CN115227836A - 利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，该方法采用AI结合的视频采集、分析技术，同时监控上百条模型的行为变化，并且以同一条鱼正常态和癫痫态参数做对比，抵消个体参数差异因素，获得更准确的药效评估效果。
Description
技术领域
本发明属于材料领域，具体涉及一种利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法及装置。
背景技术
癫痫是一种由神经元异常大规模放电导致的神经系统疾病，具有突发性以及不可预测性的特点。目前癫痫患者的治疗方式主要是使用抗癫痫药物，但约有三分之一的患者对抗癫痫药物具有耐药性，因此研究评价癫痫发作以及动物模型对于抗癫痫药物筛选具有重要意义。
相比于传统中枢神经药物研发主要依赖于具有完善的高级中枢神经系统的灵长类动物模型，癫痫药物作用的神经元客体广泛，与神经元细胞内部离子通道的抑制/激活生理参数有密切的关联关系。因此，癫痫药物的研发既要在针对微观离子通道等亚细胞层面开展，又要综合评估生物个体的整体神经元的表观行为。
目前无论是灵长类动物模型还是细胞水平、低等多细胞生物水平的动物模型都各自有自身的缺陷，因此研究评价癫痫发作以及动物模型对于抗癫痫药物筛选具有重要意义。
因此，目前急需一种既能在亚细胞微观层面筛选药物机理、又能在个体层面反应动物整体的神经行为的癫痫药物筛选方法，是相关神经药物开发的关键。
发明内容
一种利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，步骤包括，步骤I：将斑马鱼置于多孔板内；
步骤II：在多孔板内收集斑马鱼产生的涡流信息；
步骤III：加入致癫剂以诱导斑马鱼癫痫化，随后在多孔板内收集斑马鱼产生的涡流信息；
步骤IV：比对致癫剂诱导前后斑马鱼出现病理涡旋游泳数量，获得斑马鱼癫痫模型；
步骤V：加入抗癫痫药物，随后收集斑马鱼产生的涡流信息；
步骤VI：比对抗癫痫药物加入前后斑马鱼出现病理涡流数量，获得抗癫痫药物药效数据。
进一步，所述斑马鱼产生的涡流信息包括视频采集的斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为参数；
进一步，所述斑马鱼产生的涡流信息还包括微孔板内部收集到的涡旋水流压力变化数据；水流压力变化数据结合视频参数更准确的反馈出斑马鱼癫痫化的程度，实现更准确的药物疗效评估；
进一步，所述视频采集的斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为参数，步骤包括，采用AI影像识别程序，智能统计百条以上斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为数量，准确反映致癫/抗癫的统计效果。
进一步，致癫剂在斑马鱼幼体期内加入，利用发育状态的神经组织提升致癫剂的致癫效果；抗癫痫药物在斑马鱼癫痫模型发育完成后加入，利用稳定的神经网络实现更准确的药物疗效评估。
进一步，所述致癫剂选自戊四氮、红藻氨酸、氨茶碱中的一种或多种。
一种高通量斑马鱼癫痫行为分析系统的装置，包括斑马鱼生命维持系统、光线控制系统、多孔细胞板，多孔细胞板上方设置视频采集与信息处理设备。
进一步，所述信息处理设备包括可用于视频追踪的计算机，行为分析系统ZebVortrack系统。
进一步，所述多孔细胞板内部每个孔内放置1条斑马鱼，幼鱼鱼龄在5dpf(dpf，受精后天数)以上。
进一步，所述多孔细胞板内每个孔侧壁及底部设置四个以上压强传感器，利用三维定位技术检测涡旋游泳发生点，追踪斑马鱼产生涡旋游泳的空间坐标和强度参数，输入视频追踪的计算机的行为分析系统ZebVortrack系统，作为识别斑马鱼病理状态下的涡旋状游泳的权重参数。
有益效果：
本技术方案中，利用斑马鱼模型作为模型筛选抗癫痫药物，具有以下优点：
1、采用AI结合的视频采集、分析技术，同时监控上百条模型的行为变化，并且以同一条鱼正常态和癫痫态参数做对比，抵消个体参数差异因素，获得更准确的药效评估效果；
2、采用幼体态诱导癫痫模型、成熟态评价药效的模式，能够利用稳定的神经网络实现更准确的药物疗效评估；
3、斑马鱼产生的涡旋游泳信息包括视频采集的斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为参数、微孔板内部收集到的涡旋水流压力变化数据；水流压力变化数据结合视频参数更准确的反馈出斑马鱼癫痫化的程度，实现更准确的药物疗效评估；
4、多孔板内每个孔侧壁及底部设置四个以上压强传感器，利用三维定位技术检测涡流发生点，追踪斑马鱼产生涡流的空间坐标和强度参数，输入视频追踪的计算机的行为分析系统ZebVortrack系统，作为识别斑马鱼病理状态下的涡旋状游泳的权重参数，实现斑马鱼病理状态游泳姿势更精确的定位，更准确的反应斑马鱼的癫痫状态。
附图说明
图1.本发明实施例采集设备示意图；
图2.本发明实施例PTZ对斑马鱼幼鱼癫痫涡旋次数的影响；
图3.本发明实施例VPA对PTZ诱导的斑马鱼幼鱼癫痫涡旋次数的影响；
图4.本发明实施例各批次天麻对PTZ诱导的斑马鱼幼鱼癫痫涡旋次数的影响；
图5.本发明实施例天麻素对PTZ诱导的斑马鱼幼鱼癫痫涡旋次数的影响。
具体实施方式
下面的实施例及附图将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
(1)实验准备：斑马鱼早期发育与设备组装
AB系或WB野生型斑马鱼成鱼按国际通用方法养殖。养殖系统保持28±0.5℃的恒温下，14小时/10小时(上午8:30光照，下午22:30黑暗)的光照/黑暗循环。斑马鱼成鱼每天喂食丰年虫两次，晚上9:00将雄性和雌性斑马鱼以2：2的比例放置在交配池的隔板两侧。第二天开灯前拆掉隔板。斑马鱼受光刺激自然交配产卵。在产卵后2小时内收集鱼卵并用专用养鱼水(5mM NaCl,0.17mM KCl,0.4mM CaCl2,and 0.16mM MgSO4)冲洗三次，将干净的胚胎转移到含有养鱼水的90mm培养皿中，去除未受精以及发育不良的鱼卵，剩下的鱼卵在28.5℃下孵育用于后续实验。
本实验所用斑马鱼癫痫行为分析系统主要分为采集设备以及视频分析设备。采集设备包括：一个光照灯箱置底层，灯箱上可放置微孔板，周围遮光，正上方为高分辨率的摄像机。视频分析设备包括：可用于视频追踪的计算机，行为分析系统ZebVortrack系统；此外，多孔板内每个孔侧壁及底部设置四个以上压强传感器，利用三维定位技术检测涡流发生点，追踪斑马鱼产生涡流的空间坐标和强度参数，输入视频追踪的计算机的行为分析系统ZebVortrack系统，作为识别斑马鱼病理状态下的涡旋状游泳的权重参数。
(2)实验流程以及评估方式
将装有斑马鱼幼鱼的多孔微孔板(每孔一条)置于一个敞口房盒中，方盒上方支有用于拍摄斑马鱼幼鱼游泳状态的摄像机。使用致痫剂处理斑马鱼幼鱼一定时间，同时使用相机对各处理组斑马鱼进行视频采集，采集结束后导入ZebVortrack系统，连同对应的压强参数共同输出斑马鱼幼鱼的涡旋次数。
未经致痫剂处理的斑马鱼会在孔中作绕圈游泳，速度相对稳定，极少出现变速、转角等异常游泳行为，而经过一定浓度致痫剂处理的斑马鱼会出现癫痫病理状态下的涡旋状的游泳行为，量化这种行为并与正常斑马鱼幼鱼游动状态进行比较能够评估斑马鱼是否进入癫痫状态。
(3)抗癫痫药效评价
使用相机及压强传感器采集给药组、模型组、空白组斑马鱼幼鱼的游动状态视频及三维-时间动态压强参数，采集结束后导入ZebVortrack系统对各处理组斑马鱼幼鱼的涡旋次数进行量化，比较模型组与空白组之间的差异、阳性药与模型组的差异以及样品组与模型组的差异。
本实施例中，步骤(1)中设备准备的方盒为不透明方盒，且周围环境安静，减少外界环境对斑马鱼幼鱼的活动的影响；步骤(1)中底光要均匀以便在视频追踪过程中能够更好的捕捉到目标斑马鱼；步骤(2)中摄像机镜头要尽量与每个孔垂直以便能够将每个孔的视野完全暴露出来；步骤(3)每个浓度组应该在12条及以上，以减少偶然误差带来的离散度过高；步骤(3)中各药物溶液的配制使用纯水配制，减少其它离子与药物之间的反应。
实施例1：癫痫诱导剂戊四唑(PTZ)对斑马鱼幼鱼涡旋行为的影响
使用摄像支架支撑好摄像机，置于方盒正上方，摄像机摄像头垂直于被拍摄孔板，调整焦距，直至整个孔板能够被清晰地拍摄。
将5dpfAB系斑马鱼幼鱼置于12孔微孔板中，每孔一条，每个微孔板为一浓度组，设置四个戊四唑浓度组，分别为200、400、600、800μg/mL处理30min，处理的同时使用相机采集斑马鱼幼鱼整个过程的游动状态，采集结束后导入ZebVortrack系统进行涡旋次数的量化。
由图2可知，在四个浓度组的戊四唑的处理下，斑马鱼幼鱼的涡旋次数显著上升，且随着戊四唑浓度的增大涡旋次数增加，但只有400、600、800μg/mL浓度组与空白组有显著性差异，表明了在200μg/mL并没有达到斑马鱼幼鱼产生癫痫样行为的阈值。
实施例2：丙戊酸钠(VPA)对戊四唑诱导的涡旋行为的影响
丙戊酸钠是一种已知上市的经典抗癫痫药物，实验使用丙戊酸钠作为阳性药。将4dpfAB系斑马鱼幼鱼置于60、80、100μg/mL阳性药丙戊酸钠中预报护24h，之后转移至400μg/mL的戊四唑溶液中处理30min，同时设置空白组与400μg/mLPTZ模型组，处理同时使用相机采集斑马鱼幼鱼整个过程的游动状态，采集结束后导入ZebVortrack系统进行涡旋次数的量化。
如图3所示，丙戊酸钠能够显著降低斑马鱼幼鱼的涡旋次数，并且将这种行为降低到与正常斑马鱼幼鱼一样的水平。
实施例3：中药天麻对戊四唑诱导的斑马鱼幼鱼涡旋行为的影响
将九批来自不同产地、不同年份的天麻编号为S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10(S3样品进行耐受测试时不理想被去除)，对各批次天麻进行打磨成粉，天麻样品粉末过四号筛，称取各批次天麻粉末约8g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入200mL60％甲醇，超声处理(功率210W，频率40kHz)30分钟，放冷，称定质量，用60％甲醇补足失重，摇匀过滤，滤液减压浓缩后60℃真空干燥，得到天麻粗提物。称取各批次粗提物适量加入纯水定容，稀释配得0.4mg/mL溶液。
使用0.4mg/mL天麻粗提物、0.1mg/mL丙戊酸钠水溶液处理4dpfAB系斑马鱼幼鱼24h后转移到0.4mg/mL的PTZ溶液中处理30min，同时使用相机采集斑马鱼幼鱼的游泳行为。将采集好的视频导入ZebVortrack系统进行轨迹跟踪，量化斑马鱼幼鱼的涡旋行为。
结果如图4所示，0.4mg/mL的戊四唑溶液显著增加了斑马鱼幼鱼的涡旋次数，使用0.1mg/mL的阳性药丙戊酸钠进行预报护24h后能够显著降低因戊四唑带来的这种显著上升变化，使用各批次进行预报护24h后，除S1、S2、没有显著抑制这种变化外，其余批次的天麻粗体物都可显著降低斑马鱼幼鱼的涡旋次数。
实施例4：天麻素(GA)对戊四唑诱导的斑马鱼幼鱼涡旋行为的影响
称取天麻素适量，配制成200、400、800μg/mL水溶液，对4dpfAB系斑马鱼幼鱼进行预报护24h，之后转移至400μg/mLPTZ溶液中处理30min，同时设置空白组以及400μg/mL模型组，使用相机采集斑马鱼幼鱼的游动状态，导入ZebVortrack系统输出斑马鱼幼鱼的涡旋次数以及涡旋潜伏期。
如图5所示，中、高浓度的天麻素能够显著降低PTZ诱导的斑马鱼幼鱼癫痫涡旋次数。
讨论：由上述实施例及附图1～5可以得出，采用AI结合的视频采集、分析技术，同时监控上百条模型的行为变化，并且以同一条鱼正常态和癫痫态参数做对比，抵消个体参数差异因素，获得更准确的药效评估效果；进一步，在本技术方案中多孔板内每个孔侧壁及底部设置四个以上压强传感器，利用三维定位技术检测涡流发生点，追踪斑马鱼产生涡流的空间坐标和强度参数，输入视频追踪的计算机的行为分析系统ZebVortrack系统，作为识别斑马鱼病理状态下的涡旋状游泳的权重参数，实现斑马鱼病理状态游泳姿势更精确的定位，更准确的反应斑马鱼的癫痫状态。
本技术方案采用幼体态诱导癫痫模型、成熟态评价药效的模式，能够利用稳定的神经网络实现更准确的药物疗效评估；并且，斑马鱼产生的涡旋游泳信息包括视频采集的斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为参数、微孔板内部收集到的涡旋水流压力变化数据；水流压力变化数据结合视频参数更准确的反馈出斑马鱼癫痫化的程度，实现更准确的药物疗效评估。
Claims (10)
1.一种利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，其特征在于，步骤包括，
步骤I：将斑马鱼置于多孔板内；
步骤II：在多孔板内收集斑马鱼产生的涡流信息；
步骤III：加入致癫剂以诱导斑马鱼癫痫化，随后在多孔板内收集斑马鱼产生的涡流信息；
步骤IV：比对致癫剂诱导前后斑马鱼出现病理涡旋游泳数量，获得斑马鱼癫痫模型；
步骤V：加入抗癫痫药物，随后收集斑马鱼产生的涡流信息；
步骤VI：比对抗癫痫药物加入前后斑马鱼出现病理涡流数量，获得抗癫痫药物药效数据。
2.如权利要求1所述的利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述斑马鱼产生的涡流信息包括视频采集的斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为参数。
3.如权利要求2所述的利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述斑马鱼产生的涡流信息还包括微孔板内部收集到的涡旋水流压力变化数据。
4.如权利要求2所述的利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述视频采集的斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为参数，步骤包括，采用AI影像识别程序，智能统计百条以上斑马鱼病理状态下的涡旋状的游泳行为数量，准确反映致癫/抗癫的统计效果。
5.如权利要求1所述的利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，其特征在于，致癫剂在斑马鱼幼体期内加入；抗癫痫药物在斑马鱼癫痫模型发育完成后加入。
6.如权利要求1所述的利用斑马鱼幼鱼模型高通量筛选抗癫痫药物的方法，其特征在于，所述致癫剂选自戊四氮、红藻氨酸、氨茶碱中的一种或多种。
7.一种高通量斑马鱼癫痫行为分析系统的装置，包括斑马鱼生命维持系统、光线控制系统、多孔板，多孔板上方设置视频采集与信息处理设备。
8.如权利要求7所述的高通量斑马鱼癫痫行为分析系统的装置，其特征在于，所述信息处理设备包括可用于视频追踪的计算机，行为分析系统ZebVortrack系统。
9.如权利要求7所述的高通量斑马鱼癫痫行为分析系统的装置，其特征在于，所述多孔板内部每个孔内放置1条斑马鱼。
10.如权利要求9所述的高通量斑马鱼癫痫行为分析系统的装置，其特征在于，所述多孔板内每个孔侧壁及底部设置四个以上压强传感器，利用三维定位技术检测涡流发生点，追踪斑马鱼产生涡流的空间坐标和强度参数，输入视频追踪的计算机的行为分析系统ZebVortrack系统，作为识别斑马鱼病理状态下的涡旋状游泳的权重参数。
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