CN103969394A - 一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法，所述的药物是含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份；其质量控制方法包括薄层鉴别方法、定量检测方法。本发明检测方法不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率；一般在室温下分析即可，不需高柱温。高效液相色谱法是对栀子苷准确、快速的定量测定方法，为其质量标准的制定。

Description

一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法，属药物领域。

背景技术

自20世纪90年代以来，陆续发表的痴呆临床病理学研究证实，5-10％的65岁以上老年人患有某种认知衰退或痴呆，其中超过50％的病例原因是阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，且女性多于男性。阿尔茨海默病，又称阿尔茨海默病，是一种在老年期发生的以进行性痴呆为主要特征的中枢神经系统退行性疾病。在1907年由德国医生Alois Alzheimer首次描述。其主要临床表现为进行性认知功能障碍和记忆力衰退，性格和行为改变，意识错乱，思考及判断力丧失，生活自理能力丧失，最终死亡。这种破坏性的大脑退行性疾病剥夺了受害者最具人类特征的品质——记忆、推理、抽象化和语言的能力。国际阿尔茨海默病学会于2005年12月在《柳叶刀》上发表了著名的“德尔非研究共识”，指出：全球有2430万人患痴呆，每年新增痴呆病例460万(每7秒新增1例患者)。患病人数每20年增加1倍，到2040年，全球痴呆病例将达到8110万。AD是一种中枢神经系统(CNS)进行性变性疾病，其特征性病理改变为老年斑(Senile plaques，SPs)、神经元纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)，及区域性神经细胞死亡(神经元与神经突触异常丢失)等。NFTs为脑神经元内异常磷酸化的Tau蛋白聚集而形成，其多少与AD症状的严重程度有关。一个世纪以来，许多科学家就AD的确切病因及发病机制进行了不倦的探索和研究，但其致病因素复杂而至今尚不清楚。目前认为，AD是由遗传学因素、环境因素和代谢因素等多因素共同作用引起的一种病理过程。因此，AD迄今尚无特效、能中止和逆转病情进展的有效疗法。目前治疗主要在于改善病人标志性表现——记忆障碍及影响日常生活的症状等。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种治疗阿尔茨海默病的新药物的质量检测方法。

本发明提供了一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法，所述的药物是含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份；其质量控制方法包括薄层鉴别方法、定量检测方法。

进一步优选地，所述的药物是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份。

更进一步优选地，所述的药物是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

益智50份、菟丝子100份、远志100份、生地黄100份、五味子30份、川芎100份、栀子100份。

其中，所述的菟丝子为酒煮菟丝子。

其中，所述的制剂是片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液。

其中，所述的口服液中每ml含栀子以栀子苷计不低于11.4mg/ml。

其中，所述的薄层方法为：

取待测物品10ml，分别加入石油醚(60～90℃)萃取，分取石油醚溶液，合并，挥干，残渣加入无水乙醇溶液，使溶解，作为供试品溶液；

取益智对照药材粉末，加石油醚(30～60℃)，置超声提取器中超声提取，滤过，挥干，残渣加无水乙醇溶液使溶解，作为对照品溶液；

照薄层色谱法，按中国药典2010版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯253.7nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。

其中，所述的薄层方法为：

取待测样品，加乙醚，加热回流，取上层乙醚溶液，挥干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为供试液；

取川芎对照药材粉末，加乙醚，加热回流，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为对照液；

照薄层色谱法中国药典2010版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯253.7nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。

其中，所述的定量检测方法为：

色谱条件与系统适应性：采用C18柱(4.6mm×250mm，5um)，以乙氰-水(15:85)为流动相，检测波长为238nm，流速为1ml/min，进样量为10ul；

对照品溶液的制备：精密称取适量的栀子苷，置于10ml棕色容量瓶中，取甲醇溶液溶解至刻度，制成1ml含0.403mg溶液，摇匀，滤过，即得。

供试品溶液的制备：精密称取装量差异下的所述药物口服液1ml，置于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

由于本发明药物治疗阿尔茨海默病药效显著，发明人研究发现，本发明药物原料较多，通过采用薄层的方法检测其中是否含有益智、川芎；并通过栀子苷的含量测定，就能达到保障本发明药物药效的目的；栀子苷是从茜草科植物栀子的干燥成熟果实中运用高科技生产工艺提取精制而成的产品。现有研究已经表明，栀子苷具有可有效阻抑Aβ40和Aβ42的过度产生，阻断淀粉样蛋白沉积，保持钙离子稳态调节，阻抑淀粉样斑块引起的氧化损伤、非特异性炎症反应和代谢毒性物质对神经细胞的继发性损害，从而解除病变的发生和发展，减轻迟发性神经细胞死亡和皮层萎缩，对阿尔茨海默症具有显著的治疗效果。分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化，应用范围广；与气相色谱法相比具有的优点：不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率；一般在室温下分析即可，不需高柱温。高效液相色谱法是对栀子苷准确、快速的定量测定方法，为其质量标准的制定。

附图说明

图1本发明药物口服液色谱图

图2对照品色谱图

具体实施方式

实施例1本发明药物口服液的制备

称取原料药：益智50g，菟丝子(酒煮)100g，远志100g，生地黄100g，五味子30g，川芎100g，栀子100g；制成1000ml

以上七味，取益智加入30倍量水浸泡1小时后，加入川芎，按水蒸汽蒸馏法提取挥发油4小时，分别收集挥发油与提取液，待用；药渣与其他药材合并，加10入倍量水，提取2次，每次提取时间2h，合并所有提取液，减压浓缩(温度不超过80℃，真空度为-0.04—0.08MPa)到比重为1.15-1.20，加入乙醇，使其含醇量为85％，静置24小时，滤过，取滤液，减压浓缩(温度不超过80℃，真空度为-0.04—0.08MPa)到相对比重1.25—1.30，减压干燥(温度不超过80℃，真空度为-0.04—0.08MPa)，粉碎，即得。

取纯化水1000ml，加热至沸腾，缓慢加入中间体，边加边搅拌，加完后再搅拌10-15min，冷至室温，冷藏(0-4℃)过夜。滤过，取滤液，取滤液加入4g甜菊素搅拌至溶解完全，取200mL滤液，加热至70℃，加入吐温-80约4ml，搅拌均匀，冷却至40-50℃，加入挥发油，搅拌5min，将剩余的800ml药液加热至20-30℃，再将加入了吐温80的滤液缓慢加入剩余的滤液中，边加边搅拌，加完再搅拌5min，冷至室温，冷藏12小时，滤过，滤液，灌封(10ml/支)，即得。

本品为口服液，内容物为棕黄色到棕褐色的澄清液体，味微苦。

实施例2本发明药物的制备

称取原料药：益智25g，菟丝子(酒煮)50g，远志50g，生地黄50g，五味子15g，川芎50g，栀子50g，加水煎煮，浓缩，加入矫味剂等制备成口服液。

实施例3本发明药物的制备

称取原料药：益智75g、菟丝子150g、远志150g、生地黄150g、五味子45g、川芎150g、栀子150g，直接打粉，压片，得片剂。

实施例4本发明药物的制备

称取原料药：益智75g、菟丝子50g、远志50g、生地黄150g、五味子45g、川芎50g、栀子50g，加入75％乙醇提取，收集醇提液，浓缩，浸膏加淀粉，制粒，装胶囊。

实施例6本发明药物口服液的质量控制

【鉴别】(1)取本品10ml，分别加入石油醚(60～90℃)10ml萃取3次，分取石油醚溶液，合并，挥干，残渣加入3ml无水乙醇溶液，使溶解，作为供试品溶液。取益智对照药材粉末1.0g，加石油醚(30～60℃)20ml，置超声提取器中超声提取50min，滤过，挥干，残渣加1ml无水乙醇溶液使溶解，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯(253.7nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。

(2)取本品10ml，加乙醚20ml，加热回流1h，取上层乙醚溶液，挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试液。取川芎对照药材粉末1.0g，加乙醚20ml，加热回流1h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为对照液。照薄层色谱法(中国药典2010版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯(253.7nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。

【含量测定】栀子苷照高效液相色谱法(附录ⅥD)测定

色谱条件与系统适应性采用C18柱(4.6mm×250mm，5um)，以乙氰-水(15:85)为流动相，检测波长为238nm，流速为1ml/min，进样量为10ul。

对照品溶液的制备精密称取适量的栀子苷，置于10ml棕色容量瓶中，取甲醇溶液溶解至刻度，制成1ml含0.403mg溶液，摇匀，滤过，即得。

供试品溶液的制备精密称取装量差异下的所述药物口服液1ml，置于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每ml含栀子以栀子苷计不低于11.4mg/ml。色谱图见图1、图2。

以下通过具体药效学试验证明本发明药物的药效。

试验例1本发明药物口服液的药理试验

(一)本发明药物对东莨菪碱致记忆获得性障碍模型小鼠的影响

随着人类寿命的延长，越来越多老年人群受到AD的困扰，严重影响患者的生活质量。AD产生的机制非常复杂，迄今仍未完全清楚，但是越来越多证据表明，中枢胆碱能神经系统与认知功能密切相关。

1材料与方法

1.1实验动物

动物健康昆明种小鼠60只，清洁级，雌雄各半，体重(20±2)g，由成都达硕生物科技有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(川)2008-24。

环境小鼠喂养在干净白色塑料鼠笼内，每笼5只。室内光照、湿度、温度适宜(空调控制室温20～26℃，相对湿度60～70％)，通风条件好。

饲料保持充足的饮水与营养饲料。动物饲养管理按照操作规程进行。

1.2药物与试剂

本发明药物(由益智、菟丝子、远志、生地黄、五味子、川芎、栀子七味中药组成，由实施例1制备的口服液)：由四川蜀源博业医药科技有限公司提供，加工制成含生药1.2g/ml浓缩液，实验中给药剂量以水提液中所含生药的量计算。氢溴酸东莨菪碱，徐州莱恩药业有限公司。盐酸多奈哌齐，卫材(中国)药业有限公司。

1.3主要仪器和设备

VARIOSKAN FLASH3001全波长读数仪，美国Thermo公司，20PR-5型高速冷冻离心机为日本日立公司产品，HH-S型恒温水浴箱，德国Sartorius公司，WMT-100Morris水迷宫装置和XCS2小鼠跳台仪购于成都泰盟科技有限公司。

2方法

2.1动物分组及给药

经Morris水迷宫行为学测试，剔除学习、记忆能力较差或较强、游泳姿势不良者，筛选出学习、记忆能力正常小鼠。将初筛合格的小鼠按体重、性别随机分成6个组，分别是正常空白对照组，模型组，阳性对照药组，本发明药物高剂量组、中剂量组、低剂量组。每组10只小鼠，分笼适应性喂养1w。在测试前连续给药7d，按照高剂量组(0.76g/ml)，中剂量组(0.38g/ml)，低剂量组(0.19g/ml)，每天灌胃1次。正常组、模型组用生理盐水灌胃。阳性组给予安理申，灌胃1w后对小鼠进行水迷宫和跳台法测试。

(1)Morris水迷宫实验在测试的第6天造模，除空白组外各组给予腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(3mg/kg)后30min进行水迷宫实验。

(2)跳台实验水迷宫试验测试第6天，水迷宫实验结束后，对小鼠进行跳台法训练，第7天造模，除空白组外各组给予腹腔注射氢溴酸东莨菪碱(3mg/kg)后30min进行跳台实验。

2.2行为学实验

2.2.1水迷宫实验

在给药结束后的第1天，各组小鼠开始在Morris水迷宫中进行行为学测试，测试前，让鼠自由游泳以熟悉环境。将小鼠分别从三个象限面对池壁放入水池，记录90s内该鼠找到平台所用的时间(逃避潜伏期)。如果超过90s还未找到平台，则由实验者用手引致平台，并在平台上停留20s，逃避潜伏期记为90s，连续6天，第7天，撤除平台，使小鼠在无平台情况下寻找记忆中的平台，游泳90s。记录小鼠的运动轨迹，观察小鼠穿越原平台位置的次数，并汇总其停留在原平台象限的总时间。

2.2.2跳台实验

测试周期2天，训练与测试期间继续给予受试药物。于给药1h后开始训练，将动物放入反应箱内适应3min，立即通以36V交流电刺激小鼠。然后将小鼠放在绝缘平台上(计时开始)，记录各鼠第1次跳下平台的潜伏期、5min内每小鼠受到电击的次数(跳下平台的错误次数)，第2天进行测验，将小鼠放在绝缘平台上(计时开始)，记录第1次跳下平台的潜伏期、5min内的跳下平台的错误次数，以此作为学习成绩。

3统计学处理

数据用SPSS17.0软件处理，数据以x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)检验，P＜0.05为有统计学意义。

4结果

4.1Morris水迷宫实验

4.1.1定位航行实验

在3天训练期中，各组小鼠的平均逃避潜伏期呈逐渐下降趋势，表明各组小鼠学习寻找平台的能力在历次的学习训练中均有所提高。从第4天开始，模型组小鼠逃避潜伏期明显延长(P﹤0.05)，盐酸多奈哌齐阳性对照组可缩短小鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)。本发明药物高、中、低剂量组均可缩短小鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)；此外本发明药物高、中、低剂量组均能使小鼠由于学习记忆能力下降引起的穿越平台次数增多(P﹤0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)。(见表9)

表9本发明药物对东莨菪碱致学习记忆障碍模型逃避潜伏期的影响

注：均与模型组比较，^*P﹤0.05，^**P﹤0.01。下同。

4.1.2空间搜索

撤去平台后，模型组小鼠多围绕池壁游泳，在迷宫外环停留时间较长，较少游向平台附近，其运动轨迹随机分布在各个象限中，其穿越平台次数、有效区停留时间、有效区游泳路程，与空白组比较明显减少(P＜0.01)。盐酸多奈哌齐阳性对照组有效区域停留时间、有效游泳路程，与模型组比较延长(P＜0.01)，

本发明药物高、中、低剂量组均能延长小鼠有效区域停留时间，增加有效区域游泳路程(P＜0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)(见表10)。

表10本发明药物对东莨菪碱致学习记忆障碍模型空间搜索的影响

4.2跳台

模型组小鼠潜伏期明显高于对照组(P＜0.05)，盐酸多奈哌齐对照组可缩短小鼠潜伏期(P＜0.05)。本发明药物高剂量组可缩短小鼠潜伏期(P＜0.05)；此外本发明药物中剂量组能使小鼠由于学习记忆能力下降引起的错误次数次数减少(P＜0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)。(见表11)表11本发明药物对东莨菪碱致学习记忆障碍模型空间搜索的影响

(二)本发明药物对Aβ致AD模型大鼠的影响

Aβ是SP的主要成分，脑内Aβ异常沉积是AD最主要的病理变化。经典Aβ毒性作用理论认为，Aβ由可溶状态到不可溶状态的转化是AD发病中的重要环节。大量沉积的Aβ具有神经毒性，最终导致患者临床症状的发生。1材料与方法

1.1实验动物

Sprague Dawley大鼠，SPF级，雄性，2月龄，体重(200±20)g，成都达硕生物科技有限公司提供，动物生产许可证号：SCXK(川)2008-24。室内保持12h光照，12h避光循环饲养，给予标准饲料和饮用水，且控制室内温度为(22±1)℃、相对湿度约40％。

1.2药物与试剂

本发明药物(由实施例1制备的口服液)：由四川蜀源博业医药科技有限公司提供，加工制成含生药1.2g/ml浓缩液，实验中给药剂量以水提液中所含生药的量计算。盐酸多奈哌齐，卫材(中国)药业有限公司。

淀粉样蛋白片段(Aβ_25－35，美国Sigma公司)，实验前用无菌生理盐水将其稀释成浓度为2μg·μL^-1，37℃恒温箱中孵育72h，形成凝聚态后置于-20℃冰箱存放备用；一抗：Anti-Aβantibody、Anti-tau antibody(abcam公司)；β-ActinAntibody(武汉博士德生物)；Prestained Protein Marker(Fermentas公司)；二抗和DAB显示试剂盒(北京中山金桥生物有限公司)。

1.3主要仪器和设备

Labsolution5.5大鼠脑立体定位仪(成都泰盟科技有限公司)；5μL微量进样器(上海安亭进样器厂)；SAESHIN90+102电动牙科钻(Saeshin PrecisionCo.Ltd)；WMT-100Morris水迷宫视频分析系统(成都泰盟科技有限公司)；BX43正置显微镜(OLYMPUS公司)；Image-Pro Plus图像分析系统(MediaCybernetics，Inc.公司)；VARIOSKAN FLASH3001全波长读数仪(Thermo公司)；BSA224S-CW电子分析天平(Sartorius公司)；美国Thermo高速离心机(Thermo公司)。

2方法

2.1动物模型制备

根据参考文献资料方法，各组动物均用10％乌拉坦(10mL·kg-1)腹腔注射麻醉后，将大鼠平颅头位固定于脑立体定位仪上，剪去脑顶局部毛发，常规消毒后用无菌手术刀在大鼠头皮正中线处切开一长约1.5cm纵行切口，暴露前囟，钝性分离皮下组织及骨膜，根据大鼠脑立体定位图谱在颅骨前囟后3.4mm、脑正中线左右旁开2.0mm两处用无菌牙科钻钻开，用5μL微量进样器自颅骨开孔处进入大鼠两侧海马背部，进针深度2.7mm，缓慢匀速注射5μL凝聚态Aβ_25-35，注射速度为1μL·min^-1，5min注射完毕，留针2min，缓慢撤针，术后缝合创口，消毒，假手术组注射等容积的生理盐水，术后自由饲养1周。

2.2分组与给药

将造模后的60只模型大鼠按体重随机均分为模型组、盐酸多奈哌齐组(1.02mg·kg^-1)和本发明药物高(7.2g·kg^-1)、中(3.6g·kg^-1)、低(1.8g·kg^-1)剂量组。取12只假手术组大鼠作空白对照组，除假手术组和模型组大鼠给予等体积的生理盐水外，各治疗组给予相应的治疗药物，给药容积为10mL·kg^-1，连续给药30d。

2.3观察指标

2.3.1Morris水迷宫

实验连续5天，分为定位航行实验和空间探索实验，前3天为训练期，第4天为定位航行实验，第5天为空间探索实验。设置程序将水桶“十”字分成四个象限，每个象限池壁边缘中点为入水点。站台置于第四象限中心，每日依次从第一、二、三象限入水点将动物面向池壁放入水中，记录动物寻找并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期。如未找到平台，潜伏期记录为120s。第5天撤除站台，依次从第一、二、三象限入水点将动物面向池壁放入水中，三次分别记录动物120s内经过逃逸平台次数、有效区(站台直径2倍范围)停留时间、有效区(站台直径2倍范围)游泳路程。

2.3.2病理HE染色

在末次行为学测试后，将大鼠麻醉灌流后，完整取出脑组织，置于4％多聚甲醛固定24h，石蜡包埋切片。二甲苯脱蜡，无水乙醇脱水后用苏木精、伊红染色，中性树胶封片。

2.3.3免疫组化

按照免疫组化试剂盒说明，采用SP二步法进行常规脱蜡、阻断内源性过氧化物酶、滴加一抗和二抗、DBA显色、苏木素复染、乙醇脱水、透明、中性胶封片。在400倍显微镜下观察，每张切片的每个测定部位随机选取3个视野，采用Image-Pro Plus6.0图像分析系统进行分析，统计每组阳性表达目标数、目标总面积及累计光密度值(IOD)，取平均值进行结果比较。阳性为棕黄色-黄色表达于细胞浆和/或细胞核，阴性细胞核为蓝色。

3统计学方法

使用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较用最小显著差异t检验(LSD)，不符合正态分布则用秩和检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

4结果

4.1行为学实验

4.1.1定位航行实验

在3天训练期中，各组小鼠的平均逃避潜伏期呈逐渐下降趋势，表明各组大鼠学习寻找平台的能力在历次的学习训练中均有所提高。从第4天开始，模型组大鼠逃避潜伏期明显延长(P﹤0.05)，多奈哌齐阳性对照组可缩短大鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)。第4天，本发明药物高、中剂量组均可缩短大鼠逃避潜伏期(P﹤0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)。(见表12)

表12本发明药物对Aβ致AD模型大鼠逃避潜伏期的影响

4.1.2空间搜索实验

撤去平台后，模型组大鼠多围绕池壁游泳，在迷宫外环停留时间较长，较少游向平台附近，其运动轨迹随机分布在各个象限中，其穿越平台次数、有效区停留时间、有效区游泳路程，与假手术组比较明显减少(P＜0.05)。盐酸多奈哌齐阳性对照组有效区域停留时间、有效游泳路程，与模型组比较延长(P＜0.05)，

本发明药物高、中、低剂量组均能延长小鼠有效区域停留时间(P＜0.05)，中、低剂量组均增加有效区域游泳路程(P＜0.05)。组间比较无差异(P﹥0.05)(见表13)。

表13本发明药物对Aβ致AD模型大鼠空间搜索的影响

4.2HE病理变化

假手术组大鼠脑内神经细胞排列整体，少数细胞浓染，部分灶性神经细胞减少。模型组大鼠脑内小胶质细胞增多，神经细胞数量明显减少，排列不成行细胞核固缩，部分细胞消失，仅见空泡存在。各治疗组大鼠脑内神经元病变均明显轻于模型组，可见部分神经元胞浆内虎斑减少或消失，尤以本发明药物高剂量组改善最为明显，大多数形态完好，散在胶质细胞。

4.3免疫组织化学法观察脑组织tau蛋白表达

光镜下观察细胞浆着棕褐色为tau蛋白染色阳性。实验结果表明，模型对照组海马tau较假手术组显著高表达，着色较深，阳性目标数、阳性目标面积及平均光密度值显著增高(P<0.01)。本发明药物治疗组可见阳性染色神经元数目及染色程度与假手术组相接近，较模型对照组表达减少，着色较浅，阳性目标数、阳性目标面积及平均光密度值明显降低(P<0.05)。(见表14)

表14本发明药物对Aβ模型大鼠海马tau表达的影响

(三)结论

本发明药物具有一定益智作用，可用于治疗阿尔茨海默病。

Claims (9)

1.一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法，其特征在于：所述的药物是含有下述重量配比的原料药制备而成的制剂：益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份；其质量控制方法包括薄层鉴别方法、定量检测方法。

2.根据权利要求1所述的药物的质量检测方法，其特征在于：所述的药物是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

益智25-75份、菟丝子50-150份、远志50-150份、生地黄50-150份、五味子15-45份、川芎50-150份、栀子50-150份。

3.根据权利要求2所述的药物的质量检测方法，其特征在于：所述的药物是由下述重量配比的原料药制备而成的制剂：

益智50份、菟丝子100份、远志100份、生地黄100份、五味子30份、川芎100份、栀子100份。

4.根据权利要求1-4任意一项所述的质量检测方法，其特征在于：所述的菟丝子为酒煮菟丝子。

5.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的制剂是片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液。

6.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的口服液中每ml含栀子以栀子苷计不低于11.4mg/ml。

7.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的薄层方法为：

取待测物品10ml，分别加入石油醚(60～90℃)萃取，分取石油醚溶液，合并，挥干，残渣加入无水乙醇溶液，使溶解，作为供试品溶液；

取益智对照药材粉末，加石油醚(30～60℃)，置超声提取器中超声提取，滤过，挥干，残渣加无水乙醇溶液使溶解，作为对照品溶液；

照薄层色谱法，按中国药典2010版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(9:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯253.7nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。

8.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的薄层方法为：

取待测样品，加乙醚，加热回流，取上层乙醚溶液，挥干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为供试液；

取川芎对照药材粉末，加乙醚，加热回流，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为对照液；

照薄层色谱法中国药典2010版一部附录VI B试验，吸取上述两种溶液各10uL，分别点于同一硅胶GF254的薄层板上，以环己烷—乙酸乙酯(3:1)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯253.7nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱的相应位置上，显相同颜色的主斑点。

9.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于：所述的定量检测方法为：

色谱条件与系统适应性：采用C18柱(4.6mm×250mm，5um)，以乙氰-水(15:85)为流动相，检测波长为238nm，流速为1ml/min，进样量为10ul；

对照品溶液的制备：精密称取适量的栀子苷，置于10ml棕色容量瓶中，取甲醇溶液溶解至刻度，制成1ml含0.403mg溶液，摇匀，滤过，即得。

供试品溶液的制备：精密称取装量差异下的所述药物口服液1ml，置于100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

测定法：分别精密吸取对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。