CN103385884A - 天麻素在制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天麻素在制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。阿尔茨海默氏症（Alzheimer’s Disease,AD）是一种神经退化性疾病，病理特征有细胞内形成神经纤维缠结、反应性小胶质细胞和神经胶质细胞增生等，其中淀粉样蛋白Aβ在细胞外的沉积是促使AD发病的主要原因。本发明发现食用含天麻素（Gastrodin）的AD小鼠的空间记忆学习能力明显提高，大脑和血清中的Aβ水平显著下降，大脑组织中淀粉样斑块和小胶质细胞也明显减少，这说明天麻素能预防Aβ沉积和减弱ＡＤ小鼠大脑炎症的活性成分。

Description

天麻素在制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体地，涉及天麻素在制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。

背景技术

痴呆症是由多种影响记忆力、思考、行为和日常行为能力的不良病症导致的症状。《2009世界阿尔茨海默氏症报告》中说，到2050年,全球将有1.15亿人将受到这种疾病的困扰。（World Alzheimer Report2009Martin Prince，JimJackson et al.2009）。AD的病理标志是淀粉样神经炎斑块蛋白沉积（Hardy J,Selkoe DJ.The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease:progress andproblems on the road to therapeutics.Science.2002;297:353–356），形成神经纤维缠结，同时反应性小胶质细胞和星型胶质细胞增生，长期激活的小胶质细胞释放趋化因子和受损的细胞因子的级联反应，如IL-1、IL-6和TNF-α.这些炎症因子反过来又加强了Aβ的释放（Mehlhorn G,Hollborn M,SchliebsR.Induction of cytokines in glial cells surrounding corticalbeta-amyloid plaques in transgenic Tg2576mice with Alzheimer pathology,Int J Dev Neurosci.200018(4-5):423-31）。炎症可导致神经元死亡（L.E.Rojo,J.A.Fernandez et al.,Neuroinflammation:Implications for thepathogenesis and molecular diagnosis of Alzheimer's disease.ARCHIVES OFMEDICAL RESEARCH39(1):1-16,2008），或引发神经退行性疾病，如阿尔茨默症（AD）,帕金森症（PD）,多发性硬化症（MS）及脑缺血。根据淀粉样蛋白的假说，Aβ在大脑中的沉积是促使AD发病的主要原因。（Hardy J,Selkoe DJ.Theamyloid hypothesis of Alzheimer’s disease:progress and problems on theroad to therapeutics.Science.2002;297:353–356）。神经炎可能对AD的发展和长期性有显著作用。（Heneka MT,O'Banion MK.Inflammatory processesin Alzheimer's disease.J Neuroimmunol.2007Mar;184(1-2):69-91.）。因此，清除大脑中的Aβ沉积和抗炎代表了一种重要的防治和治疗该病的策略。(Wang J,Ho L,Zhao Z,Seror,Humala N,Dickstein DL,Thiyagarajan M,Percival SS,Talcott ST,Pasinetti GM(2006a)Moderate consumption ofCabernet Sauvignon attenuate Abeta neuropathology in a mouse model ofAlzheimer’s disease.FASE BJ20:2313–2320)。

目前临床上用于治疗老年痴呆的药物有以下几类：1、胆碱酯酶抑制剂：常用有石山碱甲，多奈哌齐、加兰他敏；2、改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物：如尼角麦林、吡拉西坦等；3、钙拮抗剂：常用的有尼莫地平、氟桂利嗪、脑益嗪等；4、神经保护剂：如脑活素；5、谷氨酸受体调控剂（NMDA）：如盐酸美金刚胺；6、非甾体抗炎药物：阿斯匹林或消炎镇痛药物.正在研究的非甾体抗炎药布洛芬、双氯芬酸、奈普生及COXII环氧脂酶抑制剂Celecoxib等；7、自由基清除剂和抗氧化剂：具有自由基清除作用的重要的抗氧化剂银杏叶提取物EGB—761及维生素E、退黑素、姜黄素、去铁敏、艾地苯醌、甲磺酸替拉扎特等；8、谷氨酸受体调节剂（NMDA）：如盐酸美金刚。

目前这些药物还存在很大的不足:(1)目前还没有对应治疗或逆转病程的理想一线药物，如乙酰胆碱抑制剂(AChE),只能缓解早期病人的认知障碍，适度改善症状，但无法阻止病情进展。（2）某些药物副作用大，如雌激素疗法可以减低女性患AD的风险，但只适用于停经后的妇女，且能增加患乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌的发病几率。（3）新药研发，化学合成的难度大。如美国药品研究与制造对1998-2011年间的阿尔茨海默症药物研发进行了统计，结果发现，在这13年间，药物开发商已取消或终止101个阿尔茨海默症药物临床开发，仅有3种药物上市，但仅用于阿尔茨海默症症状的治疗。而2012年8月，强生（J&J）与辉瑞（Pfizer）停止了bapineuzumab静脉注射配方（IV）在阿尔茨海默氏症的3期临床研究，原因是该药在一项后期研究中没有达到认知功能性能改变相关的主要终末点。其他基于Aβ假说和Tau蛋白等新机制开发的药物也都还处于临床阶段。

流行病学的研究表明，一些水果、蔬菜、中草药中的天然多酚成份可以降低与衰老相关的疾病如癌症、心血管病和阿尔茨海默病（AD）的发病风险（

M,Santos-Marques MJ,Carvalho F,Andrade JP(2010).Green tea avertsage-dependent decline of hippocampal signaling systems related toantioxidant defenses and survival.Free Radic Biol Med48:831-838）。如近年研究的热点葡萄籽提取物（GSE），它的主要多酚成分也表现出能抑制转基因小鼠Tg2576的Aβ*56的水平，缓解Aβ低聚物引起的记忆功能损伤（Liu,P.,Kemper,L.J.,Wang,J.,Zahs,K.R.,Ashe,K.H.,Pasinetti,G.M.Grape seedpolyphenolic extract specifically decreases aβ*56in the brains ofTg2576mice.J Alzheimers Dis,26(4):657-66.2011）

将含花青素较高的石榴汁按1:80或1:160与水勾兑喂APP/Tg2576小鼠6个半月或将0.18%或0.9%的桑葚汁喂APP/Tg2576小鼠三个月（Shih P-H,ChanY-C,Liao J-W,Wang M-F,Yen G-C(2010)Anti-oxidant and cognitivepromotion effects of anthocyanin-rich mulberry(Morus atropurpurea L.)on senescence-accelerated mice and prevention of Alzheimer's disease.JNutr Biochem21(7):598–605），减少了可溶性Aβ42的堆积及APPsw/Tg2576转基因小鼠大脑海马区Aβ的沉积及减少SAMP8小鼠Aβ堆积的趋势。中年时期饮用咖啡可以降低老年时期患痴呆的风险(Eskelinen MH,Ngandu T,TuomilehtoJ,Soininen H,Kivipelto M(2009)Midlife coffee and tea drinking and therisk of late-life dementia:a population-based CAIDE study.J AlzheimersDis16(1):85–91)。天麻素作为多酚类物质，也引起了研究者的兴趣。

天麻素（化学名4-羟甲基苯-β-D吡喃葡萄糖苷，分子式为C13H18O7）是云南兰科植物天麻（Gastrodia elata.BL）干燥块根提取物中活性成分含量最高的单体。对2000-2012年有关天麻素研究的国内报道进行检索，有约千篇。其中天麻素的药理学研究显示它具有增加中央及外周动脉血管顺应性，降低外周血管阻力，增加心脑血管血流量，产生温和降压作用，而且对心肌细胞、脑组织均有保护作用，同时具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用。在临床上广泛用于治疗高血压、眩晕、头痛、中风、糖尿病周围神经病变等。另外，也有一些天麻素治疗癫痫、血管性痴呆、耳聋耳鸣、功能性消化不良，认知功能损害的少量的报道。与痴呆相关的中文报道共8篇，大多为针对血管性痴呆的疗效，与老年痴呆阿尔茨海默症有关的共有2篇，其中1篇报道昆医的研究人员构建β-淀粉样肽（1-40）（Aβ1-40）联合D-半乳糖（D-gal）致痴呆模型。探讨了天麻素抗氧化的分子机制。他们的结论是天麻素影响了痴呆模型大鼠皮质部分内源性巯醇抗氧化物（酶）如GSH和GR的含量,抑制了H2O2的产生,影响了P-p38的表达,对改善学习记忆能力,对抗大鼠神经系统的退行性变有一定的作用（傅希玥李守民王婷婷李兴国孙俊陆地，天麻素对老年痴呆动物模型的抗氧化作用及其机制，解剖学报2010年41卷04期485-490页）。另一篇用Morris水迷宫实验检测天麻素对海马内Aβ1-40注射AD模型大鼠学习记忆的改善作用，结果证明了天麻素对海马内Aβ1-40注射AD模型大鼠DE1学习记忆有改善作用（柳星汪萌芽，天麻素对海马内Aβ_(1-40)注射阿尔茨海默病模型大鼠学习记忆的改善作用。《中国临床药理学与治疗学》2012年04期）。在pubmed上进行检索，与AD研究有关的文献也大多集中在体外实验。例如，在Abeta25-35诱导的AD细胞模型（主要是大脑皮层和海马区）中加入Gastrodin能降低LDH的释放，提高细胞的存活率，Gastrodin显示出对AD的潜在的防治效果（Liu ZH,Hu HT et.al,Protective effects of gastrodin on the cellular model of Alzheimer'sdisease induced by Abeta25-35.2005,Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban.2005Jul;36(4):537-40）。通过via ERK1/2-Nrf2通路，对大鼠海马神经元培养细胞amyloid-beta肽诱导的神经毒性有抵抗作用（Zhao X,Zou Y et.al,Gastrodin protect primary cultured rat hippocampal neurons againstamyloid-beta peptide-induced neurotoxicity via ERK1/2-Nrf2pathway.2012,Brain Res.2012Oct30;1482:13-21）;经MAPK通路，对LPS刺激的小胶质细胞释放的前炎症因子，COX-2和NO的合成有抑制效果，对神经退行性疾病表现出潜在的抗炎效果（Dai JN,Zong Y et.al.Gastrodin inhibits expressionof inducible NO synthase,cyclooxygenase-2and proinflammatory cytokinesin cultured LPS-stimulated microglia via MAPK pathways.PLoS One.2011;6(7):）。总之，现有技术中，天麻素在老年痴呆方面的疗效集中在体外实验的探索阶段，作用机制研究受限。缺乏以淀粉样蛋白的假说为基础，Aβ40和Aβ42及炎症因子为靶点，从细胞分子，到器官及整体动物水平的系统研究，缺乏对老年痴呆的防治作用的全面药理机制的描述。

发明内容：

天麻素在制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。

所述的应用，阿尔茨海默症为大脑中Aβ淀粉蛋白的沉积引起的阿尔茨海默症。

所述的应用，阿尔茨海默症为血清中Aβ淀粉蛋白负荷引起的阿尔茨海默症。

所述的应用，阿尔茨海默症为炎症引起的小胶质细胞增生的阿尔茨海默症。

所述的应用，阿尔茨海默症为由Aβ淀粉缠结引起的出血的阿尔茨海默症。

天麻素在制备预防和治疗大脑中Aβ淀粉蛋白沉积症的药物中的应用。

天麻素在制备减弱ＡＤ大脑炎症的活性成分的药物中的应用。

天麻素在制备预防和治疗血清中Aβ淀粉蛋白负荷症的药物中的应用。

天麻素在制备预防和治疗炎症引起的小胶质细胞增生症的药物中的应用。

天麻素在制备预防和治疗Aβ淀粉缠结引起的出血症及清除淀粉缠结形成的斑块的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首次用AD转基因动物为模型，以淀粉样蛋白的假说为基础，Aβ40和Aβ42及炎症因子TNF-α，IL-1，INF-γ为靶点，从细胞分子，到器官及整体动物水平对天麻素（Gastrodin）进行全面的药理研究，测评它对老年痴呆的防治效果。证实天麻素(Gastrodin)对阿尔茨海默症(AD)转基因小鼠（APP/PS1）Aβ淀粉蛋白沉积的清除及减轻相关的炎症有很好的效果。

本发明首次证实PP/PS1转基因小鼠（AD小鼠）对天麻素有很好的耐受性，即长期食用含天麻素的饲料不会引起AD转基因小鼠肝功能受损和其它生理功能异常，同时发现天麻素能有效改善AD小鼠的学习记忆力，有效清除AD小鼠大脑中Aβ的沉积，减少血清中Aβ负荷的水平，减轻炎症引起的小胶质细胞增生，减少由Aβ淀粉缠结引起的出血。这就意味着天麻素可能是一种潜在的对AD有临床疗效的药物，同时本发明的实验也证实，血清中Aβ的浓度与大脑中总的Aβ的含量具有正相关性，这意味着在使用含天麻素的食物防治AD的过程中，通过监测血清中Aβ的浓度可以反应大脑中Aβ负荷的变化。

本发明首次使用APP/PS1转基因小鼠作为研究天麻素抗老年痴呆疗效的动物模型，并且把小剂量的天麻素按比例混入转基因小鼠的饲料中进行长期喂养，并首次测定天麻素对AD小鼠大脑中Aβ40和Aβ42的清除效果，及对炎症引起的小胶质细胞增生的抑制效果，首次测定AD小鼠血清中Aβ负荷的水平及相关炎症因子的水平。

附图说明：

图1为APPSwe/PS1dE9转基因老鼠Morris水迷宫实验结果；

图2显示APP/PS1转基因小鼠对天麻素Gastrodin有很好的耐受性；

图3显示APPSwe/PS1dE9转基因小鼠食用天麻素（Gastrodin）饲料后大脑和血清中Aβ的水平结果；

图4显示APPSwe/PS1dE9转基因小鼠食用天麻素（Gastrodin）饲料后大脑组织中Aβ斑块负荷的结果；

图5为食用含有天麻素（Gastrodin）饲料后对AD小鼠大脑中小胶质细胞的效果图；

图6为食用含有天麻素（Gastrodin）饲料后，AD小鼠大脑中星形细胞的效果图；

图7为食用含有天麻素（Gastrodin）饲料后，AD小鼠大脑中出血斑点的效果图；

图8为食用含有天麻素（Gastrodin）的饲料后，用ELISA试剂盒（eBioscience）测得的AD小鼠血清中IL-1β,TNF-α和IFN-γ浓度水平的结果；

图9为食用含有天麻素（Gastrodin）的饲料后，用刚果红对小鼠大脑切片中的淀粉缠结斑块染色后的效果图。(ANOVA分析：F=20.138,p<0.001)食用天麻素的AD小鼠vs食用正常饲料的AD小鼠对照组,由淀粉缠结形成的斑块明显减少，且有显著性差异）；

图10为本发明技术路线示意图。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

A.主要研究内容

天麻素的毒性评价：长期观察和记录小鼠用药后的生理状态，定期测定AD小鼠体重和进食量随给药时间的变化，测定长期给药后小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST），以及总胆红素（Tb）的浓度，并与标准正常值作对比，以确认长期服用天麻素是否影响AD小鼠的肝功能。

Morris水迷宫实验：依照本实验室提供的PROTOCOL,测评天麻素对AD转基因小鼠学习记忆力的改善效果。

小鼠大脑的组织病理分析：对给药组的AD小鼠的大脑海马区和大脑皮层中的Aβ做定量分析，并与AD对照组比较，观察Aβ斑块的沉积的影响，对小胶质细胞和星形细胞增生的影响，对淀粉缠结形成的斑块的影响，并用ELISA实验进行验证。

炎症实验：给药组的AD小鼠取右心房血液，并做心脏灌注，对血请中的炎症因子IL-1、IL-6和TNF-α的水平进行测评，并与AD对照组比较，观察AD小鼠血清中炎症因子水平的变化。

B.技术路线（如图10所示）：

使用的天麻素由上海同田生物技术股份有限公司（http://www.tautobiotech.com/en/index.htm）提供。

化学结构式：

分子式：C₁₃H₁₈O₇

化学名称：4-羟甲基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷；

英文名称：4-(hydroxymethyl)phenyl-β-D-Glucopyranoside,经HPLC检测纯度≥98%；

C、材料和方法

转基因动物模型的建立和组织取样

本发明实验使用的野生型（WT）和带有APP-PS1转基因小鼠购于南方模式动物研究所（上海），动物的管理严格遵守2007年颁布的《云南省动物管理条例》，并严格按照供应商提供的PCR方法对小鼠基因进行鉴定。

本发明将3个月大的APP/PS1转基因小鼠分别设为天麻素给药组（N=12,天麻素和饲料相混），姜黄素给药组（N=12,姜黄素和饲料相混），AD对照组（N=12,正常饲料），另设一个WT野生型对照组（正常饲料，N=12），每个大组又分雌雄两个小组，每组各6只动物（N=12），其中给药组三个月后开始喂含有Gastrodin和Curcumin的饲料，另外两个对照组喂普通饲料，持续九个月。其间观察小鼠的体重与食物摄入量是否随着季节的变化发生改变，这些药物饲料是否会引起其它副作用和小鼠死亡，并作记录。9个月后吸入乙醚麻醉处死小鼠，通过灌注取右心房的血及脑组织并称重，对左脑大脑半球做组织病理分析，右脑半球则装入冻存管存放在在-80°C液氮中用于生化分析。

Morris水迷宫实验

小鼠水迷宫适应阶段两天（不记录，可视平台高于水面2cm），训练阶段从第三天开始，平台隐藏在水下1cm,水温保持23°c左右连续进行5d，每只小鼠每天训练3次。训练时，将小鼠面向池壁从3个入水点分别放入水池，记录小鼠从入水到找到水下隐蔽平台和停留在平台上所需时间，作为潜伏期，用秒（s）表示，若入水后60s内小鼠未能找到平台，则将其轻轻从水中拖上平台，并停留30s，然后进行下一次训练。第8天移走平台，每只小鼠从平台起始点对面下水，游泳60秒，动物在目标区域游泳的时间，穿越平台的次数和路径等主要参数将被微型摄像机（Stoelting Co.,America）跟踪记录供分析。

AD的病理图像分析与定量

对大脑所有的Aβ免疫组织化染色，对神经缠结形成的斑块进行刚果红染色，对小胶质细胞和星形小胶质细胞增生和微出血的处理简单地说就是三大系列的六个等距离跨越海马区域的组织切片(～200μm部分)被随机挑选出来，使用免疫组织化技术对所有的Aβ染色,分别激活小胶质细胞和星型胶质细胞。切片与主要抗体在4°C过夜培育，以二氨基氧化酶和葡萄糖为底物，进一步用DAB试剂盒（Cat.No.AB500-500Slide Kit CHEMICON International,Inc.）展开。对所有的Aβ沉淀，小胶质细胞和星形胶质细胞增生进行定量分析，病理图像可以通过数字显微镜的摄像头获得，然后进行图像分析，所有的图像处理和分析都采用单盲分析。小鼠大脑和血清中Aβ40和Aβ42肽水平的定量采用ELISA（Cat.#EZBRAIN40及Cat.#EZBRAIN42，MILLIPORE）试剂盒。

用ELISA试剂盒对AD小鼠血清中的IL-1β，TNF-α及IFN-γ进行定量

小鼠血清中的IL-1β，TNF-α及IFN-γ是用ELISA试剂盒(Cat No.BMS607/2,BMS6002,BMS606,eBioscience,USA)并严格按照厂家提供的操作指南进行。

Gastrodin的毒性评价

AD小鼠血清中总胆红素，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的测定由昆医附一院检验科协助完成

统计分析

本发明的所有数据的分析均使用SPSS17.0软件，一般用mean±SEM表示，除非另有说明。单向ANOVA分析被用于确定所有测试组间显著性的不同，P>0.05被认为无显著性差异。

研究结果如下：

APPSwe/PS1dE9转基因老鼠Morris水迷宫实验结果（如图1所示）。

Morris水迷宫实验，结果显示天麻素（Gastrodin）对APPSwe/PS1dE9转基因小鼠的学习和记忆的能力有一定影响A）隐藏跳台后的七天里各组测得的平均逃避潜伏期结果；B)平均游泳距离；C）平均速度；D）第八天探索平台试验的首次进入平台的平均逃避潜伏期E)探索平台试验AD小鼠在60s内平均穿越平台的次数。

WT（野生型）作为对照组，给予正常饮食。APPSwe/PS1dE9转基因小鼠给予正常的饮食，作为对照组。另一组APPSwe/PS1dE9小鼠从3个月起持续9个月按100mg/kg/d的计量给予天麻素。另外APPSwe/PS1dE9转基因小鼠按47mg/kg/d给予姜黄素（Curcumin），作为阳性对照。小鼠每天用Morris水迷宫进行3次寻找平台实验，持续7天，第8天移除平台后，AD小鼠从平台起始象限对面的点入水进行探索实验。隐藏跳台后的七天里各组小鼠的潜伏期（图1A，），游泳距离（图1B），游泳速度（图1C），没有明显差异（P>0.05）。第8天的探索平台实验图D显示潜伏期有差异(P<0.05vs.Control)，食用天麻素饲料的AD小鼠在第一象限（平台所在象限）的潜伏期比AD小鼠对照组明显减少（P<0.01vsControl），但食用姜黄素饲料的AD小鼠与AD小鼠对照组相比没有明显区别（P>0.05）。同时，食用天麻素饲料的AD小鼠在60s内平均穿越平台的次数明显高于转基因对照组（P>0.05），姜黄素组却没有明显差异（P>0.05），这意味着天麻素对AD小鼠的学习记忆能力有潜在提高的效果。图中所有的数据都进行了ANOVA分析及Student-Newman-Keuls post-hoc检验。

APPSwe/PS1dE9转基因老鼠对天麻素有很好的耐受性

从第三个月（此时大脑中还未形成Aβ沉积）开始给其中的两组转基因老小鼠喂含有天麻素（Gastrodin）和Curcumin的饲料，直至第十二个月。在此期间，动物无死亡发生，无行为异常，长期食用这种饲料的动物的体重(图2A)和日食量也没有受到影响(图2B)。另外长期食用天麻素（Gastrodin）和姜黄素(Curcumin)不会引起小鼠肝功能损伤(图2C)。

图2显示APP/PS1转基因小鼠对天麻素Gastrodin有很好的耐受性。从第三个月开始，APP/PS1转基因小鼠（年龄和性别相匹配）分别喂正常饲料，含有姜黄素（Curcumin）及天麻素（Gastrodin）的饲料，并持续9个月。A）分别在第3,6,9,12个月时对体重进行监测的结果。B)分别在第3,6,9,12个月时对进食量进行监测的结果，并对每天每克体重对食物的吸收量进行了计算。C)肝功能ALT及AST的血清指标。点和条形图代表平均值（±SEM）

小鼠平均每天的进食量为每克体重0.14-0.16g,每日天麻素的消耗量为每克体重100μg，姜黄素为每克体重消耗77–98μg。相当于60Kg成年人的每日剂量0.66g天麻素，姜黄素则为每天0.35g,以上数据是基于FDA动物和人给药剂量体表面积换算关系式计算得出。另外，长期食用这个剂量下的天麻素并未引起肝功能损伤，这可以从血清中总胆红素(Tb)、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）测定的值依然在正常范围内得到证实。由于总胆红素（Tb）的含量较低（<1U/L),图中未显示。

Gastrodin能减少APP/PS1转基因小鼠大脑和血清中Aβ的水平,预防Aβ沉积的形成。

喂养不同的饲料9个月后，用ELISA试剂盒对各组小鼠大脑SDS（Aβ-SDS）及甲酸（Aβ-FA）提取部分中的Aβ进行检测，Aβ-SDS代表可溶性Aβ，Aβ-FA代表不可溶的Aβ，单个动物的总的Aβ水平的计算是用总的SDS可溶性Aβ（可溶性的SDS-Aβ42加上可溶性的SDS-Aβ40）加上总的FA中的可溶性Aβ（可溶性的FA-Aβ42加上可溶性的FA-Aβ40）。

与食用正常饲料的转基因小鼠相比，食用含天麻素(Gastrodin)（P=0.001）饲料及含有姜黄素（Curcumin）（P<0.001）饲料的转基因小鼠大脑中总的Aβ的负荷明显降低（Fig3A）(ANOVA F=186.080，P=0.001)。食用天麻素饲料的AD小鼠大脑中Aβ的负荷降低约40%，食用姜黄素饲料的AD小鼠则降低约52%，SDS-Aβ及FA-Aβ（Aβ40及Aβ42）的组间比较与总的Aβ的比较本质上一致（Fig3B及Fig3C）。

Aβ淀粉蛋白斑块的观察主要在大脑的海马区和新皮层区，与对照组相比，组织定量ANOVA分析也得到了相同的结果（F=26.217，P<0.001）.食用Gastrodin组（P=0.022）与食用Curcumin（P=0.019）的AD小鼠大脑海马区及新皮质区的Aβ明显减少。这与ELISA试剂盒对Aβ水平的检测结果的趋势一致，食用天麻素（Gastrodin）饲料的AD组用免疫组化确定的总的Aβ沉积减少了66%，Curcumin组减少了70%，这些数据表明天麻素（Gastrodin）在减少Aβ负荷和预防Aβ沉积方面有明显效果。

图3显示APPSwe/PS1dE9转基因小鼠食用天麻素（Gastrodin）饲料后大脑和血清中Aβ的水平结果。每只动物大脑和血清中Aβ肽的浓度用ELISA检测，A）各组中总的Aβ，SDS部分的Aβ（Aβ-SDS），甲酸部分的Aβ（Aβ-FA的水平浓度的比较；B）各组中总的Aβ40，Aβ40-SDS，Aβ40-FA的水平浓度的比较；C）各组中总的Aβ42，Aβ40-SDS，Aβ40-FA的水平浓度的比较；D）各组血清中总的Aβ，Aβ40，Aβ42的水平浓度的对比（P<0.05或P<0.01vsAPPSwe/PS1dE9转基因对照组小鼠。

图4显示APPSwe/PS1dE9转基因小鼠食用天麻素（Gastrodin）饲料后大脑组织中Aβ斑块负荷的结果。6个空间等距离系列脑组织切片，用漂片免疫组化法对脑片上的Aβ淀粉蛋白斑块进行反应，(anti-Aβantibody6E10,Serotec)并用DAB试剂盒完成显色反应，对新皮层区和海马区的Aβ淀粉蛋白斑块进行定量，对总的检测区域内的阳性反应斑点与面积比进行分析，计算单位面积的阳性反应的数量的平均值及标准差。对比食用天麻素饲料AD小鼠与转基因对照组小鼠新皮层区及海马区Aβ斑块所占的面积部分（AVOVA分析，P<0.01or P<0.05）有显著性差异。

天麻素（Gastrodin）可以阻碍APPSwe/PS1dE9转基因小鼠的AD型的神经病理通路。

小胶质细胞和星形细胞的观察主要是在大脑的新皮质区和海马区。我们用抗体CD45加小胶质细胞及GFAP加星形细胞的免疫组化实验来检测新皮质区和海马区域。

野生型（WT）小鼠的大脑组织上没有观察到小胶质细胞（Fig），APPSwe/PS1dE9转基因小鼠则有明显的小胶质细胞。统计用的是ANOVA分析（F=37.640，P<0.001）.结果表明，与喂标准食物的转基因小鼠相比，食用含天麻素（Gastrodin）饲料的转基因小鼠的小胶质细胞的水平明显降低（6.5±6.1vs32.6±11.2，F<0.001）,与食用姜黄素的对照组相比则水平一致（6.5±6.1vs4.8±2.2,P=0.513）。

图5为食用含有天麻素（Gastrodin）饲料后对AD小鼠大脑中小胶质细胞的效果图。6个空间等距离系列脑组织切片，用漂片免疫组化法对脑片上的激活小胶质细胞进行反应，(大鼠单克隆anti-CD45,Millipore)并用DAB试剂盒完成显色反应，同时对新皮层区和海马区的激活的小胶质细胞进行定量，对总的检测区域内的阳性反应斑点与面积比进行分析，计算单位面积的阳性反应斑点的数量的平均值及标准差（ANOVA分析，P<0.01）,有显著性差异。

对转基因AD小鼠的病理切片观察发现，食用含有天麻素（Gastrodin）及姜黄素（Curcumin）饲料的AD小鼠星形细胞明显较少(F=24.336,P<0.001)，与食用正常饲料AD小鼠的大脑上的星形细胞相比水平明显降低（9.6±2.2vs35.2±3.8，P<0.001）,与食用含姜黄素（Curcumin）饲料的小鼠相比,无显著性差异（9.6±2.2vs15±2.6,P=0.061）

图6为食用含有天麻素（Gastrodin）后，AD小鼠大脑中星形细胞的效果图。6个空间等距离系列脑组织切片，用免疫组化漂片法对脑片上的星形细胞进行反应，(兔抗-胶质纤维酸蛋白，DAKO)并用DAB试剂盒完成显色反应，对新皮层区和海马区的星形细胞细胞进行定量，对总的检测区域内的阳性反应斑点与面积比进行分析，计算单位面积的阳性反应斑点的数量的平均值及标准差,（ANOVA分析，P<0.05）,有显著性差异。

含铁血黄素阳性反应的蓝色特征颗粒是出血点(Fig7)，主要是观察新皮层区，柔脑膜区，大脑的海马区和丘脑区域。喂正常饲料的每个转基因AD小鼠的单侧大脑的微出血点率为38±13.0，远高于野生型（WT）4.0±11.0（P<0.001）.同样，喂含有天麻素（Gastrodin）（5.4±14.6，P<0.001）和姜黄素（Curcumin）（23.2±16.8）饲料的AD小鼠也没有观察到明显的微出血点(ANOVA,F=9.905,P=0.001)

图7为食用含有天麻素（Gastrodin）后，AD小鼠大脑中出血斑点的效果图。准备6张空间等距离系列脑组织切片，用含HCl2%的亚铁氰化钾对脑片上的血红素斑点进行染色，然后再用1%的核固红复染，对每张脑片子上的蓝色微型斑点计数，计算单位面积的阳性反应斑点的数量的平均值及标准差,（ANOVA分析，P<0.01）,有显著性差异。

食用含天麻素（Gastrodin）的饲料后,AD小鼠血清中炎症因子的水平：

小胶质细胞和巨噬细胞被激活后会释放出一些炎症因子IL-1β,TNF-α和IFN-γ，在AD大脑内部的炎症级联反应的进展过程中，这是一个重要的病理现象。通常情况下，转基因小鼠血清中炎症因子的水平应该趋向于增高，但我们检测发现IL-1β和IFN-γ的水平变化不大，与野生型小鼠相比无显著性差异（ANOVA IL-1β,F=00.191，P=0.383;ANOVA IFN-γ，F=0.430，P=0.388）。但食用天麻素饲料转基因小鼠与食用正常饲料的对照组转基因小鼠AD组相比，血清中的TNF-α水平明显降低，且有显著性差异（15.4±4.5pg/mL vs22.8±6.1pg/mL，P=0.037）,但食用姜黄素（Curcumin）饲料的AD小鼠却没有显著变化（19.4±7.1vs22.8±6.1,P=0.310），这表明天麻素对AD小鼠的炎症有一定抑制效果（ANOVA TNF-α,F=8.506，P=0.002,Fig9）。

图8为食用含有天麻素（Gastrodin）的饲料后，用ELISA试剂盒（eBioscience）测得的AD小鼠血清中IL-1β,TNF-α和IFN-γ浓度水平的结果。（ANOVA分析，P<0.05vs喂正常饲料的WT野生型，P<0.05vs喂对照药物饲料的AD组）

图9为食用含有天麻素（Gastrodin）的饲料后，用刚果红对小鼠大脑切片中的淀粉缠结斑块染色后的效果图。(ANOVA分析：F=20.138,p<0.001)食用天麻素的AD小鼠vs食用正常饲料的AD小鼠对照组,由淀粉缠结形成的斑块明显减少，且有显著性差异）。方法如下：室温下将片子侵入NaCl工作液（50ml饱和NaCl溶液，加入0.5ml的1%的HCl溶液中，）,20分钟，然后浸入刚果红工作液（1.0mg刚果红+500ml饱和NaCl溶液）1小时，在无水乙醇中浸提10次，最后在二甲苯中脱水2分钟，干燥，封片。

通过上述试验，得出结论：本发明首次证实PP/PS1转基因小鼠（AD小鼠）对天麻素有很好的耐受性，即长期食用含天麻素的饲料不会引起AD转基因小鼠肝功能受损和其它生理功能异常，同时发现天麻素能有效改善AD小鼠的学习记忆力，有效清除AD小鼠大脑中Aβ的沉积，减少血清中Aβ负荷的的水平，减轻炎症引起的小胶质细胞增生，减少由Aβ淀粉缠结引起的出血及淀粉缠结形成的斑块。这就意味着天麻素是一种对AD有临床疗效的药物，同时本发明的实验也证实，血清中Aβ的浓度与大脑中总的Aβ的含量具有正相关性，这意味着在使用含天麻素的食物防治AD的过程中，通过监测血清中Aβ的浓度能反应大脑中Aβ负荷的变化。

本发明天麻素药物临床使用结果表明，本发明证实人体对天麻素有很好的耐受性，即长期食用含天麻素的不会引起AD患者肝功能受损和其它生理功能异常，同时发现天麻素能有效改善AD患者的学习记忆力，有效清除AD患者大脑中Aβ的沉积，减少血清中Aβ负荷的的水平，减轻炎症引起的小胶质细胞增生，减少由Aβ淀粉缠结引起的出血及淀粉缠结形成的斑块。这就意味着天麻素是一种对AD有临床疗效的药物。

Claims (10)

1.天麻素在制备预防和治疗阿尔茨海默症的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述阿尔茨海默症为大脑中Aβ淀粉蛋白的沉积引起的阿尔茨海默症。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述阿尔茨海默症为血清中Aβ淀粉蛋白负荷引起的阿尔茨海默症。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述阿尔茨海默症为炎症引起的小胶质细胞增生的阿尔茨海默症。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述阿尔茨海默症为由Aβ淀粉缠结引起的出血的阿尔茨海默症。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于天麻素在制备预防和治疗大脑中Aβ淀粉蛋白沉积症的药物中的应用。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于天麻素在制备减弱ＡＤ大脑炎症的活性成分的药物中的应用。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于天麻素在制备预防和治疗血清中Aβ淀粉蛋白负荷症的药物中的应用。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于天麻素在制备预防和治疗炎症引起的小胶质细胞增生症的药物中的应用。

10.如权利要求1所述的应用，其特征在于天麻素在制备预防和治疗Aβ淀粉缠结引起的出血症及清除淀粉缠结形成的斑块的药物中的应用。

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