CN106727928A - 夏枯草提取物及制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了夏枯草提取物及制备方法及应用、夏枯草提取物中咖啡酸的重量百分比大于等于5％，迷迭香酸的重量百分比大于等于15％。本发明的夏枯草提取物其制备方法简便实用，易于操作，更适合工业化生产。另外，该提取物对D‑半乳糖所致的快速老化模型大鼠的学习记忆具有改善作用，能够降低快速老化模型大鼠的水迷宫实验中的逃避潜伏期和穿越平台次数；免疫组化结果显示，该提取物可降低快速老化模型大鼠海马CA1区Caspase‑3和大脑皮层GFAP的表达。HE和Nissl染色结果显示，该提取物能够改善D‑半乳糖所致的神经元损伤。发现夏枯草提取物具有抗阿尔兹海默病的作用，应用于制备抗阿尔兹海默病的药物，治疗老年痴呆。

Description

夏枯草提取物及制备方法及应用
技术领域
本发明属于药物制备领域，具体涉及一种夏枯草提取物及制备方法及应用。
背景技术
阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease)是一种中枢神经系统退行性疾病，是最常见的痴呆类型。对于阿尔兹海默病患者而言，认知功能的减退是疾病的主要标志。阿尔兹海默病的病理特征主要有(由β-amyloid形成的)淀粉样蛋白斑、神经纤维缠结和神经元丢失等。根据国际阿尔兹海默病协会统计，截止2015年，全球估计有4700万左右的痴呆患者，其中阿尔兹海默病占约60％-70％，而据估计到2050年这个数字将超过一亿。美国于2014年公布的一组统计数字显示，对于阿尔茨海默病病人的护理费用已经达到6000亿美元。痴呆的患病率和巨大耗费给社会带来严峻的政治和经济挑战。然而到目前为止，仅有5种药物获得FDA批准用于治疗阿尔茨海默氏症，但这些药物只能暂时性地提高认知能力，不能解决阿尔茨海默病认知功能障碍的根源。
传统中药历来用于防治认知功能障碍，近年来，随着对阿尔兹海默病研究的深入，中药及其提取物预防和治疗阿尔兹海默病的作用也日益受到重视。传统中药不仅看重疾病的症状是否缓解，更关注于恢复和维持体内平衡，且中药的治疗理论正是多靶点、多途径协同作用，这种策略和现代多靶点治疗复杂疾病的原理不谋而合。
夏枯草为唇形科植物夏枯草Prunella vulgarls L.的干燥成熟果穗或全草，具有清火、明目、散结、消肿之功效，用于目赤肿痛、目珠夜痈、头痛眩晕、痹病、癌瘤和乳腺肿痛，甲状腺肿大，淋巴结结核、乳腺增生、高血压等症。目前市场上夏枯草的单味制剂有夏枯草口服液、夏枯草颗粒等，均为夏枯草的粗提制剂，提取工艺粗糙，质量可控性不强，到目前为止未见有较明确化学成分的夏枯草的有效部位作为新药申报。夏枯草属植物中主要含有三萜及其苷类、甾醇及其苷类、黄酮类、香豆素、酚酸、挥发油及糖类等成分。其中以熊果酸、齐墩果酸为主的三萜类成分和以迷迭香酸、咖啡酸为主的酚酸类成分，含量较为丰富，是夏枯草的主要有效成分。文献报道夏枯草具有降压、降血脂、抗炎、免疫抑制、抗菌、抗病毒、降糖、抗肿瘤等多种作用，迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、免疫抑制、抗过敏、抗血小板凝集、神经保护等作用，熊果酸具有抗肿瘤、抗肝损伤、抗菌消炎和抗病毒等多种药理学活性。但目前的研究大多集中在夏枯草抗高血压的作用上，而对夏枯草抗老年痴呆的活性未见报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种夏枯草提取物。
本发明的第二个目的是提供一种夏枯草提取物的制备方法。
本发明的第三个目的是提供一种夏枯草提取物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
夏枯草提取物，所述夏枯草提取物中咖啡酸的重量百分比大于等于5％，迷迭香酸的重量百分比大于等于15％。
上述夏枯草提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)将夏枯草药材粉碎，以甲醇水溶液或乙醇水溶液为溶剂，按固液质量比为1:4～8的比例，采用溶剂回流提取法、超声提取法、室温浸提法或渗漉法进行提取，提取1-3次，过滤，得滤液；
(2)滤液浓缩至60-65℃相对密度1.01～1.10，得到浓缩液a；
(3)将浓缩液a加2～5倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积1～3倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取2～5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
所述步骤(1)提取的方法为溶剂回流提取法。
所述甲醇水溶液的体积浓度为30％～95％，所述乙醇水溶液的体积浓度为30％～95％。
所述步骤(2)为：滤液浓缩至65℃相对密度1.08，得到浓缩液a。
所述步骤(3)为：将浓缩液a加3倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积2倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
上述夏枯草提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用。
本发明的优点：
本发明的夏枯草提取物中咖啡酸的重量百分比大于等于5％，迷迭香酸的重量百分比大于等于15％。其制备方法简便实用，易于操作，更适合工业化生产。另外，该提取物对D-半乳糖所致的快速老化模型大鼠的学习记忆具有改善作用，能够降低快速老化模型大鼠的水迷宫实验中的逃避潜伏期和穿越平台次数；免疫组化结果显示，该提取物可降低快速老化模型大鼠海马CA1区Caspase-3和大脑皮层GFAP的表达。HE和Nissl染色结果显示，该提取物能够改善D-半乳糖所致的神经元损伤。发现夏枯草提取物具有抗阿尔兹海默病的作用，应用于制备抗阿尔兹海默病的药物，治疗老年痴呆。
附图说明
图1夏枯草提取物HPLC色谱图。
图2水迷宫实验典型游泳轨迹.A:Control；B:SCOP；C:DON；D:XKC-L；E:XKC-H。
图3实施例1所得夏枯草提取物对SCOP所致痴呆小鼠逃避潜伏期的影响。
图4实施例1所得夏枯草提取物对SCOP所致痴呆小鼠穿越平台次数的影响。
图5尼氏染色观察实施例1所得夏枯草提取物对SCOP所致痴呆小鼠大脑皮质GFAP表达的影响。
图6尼氏染色观察实施例1所得夏枯草提取物对SCOP所致小鼠海马CA1区Caspase-3表达的影响。
图7尼氏染色观察实施例1所得夏枯草提取物对SCOP所致痴呆小鼠海马CA1区的影响。
图8 HE染色观察实施例1所得夏枯草提取物对SCOP所致小鼠海马CA1区的影响。
图9实施例2所得夏枯草提取物对SCOP所致痴呆小鼠逃避潜伏期的影响。
图10实施例2所得夏枯草提取物对SCOP所致痴呆小鼠穿越平台次数的影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
夏枯草提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)将夏枯草药材粉碎，以体积浓度为70％的乙醇水溶液为溶剂，按固液质量比为1:6的比例，采用溶剂回流提取法进行提取，提取3次，过滤，得滤液；
(2)滤液浓缩至65℃相对密度1.08，得到浓缩液a；
(3)将浓缩液a加3倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积2倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
实施例2
夏枯草提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)将夏枯草药材粉碎，以体积浓度为70％的甲醇水溶液为溶剂，按固液质量比为1:4的比例，采用超声提取法，提取3次，过滤，得滤液；
(2)滤液浓缩至60℃相对密度1.01，得到浓缩液a；
(3)将浓缩液a加2倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积3倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取2次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
实施例3
夏枯草提取物的提取方法，包括以下步骤：
(1)将夏枯草药材粉碎，以体积浓度为95％的乙醇水溶液为溶剂，按固液质量比为1:8的比例，采用渗漉法进行提取，提取1次，过滤，得滤液；
(2)滤液浓缩至65℃相对密度1.10，得到浓缩液a；
(3)将浓缩液a加5倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积1倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
用室温浸提法替代本实施例的渗漉法，其它同本实施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比为5.6％；迷迭香酸的重量百分比15.8％。
用体积浓度为30％的乙醇水溶液替代本实施例的95％的乙醇水溶液，其它同本实施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比为5.9％；迷迭香酸的重量百分比16.4％。
用体积浓度为30％的甲醇水溶液替代本实施例的95％的乙醇水溶液，其它同本实施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比为6.1％；迷迭香酸的重量百分比17.5％。
用体积浓度为95％的甲醇水溶液替代本实施例的95％的乙醇水溶液，其它同本实施例，得到的夏枯草提取物的咖啡酸的重量百分比为6.4％；迷迭香酸的重量百分比16.2％。
实施例4夏枯草提取物的成分分析
1色谱条件
色谱柱：Phenomenex C18。(4.6mm*250mm，5μm)；液相条件：A相：0.1％醋酸水溶液；B相：甲醇；梯度洗脱，0～30min：30％～60％B相；吸收波长为330nm；柱温箱35℃。
2供试品溶液配制
准确称取实施例1制备的夏枯草提取物605mg于5mL容量瓶中，加70％乙醇定容，超声20min后放至室温，用70％乙醇补足至刻度，0.45μm微孔滤膜过滤后作为制剂供试品溶液。
3结果
采用标准曲线法对夏枯草提取物中的咖啡酸和迷迭香酸的含量进行测定，咖啡酸的标准曲线方程为y＝53032x+39125,R2＝0.999,迷迭香酸的标准曲线方程为y＝57333x+11207,R2＝0.999。
采用标准曲线法对夏枯草提取物中的咖啡酸和迷迭香酸的含量进行测定，咖啡酸的标准曲线方程为y＝53032x+39125,R2＝0.999,迷迭香酸的标准曲线方程为y＝57333x+11207,R2＝0.999。实施例1制备的夏枯草提取物中咖啡酸和迷迭香酸的含量分别为6.4％和20.3％。典型的色谱图如图1所示。
用同样的方法测定：
实施例2制备的夏枯草提取物中咖啡酸和迷迭香酸的重量百分比分别为5.8％和18.5％。。
实施例3制备的夏枯草提取物中咖啡酸和迷迭香酸的重量百分比分别为6.2％和19.7％。。
实施例5夏枯草提取物的活性考察
1体外实验：微孔高通量筛选法对夏枯草提取物(实施例1提取)AChE抑制作用的体外活性研究
本部分实验通过微孔高通量筛选技术，采用改良Ellman法，夏枯草提取物的AChE抑制活性。其实验原理为：碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)在AChE作用下分解，生成硫代胆碱，硫代胆碱与显色剂DTNB(5，5-二硫代双对硝基苯甲酸)迅速作用，生成在412nm处有光吸收的黄色物质，若样品对酶有抑制作用，则转化出的有色物质少，其在紫外下的吸光度值小，可利用吸光度值差异来计算抑制率的大小。
1.1样品溶液的配制
①实验样品的配制：精密称取夏枯草提取物2.25mg溶于1mL PBS中，分别设3个浓度梯度，依次为2.25、22.50和225.00μg·mL-1。
②阳性药：精密称取多奈哌齐1mg，蒸馏水溶解，配制成浓度为50μg·mL-1的溶液。
③AChE储备液的制备：取健康小鼠大脑，用匀浆器将其研碎。称取1g小鼠大脑匀浆，加入9mL PBS缓冲溶液，3000r·min-1离心30min，取上清液。吸取1mL上清液，加入13mLPBS缓冲溶液，作为酶储备液。
④底物和显色剂的制备：称取9mg碘化硫代乙酰胆碱，溶于500mL PBS中，作为底物。称取50mg DTNB，溶于50mL PBS中，作为显色剂；称取1.5g SDS，溶于50mL PBS中，作为酶反应终止剂。
1.2孵育取5mL EP管，先加入608μL PBS，随后加入32μLAChE。然后实验组加入160μL样品溶液；空白对照组加入160μL蒸馏水。混匀，于37℃水浴中孵育20min，让样品与酶液充分反应。
1.3显色从水浴中取出EP管，加入400μL DTNB，然后加入400μL底物，混匀，于37℃水浴中孵育20min，进行显色。
1.4检测从水浴中取出EP管，加入400μL SDS，终止反应。然后从中吸取200μL反应液，迅速加到96孔板中，每个样品设5个复孔。于酶标仪412nm处检测吸光值。
AChE的相对抑制率＝(1－实验组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％。
1.5结果
通过微孔高通量筛选技术，采用改良Ellman法，评价实施例1制备的夏枯草提取物AChE抑制活性。结果显示实施例1制备的夏枯草提取物具有很好的AChE抑制活性，其为225.00μg·mL-1时的抑制率大于阳性药多奈哌齐的AChE抑制率。而目前FDA批准治疗老年痴呆的5个药物中，其中有4个药物为AChE抑制剂，提示夏枯草提取物具有很好的抗老年痴呆的作用。
表1不同浓度夏枯草提取物的AChE抑制率
2体内实验：夏枯草提取物对氢溴酸东莨菪碱(SCOP)所致痴呆小鼠学习记忆改善作用
2.1实验材料与方法
2.1.1实验药物与试剂
所用夏枯草提取物按实施例1自制。多奈哌齐(DON，国药准字H20030472，江苏豪森药业股份有限公司)；GFAP抗体和Caspase-3抗体(购自武汉博士德生物工程有限公司)。
2.1.2实验动物
雌性昆明小鼠，体重为18±2g，由军事医学科学院实验动物中心提供；许可证号：SCXK-2010-004，实验用小鼠于25℃条件下适应性饲养一周以后进行实验。
2.1.3实验仪器
水迷宫实验系统(天津中医药大学提供)TopScanLite-TopView行为学分析系统(NoldusInformation Technology,Leesburg,VA,USA)。Molecular Device Flexstation 3酶标仪。
2.1.4分组及给药
将50只健康的雌性昆明小鼠随机分成5组：空白组(Control)、模型组(SCOP)、多奈哌齐组(DON)夏枯草高剂量(XKC-H,800mg/kg)和夏枯草低剂量组(XKC-L,400mg/kg)，每组10只，连续给药3周，给药的后3天，模型组和各个实验组均腹腔注射SCOP(3mg/kg.d)，空白组注射同等剂量的生理盐水，连续注射3天。同时，空白组、模型组灌胃5％CMC-Na，各给药组连续灌胃给药60天，每天1次。药物均采用5％的CMC-Na溶解至一定浓度。
2.1.5样本采集
给药3周后，于末次给药后10％水合氯醛麻醉，待麻醉满意后进行脑灌注。脑于中性福尔马林中保存用于病理切片。
2.1.6行为学测定(水迷宫实验)
Morris水迷宫由一个不锈钢喷塑圆柱形水池和自动录像记录系统两部分组成。水池直径为100cm，高38cm。池壁上标记有4个等距离点，按顺时针方向将水池分为4个象限，任选一个象限，于其中央放置平台(平台与池壁及圆心距离相等)。平台黑色，直径6cm，高15cm，泳池内盛水，水温保持在25±1℃，自动录像记录系统包括摄像头和录像系统(计算机、记录软件)，摄像头装于水池上方约3m处，并与录像系统相连接，自动录入并记录大鼠逃避潜伏期、穿越平台次数。大鼠于灌胃给药60天后开始进行Morris水迷宫检测，先训练1周，每天上下午各2遍，第7天给药60min后开始检测,运用空间探索实验来检测动物对平台空间位置的准确记忆，即记忆保持能力。水迷宫第7天，撤除平台后，从原实台象限的对角象限(第3象限)作为入水点将动物面向池壁放入水中。记录动物在90s内在实台象限的穿台次数和目标象限游泳时间，用于检测动物对平台空间位置的准确记忆，即记忆保持能力。数据采集和处理均由该装置的图像动监视和处理系统完成。
2.1.7脑海马形态学观察及检测方法
尼氏染色和HE染色后观察各给药组大脑海马CA1区的形态组织变化。
2.1.6统计学处理
利用SPSS20.0统计分析处理软件，对测量参数进行统计学分析，实验数据以表示，采用双侧t检验进行比较，P<0.05则表示具有显著性差异。
2.2结果
2.2.1行为学测定
采用水迷宫实验对其行为学进行评价，代表性的游泳轨迹如图2所示。空间探索实验中的逃避潜伏期和穿越平台次数分别如图3和图4所示，Control组(正常对照组)、DON组(阳性药给药组)、XKC-L组(夏枯草低剂量组)和XKC-H(夏枯草高剂量组)组的潜伏期均较SCOP组小，且Control组、XKC-L组和XKC-H具有显著性差异(P<0.001,P<0.05,P<0.01)。Control组、DON组、XKC-L组和XKC-H组穿过平台的次数均大于模型组，表明了夏枯草提取物可减少SCOP组(模型组)所致小鼠逃避潜伏期的延长，提高其学习记忆能力。
2.2.2免疫组织化学染色观察Caspase-3和GFAP表达
免疫组织化学染色结果如图5和图6所示。GFAP的阳性表达颗粒主要出现在神经胶质细胞突起处，呈棕黄色深染颗粒。GFAP染色结果显示，在Control组小鼠大脑皮质内GFAP阳性染色较淡；模型组的神经胶质细胞突起处，可见大量深染的棕黄色颗粒，为GFAP阳性染色细胞，阳性细胞数量明显高于对照组(见图5)。与模型组相比，DON组及不同剂量夏枯草提取物处理组的细胞染色相对较淡，阳性细胞数量明显低于模型组。Caspase-3染色结果显示，Control组的阳性细胞数量与SCOP组存在有显著差异。SCOP组小鼠海马神经元阳性细胞数比正常对照组显著增加。阳性对照组DON和不同剂量夏枯草提取物干预组可见海马阳性反应细胞着色浅，结果见图6。
2.2.3脑海马形态学观察
各组小鼠脑海马区形态变化如图7和图8所示，正常小鼠海马CA1区结构正常，神经毯排列紧密且整齐，层次清楚，有4-6层细胞，细胞核呈圆形，核仁清晰。SCOP组小鼠海马CA1区病变严重，神经元排列散乱疏松，锥体细胞带不完整，细胞数量明显减少，核固缩明显，夏枯草提取物给药组小鼠海马CAl区病变较模型组明显改善，结构清晰，细胞排列较整齐，细胞核固缩不明显，其病变较模型组明显减轻，与阳性药SCOP组相似，几乎与空白对照没有差异，显示夏枯草提取物可明显改善模型大鼠脑组织的病理变化。
实施例2、3的体内外实验研究方法与实施例1相同，体外实验结果证明，实施例2和实施例3所得夏枯草提取物对氢溴酸东莨菪碱(SCOP)所致痴呆小鼠学习记忆改善作用，其剂量为22.50μg·mL-1时抑制率分别可达63.47±3.29％和65.83±2.91％；体内实验结果也证实了，实施例2(结果见图9，10)和实施例3所得夏枯草提取物可减少SCOP所致小鼠逃避潜伏期的延长，提高其学习记忆能力。其剂量为400mg/kg时，小鼠逃避潜伏期分别为20.28±4.53和18.01±3.71；剂量为800mg/kg时，小鼠逃避潜伏前为15.42±4.21和12.50±4.22。

Claims (7)

1.夏枯草提取物，其特征在于所述夏枯草提取物中咖啡酸的重量百分比大于等于5％，迷迭香酸的重量百分比大于等于15％。
2.权利要求1夏枯草提取物的提取方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将夏枯草药材粉碎，以甲醇水溶液或乙醇水溶液为溶剂，按固液质量比为1:4～8的比例，采用溶剂回流提取法、超声提取法、室温浸提法或渗漉法进行提取，提取1-3次，过滤，得滤液；
(2)滤液浓缩至60-65℃相对密度1.01～1.10，得到浓缩液a；
(3)将浓缩液a加2～5倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积1～3倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取2～5次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(1)提取的方法为溶剂回流提取法。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述甲醇水溶液的体积浓度为30％～95％，所述乙醇水溶液的体积浓度为30％～95％。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(2)为：滤液浓缩至65℃相对密度1.08，得到浓缩液a。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述步骤(3)为：将浓缩液a加3倍体积的蒸馏水得悬浮液，再加入悬浮液体积2倍的乙酸乙酯，振荡，静置分层，上清液为乙酸乙酯层，下层液体用等体积的乙酸乙酯重复萃取3次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得夏枯草浓缩液b；干燥得夏枯草提取物。
7.权利要求1夏枯草提取物在制备治疗阿尔兹海默病药物的应用。
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