CN112941139A - 一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，该方法是以斑马鱼为模型，通过获取神经丘周围巨噬细胞迁移个数用于评价栀子水提取物的抗炎活性，以及通过获取肠下静脉血管血栓形成时间用于评价栀子水提取物的抗血栓活性。本发明方法，以斑马鱼为模型，不仅能够评价栀子水提取物的抗炎活性，而且还能评价栀子水提取物的抗血栓活性，具有靶点明确、筛选速度快、筛选成本低、高通量、样品消耗少、重复性好等优点，有着较高的使用价值和应用前景。

Description

一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法
技术领域
本发明属于中药技术领域，涉及一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis，As)是一个由多种细胞相互作用(如内皮细胞、核细胞、T细胞)，主要影响大、中动脉的慢性进行性炎症疾病。炎症反应可促进血栓的形成和发展，并最终导致血栓破裂。在这个发生发展过程中，血液中的单核巨噬细胞，包括骨髓来源的单核细胞和由单核细胞分化而来的巨噬细胞在血栓溶解部位呈现明显的高度聚集状态，提示其在血栓机化和再通中发挥着重要作用。研究发现，巨噬细胞可以吞噬性炎症细胞，填充AS损伤部位，积极参与胆固醇堆积，还可通过维持促炎微环境促进复杂和不稳定斑块的形成。此外，抗炎巨噬细胞有助于组织修复重塑和斑块稳定。因此，抑制单核巨噬细胞功能可抑制血栓的溶解过程，针对巨噬细胞作用的研究可能成为抗As治疗的突破口。目前，有关中药提取物发挥抗炎或抗血栓作用的研究尽管已有报道，然而它们仅仅都是从其中一种活性进行评价，忽视了炎症与血栓形成二者内在的联系，涉及同步考察某种中药提取物的抗炎和抗血栓作用较少。
栀子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科栀子属一种常绿灌木，主产于江西、湖南等地。栀子的果实是传统中药材，具有抗炎镇痛、保肝利胆、降血糖等作用，是多种中药常用复方的组成成分。目前，有关栀子乙醇提取物的活性及成分研究较多，然而，涉及栀子水提物的研究报道并不多。在评价栀子提取物的药理活性时，主要集中在抗抑郁、抗氧化、降糖和抗血栓方面，采用合适的药理模型同时评价栀子提取物的抗炎及抗血栓活性未见报道。另外，已报道相关药理研究模型仅仅局限于体外细胞或小鼠模型，且活性评价仅仅也是侧重抗炎或抗血栓活性一种。同时采用小鼠等整体动物模型在实际的药物筛选过程中存在着各种问题，如个体空间占位大、养育成本高、繁殖量有限(筛选通量小)、寿命周期长(活性测试周期长)、样品的消耗量大等，因而大大限制了其应用于药物筛选和活性指导下的活性成分研究。采用一种靶向明确、成本低廉、筛选周期短、供试样品消耗少的筛选模型评价中药提取物的抗血栓和抗炎功能具有重要意义。目前，尚不清楚栀子水提物在斑马鱼模型上是否同时具有抗炎和抗血栓的功能。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种靶点明确、筛选成本低、筛选速度快、高通量、样品消耗少、重复性好的利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗炎活性，包括以下步骤：
S1、将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；
S2、采用硫酸铜溶液对步骤S1中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，造成急性炎症；
S3、采用多聚甲醛溶液对步骤S2中经硫酸铜溶液处理后得到的斑马鱼进行固定处理；
S4、采用荧光显微镜观察步骤S3中经多聚甲醛溶液固定处理后的斑马鱼的巨噬细胞炎症反应，计数神经丘周围巨噬细胞迁移个数；
S5、以步骤S4中得到神经丘周围巨噬细胞迁移个数为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗炎活性。
上述的方法，进一步改进的，所述步骤S5中，所述神经丘周围巨噬细胞迁移个数＜12.75±6.714个，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗炎作用。
上述的方法，进一步改进的，所述步骤S1中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为24h；
所述步骤S2中，所述采用硫酸铜溶液的浓度为20μM；所述处理的时间为1h；
所述步骤S3中，所述固定处理后还包括以下步骤：去除斑马鱼上的多聚甲醛溶液，然后采用PBST溶液对斑马鱼进行清洗；所述多聚甲醛溶液的质量浓度为4％；所述固定处理的时间为1h。
上述的方法，进一步改进的，所述步骤S1中，所述斑马鱼胚胎由巨噬细胞荧光转基因斑马鱼交配受精后培养得到。
上述的方法，进一步改进的，所述栀子水提取物由以下方法制备得到：将栀子粉碎，过筛，加入水，超声提取，得到提取液；将提取液进行过滤，得到滤液；将滤液进行减压浓缩，回收溶剂，冷冻干燥，得到栀子水提取物。
上述的方法，进一步改进的，所述栀子的质量与水的体积的比值范围为1g∶5mL～10mL；所述过筛为过40目筛；所述超声提取的次数为3次，单次超声提取的时间范围为30min～60min；所述减压浓缩在温度范围为40℃～60℃下进行。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗血栓活性，包括以下步骤：
(1)将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；
(2)采用三氯化铁溶液对步骤(1)中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，诱导血栓形成；
(3)从加入三氯化铁溶液开始，记录肠下静脉血管形成血栓的时间；
(4)以步骤(3)中得到肠下静脉血管血栓形成时间为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗血栓活性。
上述的方法，进一步改进的，所述步骤(4)中，所述肠下静脉血管血栓形成时间≥8.84±0.10min，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗血栓作用。
上述的方法，进一步改进的，所述步骤(1)中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为48h；
所述步骤(2)中，所述三氯化铁溶液的浓度为60μg/mL。
上述的方法，进一步改进的，所述步骤(1)中，所述斑马鱼胚胎由AB系斑马鱼交配受精后培养得到。
上述的方法，进一步改进的，所述栀子水提取物由以下方法制备得到：将栀子粉碎，过筛，加入水，超声提取，得到提取液；将提取液进行过滤，得到滤液；将滤液进行减压浓缩，回收溶剂，冷冻干燥，得到栀子水提取物。
上述的方法，进一步改进的，所述栀子的质量与水的体积的比值范围为1g∶5mL～10mL；所述过筛为过40目筛；所述超声提取的次数为3次，单次超声提取的时间范围为30min～60min；所述减压浓缩在温度范围为40℃～60℃下进行。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明提供了一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以斑马鱼为模型，不仅能够评价栀子水提取物的抗炎活性，而且还能评价栀子水提取物的抗血栓活性，具有靶点明确、筛选速度快、筛选成本低、高通量、样品消耗少、重复性好等优点，有着较高的使用价值和应用前景。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中不同样品处理斑马鱼后巨噬细胞的荧光电镜图，其中a为空白对照组，b为模型组，c为阳性药物组，d为栀子水提取物组(浓度为1μg/mL)，e为栀子水提取物组(浓度为5μg/mL)，f为栀子水提取物组(浓度为10μg/mL)
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。本发明的实施例中，若无特别说明，所采用的工艺为常规工艺，所采用的设备为常规设备，且所得数据均是三次以上试验的平均值。
实施例1：
一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以3dpf(days postfertilization)健康巨噬细胞荧光转基因斑马鱼Tg(zlyz:EGFP)为模型评价栀子水提取物的抗炎活性，包括以下步骤：
(1)斑马鱼胚胎获取
雌雄斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按♀♂1:1的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4)中，28℃下控光培养。
(2)在受精卵发育3dpf(days post fertilization)时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔8枚，每次每组两个重复孔，实验重复两次。分别加入不同浓度的栀子水提取物(1μg/mL，5μg/mL和10μg/mL)，加培养水至2.0mL。栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合后，对斑马鱼胚胎进行孵育24h；在避光条件下采用浓度为20μM的硫酸铜溶液对孵育后得到的斑马鱼进行处理1h，造成急性炎症；在室温条件下利用浓度为4％的多聚甲醛(PFA)溶液对斑马鱼进行固定处理1h，然后，清除4％PFA并使用PBST清洗斑马鱼。
空白对照组：以水代替栀子水提取物，且不加入硫酸铜溶液，其他条件相同。
阳性药物组：以吲哚美辛代替栀子水提取物，其他条件相同。
模型组：以水代替栀子水提取物，其他条件相同。
(3)采用荧光显微镜观察巨噬细胞炎症反应，获取神经丘周围巨噬细胞迁移个数。利用Image Pro Plus软件统计样品对炎症反应的影响。实验数据用mean±SD表示，采用SPSS软件进行各组间方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。
(4)以步骤(3)中得到神经丘周围巨噬细胞迁移个数为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗炎活性，其中神经丘周围巨噬细胞迁移个数＜12.75±6.714个，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗炎作用。
表1：不同样品对斑马鱼巨噬细胞迁移个数的影响(mean±SD)
Figure BDA0002311320690000041
*表示与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.05)，#表示与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)
图1为本发明实施例1中不同浓度栀子水提取物样品处理斑马鱼后巨噬细胞的荧光电镜图，其中a为空白对照组，b为模型组，c为阳性药物组，d为栀子水提取物组(浓度为1μg/mL)，e为栀子水提取物组(浓度为5μg/mL)，f为栀子水提取物组(浓度为10μg/mL)。
由表1及图1可知，栀子水提取物在1μg/mL剂量下，斑马鱼巨噬细胞迁移个数为9.50±5.320个，远小于12.75±6.714个，与模型组相比具有显著性差异(P<0.05)，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗炎作用。
本实施例中，采用的栀子水提取物由以下方法制备得到：
选取100g新鲜的栀子，粉碎，过40目筛，加入800mL水，超声提取3次，每次30min。合并提取液，过滤，在50℃下减压浓缩回收溶剂，最后经冷冻干燥，得到栀子水提取物。
实施例2：
一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，以3dpf(days postfertilization)健康AB系斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗血栓活性，包括以下步骤：
(1)斑马鱼胚胎获取
雌雄斑马鱼分开喂养，照明14h/黑暗10h交替进行，定时喂以人工颗粒状饵料和刚孵出的卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。采卵时取健康性成熟的斑马鱼按♀♂1:1的比例放入交配缸内，次日9-10时获得受精卵。对受精卵进行消毒和洗涤后移入斑马鱼胚胎培养用水(含5.0mM NaCl，0.17mM KCl，0.4mM CaCl2，0.16mM MgSO4)中，28℃下控光培养。
(2)样品对斑马鱼血栓形成的影响
在受精卵发育3dpf时，在体视显微镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入24孔培养板中，每孔10枚，每次每组两个重复孔，实验重复两次。加培养水至2.0mL，作为阳性对照组。分别加入不同浓度的实施例1中制得的栀子水提取物(1μg/mL，5μg/mL和10μg/mL)，加培养水至2.0mL。置于光照培养箱(28℃)让胚胎继续发育。在48h时，用60μg/mL的三氯化铁分别处理各组斑马鱼。
对照组：以水代替栀子水提取物，其他条件相同。
肝素钠组：以肝素钠栀子水提取物，其他条件相同。
(3)从加入三氯化铁开始，在显微镜下肠下静脉血管的形成情况，记录肠下静脉血管形成血栓的时间，判断样品是否具有抑制血栓形成的活性，并观察胚胎死亡或畸形情况。实验数据用mean±SD表示，采用SPSS软件进行各组间方差分析，P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有极显著性差异。
(4)以步骤(3)中得到肠下静脉血管血栓形成时间为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗血栓活性，其中肠下静脉血管血栓形成时间≥8.84±0.10min，且差异系数P＜0.05时，说明栀子水提取物对斑马鱼具有抗血栓作用。
表2：不同样品对斑马鱼血栓形成时间的影响(mean±SD)
Figure BDA0002311320690000061
*表示与对照相比具有显著性差异(P<0.05)
由表2可知，栀子水提取物的浓度为10μg/mL时，血栓形成时间为10.67±0.56min，远大于8.84±0.10min，与对照相比具有显著性差异(P<0.05)，此时栀子水提取物具有抑制血栓形成活性。
由此可知，本发明中，以斑马鱼为模型，不仅能够评价栀子水提取物的抗炎活性，而且还能评价栀子水提取物的抗血栓活性，具有靶点明确、筛选速度快、筛选成本低、高通量、样品消耗少、重复性好等优点，有着较高的使用价值和应用前景。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，其特征在于，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗炎活性，包括以下步骤：
S1、将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；
S2、采用硫酸铜溶液对步骤S1中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，造成急性炎症；
S3、采用多聚甲醛溶液对步骤S2中经硫酸铜溶液处理后得到的斑马鱼进行固定处理；
S4、采用荧光显微镜观察步骤S3中经多聚甲醛溶液固定处理后的斑马鱼的巨噬细胞炎症反应，计数神经丘周围巨噬细胞迁移个数；
S5、以步骤S4中得到神经丘周围巨噬细胞迁移个数为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗炎活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述神经丘周围巨噬细胞迁移个数＜12.75±6.714个，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗炎作用。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为24h；
所述步骤S2中，所述采用硫酸铜溶液的浓度为20μM；所述处理的时间为1h；
所述步骤S3中，所述固定处理后还包括以下步骤：去除斑马鱼上的多聚甲醛溶液，然后采用PBST溶液对斑马鱼进行清洗；所述多聚甲醛溶液的质量浓度为4％；所述固定处理的时间为1h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中，所述斑马鱼胚胎由巨噬细胞荧光转基因斑马鱼交配受精后培养得到。
5.一种利用斑马鱼为模型评价栀子水提取物活性的方法，其特征在于，以斑马鱼为模型评价栀子水提取物的抗血栓活性，包括以下步骤：
(1)将栀子水提取物与斑马鱼胚胎混合，对斑马鱼胚胎进行孵育；
(2)采用三氯化铁溶液对步骤(1)中经孵育后得到的斑马鱼进行处理，诱导血栓形成；
(3)从加入三氯化铁溶液开始，记录肠下静脉血管形成血栓的时间；
(4)以步骤(3)中得到肠下静脉血管血栓形成时间为评价指标，用于评价栀子水提取物的抗血栓活性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述肠下静脉血管血栓形成时间≥8.84±0.10min，且差异系数P＜0.05时，提示栀子水提取物对斑马鱼具有抗血栓作用。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述孵育在光照条件下进行；所述孵育的温度为28℃；所述孵育的时间为48h；
所述步骤(2)中，所述三氯化铁溶液的浓度为60μg/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述斑马鱼胚胎由AB系斑马鱼交配受精后培养得到。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其特征在于，所述栀子水提取物由以下方法制备得到：将栀子粉碎，过筛，加入水，超声提取，得到提取液；将提取液进行过滤，得到滤液；将滤液进行减压浓缩，回收溶剂，冷冻干燥，得到栀子水提取物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述栀子的质量与水的体积的比值范围为1g∶5mL～10mL；所述过筛为过40目筛；所述超声提取的次数为3次，单次超声提取的时间范围为30min～60min；所述减压浓缩在温度范围为40℃～60℃下进行。
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