KR20130001510A - 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로 좀 더 자세하게는 유자 과피를 동결건조하여 유기용매로 열수 추출하는 단계를 포함하는 항 당뇨 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 항 당뇨 조성물은 혈당, 당화혈 색소 및 혈중 지질의 수치감소, 인슐린 감수성 개선을 통해 항 당뇨 효과를 제공할 수 있다.

Description

유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 조성물 및 이의 제조방법{ANTI DIABETIC COMPOSITION COMPRISING CITRON PEEL EXTRACTS AND METHOD OF MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

유자는 한국, 중국, 일본을 비롯해 동북아시아에서 생산되는 감귤류의 일종이다. 한국산이 가장 향이 진하고 껍질이 두껍다. 국내 주요 산지로는 전라남도 고흥·완도·장흥·진도, 제주도 등이다.

유자의 주요 성분으로 비타민C가 레몬보다 3배 많이 들어 있어 감기와 피부미용에 좋고, 노화와 피로를 방지하는 유기산이 많이 들어 있다. 그밖에 비타민B와 당질, 단백질 등이 다른 감귤류 과일보다 많고 모세혈관을 보호하는 플라보노이드류 등이 들어 있어 뇌혈관 장애와 풍을 막아준다. 또한, 배농 및 배설작용을 해서 몸 안에 쌓여 있는 노폐물을 밖으로 내보낸다.

한편, 유자나무의 '종류'에 포함되는 아연이 당뇨병 등의 개선에 효과가 있다는 것이 알려져 있는데 이에 본 발명자들은 유자 추출물로부터 좀 더 효과적인 항 당뇨 조성물을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

일 구체예에서, 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 약학 조성물을 제공하는데, 상기 유자 과피 추출물은 유기 용매로 열수 추출하는 것이고, 유기 용매는 페녹시에탄올, 프로피파라벤, 옥시페놀, 벤조페논 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며, 특히 유기 용매는 에탄올인 것이 바람직하며, 상기 추출은 열수 추출이다.

일 구체예에서, 상기 항 당뇨 약학 조성물은 유기용매의 농도가 400ug/ml 내지 1200ug/ml이고, 특히 유기용매의 농도가 500ug/ml 내지 1000ug/ml인 것이 바람직하며, 상기 항 당뇨 약학 조성물은 산제, 과립제, 전제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형이며, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 형태이다.

일 구체예에서, 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 식품 조성물을 제공하는데, 상기 유자 과피 추출물은 유기 용매로 열수 추출하는 것이고, 유기 용매는 페녹시에탄올, 프로피파라벤, 옥시페놀, 벤조페논 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며, 특히 유기 용매는 에탄올인 것이 바람직하며, 상기 추출은 열수 추출이다.

일 구체예에서, 상기 항 당뇨 식품 조성물은 유기용매의 농도가 400ug/ml 내지 1200ug/ml이고, 특히 유기용매의 농도가 500ug/ml 내지 1000ug/ml인 것이 바람직하다.

본 발명에 의한 유자 과피 추출물을 유효성분으로 하는 항 당뇨 조성물은 혈당, 당화혈 색소 및 혈중 지질의 수치감소, 인슐린 감수성 개선을 통해 항 당뇨 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 유자 추출물의 혈당 흡수능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 유자 추출물의 PPAR-gamma의 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 유자 추출물의 AMPK 활성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1. 유자 과피 추출물의 제조

실시예 1-1. 유자 과피의 주정추출물( EtoH ) 제조

유자의 과피만을 분리하여 동결건조기(Il Shin, Korea, Seoul)를 이용하여 건조한 후 분쇄기를 이용하여 분말화하였다. 유자 과피 분말　100g에 70% 주정 900 mL를 가하고 25℃에서 24시간 추출한 후 30분 동안 8,000×g에서 원심분리기 (Beckman, USA, CA)를 이용하여 고형분을 제거하였다. 원심분리된 상등액만을 모아 감압농축한 후 동결건조를 하였다. 건조하여 얻어진 유자 과피 주정추출물의 수율은 29.4%이었다.

실시예 1-2. 유자 과피의 물추출물 ( Water ) 제조

유자의 과피만을 분리하여 동결건조기(Il Shin, Korea, Seoul)를 이용하여 건조한 후 분쇄기를 이용하여 분말화한다. 유자 과피 분말　100g에 물 900 mL를 가하고 25℃에서 24시간 추출한 후 30분 동안 8,000×g에서 원심분리 (Beckman, USA, CA)하여 고형분은 제거하였다. 원심 분리된 용액을 모아 동결건조하였다.

실시예 2. 유자 과피 추출물의 근육세포에서 당 흡수능 평가

유자 과피 추출물의 항 당뇨 효능을 검증하기 위하여 먼저 근육세포의 분화를 유도하였다. C2C12 세포를 완전히 자라게 한 후 1% 말혈청 배지(horse serum media)로 바꾸어 주어 48시간 후 근육세포로의 분화로 유도하였다. 분화가 끝난 후 세포수준에서의 당 흡수능을 평가하기 위하여 2-NBDG 흡수 분석을 실시하였다. 분화가 끝난 세포를 각각 로우 글루코즈 DMEM (Low glucose DMEM) 으로 배지를 교환하여 글루코브 회피를 48시간 동안 시켰다. 그 후 각각의 샘플을 처리 후 24시간 동안 배양한 후　50uM NBDG를 넣고 1시간 동안 배양하였다. 그 후에 형광계(Fluorometer)를 이용하여 EX/EM=485/535값에서 측정하였다.　

도 1에서 보는 바와 같이 유자를 각각 물 또는 에탄올로 추출하여 혈당 흡수능을 2-NBDG 분석을 실시하여 측정한 결과 유자의 주정추출물의 과육보다는 껍질부분에서 혈당 흡수능을 유의하게 증가시키는 것으로 관찰되었다. 100uM/ml 및 250uM/ml의 농도에서는 유자의 과육과 과피에서 2-NBDG 흡수 효과가 유사하였으나, 500uM/ml 및 1000uM/ml의 농도에서 유자의 과육보다는 과피에서 2-NBDG 흡수 효과가 유의적으로 증가하였다. 양성 대조군은 로지 글리타존을 사용하였다.

실시예 3. PPAR - gamma 의 전사활성에 대한 유자 과피 주정추출물의 효과

항 당뇨제인 글리타존 계열 약물의 특이한 타겟이 되는 PPAR-γ(gamma)의 전사활성에 대한 유자 과피 주정 추출물의 효능을 알아보기 위해 PPAR-γ 전사활성측정 실험을 실시하였다. HEK293 (ATCC) 세포를 1㎍의 총 DNA (300 ng PPAR-γ를 위한 발현벡터, 300 ng RXRα, PPAR-response element(증식반응요소) (PPRE)를 함유한 루시퍼라제 리포터 벡터 300 ng, 및 β-갈락토시다제 100 ng)를 각각 슈퍼펙트 트렌스펙션 시약(Superfect Transfection Reagent) (Qiagen, 발렌시아, CA, 미국)를 이용하여 일시적으로 전사하였다.　

18시간 지난 후, 세포에 로지글리타존 (a PPAR-γ 아고니스트) 단독 또는 PGA와 함께 24시간 동안 처리하였다.　 이때 로지 글리타존은 양성 대조군으로 사용하였다. 루시퍼라제 에세이 시스템 (프로메가, 메디슨, WI, 미국)을 가지고 그 후 세포를 라이시스한 후 루시퍼라제 리포터 유전자 분석을 루미네슨스 마이크로플레이트 리더 (LMaxⅡ384; Molecular Devices, 콩코드, 온타리오, 캐나다)를 이용하여 측정하였다.　 β-갈락토시다제 활성을 이용하여 정규화하였다.

도 2에서 보는 바와 같이 유자의 과피는 농도 의존적으로 유의하게 PPAR-γ의 전사활성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 즉, 100uM/ml 및 250uM/ml의 농도에서는 PPAR-γ의 전사활성이 유사하게 유지되었으나, 500uM/ml 및 1000uM/ml의 농도에서는 100uM/ml 및 250uM/ml에 비하여 농도의 증가에 따라 PPAR-γ의 전사활성이 유의적으로 증가하였다. 이때 로지 글리타존은 양성 대조군으로 사용하였다.

실시예 4. AMP - 활성화된 카이네이즈 활성에 대한 유자 과피 주정추출물의 효과

AMP-활성화된 카이네이즈(AMPK)는 항 당뇨의 타겟 바이오 마커로서 에너지 대사의 중심단백질로 잘 알려져 있다. 최근 임상에서 당뇨병 치료제로 쓰이는 메트포민(Metformin)이 AMPK를 타겟으로 하여 작용한다는 것이 밝혀지며 더욱 중요성이 강조되고 있다. 이에 유자 과피 추출물이 항 당뇨효능을 나타내는데 있어 AMPK의 활성에 대해 어떠한 영향을 미치는지를 웨스턴 블롯을 실행하여 평가하였다.　

AMPK 항체는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다.　 β-액틴 항체는 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, USA)로부터 구입하였다.　 호스라디시 페록시다제가(Horseradish peroxidase)가 연결된 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다.

배양된 세포에 시료를 처리하여 세포를 포집한 후 파쇄용액(50mM HEPES, pH7.4, 150mM NaCl, 1% deoxy-cholate, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1㎍/㎖ 아프로티닌, 2mM Na₃VO₄, 100μM 페닐라진 산화물(phenylarsine oxide))으로 4℃에서 파쇄하고, 이와 마찬가지로 BCA 용액에 의하여 동량으로 정량하여 2배의 샘플 버퍼(5mM EDTA, 4% SDS, 20% 글리세롤, 200mM 트리스(Tris), pH6.8, 0.06% 브로모페놀 블루(bromophenol blue))를 섞어 100℃에서 3분 끓여 단백질 변성을 유도하고, 10% SDS-PAGE를 시행한다.

전기영동이 끝난 겔의 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 0.8㎃/㎠의 전기를 걸어주면서 이동시킨 후 블로킹 버퍼(blocking buffer)(5% 탈지유)로 상온에서 1시간 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. 특이적인 항체를 TBS에 1:1,000으로 희석하여 니트로셀룰로오스 멤브레인과 상온에서 2시간 반응시켰다. 이차항체인 안티-래빗(anti-rabbit) IgG로 연결된 HRP(TBS로 1:3,000으로 희석, Amersham Co., England)와 상온에서 1시간 반응 후 ECL kit(Amersham Co., England)를 사용하여 ECL 필름에 현상하였다.

도 3에서 보는 바와 같이 유자 과피의 주정추출물은 농도의존적으로 AMPK의 인산화를 증가시키는 것으로 나타났으며 AMPK의 억제제인 화합물 C를 처리했을 때 인산화가　일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 따른 물질을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.01 내지 500 mg/㎏의 양, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 항 당뇨 효과를 나타내는 상기 유자 과피 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 유자 과피 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 또한, 항 당뇨 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 유자 과피 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 5 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 2 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유자 과피 추출물을 함유하는 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 추가 성분을 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 솔비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제인 타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등; 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 10 g, 바람직하게는 약 5 내지 6 g이다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

1. 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 약학 조성물.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 유자 과피 추출물은 유기 용매로 열수 추출하는 것인 항 당뇨 약학 조성물.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 유기 용매는 페녹시에탄올, 프로피파라벤, 옥시페놀, 벤조페논 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 항 당뇨 약학 조성물.
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 유기 용매는 에탄올인 항 당뇨 약학 조성물.
5. 제 2 항에 있어서,
   상기 추출은 열수 추출인 항 당뇨 약학 조성물.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 항 당뇨 약학 조성물은 유기용매의 농도가 400ug/ml 내지 1200ug/ml인 항 당뇨 약학 조성물.
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 항 당뇨 약학 조성물은 유기용매의 농도가 500ug/ml 내지 1000ug/ml인 항 당뇨 약학 조성물.
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 항 당뇨 약학 조성물은 산제, 과립제, 전제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형인 항 당뇨 약학 조성물.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 항 당뇨 약학 조성물은 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 형태인 항 당뇨 약학 조성물.
10. 유자 과피 추출물을 유효성분으로 포함하는 항 당뇨 식품 조성물.
11. 제 10 항에 있어서,
    상기 유자 과피 추출물은 유기 용매로 열수 추출하는 것인 항 당뇨 식품 조성물.
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 페녹시에탄올, 프로피파라벤, 옥시페놀, 벤조페논 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 항 당뇨 식품 조성물.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 에탄올인 항 당뇨 식품 조성물.
14. 제 11 항에 있어서,
    상기 추출은 열수 추출인 항 당뇨 식품 조성물.
15. 제 10 항에 있어서,
    상기 항 당뇨 식품 조성물은 유기용매의 농도가 400ug/ml 내지 1200ug/ml인 항 당뇨 식품 조성물.
16. 제 15 항에 있어서,
    상기 항 당뇨 식품 조성물은 유기용매의 농도가 500ug/ml 내지 1000ug/ml인 항 당뇨 식품 조성물.

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