 (Escherichia coli)을 1011 cfu (colony forming unit) 복강주사 및 109 cfu 꼬리 정맥주사한 마우스의 생존률에 대한 LGK974의 효과를 분석한 것이며 (LGK974: 0, 20 또는 60 mg/kg 처리),
도 7은 대장균 (Escherichia coli) 109 cfu를 꼬리 정맥 주사한 마우스에서 혈청 사이토카인 수준에 대한 LGK974의 효과를 분석한 것이며 (LGK974: 0 또는 60 mg/Kg 처리),
도 8은 대장균 (Escherichia coli) 109 cfu를 꼬리 정맥 주사한 마우스에서 신장의 염증성 사이토카인 및 케모카인 mRNA에 대한 LGK974 처리 효과를 RT-qPCR에 의해 분석한 것이다 (LGK974: 0 또는 60 mg/Kg 처리).
이하에서는 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 발명자는 신약재창출 (drug repositioning)을 통해 기존 신장염 치료제보다 부작용 등을 줄이고, 안전성이 확보되고 신장염 치료 활성이 우수한 신장염 치료제 후보물질에 대해 연구 개발하던 중, 현재 췌장암, 대장암, 흑색종, 유방암, 두경부암, 자궁경부암, 식도암 및 폐암 환자에서 임상시험 중인 LGK974가 LPS (lipopolysaccaride)를 복강주사하여 염증을 일으킨 마우스의 생존률을 증가시키고, 신장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5 등의 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 감소시키며, 혈청 크레아티닌, 혈청 시스타틴 C 또는 혈청 혈중요소질소 (Blood Urea Nitrogen : BUN)와 같은 신장손상 바이오마커를 감소시키고 신장의 조직학적 염증 소견을 억제함으로써 탁월하게 우수한 염증성 신장질환 치료 또는 개선 효과를 나타내는 것을 규명하였다.
LGK974는 Wnt pathway 억제제로 보고되어 있지만, 단순히 Wnt pathway를 억제하여 신장 염증을 억제하는 것은 아니다. 본 발명에서는 LGK974가 p-IκB (NF-κB pathway의 단백질)와 β-TrCP (Wnt pathway 단백질) 간의 상호작용을 억제함을 밝혔다. P-IκB는 염증반응을 일으키는 NF-κB pathway의 핵심 단백질이며, β-TrCP는 Wnt pathway 활성화에 의해 유도되는 단백질인데, P-IκB와 β-TrCP의 상호작용은 친염증성 NF-κB pathway을 활성화 시킬 수 있다. NF-κB은 Wnt의 발현을 증가시키므로 Wnt pathway를 활성화시키고, Wnt pathway에 의해 유도되는 β-TrCP는 p-IκB와의 상호작용에 의해 NF-κB pathway를 활성화 시키므로, 두 경로 (pathway) 간의 상승작용에 의해 염증이 증폭을 일으키는 것을 알 수 있다.
상기 LGK974는 p-IκB와 β-TrCP의 상호작용을 억제하여 NF-κB pathway와 Wnt pathway의 상호작용을 감소시킴으로써 염증의 증폭을 억제할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 상기 LGK974가 신장에서 염증의 증폭에 따른 사이토카인 및 케모카인의 급격한 증가 억제하고, 결과적으로 신장 손상을 치료하고 개선하는 것을 규명하였다.
아울러, LGK974는 살아있는 대장균(Escherichia coli)를 정맥주사하여 패혈증을 유발한 마우스에서 사망률과 혈청내 사이토카인의 급격한 증가(cytokine storm)를 억제하고, 신장의 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5 등의 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 감소시킴으로서 패혈증 연관 신장손상의 억제효력이 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(LGK974) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2022018564-appb-img-000002
상기 화학식 1로 표시되는 화합물인 LGK974는 (2-(2',3-디메틸-[2,4'-비피리딘]-5-일)-N-(5-(피라진-2-일)피리딘-2-일)아세트아미드)로 명명되며, 난소암, 폐암, 편팡세포암종, 교모세포종 또는 대장암 등의 다양한 암에 대한 후보 약물로서 개발되어 왔고, 현재 다양한 암 환자에서 임상시험을 진행하고 있다.
LGK974는 Wnt pathway 억제제로 보고되어 있지만, 단순히 Wnt pathway를 억제하여 신장 염증을 억제하는 것은 아니다. 본 발명에서는 LGK974가 신장조직에서 p-IκB (NF-κB pathway의 단백질)와 β-TrCP (Wnt pathway 단백질)간의 상호작용을 억제함을 최초로 규명하였다. p-IκB와 β-TrCP의 상호작용 억제는 NF-κB pathway와 Wnt pathway의 상호작용에 의한 염증의 증폭에 따른 급격한 염증성 사이토카인과 케모카인의 증가를 억제할 수 있다.
LGK974는 다낭성신장질환 (polycytic kidney disease)의 마우스 모델에서 신장기능 개선효과가 알려져 있지만, 다낭성 신장질환은 유전자 돌연변이에 의한 상염색체 우성 유전질환으로서, 다낭성 신장질환을 지닌 사람은 부모 중 한 사람에게서 우성 돌연변이 유전자 1개를 물려받아서 신장 내에서 폭넓게 낭종이 형성되는 특징을 보인다. 다낭성 신장질환은 유전자 돌연변이와 무관하게 발생하는 염증성 신장질환과 발병원인에 뚜렷한 차이가 있다. LGK974의 염증성 신장질환에 대한 연구결과는 전혀 보고된 바 없었다.
상기 ‘약제학적으로 허용가능한 염’은 약제학적으로 허용가능한 염기성 염 또는 산성 염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있다. 염기성 염으로는 유기염기염, 무기염기염 중 어느 하나의 형태로 사용할 수 있으며, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 리튬염, 마그네슘염, 세슘염 및 아미늄(aminium)염, 암모늄염, 트리에칠아미늄염 및 피리디늄염 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 산성 염은 유리산 (free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용할 수 있다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산 및 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산, 캠퍼설폰산, 옥살산, 말론산, 글루타릭산, 아세트산, 글리콘산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산 및 아스파르탄산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 무기산으로는 염산, 유기산으로는 메탄설폰산을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 LGK974를 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기염기를 가하거나 무기염기의 염기 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 또는 이 혼합물에서 용매나 과량의 염기를 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
상기 염증성 신장질환은 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 당뇨병성 신증, 세관위축, 사구체 경화, 신부전증, 패혈증 연관 신손상 및 신독성 신손상으로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 LGK974는 신장에서 p-IκB (NF-κB pathway의 단백질)와 β-TrCP (Wnt pathway 단백질)간의 상호작용에 의한 염증의 증폭으로 발생하는 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4 및 CCL-5 등의 염증성 사이토카인 또는 케모카인의 급격한 증가를 억제시킬 뿐 아니라, 혈청 크레아티닌, 혈청 시스타틴 C 또는 혈청 혈중요소질소 (Blood Urea Nitrogen : BUN)에서 선택된 신장손상 바이오마커를 감소시켜 염증성 신장질환을 치료하거나 개선할 수 있다.
상기 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 겔제, 유제, 주사제, 산제, 과립제, 에어로솔제, 페이스트제, 경피흡수제 및 패치제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 제형으로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
상기 LGK974의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 건강식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품은 유효성분인 화합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품에 포함된 화합물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
상기 염증성 신장질환은 앞서 설명한 바와 동일하여 반복적인 기재를 생략한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예> LGK974의 염증성 신장질환 치료 활성 검토
1. 물질 및 시약 준비
LPS (Lipoplysaccharide)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 대장균 (Escherichia coli)는 ATCC (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. LGK974는 MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, USA)에서 입수하였다.
2. 샘플 준비 및 신장염증 동물실험
동물실험 프로토콜은 중앙대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 수컷 C57BL/6 마우스(4주령)는 Central Lab Animal Inc. (Seoul, Republic of Korea)에서 구입하였다. LGK974와 LPS는 주입 직전에 pH를 조정하면서 격렬한 볼텍싱에 의해 식염수에 용해되었다.
25 mg/Kg의 LPS와 20, 40 또는 60 mg/Kg의 LGK974를 마우스에 복강주사한 다음 3시간 단위로 마우스의 생존률을 분석하였다.
식염수를 복강주사한 마우스은 대조군으로 사용되었다. LPS 복강주사하고 6시간 후에 마우스를 50 mg/kg 알팍살론 (Jurox, Rutherford, Australia) 복강 주사를 통해 마취시켜 심장에서 혈액 샘플을 수집하고 4 ℃에서 16시간 동안 보관한 다음 2,000 xg에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 그리고 RT-qPCR 및 조직학적 검사를 위해 신장 조직을 수집하였다.
3. 신장조직의 정량적 역전사(RT-q) PCR 분석
RNeasy 키트 (Qiagen; cat# 74106)를 사용하여 각 마우스로부터 수집된 신장으로부터 RNA를 추출하였고, cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems Inc.; cat# 43-688-13)를 사용하여 1 ㎍의 RNA를 역전사 시켰다. RT-qPCR 반응은 TaqMan Gene Expression Master Mix (cat# 43-690-16)와 해당 유전자의 primer/probe 세트 [tumor necrosis factor(TNF)-α (cat# Mm00443258_m1), interferon(IFN)-γ (cat# Mm01168134_m1), interleukin(IL)-1α (cat# Mm00439620_m1), IL-1β (cat# Mm00434228_m1), IL-6 (cat#Mm00446190_m1), IL-12 (cat# Mm00434228_m1), C-C motif chemokine ligand(CCL)2 (cat# Mm00441242_m1), CCL3 (cat# Mm00441259_m1), CCL4 (cat# 00443111_m1), CCL5 (cat# Mm01302428_m1) 및 18S ribosomal RNA (cat# Hs99999901_s1)]를 사용하여 수행하였다. 목표 유전자의 mRNA 수준을 18S ribosomal RNA 수준으로 표준화 한 후 대조군의 값과 비교한 상대값으로 나타내었다.
4. 신장 손상에 대한 혈청 바이오마커 분석
임상적으로 신장 손상의 바이오마커로 사용되는 크레아티닌, 시스타틴 C 및 혈중요소질소 (BUN)의 혈청 수준을 혈청 생화학 분석기 (Cobas c502, Roche, Germany)를 사용하여 측정하였다.
5. 신장 손상에 대한 조직학적 분석
각 마우스로부터 수집된 신장 조직을 4% 포르말린으로 고정하였고, 고정된 조직은 탈수, 파라핀 포매, 해부 등의 일반적인 조직 처리를 거쳐 조직병리학적 검사를 위한 검체를 제작한 후 헤마톡신-에오신 (Hematoxylin-Eosin) 염색을 통해 조직학적 분석을 수행하였다.
6. P-IkB와 β-TrCP의 상호작용억제 효과
P-IκB는 염증반응을 일으키는 NF-κB pathway의 핵심 단백질이고, β-TrCP는 Wnt pathway 활성화에 의해 유도되는 단백질이다. 신장에서 p-IκB와 β-TrCP의 상호작용을 면역침강(Immunoprecipitation) 방법으로 분석하였다. 신장조직을 β-TrCP에 대한 항체로 면역침강시킨후 p-IκB에 대한 항체로 웨스톤블롯팅을 실시하여 β-TrCP와 함께 침강된 p-IκB의 양을 측정하였다.
7. 패혈증 유도 마우스의 생존률 분석
수컷 C57BL/6 마우스(4주령)를 1주간 적응시킨 후, 1011 cfu (colony forming unit)의 Escherichia coli를 복강주사하거나, 109 cfu의 대장균(Escherichia coli)를 꼬리 정맥에 주사하였다. 20 또는 60 mg/Kg의 LGK974를 복강주사하고 3시간 단위로 생존률을 측정하였다.
8. 패혈증 유도 마우스 혈액 중의 사이토카인 폭풍 분석
패혈증 유도 마우스의 혈액에서 사이토카인 폭풍을 분석하기 위하여 109 cfu의 대장균을 꼬리 정맥에 주사한 4시간 후에 마우스의 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 주요 염증성 사이토카인 Tumor necrosis factor(TNF)-α, interleukin(IL)-6, IL-1β의 혈청 농도를 ELISA (Enzyme linked immuno-sorvant assay) 방법으로 분석하였다.
9. 실험결과
도 1에 따르면, LGK974는 LPS를 복강주사에 의해 염증을 유도한 마우스의 생존률을 용량의존적으로 증가시켰으며, LPS 복강주사 전처리, 동시처리, 후처리의 모든 경우에 뚜렷한 생존률 증가효과를 나타냈다.
도 2에 따르면, LPS의 복강 주사에 의한 염증 유도에 의해 신장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4, CCL-5 등의 다양한 염증성 사이토카인과 케모카인이 급격하게 증가하였으나, LGK974의 처리에 의해 용량의존적으로 의미있게 억제되었다.
도 3에 따르면, LPS의 복강 주사에 의해 신장 손상에 대한 혈청 바이오마커인 혈청 크레아티닌, 혈청 시스타틴 C 또는 혈청 혈중요소질소(Blood Urea Nitrogen : BUN)가 유의적으로 증가하였으나, LGK974의 처리에 의해 용량의존적으로 의미있게 억제되었다.
도 4에 따르면, LPS의 복강 주사에 의해 신장 조직학에서 염증소견이 뚜렷하게 나타났으나 LGK974의 처리에 의해 억제되었다.
도 5에 따르면, LPS에 의한 염증 유도에 의해 신장 조직에서 p-IκB(NF-κB pathway 단백질)와 β-TrCP(Wnt pathway 단백질)의 상호작용이 증가하였으나 LGK974의 처리에 의해 억제되었다.
도 6에 따르면, 대장균의 복강 주사 또는 꼬리 정맥 주사로 패혈증을 유발하였을 때 마우스의 생존률의 급격하게 감소하였으나 LGK974의 복강주사에 의해 억제되었다.
도 7에 따르면, 대장균의 꼬리 정맥 주사로 마우스에 패혈증을 유발하였을 때, 혈액중에 염증성 사이토카인의 급격히 증가(cytokine storm)가 발생하였으나 LGK974의 복강주사에 의해 억제되었다.
도 8에 따르면, 대장균의 꼬리 정맥 주사로 마우스에 패혈증을 유발하였을 때, 신장내에 사이토카인 및 케모카인이 급격히 증가하였으나 LGK974의 복강주사에 의해 억제되었다.
따라서, 상기 실험결과를 종합해 보면, LGK974는 LPS 복강주사 및 대장균 정맥주사에 의한 신장 염증, 신장 손상 및 패혈증을 효과적으로 치료하거나 개선할 수 있음을 확인하였기 때문에 LGK974는 염증성 신장 질환의 치료 또는 개선에 매우 효과적인 약물로서 약제 또는 건강기능식품으로 활용할 수 있다.
하기에 본 발명에 따른 LGK974를 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
<처방예 1> 약학조성물의 처방예
<처방예 1-1> 산제의 제조
LGK974 20 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<처방예 1-2> 정제의 제조
LGK974 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<처방예 1-3> 캅셀제의 제조
LGK974 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<처방예 1-4> 주사제의 제조
LGK974 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
<처방예 2> 건강보조식품
<처방예 2-1> 건강식품의 제조
LGK974 1 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B1 0.13 ㎎, 비타민 B2 0.15 ㎎, 비타민 B6 0.5 ㎎, 비타민 B12 0.2 ㎍, 비타민 C10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산 제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.
<처방예 2-2> 건강음료의 제조
LGK974 1 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022018564-appb-img-000003
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 염증성 신장질환은 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 당뇨병성 신증, 세관위축, 사구체 경화, 신부전증, 패혈증 연관 신손상 및 신독성 신손상으로부터 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 신장에서 TNF-α, IFN-γ, IL-1α, IL-1β, IL-6, IL-12, CCL-2, CCL-3, CCL-4 및 CCL-5로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 염증성 사이토카인 또는 케모카인을 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 혈청 크레아티닌, 혈청 시스타틴 C 또는 혈청 혈중요소질소(Blood Urea Nitrogen : BUN)에서 선택된 신장손상 바이오마커를 감소시키는 것을 특징으로 하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 화합물은 p-IκB (phospho-IκB) 및 β-TrCP (β-transducin repeat-keeping protein) 간의 상호작용을 억제하는 것을 특징으로 하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022018564-appb-img-000004
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 염증성 신장질환은 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 당뇨병성 신증, 세관위축, 사구체 경화, 신부전증, 패혈증 연관 신손상 및 신독성 신손상으로부터 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 염증성 신장질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2022018564-appb-img-000005
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 염증성 신장질환은 사구체 신염, 신우 신염, 간질성 신염, 루프스 신장염, 당뇨병성 신증, 세관위축, 사구체 경화, 신부전증, 패혈증 연관 신손상 및 신독성 신손상으로부터 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 염증성 신장질환 예방 또는 치료방법.
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