CN104069141A - 一种锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用 - Google Patents
一种锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，有效解决制备抗抑郁症的药物，实现锁阳提取物在制备抗抑郁症药物中的应用，锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，该锁阳提取物是，取锁阳药材粉碎成粗粉，用乙醇浸泡，回流提取，滤液减压回收乙醇至无醇味，得锁阳提取液；大孔吸附树脂用乙醇浸泡，湿法装柱；将锁阳提取液用蒸馏水分散成分散液，调pH4.5，上大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；继用乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎，即得，本发明具有抗抑郁作用，可有效用于制备抗抑郁药物，实现锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用。
背景技术
锁阳，又名不老药，锁阳多年生肉质寄生草本。一种寄生植物，野生于沙漠戈壁，零下20℃生长最宜，生长之处不积雪、地不冻。有补肾润肠、治阳痿，尿血等功效。随着锁阳药物价值的不断提高，对锁阳的研究日益被人们所重视，但至今未见有锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用的公开报导，也未见锁阳制备治疗抑郁症药物的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，可有效解决制备抗抑郁症的药物，实现锁阳提取物在制备抗抑郁症药物中的应用。
本发明解决的技术方案是，锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，该锁阳提取物是，取锁阳药材粉碎成粗粉，用乙醇浸泡，回流提取，滤液减压回收乙醇至无醇味，得锁阳提取液；D-101型大孔吸附树脂用乙醇浸泡，湿法装柱；将锁阳提取液用蒸馏水分散成含生药量0.3g/mL的分散液，调pH4.5，上大孔吸附树脂柱，先用蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；继用质量浓度为10％的乙醇洗脱，弃去洗脱液；然后用质量浓度为30％的乙醇洗脱，收集质量浓度为30％的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，干燥粉碎，得锁阳提取物，锁阳提取物中锁阳总黄酮质量含量70％以上。
本发明制备方法简单，原材料丰富，所制备的锁阳提取物具有抗抑郁作用，可有效用于制备抗抑郁药物，实现锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，开拓了锁阳的药用价值和新用途，并进而实现在制备抗抑郁药物中的新用途。
具体实施方式
以下结合具体情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，该锁阳提取物是，取锁阳药材，粉碎成过20-30目筛的粗粉，加10倍锁阳重量的质量浓度为70％的乙醇浸泡0.5h，回流提取两2次，第一次1.5h，第二次1h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得锁阳提取液；D-101型大孔吸附树脂用质量浓度为95％的乙醇浸泡24小时后，湿法装柱，用质量浓度为95％的乙醇动态清洗至乙醇洗脱液与水以体积1︰3混合不呈白色混浊溶液止，用水洗去乙醇后备用；将锁阳提取液用蒸馏水分散成含生药量0.3g/mL的分散液，调pH4.5，上大孔吸附树脂柱，分散液上柱量与树脂体积的比例为1︰10，树脂柱径高比为1︰12，先用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积的质量浓度为10％的乙醇洗脱，弃去质量浓度为10％的乙醇洗脱液；然后用10倍柱体积的质量浓度为30％的乙醇洗脱，收集质量浓度为30％的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃干燥粉碎，得锁阳提取物，锁阳提取物中锁阳总黄酮质量含量70％以上。
本发明锁阳提取物具有抗抑郁作用，可有效用于制备抗抑郁药物，实现锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，进而实现锁阳提取物在制备治疗抑郁症药物中的应用，并经试验得到了有效证明，有关试验资料如下。
1 实验材料
1.1 实验动物
Wister大鼠，雄性，180-220g，SPF级，由山东鲁抗医药股份有限公司
提供。合格证编号0017183；实验室合格证号SYXK(豫)2010-001。
1.2 药品试剂
本发明锁阳提取物；盐酸氟西汀，市售；羧甲基纤维素钠，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；甲醛溶液(分析纯)，烟台市双双化工有限公司；氯化钠注射液，河南双鹤华利药业有限公司；葡萄糖注射液，开封制药(集团)有限公司；大鼠5-HT ELISA检测试剂盒，R&D公司；大鼠DA ELISA检测试剂盒，R&D公司；大鼠NE ELISA检测试剂盒，R&D公司；大鼠CORT ELISA检测试剂盒，R&D公司；大鼠ACTH ELISA检测试剂盒，R&D公司。
1.4 实验仪器
电子天平，上海精密科学仪器有限公司生产，型号YP1201N；电子分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司生产，型号GN0741；高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司生产，型号KDC-160HR；台式低速自动平衡离心机，长沙湘智离心机仪器有限公司，型号TDZ5-WS；电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司生产，型号HWS12；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司生产，型号DHG-9145A；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；酶标仪，美国BIO-RAD公司生产，型号680。
2 实验方法
2.1 造模及给药
造模方法：取体重180-220g雄性Wister大鼠60只，随即将大鼠分为6组：空白组、模型组、大、中、小剂量锁阳提取物组、阳性组。空白组大鼠不予任何刺激，每5只1个笼子饲养。模型组和给药组大鼠每笼1只单独饲养。抑郁组大鼠共接受21d慢性温和性不可预见性应激刺激，刺激方法包括：(1)冰水游泳：(4℃,5min)将大鼠放入盛有4℃冷水的容器中，大鼠的足尖刚能接触容器底部，刺激持续5min后取出；(2)热应激：(45℃,5min)烘箱温度调至45℃恒定，将大鼠放入烘箱中，刺激5min后取出；(3)禁水(24h)；(4)禁食(24h)；(5)夹尾：(1min)将大鼠固定，露出尾巴，用止血钳夹住距尾根部1cm处，用力不宜过大，大鼠发出哀叫声即可，1min后松开；(6)潮湿垫料(每100g垫料中加入200ml水)；(7)通宵照明(24h)。随机安排到21d内，每天随机安排1种刺激方式，每种刺激在实验过程中使用不超过3次，使大鼠不能预料刺激的发生，以避免发生适应性。
配药方法：0.6％CMC配制：称取CMC0.6g，用蒸馏水配成100ml。大、中、小剂量锁阳提取物组给药剂量分别为200mg·kg-1、100mg·kg-1、50mg·kg-1(给药剂量结合临床锁阳用量和锁阳中总黄酮的含量确定)，配置方法：分别称取锁阳提取物5040mg、1260mg、630mg，用500mL的0.6％CMC溶解，浓度为10mg·mL-1、5mg·mL-1、2.5mg·mL-1。盐酸氟西汀(6.6mg·kg-1，浓度0.33mg·mL-1，相当于临床用量的10倍)，配置方法：取盐酸氟西汀片16.8片，用500mL的0.6％CMC溶解。给药体积均为2mL/100g。
给药方法：各组动物于造模同时给予相应药物。盐酸氟西汀组灌胃盐酸氟西汀混悬液6.6mg·kg-1，大、中、小剂量锁阳提取物组分别按组别灌胃大、中、小剂量玫瑰总黄酮00mg·kg-1、100mg·kg-1、50mg·kg-1。空白组和模型组分别灌胃同体积蒸馏水，每日灌胃1次，连续给药21d。
2.2 观察项目及检测方法
各组大鼠于给药20d时进行糖水消耗测试，于给药21d时测定大鼠游泳不动时间。于末次给药后1h，大鼠摘眼球取血，分离血清，测定血清中CORT、ACTH的含量；然后脱颈椎处死大鼠，解剖大鼠，剖开胸腹腔,完整地取出胸腺、脾脏,滤纸吸干血后,称取重量,计算胸腺指数和脾指数(以胸腺和脾脏的重量(mg)与体重(g)之比作为胸腺或脾指数，然后取脑，测定脑组织中DA、NE、5-TH含量并同时分离垂体；将胸腺、脾脏、脑组织固定于10％甲醛溶液中，石蜡包埋组织，切片，HE染色，光镜下观察各组的组织形态学变化。
2.2.1 糖水消耗测试
实验第21天，每只大鼠水壶内加1％蔗糖溶液200ml，同时禁食，计算动物24h糖水消耗量。
2.2.2 强迫游泳测试
实验第21天，每只动物饮水壶内加1％蔗糖溶液200ml，同时禁食，计算动物24h糖水消耗量。
2.2.3 试剂盒检测方法
摘除眼球取血，室温下凝固，离心(3000r/min，离心10min)，取血清，酶免法测血清皮质酮(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)含量。行为学检测结束，立即将小鼠断头,在冰台上迅速取全脑,切左脑分析天平称重,加9倍预冷的生理盐水制备10％脑组织匀浆,匀浆液用2500r/min离心10min,取上清夜放于-20℃冰箱冻存备用。用酶免法测定脑组织匀浆中单胺类神经递质5-HT、DA、NE的含量。
大鼠5羟色胺(5-TH)ELISA检测试剂盒测定方法：从室温下放置20min的铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加入不同浓度的标准品50μL。样本孔中先加入待测样本10μL，再加样本稀释液40μL(即样本稀释5倍)；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔。保鲜膜包裹自封袋密封后37℃水浴锅温育60min。甩去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min。甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复操作5次。每孔先加入底物A、B各50μL，保鲜膜包裹自封袋密封后放入铝箔袋，37℃避光孵育15min。取出酶标板，每孔加终止液50μL，15min内，选择450nm波长测量各孔的吸光值(OD值)。根据标准品的浓度和对应的OD值，绘制出标准品回归曲线，根据曲线方程计算各样本浓度值。最终浓度为实际测定浓度乘以稀释倍数(5倍)。其中，标准品(S0-S5)浓度依次为：0、7.5、15、30、60、120ng/ml。
大鼠多巴胺(DA)ELISA检测试剂盒测定方法同5-TH，其中，标准品(S0-S5)浓度依次为：0、100、200、400、800、1600pg/ml。
大鼠去甲肾上腺素(NE)ELISA检测试剂盒测定方法同5-TH，其中，标准品(S0-S5)浓度依次为：0、7.5、15、30、60、120ng/ml。
大鼠皮质酮(CORT)ELISA检测试剂盒测定方法同5-TH，其中，标准品(S0-S5)浓度依次为：0、30、60、120、240、480ng/ml。
大鼠促肾上腺激素(ACTH)ELISA检测试剂盒测定方法同5-TH，其中，标准品(S0-S5)浓度依次为：0、5、10、20、40、80pg/ml。
3.实验结果
3.1 对大鼠体重的影响结果见表1，对大鼠糖耗量及游泳时间见表2
表1 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型体重的影响
与模型组相比：**：P<0.01*：P<0.05
从上表可看出，实验第1d，各组体重之间无明显差异；在第14～21d模型组体重显著减轻(P<0.01)，说明模型大鼠体重已显著减轻。与模型组比，在第14d，大剂量锁阳提取物组大鼠体重显著增加(P<0.01)，中剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组大鼠体重明显增加(P<0.05)；在第21d，大、中、小剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组大鼠体重均显著增加(P<0.01)。
表2 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型游泳、糖耗
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | 糖水耗量(ml) | 游泳不动时间(s) |
| 空白组 | - | 76.9±8.5** | 62.4±12.2** |
| 模型组 | - | 53.6±7.8 | 117.1±19.9 |
| 盐酸氟西汀组 | 6.6 | 67.2±7.6** | 82.7±12.1** |
| 小剂量锁阳提取物组 | 50 | 53.7±6.7 | 116.2±21.8 |
| 中剂量锁阳提取物组 | 100 | 61.3±5.8* | 102.2±14.6* |
| 大剂量锁阳提取物组 | 200 | 64.4±5.8** | 93.4±14.1** |
与模型组相比：**：P<0.01*：P<0.05
与空白组比，模型组大鼠对糖水的偏爱程度显著降低(P<0.01)、游泳不动时间显著增加(P<0.01)，提示模型大鼠对不利环境的绝望程度升高。与模型组比，大剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组大鼠对糖水的偏爱程度显著增加(P<0.01)，中剂量锁阳提取物组大鼠对糖水的偏爱程度明显增加(P<0.05)；大剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组大鼠游泳不动的时间显著减少(P<0.01)，中剂量锁阳提取物组大鼠游泳不动的时间明显减少(P<0.05)。
3.2对大鼠脑匀浆5-TH、DA、NE含量的影响见表3，对大鼠血清中ACTH、CORT含量的影响见表4
表3 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型脑匀浆5-TH、DA、NE含量的影响
与模型组相比：**：P<0.01*：P<0.05
与空白组比，模型组大鼠脑匀浆中5-HT、DA、NE水平均显著降低(P<0.01)，说明造大鼠慢性应激抑郁模型成功。与模型组比，大剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组可显著提高脑匀浆中的5-HT水平(P<0.01)，中剂量锁阳提取物组可明显提高脑匀浆中的5-HT水平(P<0.05)；大剂量锁阳提取物组可明显提高脑匀浆中的DA水平(P<0.05)，盐酸氟西汀组可显著提高脑匀浆中的DA水平(P<0.01)；大、中剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可显著提高脑匀浆中的NE水平(P<0.01)。
表4 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型血清中ACTH、CORT含量
与模型组相比：**：P<0.01*：P<0.05
与空白组比，模型组大鼠血清中ACTH、CORT水平均显著升高(P<0.01)，说明造大鼠慢性应激抑郁模型成功。与模型组比，大剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可显著降低血清中ACTH水平(P<0.01)，中剂量锁阳提取物组可明显降低血清中ACTH水平(P<0.05)；大、中剂量锁阳提取物组和均可明显降低血清中CORT水平(P<0.05)，盐酸氟西汀组可显著降低血清中CORT水平(P<0.01)。
3.3对大鼠胸腺指数、脾脏指数的影响见表5，
表4 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型胸腺及脾脏指数的影响
| 组别 | 剂量/mg·kg-1 | 胸腺指数 | 脾脏指数 |
| 空白组 | - | 1.725±0.513** | 3.019±0.531** |
| 模型组 | - | 1.212±0.323 | 2.389±0.211 |
| 盐酸氟西汀组 | 6.6 | 1.880±0.433** | 2.843±0.570* |
| 小剂量锁阳提取物组 | 50 | 1.493±0.495 | 2.928±0.396* |
| 中剂量锁阳提取物组 | 100 | 1.640±0.457* | 2.948±0.559* |
| 大剂量锁阳提取物组 | 200 | 1.710±0.244* | 2.930±0.568* |
与模型组相比：**：P<0.01*：P<0.05
与空白组比，模型组胸腺指数及脾脏指数均显著降低(P<0.01)，说明慢性抑郁抑郁大鼠模型出现胸腺、脾脏的萎缩。与模型组比，大、中剂量锁阳提取物组可明显提高模型大鼠胸腺指数(P<0.05)，盐酸氟西汀组可显著提高模型大鼠胸腺指数(P<0.01)；大、中、小剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可明显提高模型大鼠脾脏指数(P<0.05)。
3.4对慢性抑郁模型大鼠下丘脑组织形态的影响，见表5
表5 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型下丘脑病理变化的影响 单位：个
“-”神经细胞结构清晰，无异常；“+”神经细胞体积缩小，胞浆少；“++”神经细胞体积缩小，胞浆少，胞浆内尼氏体消失；“+++”神经细胞体积缩小，胞浆少，核固缩。或有嗜神经现象。
从上表可知，经Ridit检验，与空白组比，模型组大鼠下丘脑出现显著病理组织病变(P<0.01)。与模型组比，大、中、小剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可明显改善大鼠下丘脑的病理组织病变(P<0.01)。
3.5对慢性抑郁模型大鼠垂体组织形态的影响，见表6
大鼠垂体组织主要观察与分泌相关的腺垂体，于高倍视野下(×400倍)观察落在测微矩形面积5000平方微米内的腺细胞数。
表6 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型垂体病理变化的影响 单位：个
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
与空白组比，模型组大鼠腺细胞数显著减少(P<0.01)。与模型组比，大、中剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可显著提高模型大鼠腺细胞数(P<0.01)，小剂量锁阳提取物组可明显提高模型大鼠腺细胞数(P<0.05)。
3.6对慢性抑郁模型大鼠胸腺组织形态的影响，见表7。
在光镜视野下(×200倍)用测微尺测量胸腺皮质厚度，并计算压在测微尺上的淋巴细胞数。
表7 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型胸腺病理变化的影响 单位：个
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
与空白组比，模型组大鼠胸腺皮质淋巴细胞个数显著减少(P<0.01)，说明大鼠造慢性抑郁模型后胸腺体积萎缩。与模型组比，大、中剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可显著提高模型大鼠胸腺淋巴细胞数(P<0.01)，小剂量锁阳提取物组可明显提高模型大鼠胸腺淋巴细胞数(P<0.05)。
3.7对慢性抑郁模型大鼠肾上腺皮质组织形态的影响，见表8
在光镜视野下(×200倍)用测微尺测量肾上腺皮质束状带、网状带的厚度。
表8 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型肾上腺病理变化的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
与空白组比，模型组大鼠肾上腺皮质厚度显著增加(P<0.01)，说明大鼠造慢性抑郁模型后肾上腺功能亢进。与模型组比，大、中剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可显著减少模型大鼠肾上腺皮质厚度(P<0.01)，小剂量锁阳提取物组可明显减少模型大鼠肾上腺皮质厚度(P<0.05)。
3.8对慢性抑郁模型大鼠脾脏组织形态的影响，见表9
在光镜视野下(×200倍)用测微尺测量脾小体生发中心直径大小。
表9 锁阳提取物对大鼠慢性应激抑郁模型脾脏病理变化的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
与空白组比，模型组大鼠脾小结生发中心直径显著减小(P<0.01)，说明大鼠造慢性抑郁模型后脾脏萎缩。与模型组比，大、中剂量锁阳提取物组和盐酸氟西汀组均可显著增加模型大鼠脾小结生发中心直径(P<0.01)，小剂量锁阳提取物组可明显模型大鼠脾小结生发中心直径(P<0.05)。
上述试验资料充分表明本发明的锁阳提取物中总黄酮含量达70％以上，具有很好的抗抑郁作用，有效用于制备抗抑郁药物，实现锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，并开拓了抑郁症治疗用药的新途径，并实现锁阳提取物在制备治疗抑郁症药物中的应用，并且经临床对55例抑郁症患者按常规服药办法进行服用，每天3次，每次1.5-2.0g，连服20-30天，测定疗效，抑郁症均有不同程度的改善，表明无论是经动物试验，还是经临床验证，都证明锁阳提取物具有抗抑郁之功效，开拓了锁阳的新用途和药用价值，具有极大的实用价值，是中药上的一大创新。
Claims (1)
1.一种锁阳提取物在制备抗抑郁药物中的应用，该锁阳提取物是，取锁阳药材，粉碎成过20-30目筛的粗粉，加10倍锁阳重量的质量浓度为70%的乙醇浸泡0.5h，回流提取两2次，第一次1.5h，第二次1h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至无醇味，得锁阳提取液；D-101型大孔吸附树脂用质量浓度为95%的乙醇浸泡24小时后，湿法装柱，用质量浓度为95%的乙醇动态清洗至乙醇洗脱液与水以体积1：3混合不呈白色混浊溶液止，用水洗去乙醇后备用；将锁阳提取液用蒸馏水分散成含生药量0.3g/mL的分散液，调pH4.5，上大孔吸附树脂柱，分散液上柱量与树脂体积的比例为1：10，树脂柱径高比为1：12，先用4倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液；继用4倍柱体积的质量浓度为10%的乙醇洗脱，弃去质量浓度为10%的乙醇洗脱液；然后用10倍柱体积的质量浓度为30%的乙醇洗脱，收集质量浓度为30%的乙醇洗脱液，减压回收乙醇，60℃干燥粉碎，得锁阳提取物，锁阳提取物中锁阳总黄酮质量含量70%以上。
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